Piroplasmosis por Babesia microti (syn.

Babesia vulpes )
en zorros rojos ( Vulpes vulpes ) en el noroeste de
España (Galicia) y su relación con Ixodes hexagonus

Rocío Checa aAna María López-Beceiro bAna Montoya aJuan

Pedro Barrera aNieves Ortega aRosa Gálvez aValentina Marino aJulia González aÁngeles
Sonia Olmeda aLuis Eusebio Fidalgo bGuadalupe Miró a

Abstracto
La Piroplasmosis es causada por varias especies de protozoos tales
como la Babesia microti (Bml), un protozoo de la sangre emergente
también conocido como Theileria annae o vulpes Babesia. La infección por
Bml se informó por primera vez en perros en España, donde
es endémica en la actualidad. Recientemente, se ha detectado una alta
prevalencia de Bml en zorros rojos ( Vulpes vulpes) en los países
europeos. El objetivo de este estudio fue determinar los niveles de
infección de este parásito en zorros de Galicia, noroeste de España, y la
infestación de especies de garrapatas en estos carnívoros, donde hasta
ahora se desconocen. Se tomaron muestras de sangre, bazo y
garrapatas (si estaban presentes) de 237 zorros rojos cazados en la
región de Galicia. Se prepararon frotis de sangre para observación
directa del parásito y se examinaron muestras de bazo y garrapata
mediante PCR anidada . Las prevalencias de infección por Bml en zorros
rojos gallegos se estimaron en 72% (171/237) por PCR y 38.23% (26/68)
por observación directa. Entre 837 garrapatas recolectadas, la garrapata
principal identificada fue Ixodes hexagonus (presente en el 82.4% de los
zorros) seguida de Ixodes ricinus (12.3%) ,Dermacentor reticulatus(12.3%)
y Rhipicephalus sanguineuss en su lato (3.5%). De 34 zorros que dieron
positivo para Bml, se recolectaron 616 garrapatas: se obtuvieron
resultados positivos de Bml PCR en 55.6% (227/408) de garrapatas
recolectadas de 9 zorros, mientras que 208 garrapatas de los 25 zorros
infectados restantes arrojaron resultados de PCR negativos. Dado que la
piroplasmosis canina es endémica en esta área, nuestras observaciones
apuntan al zorro rojo como el principal reservorio para la infección Bml y
la alta proporción deI. Hexagonus entre garrapatas recolectadas de zorros
rojos sugiere su probable papel como vectores de B.microti-like
piroplasma en esta región. Se necesitan más estudios para una mejor
comprensión del vínculo entre los ciclos de vida silvestre y doméstico de
este piroplasma.

Palabras clave
Piroplasma tipo Babesia microti
Theileria annae
Zorros rojos
Vulpes vulpes
Ixodes hexagonus
NO España

