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TARAPOTO - PERÚ
2014
MANUAL DE PRÁCTICAS:
“MICROBIOLOGÍA AGROINDUSTRIAL”
Finalmente, y como ésta es una primera edición, el autor ruega y quedará muy
agradecido a los lectores que lo informen de cualquier errata u omisión observada.
Agroindustrial.
INTRODUCCIÓN A LA SEGUNDA EDICIÓN
Siempre respetando los métodos y las técnicas ya propuestas, más los conocimientos
adquiridos a lo largo demás de una década en los análisis microbiológicos de los
alimentos, sumados a estos la enseñanza impartida a través de la asignatura de
Microbiología Aplicada; queremos de esta manera llegar a los estudiantes de la
Facultad de Ingeniería Agroindustrial de la Universidad Nacional de San Martín -
Tarapoto, personas interesadas y público en general, y así aumentar los
conocimientos en el campo microbiológico.
Página
Introducción
Índice General
:
5
Índice de Prácticas
:
6
Instrucciones de Laboratorio
:
8
PRÁCTICA Nº 01
:
11
PRÁCTICA Nº 02
:
15
PRÁCTICA Nº 03
:
18
PRÁCTICA Nº 04
:
24
PRÁCTICA Nº 05
:
27
PRÁCTICA Nº 06
:
30
PRÁCTICA Nº 07
:
38
PRÁCTICA Nº 08
:
48
PRÁCTICA Nº 09
:
50
PRÁCTICA Nº 10
:
53
PRÁCTICA Nº 11
:
57
Referencias Bibliográficas
:
60
ÍNDICE DE PRÁCTICAS
Página
:
18
:
27
:
30
:
48
:
57
INSTRUCCIONES DE LABORATORIO
3) No coma, beba o fume en el área del laboratorio, siempre evite el contacto de las
manos con la boca, nariz, ojos, etc.
5) Las carteras, libros y demás útiles colóquelos en las gavetas individuales u otro
lugar, nunca sobre las mesas de trabajo.
6) Antes de cada sesión de trabajo, limpie el área con desinfectante y luego lave las
manos.
7) Coloque las pipetas usadas en los recipientes destinados para tal fin.
10) Para centrifugar materiales tóxicos o infecciosos use únicamente tubos con tapa.
13) Identifique su material de trabajo con Nº, fecha, experiencia y demás datos.
- Título
- Introducción
- Objetivo (s)
- Revisión de literatura
- Materiales y métodos
- Resultados
- Discusión
- Conclusiones
- Referencias Bibliográficas
- Anexos.
1) TÍTULO.
El título debe dar una idea precisa de la naturaleza del trabajo; debe ser claro y
breve.
2) INTRODUCCIÓN.
La introducción sirve para suministrar al lector los antecedentes, razones,
implicaciones y otros aspectos que permitan conocer la naturaleza y finalidad del
trabajo. Por ello una buena introducción debe reseñar brevemente los siguientes
aspectos:
- Importancia y naturaleza del estudio.
- Propósito.
- Relación con otros estudios.
- Limitaciones del trabajo.
3) OBJETIVO (S).
Se deben describir con precisión los propósitos de la práctica. Algunos lo
incluyen al final de la introducción.
4) REVISIÓN DE LITERATURA.
En esta parte se dan a conocer los hechos, opiniones o sugerencias de otros
autores relacionados al tema de trabajo.
Por materiales se tiene por ejemplo: procedencia del material, lugar de las
experiencia, período de trabajo, dosis empleada, equipos e instrumentos,
productos químicos, etc.
6) RESULTADOS.
Los resultados, son la presentación de los hechos obtenidos hasta la terminación
de la experiencia. Esta presentación debe hacerse en un orden lógico,
agrupando bien los diversos resultados.
Conviene tener presente que los resultados se limitarán a los datos obtenidos,
sean estos positivos o negativos. No se debe incluir suposiciones, conjeturas o
posibles datos en otras circunstancias. No se puede especular. En esta parte se
puede incluir cuadros estadísticos, tablas, ilustraciones (fotografías, mapas,
gráficos, dibujos).
7) DISCUSIÓN.
Ésta, es la parte más importante del informe, es considerada como la
sustentación del trabajo. Es la parte central del escrito y en ella se refleja la
personalidad, capacidad y madurez intelectual de la autor.
8) CONCLUSIONES.