1 . Introducción

Los piroplasmas (Apicomplexa, Piroplasmida) son parásitos protozoarios

intraeritrocíticos de los géneros Babesia , Theileria y Cytauxzoon , que
pueden afectar a los carnívoros salvajes y domésticos ( Otranto et al.,
2015 ). En base a la morfología de los parásitos en los glóbulos rojos ,
los piroplasmas se han dividido tradicionalmente en piroplasmas grandes
(3-5 μm) y pequeños (0.5-2.5 μm). Aunque todas las formas grandes
reportadas hasta la fecha pertenecen al género Babesia , las
pequeñas Babesia spp. y Theileria spp. difícilmente se distingue
por microscopía ópticasolo (necesita un especialista), y se necesitan
técnicas moleculares basadas en ADN para su identificación precisa a
nivel de especie ( Irwin, 2010 ). En muchas partes del mundo, diferentes
especies de piroplasmas grandes y pequeños se han identificado
morfológica y genéticamente tanto en cánidos domésticos como
silvestres ( Cardoso et al., 2013 ).
El piroplasmosis por Babesia microti (Bml), generalmente considerado
como sinónimo de Theileria annae , es un piroplasma pequeño descrito por
primera vez en perros en España. Hoy en día, se considera que Bml
es endémica en el noroeste del país ( Camacho et al., 2001 ; García,
2006 ; Miró et al., 2015 ). Otros autores prefieren el nombre Babesia
vulpes debido a la alta prevalencia reportada en su hospedero natural, el
zorro colorado ( Vulpes vulpes ), y la aparente falta de una etapa de
infección preeritrocítica en los linfocitos ( Baneth et al.,
2015 ). Actualmente no está claro si el protozoario Bml pertenece al
géneroTheileria o Babesia , ya que todavía no hay evidencia de una etapa
infecciosa extraeritrocítica o de la falta de transmisión transovárica en las
garrapatas (características distintivas de Theileria spp.) ( Miró et al.,
2015 ). En este documento, nos referiremos a este piroplasma
como Babesia microti (Bml).
Cuando los perros están clínicamente infectados con Bml, muestran
signos clínicos graves, como membranas mucosas pálidas , anorexia,
apatía y fiebre. Los recuentos de glóbulos blancos indican anemia
regenerativa y macrocítica grave / hipocrómica y trombocitopenia
( Guitián et al., 2003 ; Miró et al., 2015 ). Si bien el vector de este
pequeño piroplasma aún no se ha identificado, se cree que se transmite
por garrapatas del género Ixodes como para muchos otros pequeños
piroplasmas. La garrapata erizo Ixodes hexagonus parece un candidato
probable debido a que las áreas endémicas de la infección Bml coinciden
estrechamente con su rango de distribución ( Camacho et al.,
2003 ). Aparte deI. hexagonus , el ADN Bml también se ha detectado en
otras especies de garrapatas como Ixodes ricinus ( Lledó et al., 2010 ) ,
Ixodes canisuga y Rhipicephalus sanguineuss en su lato ( Solano-Gallego
et al., 2016 ). Sin embargo, aún nos faltan datos para sugerir su
competencia como vectores para Bml.
Durante los últimos 10 años, Bml se ha detectado cada vez más en
carnívoros y se han recibido informes de su presencia en perros y zorros
en Europa y América del Norte. Utilizando técnicas moleculares, Bml
también se ha detectado en perros en España en regiones fuera de
Galicia, como Asturias ( Miró et al., 2015 ) o Barcelona ( Tabar et al.,
2009 ), y también en otros países, incluido Portugal ( Simões et al.,
2011 ), Croacia ( Beck et al., 2009 ), Suecia ( Falkenö et al., 2013 ),
Francia ( René-Martellet et al., 2015 ) y Estados Unidos ( Yeagley et al.,
2009)) Sin embargo, en la mayoría de estos estudios, el historial de viaje
de los perros era desconocido. Algunos autores han informado casos de
zorros infectantes Bml en el centro y norte de España ( Criado-Fornelio et
al., 2003 ; Gimenez et al., 2009 ), en algunos países europeos (Portugal
Croacia, Italia, Austria, Alemania y Hungría) ( Cardoso et al.,
2013 ; Duscher et al., 2014 ; Najm et al., 2014 ; Zanet et al.,
2014 ; Farkas et al., 2015 ), y en Canadá y EE. UU. ( Birkenheuer et al.,
2010 ; Clancey et al., 2010) Entre todas las especies de piroplasma
reportadas en Europa, Bml parece mostrar una fuerte preferencia por los
zorros. Por lo tanto, Bml es la principal especie de piroplasma confirmada
molecularmente en zorros, mientras que Babesia canis se ha identificado
muy pocas veces en estos animales ( Cardoso et al., 2013 ).
El zorro rojo es el carnívoro más común en Europa y muestra un gran
rango de distribución y tamaño de población. Las abundancias de zorro
en Europa dependen del hábitat, la alimentación, la estación, la
competencia con otras especies, otras enfermedades y medidas de
control (por ejemplo, la caza), así como las interacciones entre estos
factores.
Las estimaciones para la región de Galicia (NW España) sugieren una
densidad de población promedio de 2.7 zorras / km 2 en invierno, con las
densidades más altas (5.6 zorras / km 2 ) en áreas periurbanas cercanas
a grandes poblaciones humanas, como la industrial áreas, granjas,
mataderos y basurales incontrolados ( Fidalgo et al., 2009 ). En el centro
y sur de España, las densidades son más bajas que en el noroeste de
España (0.8 y 2.5 fox / km 2 , respectivamente) ( Gortázar, 1997 ). Las
abundancias locales de zorro se benefician de la presencia de
personas. En las zonas urbanas, la disponibilidad de alimentos y lugares
de descanso, la tolerancia humana y la ausencia de depredadores /
competidores hacen que el zorro rojo sea una especie muy exitosa
( Otranto et al., 2015).) La gran región de Galicia es especialmente
adecuada en términos de sus características demográficas y ecológicas
para la alta proliferación de zorros.
Algunos estudios han informado la incidencia y el manejo clínico de la
infección Bml en perros domésticos en el noroeste de España ( Camacho
et al., 2001 ; Miró et al., 2015 ; Checa et al., 2017 ) como el único área
endémica reconocida en Europa. En contraste con la situación de los
perros domésticos, la información sobre la ocurrencia y prevalencia de
piroplasmas en zorros rojos en el noroeste de España sigue siendo
limitada.
El presente estudio buscó examinar utilizando herramientas moleculares
la prevalencia de Bml y para describir las especies de garrapatas
(Ixodidae) que infestan zorros rojos en el noroeste de España.
2 . materiales y métodos