Es una puntualización de las generalizaciones, sugerencias y deducciones que
emanan del trabajo. Las conclusiones tienen que basarse en hechos
comprobados; tendrán claridad si se agrupan en un orden lógico y se enumeran.
A continuación se algunos ejemplos:
9) REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
Es la enumeración de las publicaciones consultadas y citadas. Los elementos
principales y el orden de una referencia o cita bibliográfica son las siguientes:
Autor, Año de Publicación, Título de la publicación, Número de la edición, Casa
editora, lugar de publicación, paginación.
10. ANEXOS.
PRÁCTICA Nº 01: MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN.
Calor, Filtración, Humedad y Desecación, Radiaciones, Agentes
Químicos.
I. INTRODUCCIÓN.
Los laboratorios relacionados con estudios microbiológicos por lo menos debe contar con
equipos básicos tales como: Autoclave, Estufas (de incubación y de esterilización),
refrigerador, Microscopio, balanza.
Para los trabajos microbiológicos, se requiere contar con anterioridad al desarrollo del
experimento, contar con instrumentos limpios y sobretodo estériles; por lo tanto es
necesario la preparación y esterilización de éstos por anticipado.
Se entiende por ESTERILIZACIÓN a todo tratamiento de todo material con un agente físico
o químico que conlleve a la eliminación de toda forma de vida en él. La inactivación parcial
o la esterilización, se puede lograr de diferentes maneras: Por medio de calor (húmedo y
seco), Por filtración, por humedad y desecación, Por radiación, y Por agentes químicos.
II. OBJETIVOS.
- Conocer el fundamento de los métodos de esterilización.
- Conocer los equipos con que cuenta el laboratorio, y los que se utilizan para
esterilización.
- Conocer los materiales de vidrio, básicos para el uso en un laboratorio de microbiología.
- Aprender a preparar los materiales de vidrio y medios de cultivo para su esterilización.
Materiales.
-Equipos: Autoclave, Horno, Estufas (incubación, esterilización), Baño María, Cámara luz
UV.
-De vidrio: Tubos de ensayo, placas petri, pipetas de 1, 2, 5,10 mL., matraces de 100,
250, 500, y 1000 mL.
-Otros: Mecheros, asa bacteriológica, algodón, hilo pabilo, papel kraft, gradilla, tijera,
fósforo, detergente, jabón, lapicero rotulador, escobilla, toalla.
Procedimiento.
A) ESTERILIZACIÓN POR MEDIO DEL CALOR. El efecto del calor sobre los
microorganismos está en relación con el grado de humedad del ambiente de
esterilización y es calor que se propaga es por conducción, convección y radiación;
de ello se distingue dos métodos muy usados. CALOR HÚMEDO: Pasteurización,
Tindalización, Ebullición y Vapor a presión en autoclave y CALOR SECO: Estufa de
Esterilización, Fuego directo al rojo vivo e Incineración.
Autoclave y manejo. Equipo que consta de una caldera de cobre cubierta por cobre y
estaño y protegida por una camiseta metálica de acero inoxidable formando paredes
dobles.
En la base posee una fuente de calor eléctrica (resistencia), por encima de ésta se
encuentra un recipiente con la base cribado para la salida de vapor y al mismo tiempo
sirve para colocar los materiales, en la parte superior posee una tapa de bronce con
un dispositivo alrededor que permite un cierre hermético además de contener tornillos
para evitar la salida de vapor.
La tapa en la parte externa también posee una válvula de seguridad que funciona
cuando la presión interna excede; Una espita, que permite la salida del aire frío al
inicio del calentamiento; un barómetro, para medir la presión; un termómetro, para
temperatura.
Vapor Fluente. Su acción es similar a la del agua a 100°C, se usa mucho en los
laboratorios para esterilizar medios de cultivo que llevan sustancias que se puedan
alterar a temperaturas superiores; se hace actuar sobre el material un chorro continuo
de vapor de agua por 30 a 60 minutos, el vapor debe ser obtenido a 100°C no más.
Las membranas que son utilizadas como filtros son de amianto o de acetato de
celulosa cuya porosidad fluctúa de 0.005 a 1 um. De diámetro; muy útiles en la
esterilización de medios líquidos, soluciones de albúmina, soluciones de antibióticos y
otras sustancias que pueden ser alteradas por acción de calor.