2.1 . Área de estudio, muestreo y recopilación de datos

En este estudio se incluyeron los cadáveres de 237 zorros colorados
silvestres aparentemente sanos encontrados en Galicia (noroeste de
España). Los zorros habían sido disparados durante la temporada oficial
de caza (por miembros de la Federación Galega de Caza y otras
sociedades cazadoras de esta región) en enero y febrero de 2016. No
más de 6 horas después de la muerte de cada animal, muestras de bazo
y sangre se obtuvieron. Durante la necropsia, se recogió sangre
o suero hemolizado utilizando una técnica estéril de la aurícula
derecha o la cavidad torácica y se colocó en tubos de EDTA para frotis
de sangre . Las muestras de bazo también se recogieron con
instrumentos estériles y se colocaron en tubos estériles para detectar
Bml siguiendo aislamiento de ADN genómico , PCR y secuenciación. Las
muestras de bazo se mantuvieron a -20 ° C y las muestras de sangre a
4 ° C hasta su procesamiento posterior.
En un archivo clínico, registramos: número de identificación, fecha, sitio
de captura, edad, sexo y presencia de ectoparásitos visibles . Los signos
clínicos también se evaluaron en el momento del muestreo, como los
cambios en el color de las membranas mucosas , la condición corporal,
la condición de la piel o la linfadenomegalia.
Las edades de los animales se estimaron de acuerdo con varios factores:
desarrollo corporal (completo o no), apariencia externa, etapa de
desarrollo de los genitales (externos e internos) y dentición (presencia,
desarrollo y desgaste de los dientes, enfermedad
periodontal). Establecimos tres grupos de edad: inmaduros o jóvenes,
definidos como individuos menores de 1 año de edad; adultos o zorros
entre 1 y 5 años con capacidad reproductiva; y adultos mayores zorros
mayores de 5 años, que muestran mayor desgaste de todos los dientes
y, a menudo, un grado variable de enfermedad periodontal o incluso
pérdida de dientes.
2.2 . Detección de parásitos microscópicos

Los frotis de sangre fina teñidos con Giemsa se examinaron

mediante microscopía óptica (LM) para detectar formas intraeritrocíticas
consistentes con pequeños merozoitos de Babesia . Los frotis se secaron
al aire, se fijaron en metanol absoluto durante 5 minutos, se tiñeron con
Giemsa al 20% y luego se observaron mediante microscopía óptica (LM)
usando un objetivo de aumento x1000 en aceite de inmersión. Todas las
muestras fueron examinadas por la misma persona.
De 237 muestras de sangre recogidas, se prepararon frotis de sangre a
partir de solo 68. Esto se debió a que la sangre no siempre se pudo
recoger en condiciones óptimas después de la muerte del animal por la
caza.
2.3 . Selección e identificación de garrapatas
Las garrapatas obtenidas de zorros después del examen clínico se
almacenaron en etanol al 70% en viales individuales para cada zorro. Las
garrapatas fueron identificadas a nivel de especie y sexuadas usando
claves morfológicas ( Gil Collado et al., 1979 ; Manilla e Iori,
1992 ; Estrada-Peña et al., 2004 ). Antes de aislar el ADN de las
garrapatas, se clasificaron según la etapa (adultos, larvas o ninfas) y el
grado de alimentación (hembras adultas hinchadas, ninfas alimentadas y
larvas alimentadas). En nuestro estudio, debido a restricciones
económicas, decidimos analizar solo garrapatas recolectadas de zorros
Bml-positivos.