Cuando se utiliza luz UV., es muy importante que las lámparas sean limpiadas
periódicamente con alcohol y se verifique su efectividad con cierta frecuencia. Para la
aplicación de luz UV., es necesaria una adecuada protección personal en particular
de los ojos y manos. Se utilizan lámparas generadoras de luz UV., y las radiaciones
UV comprendidas entre 210 y 328 nm. tienen acción bactericida pero esporicida; la
longitud de onda más eficaz es a 3300 angstrom.
D. AGENTES QUÍMICOS. Los que destacan son los bacteriostáticos y los bactericidas.
IV. CUESTIONARIO.
I. INTRODUCCION.
El cuerpo humano es una gran superficie cutánea y mucosa por la que entra en contacto
con el medio ambiente. En la superficie existen diversos sectores, donde residen
microorganismos con diferentes características de humedad, temperatura, pH y
disponibilidad de nutrientes.
La flora basal es la característica de cada sector del organismo y está constituida por
gérmenes que siempre están presentes en ese sector. Por ejemplo, Staphylococcus
epidermis en la piel, la Escherichia coli, en el intestino. En cambio la flora transitoria es
variable de un ser humano a otro y está compuesta por gérmenes que colonizan en forma
intermitente un determinado sector; esta flora puede incluir bacterias potencialmente
patógenas para el propio individuo u otras personas que entran en contacto con él.
La morfología de las bacterias es importante porque permiten distinguir las diversas formas,
bacilar, cocos, espirilos, espiroquetas, sarcinas, diplococos, etc. Se debe tener mucho
cuidado al preparar la muestra de alimento, la fijación por aplicación de calor a la lámina
porta objeto luego la coloración, teniendo en cuenta elementos estructurales básicos que
son necesarios para su identificación, como, por ejemplo: pared celular, cápsula, espora,
flagelos, Gram, etc. y así poder lograr una buena observación de la morfología bacteriana.
El conjunto de elementos que constituyen un hongo se denomina talo, el talo puede ser
unicelular (en levaduras): en los mohos el talo incluye una parte vegetativa, el micelio,
compuesta por hifas y una parte reproductora. Las hifas son tubos que contienen núcleo y
citoplasma. El micelio puede ser tabicado y no tabicado.
El crecimiento saprofítico de los hongos puede ser dañino y causar cuantiosas pérdidas si
ocurre en materias primas industriales, además producen micotoxinas altamente
toxigénicos y en algunos casos carcinógenos; son importantes en las fermentaciones
industriales para la producción de cerveza, vino, pan, antibióticos, vitaminas y ácidos
orgánicos.
II. OBJETIVOS.
- Adiestrar al estudiante en el cultivo de microorganismos (bacterias y hongos).
- Conocer la diversidad de microorganismos que están presentes en el medio ambiente.
Materiales.
Equipo: Microscopio
Material de vidrio: Placas Petri, laminas portaobjeto, laminas cubreobjetos.
Colorante para tinción: solución de cristal violeta 1%, solución de safranina, solución de
azul de metileno al 1 %.
Otros: medios de cultivo, mechero de alcohol, asa bacteriológica, aceite de inmersión,
pinzas de madera, fosforo y detergente
Muestras de alimentos: yogurt, vinagre, frutas y verduras.
Procedimiento.
La observación macroscópica de los microrganismos, se realizarán observando la
morfología de las colonias que crecen en los medios de cultivo; y la observación
microscópica, se realizaran en muestras fijadas y teñidas.
Abrir las placas con el medio de cultivo y recorra el ambiente del laboratorio, cierre las
placas e incubar en la estufa o lo que indique el profesor. Observar el crecimiento de los
microorganismos sobre el medio de cultivo con la ayuda de una lupa o a simple vista.
- Disolver una pequeña cantidad de muestra con una gota de agua en una lámina porta
objeto y entender
- Dejar secar y fijar con calor.
- Teñir con un colorante cualquiera de los mencionados durante 1-2 minutos.
- Observar al microscopio.
- Disolver una pequeña cantidad de muestra con una gota de agua en una lámina
porta-objeto y extender.
- Dejar secar y fijar con calor.
- Teñir con un colorante de los mencionados 1-2 minutos
- Observar al microscopio.
IV. CUESTIONARIO.
I. INTRODUCCIÓN.
Existe un conjunto de microorganismos que integran la flora microbiana del intestino del
hombre y de los animales, representados por millones de bacilos Gram negativo no
esporulados, que se encuentran también en las excretas, aguas, pastos, suelos,
alimentos y vegetales al estado normal y en descomposición, etc.