2.4 . Aislamiento de ADN

ADN genómico se aisló a partir de bazo (10 mg) y de las garrapatas
utilizando el QIAamp ® Mini ADN kit (Qiagen ® , EE.UU.). El ADN de los
bazos se extrajo como se describe por el fabricante y se eluyó en agua
de calidad molecular (200 μl) y se almacenó a -20 ° C hasta su uso
posterior. Para aislar el ADN de las garrapatas se introdujeron algunas
modificaciones al protocolo original. Brevemente, cada garrapata se lavó
en etanol al 70% y luego una vez en agua destilada. Utilizando un bisturí
limpio y cuentas de acero inoxidable (Werfren, España), las garrapatas
se presionaron contra las perlas afiladas para derramar su contenido
abdominal. Cada muestra se mantuvo en 360 μl del tampón de
lisis tisular incluido en el kit y se trató con 40 μl de proteinasa K durante
la noche a 56ºC. ° C. Las etapas posteriores se llevaron a cabo de
acuerdo con las instrucciones del fabricante (protocolo de tejido).

2.5 . PCR anidada para detección de bml en muestras de bazo y garrapata

Las muestras de ADN de bazo y garrapata se mediante ensayos
específicos basados en PCR dirigidos al gen de la subunidad de ARN
ribosomal pequeño (18S rDNA), recientemente validado para la
detección de Bml, utilizando cebadores Babesia-Theileria universales BT1-
F y BTH-1R ( Criado-Fornelio et al., 2003 ) para la ronda de amplificación
primaria y los cebadores específicos de Bml BTFox1F y BTFox1R para la
segunda ronda de amplificación ( Bartley et al., 2016 ) ( Tabla 1 ). La
mezcla de reacción se adaptó a la descrita previamente por Bartley et
al. (2016) y las condiciones de amplificación fueron las siguientes; Se
añadieron 2 μl de ADN extraído a una mezcla de reacción de 23 μl que
contenía 0,75 unidades de ADN polimerasaTth Plus.5U / μl (Biotools B &
M Labs., SA, España), 200 μM (cada uno) deoxirribonucleótidos (dATP,
dTTP, dGTP, dCTP) (Biotools B & M Labs.), 10 pmol de cada cebador
(Invitrogen, EE. UU.), 2,5 μl 10X Tampón de PCR y MgCl _ {2 } 1,5
mM (Biotools B & M Labs.). Se incluyeron muestras de controlnegativas
(2 μl dH2O) y positivas ( B. canis y Bml DNA) en cada ensayo de
PCR. Las identidades de estos controles positivos se habían confirmado
previamente mediante amplificación por PCR, secuenciación y análisis
BLASTN del gen 18S rRNA. Las reacciones de amplificación para BML
PCR anidada específica se llevaron a cabo en un termociclador
GenAmp ® PCR System 2700 (Applied Biosystems, España). Se
realizaron 10 μl de productos de PCR en un gel de agarosa al 1,5% que
contiene SYBR Safe Gel Stain (Invitrogen, EE. UU.) y se visualiza con un
lector transiluminador oscuro (Clare Chemicals, EE. UU.).
Tabla 1 . Conjuntos de cebadores externos e internos utilizados para amplificar una región del gen
rRNA 18S del piroplasma de Babesia microti (Bml) .

Primer nombre Secuencia (5'-3 ')

BT1-F Universal Babesia-Theileria 5'GGTTGATCCTGCCAGTAGT 3 '
BTH-1R Universal Babesia-Theileria 5'TTGCGACCATACTCCCCCCA 3 '
BTFox1F (Bml) 5'AGTTATAAGCTTTTATACAGC 3 '
BTFox1R (Bml) 5'CACTCTAGTTTTCTCAAAGTAAAATA 3 '

2.6 . secuencia ADN

Productos de PCR correspondientes a la longitud esperada se purificaron

(15 l) usando un kit de purificación QIAquick (Qiagen ® ) como se
describe por el fabricante y se secuenció en el servicio de secuenciación
del departamento Genomics, UCM, utilizando un sistema ABI Prism 3730
(Applied Biosystems) .
Los archivos del cromatograma de secuencia se analizaron usando
Chromas 2.1.1 y se importaron en BioEdit v7.0.5 para edición,
ensamblaje y alineaciones. Las secuencias obtenidas se alinearon con
secuencias disponibles de GenBank usando Clustal W y se compararon
con secuencias de piroplasma adicionales disponibles de GenBank
usando el programa BLAST para determinar identidades porcentuales de
las secuencias generadas contra secuencias publicadas.

2.7 . análisis estadístico

Los resultados se analizaron utilizando el paquete de software SAS
versión 9.4. Las asociaciones entre la infección Bml (detectada por PCR)
y las variables categóricas restantes como la edad, el sexo, la condición
corporal, las garrapatas y la ubicación del zorro se evaluaron mediante la
prueba Chi-cuadrado. Los resultados moleculares se compararon con los
resultados de LM a través de coeficientes Kappa simples para evaluar el
acuerdo entre estas dos técnicas de diagnóstico. La significancia se
estableció en p ≤ 0.05.
3 . Resultados
3.1 . Diagnóstico molecular
De las 237 muestras de bazo examinadas por PCR específica para Bml ,
171 (72,2%) arrojaron resultados positivos. De estos, 14 muestras se
enviaron para la secuenciación con cebadores BTFox1F y
BTFox1R. Todas las secuencias mostraron 99-100% de identidad con
varios aislamientos delpiroplasma tipo B.microti ( Babesia annae , Babesia
cf. microti y Babesia Spanish dog aislate, números de acceso
KT580785.1, KJ871351.1 y EU583387.1 , respectivamente )
En este estudio, se recolectaron 816 garrapatas de 50 zorros con
resultado positivo para Bml. De estos, 616 garrapatas de 34 zorros con
resultado positivo para Bml se analizaron agrupados en 57 lotes según
su etapa (adultos individuales, grupos de hasta 100 larvas o grupos de
23 ninfas). Nueve de estos lotes fueron Bml positivos por PCR anidada
específica (BTFox1F / R): dos lotes de hembras adultas I. hexagonus (n =
2), cuatro grupos de ninfas alimentadas con I. hexagonus (n = 66) y tres
grupos de I. hexagonus alimentado larvas (n = 159). El ADN Bml no se
detectó en otras garrapatas especies analizadas (I. ricinus y D. reticulatus)
(Archivo adicional). De 34 zorros que dieron positivo para Bml, se
recolectaron 616 garrapatas: se obtuvieron resultados positivos de Bml
PCR en 55.6% (227/408) de garrapatas recolectadas de 9 zorros,
mientras que 208 garrapatas de los 25 zorros infectados restantes
arrojaron resultados de PCR negativos. Además, el 6,4% (2/31), el 23,5%
(4/17) y el 37,5% (3/8) de los grupos de adultos, ninfas y larvas fueron
Bml positivos, respectivamente.

3.2 . Microscopía
De las 237 muestras de sangre obtenidas, solo 68 fueron válidas para
el examen de microscopía óptica . Debido a que en la mayoría de los
zorros, la muestra de sangre después de la muerte no se recogió en
condiciones estériles o se coaguló.
Los cuerpos intraeritrocíticos en forma de anillo, morfológicamente
compatibles con pequeños piroplasmas, fueron detectados por LM en 26
de las 68 muestras de sangre (38.2%).
Observamos mala concordancia entre un resultado positivo de LM y
PCR. El valor de kappa fue bajo (0,213, acuerdo justo), lo que indica un
acuerdo del 54,4% y una discrepancia del 45,6%. Todos los frotis de
sangre LM positivos fueron PCR positivos. Sin embargo, 31 zorros que
probaron LM negativo para Bml fueron PCR positivos para el parásito.

3.3 . Epidemiología
Zorros de prueba Bml positivos se distribuyeron ampliamente en toda
Galicia ( Fig. 1 ). Así, se detectó Bml en el 61% (36/59) de los zorros de
la costa noroeste (provincia de A Coruña), en el 70,9% (56/79) de los
zorros de la costa suroccidental (provincia de Pontevedra) y en el 79,8%
( 79/99) de los zorros del noreste de Galicia (provincia de Lugo). Por
regiones geográficas, se observaron diferencias significativas entre las
provincias de Lugo y A Coruña (p = 0,037), siendo la prevalencia de Bml
la mayor en zorros de Lugo (79,8%).

Fig. 1 . Distribución geográfica de Bml en zorros rojos en el noroeste de

España (Galicia). (Para la interpretación de las referencias al color en
esta leyenda de la figura, se remite al lector a la versión web de este
artículo).
Orotemperato = T 3-7 ° C; m -7 a -4 ° C; M 0-3 ° C
Supratemperato = T 7-12 ° C; m -4 a 2 ° C; M 3-10 ° C
Mesotemperato = T> 12 ° C; m> 2 ° C; M> 10 ° C
Oromediterranean = T 4-8 ° C; m -7 a -4 ° C; M 0-3 ° C
Supramediterráneo = T 8-13 ° C; m -4 a -1 ° C; M 3-8 ° C
Mesomediterráneo = T 13-17 ° C; m -1 a 5 ° C; M 8-14 ° C
Parámetros de temperatura: T = temperatura mensual promedio; m =
temperatura promedio de los mínimos del mes más frío; M =
temperaturas promedio de los máximos del mes más frío.

De los 237 zorros examinados, 125 mujeres y 112 hombres, 67 fueron

clasificados como jóvenes, 143 como adultos y 27 como zorros adultos
mayores. Los puntajes de condición corporal (de 5 puntos) en 197 zorros
variaron de 1 a 4, con una mediana de 2.9 puntos. En base a los
resultados de PCR específicos de Bml, 95 (76%) mujeres y 75 (67.9%)
hombres fueron positivos. Entre estos zorros con resultado positivo, 52
(77.6%) eran jóvenes, 102 (71.3%) eran adultos y 17 (63%) eran adultos
mayores. Los puntajes de condición corporal en zorros infectados con
Bml fueron de 1-2 en 41 (74.5%), 3 en 76 (71.7%) y 4 en 20 (55.6%) de
los animales. No hubo diferencias significativas en la prevalencia de Bml
entre los sexos (p = 0,16), y entre los grupos de edad (p = 0,34) o los
grupos de puntuación de la condición corporal (p = 0,21).
De 837 garrapatas de cuatro especies diferentes recolectadas, 72%
fueron larvas, 21.5% fueron ninfas y 6.5% fueron adultos. El número
mínimo y máximo de garrapatas en un solo zorro fue uno y 212
garrapatas, respectivamente. Las larvas de Ixodes hexagonus fueron las
formas predominantes detectadas. Estas garrapatas fueron identificadas
como I. hexagonus (90.7%), I. ricinus(1.3%),
Dermacentor reticulatus(1.3%), Rhipicephalus sanguineus (0.3%)
e Ixodes spp. (6.3%) ( Fig. 2 ).
Fig. 2 . Distribución geográfica de garrapatas recolectadas de zorros
rojos ( Vulpes vulpes) en tres provincias de Galicia (noroeste de
España). (Para la interpretación de las referencias al color en esta
leyenda de la figura, se remite al lector a la versión web de este artículo).

De 139 de los 237 zorros que podrían ser examinados externamente, 57

garrapatas albergadas (41%) ( Tabla 2 ). Mientras que 87.7% (50/57) de
los zorros con garrapatas fueron Bml positivos, 76.8% (63/82) de los
zorros sin infestación de garrapatas resultaron Bml positivos. No se
encontraron diferencias significativas en la infección Bml según la
infestación por garrapatas (p = 0.1). Ixodes hexagonus fue la garrapata
más abundante entre los zorros (82,4%; 47/57) y se identificó en 41 de
los 50 zorros infectados Bml (82%). Sin embargo, no se observó una
relación significativa entre los zorros infectados y la presencia de I.
hexagonus (p = 0,8). Menos abundantes entre los zorros fueron D.
reticulatus (12.3%; 7/57), I. ricinus (12.3%; 7/57) y R. sanguineussl (3.5%;
2/57). Además, 5.2% de los zorros tenían Ixodes spp. larvas (no
identificadas a nivel de especie).

Tabla 2 . Infección por Babesia microti e infestación por garrapatas en zorros rojos ( Vulpes
vulpes ) según se determina mediante PCR específica en muestras de bazo y garrapata.

Zorros Ticks
Garrapatas, De los zorros Resultados
especie (PCR Total positivos
Analizado
positivos
No.
+)
No. Etapas No. Etapas No. Etapas No. Etapas
32F, 1M, 28F, 1M, 22F, 2F,
I. hexagonus 47 41 759 177N, 741 163N, 606 146N, 227 66N,
549L 549L 438L 159L
7F, 3N, 7F, 3N,
I. ricinus 7 7 11 11 5 4F, 1N 0 0
1L 1L
Dakota Dakota Dakota Dakota
Ixodes spp. 3 3 53 53L 53 53L del del del del
Norte Norte Norte Norte
D. reticulatus 7 6 11 8F, 3M 10 7F, 3M 5 5F 0 0
Dakota Dakota Dakota Dakota
R.
2 1 3 2F, 1M 1 1F del del del del
sanguineussl
Norte Norte Norte Norte
49F, 5M, 42F, 4M, 31F, 2F,
Total 57a 50 a 837 180N, 816 166N, 616 147N, 227 66N,
603L 603L 438L 159L

4 . Discusión
Los hallazgos de este estudio indican claramente la amplia presencia de
ADN Bml en la población de zorro rojo del noroeste de España. Se
encontraron animales cazados que dieron positivo para
este piroplasma en todas las regiones de Galicia, excepto en la provincia
de Ourense, donde no se tomaron muestras de zorros.
Hasta donde sabemos, este es el primer estudio para abordar la
infección Bml en zorros salvajes en Galicia. Esta región noroeste de
España fue la primera área donde se informó que la infección Bml
causaba enfermedad grave en perros ( Camacho et al., 2001 ; García,
2006 ). Se informó sobre perros infectados posteriores de Croacia y
Portugal ( Simões et al., 2011 ; Farkas et al., 2015 ). Hoy, noroeste de
España es la principal área considerada endémicade la infección Bml en
perros, que rara vez se detecta en las áreas vecinas ( Miró et al.,
2015 ). El interés en este parásito emergente entre los carnívoros
salvajes ha aumentado recientemente ( Clancey et al., 2010 ; Cardoso et
al., 2013 ;Baneth et al., 2015 ). La infección por Bml en zorros se
describió por primera vez en dos estudios independientes realizados en
el norte (provincia de Burgos) y el centro de España (provincia de
Guadalajara), donde el 20% (1/5) y el 50% (5/10) de los zorros resultaron
positivos, respectivamente ( Criado-Fornelio et al., 2003 ; Gimenez et al.,
2009 ). Más recientemente, en un estudio llevado a cabo en dos regiones
del norte de España (País Vasco y región de Asturias), Bml fue el único
hemoparásito detectado en 35.4% (17/48) de los zorros rojos analizados
( Barandika et al., 2016)) Sin embargo, estas cifras pueden no reflejar las
prevalencias actuales en toda España, ya que se tomaron muestras de
un número muy bajo de zorros. En este estudio más amplio, detectamos
una prevalencia de Bml en zorros rojos del 72,2% (171/237), que es más
alta que las prevalencias reportadas en estudios españoles previos y
más similar a la reportada para zorros en Portugal (69.2%) ( Cardoso et
al., 2013 ).
El piroplasma tipo Babesia microti se está detectando cada vez más en
zorros en Europa y se ha informado en 50% de zorros en Austria
( Duscher et al., 2014 ), 46,4% en Alemania ( Najm et al., 2014 ), 20% en
Hungría ( Farkas et al., 2015 ), 14.6% en Gran Bretaña ( Bartley et al.,
2016 ), 5.2% en Croacia ( Dezdek et al., 2010 ) y 0.98% en Italia ( Zanet
et al., 2014 ) . Además, el protozoo también se ha detectado en zorros en
América del Norte ( Birkenheuer et al., 2010 ; Clancey et al.,
2010).) Estos hallazgos sugieren que los zorros rojos son un reservorio
importante de Bml en España y otros países europeos y también en los
EE. UU.
Nuestros datos epidemiológicos indicaron que no existe correlación entre
la infección por Bml y la edad, el sexo o el estado corporal de los zorros
rojos examinados. Bartley et al. (2016) describieron un mayor porcentaje
de zorros machos infectados que hembras, mientras que nuestros datos
apuntan a las hembras más afectadas, aunque las diferencias no fueron
significativas en ninguno de los casos. Las edades positivas del zorro (es
decir, los animales más jóvenes) están de acuerdo con las observaciones
de Zanet et al. (2014) en zorros en Italia. Otros autores también han
informado un mayor riesgo de infección Bml en perros más jóvenes en
áreas endémicas ( Miró et al., 2015) Los perros de caza están en
estrecho contacto con zorros rojos en áreas con una alta densidad de
este carnívoro salvaje como el noroeste de España. Ambas especies de
animales comparten el mismo hábitat y pueden tener contacto directo
durante las actividades de caza. En efecto, se ha descrito una mayor
prevalencia de Bml en la caza que en los perros de compañía o guardia
( Guitián et al., 2003 ; Miró et al., 2015 ). La transferencia de parásitos de
carnívoros salvajes a domésticos y viceversa depende principalmente de
las variantes ecológicas que caracterizan a un área determinada. Por
ejemplo, la caza podría promover el contagio de infecciones
parasitarias de cánidos domésticos y felinos a poblaciones silvestres
( Otranto et al., 2015 ).
En nuestro estudio, se encontraron cuatro especies de garrapatas
infestando zorros: I. hexagonus , I. ricinus , D. reticulatus y R. sanguineus sl.
Sin embargo, con mucho, las garrapatas más numerosas encontradas en
los zorros rojos en el noroeste de España fueron las etapas inmadura y
adulta de I. hexagonus. Estos hallazgos son similares a los de otro estudio
en el norte de España en el que los zorros rojos fueron parasitados
principalmente por I. hexagonus ( Barandika et al., 2016 ). Prevalencia
similar de esta garrapata ha sido proporcionada por grandes estudios
realizados en Rumania y en países con un clima húmedo del Atlántico
(Reino Unido o norte de Alemania) ( Sándor et al., 2017) Las condiciones
climáticas y ambientales en el norte y el noroeste de España (climas
húmedos) son capaces de soportar altas cargas de
garrapatas ixodídicas ( Barandika et al., 2006 ). En base a las áreas
coincidentes de altas prevalencias de Bml e I. hexagonus en España, esta
garrapata ha sido sugerida como el vector de Bml ( Camacho et al.,
2003 ). En nuestro estudio, la alta proporción de I. hexagonus entre
garrapatas recolectadas de zorros rojos sugiere su probable papel como
vectores de piroplasma tipo B. microti en esta región. Sin embargo, esta
especie de garrapata no se conoce en otros países europeos donde se
ha informado de la infección Bml en zorros como Croacia ( Beck et al.,
2009).) o los EE. UU. Esto plantea la posibilidad de vectores distintos
de I. hexagonus . Se necesitan más estudios para identificar otros posibles
vectores o rutas de transmisión para Bml particularmente en regiones en
las que I. hexagonus está ausente.
Examinamos la infección por Bml por PCR y LM en el bazo y muestras
de sangre obtenidas de 68 zorros en el noroeste de España. Nuestros
resultados indican una mala concordancia entre la observación directa
del parásito y la PCR (54,4% de las muestras). Miró et al. (2015) notaron
un acuerdo moderado (valor Kappa: 0.6680) entre LM y PCR en
muestras de perros analizados en la fase clínica de la infección Bml
cuando la observación microscópica de piroplasmas es más fácil que en
animales con baja parasitemia niveles debido a la enfermedad
crónica. Por LM, solo pudimos detectar cuerpos en forma de anillo
intraeritrocíticos que eran morfológicamente compatibles con piroplasmas
pequeños en 26 (38.2%) de las 68 muestras de sangre. En contraste, el
ADN Bml fue detectado por PCR en 57 (83.8%) de las 68 muestras de
sangre. En un estudio similar, la PCR pudo detectar el parásito tanto en
una etapa más temprana de la infección como en etapas posteriores,
cuando los niveles de parasitemia son bajos y los frotis de sangre
delgados teñidos con Giemsa sonnegativos ( Fukumoto et al., 2001 ). De
hecho, el enfoque molecular se ha propuesto como el método estándar
de oro para la detección de pequeñas infecciones por piroplasma ( Miró
et al., 2015).) En consecuencia, utilizando la prueba de diagnóstico
molecular, se detectó un mayor número de zorros positivos para la
infección Bml (57/68, 83,8%) en animales sometidos a prueba mediante
ambas técnicas.
Todos los frotis de sangre positivos mostraron un bajo nivel de
parasitemia. Esto podría explicarse por la ausencia de signos clínicos
compatibles con la infección Bml observada en los zorros con resultado
positivo. Todos los zorros examinados externamente mostraron un buen
estado clínico de acuerdo con estudios previos ( Cardoso et al.,
2013 ). Hasta la fecha, no hay datos disponibles sobre los impactos
clínicos en los zorros, y más estudios serían útiles para definir el impacto
clínico de la infección Bml en zorros rojos.
5 . Conclusiones
Nuestros hallazgos indican que el piroplasma tipo B. microti está muy
extendido entre los zorros rojos en el noroeste de España, y sugieren
que las prevalencias de infección por Bml en zorros son algo más altas
que las registradas en perros de la misma región.
Nuestras observaciones también apuntan a I. hexagonus como
el vector más probable para la propagación de Bml a los zorros y otros
carnívoros, incluidos los perros en el noroeste de España. Sin embargo,
no debemos subestimar la posibilidad de que otros tics o modos de
transmisión puedan jugar un papel importante en la transmisión de Bml
en otras regiones donde esta especie de garrapata está ausente. Debido
a su hábitat suburbano, su capacidad de adaptación y su amplia
distribución geográfica, el zorro rojo es la clave en la difusión de Bml en
toda Europa.
Expresiones de gratitud
Los zorros rojos utilizados en este estudio fueron proporcionados por los
Centros de Recuperación de Vida Silvestre de Galicia, la Dirección Xeral
de Patrimonio Natural (Xunta de Galicia, España) y la
Federación Galega de Caza.
Apéndice A . Dato suplementario
La siguiente es información suplementaria a este artículo:

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