Algunos autores afirman que la tercera parte de las excretas normales y secas, de
origen humano, se componen de bacterias, en su mayoría muertas; de las cuales 9/10
partes de ellas corresponden a las denominadas bacterias Gram negativas, que en casi
su totalidad de las Enterobacteriaceae y el décimo restante por microorganismos Gram
positivos. Si esta proporción ha sido considerado en un individuo que consume un
régimen alimenticio normal y mixto, es de suponer la alteración que sufriría esta
relación por variación de la dieta, por la implantación de estos dos patológicos y
disturbios intestinales, cuyos agentes son precisamente, los miembros de esta familia,
agrupados en las tribus: Salmonella, Shigella, Proteus , y Colibacilo, que integran
numerosos géneros y especies.
II. OBJETIVO.
OXIDASA (Ox)
Llamada también Citrocromo Oxidasa; Es una enzima por la cual las bacterias que las
poseen, oxidan la tetrametil-para-fenil-endiamina en Indol (azul).
Prueba
En una placa petri colocar un papel de filtro, humedecer este con el reactivo de
Kovacs (solución de tetrametil-parafenil-endiamina al 1% en agua destilada).
Preparar el reactivo inmediatamente antes de usarlo, debido a que se oxida con el
aire y la luz. En la parte humedecida hacer una estría de cultivo joven (18 a 24 horas
de incubación) de más o menos 5 mm. de longitud considerar la prueba como
positiva, si en 5 segundos aparece un color azul intenso. Las enterobacterias no
deben dar esta reacción.
Prueba
Sembrar el germen a estudiar en agar o caldo nutritivo que contenga además 1/1000
de Nitrato de Potasio. Después de incubar a 37º/24 horas, añadir gotas de solución A
y de solución B (Reactivo de Gries) o en su defecto reactivo sólido formado por ácido
sulfanílico, ácido tartárico, y alfa-naftil-amina.
La prueba es positiva si aparece color rojizo en ambos casos. Sino aparece dicha
coloración agregar sobre el cultivo que contiene el reactivo, Zn o Mg en polvo;
observar después de 10 minutos si la coloración es rojiza, considerarla como
negativa ya que en el caso, son el Zn, Mg, y no el germen, es el que se ha reducido
en nitratos.
Prueba y lectura.
Prueba
Como medio de cultivo se utiliza un medio semi-sólido (agar nitratado que lleva 3%
de agar) distribuidos en tubos de "U" la siembra se realiza por puntura, introduciendo
la aguja de Kolle 5 mm de profundidad, sólo en una de las ramas.
Lectura
Después de incubar a 37ºC por 24 horas, considerar la prueba positiva, si un
enturbiamiento se extiende desde la rama cultivada a la otra.
KNO3: Fuente de Oxígeno, necesaria para la movilidad del germen aerobio.
Las enterobacterias que utilizan el Citrato de Sodio como única fuente de Carbono,
alcalinizan el medio agar Citrato de Simmons, haciendo virar el indicador azul de
bromo timol, del verde al azul intenso.
- Realizar siempre la siembra a partir de un medio sólido porque con medio líquido
se arrastraría restos de materia orgánica.
Lectura
Prueba positiva: Disco blanco en la superficie del medio.
Prueba negativa: Turbidez en la parte inferior, con una superficie completamente
transparente, o ausencia total de desarrollo.
Prueba. Esta prueba se realiza en el medio de Taylor, que lleva glucosa, lisina y
púrpura de bromocresol como indicador del medio.
V. CUESTIONARIO.
1) Porqué las bacterias gramnegativas retienen el colorante de contraste, durante la
coloración Gram.
2) Mencione diferencias entre bacterias Gramnegativas y bacterias grampositivas.
3) Describa a las bacterias entéricas y nombre a los géneros más representativos,
dando características de cada uno de ellos.
4) Mencione las enfermedades que ocasionan algunos géneros de la familia
Enterobacteriaceae.
DIV GRUPO Ox Ni G L U Mo C I S K A D
1 Shigela - + + - - - - - - - - -
Alkalencens-Dispar - + + +- - - - + - - - +-
Escherichia
- + +g +- - +- - +- - - - +-
2 Salmonella - + +g - - +- + - - +- - +*
Arizona - + +g -+ - + + - + - - +
Citrobacter - + +g +- - + + - + + - -
Bethesda-Ballerup - + +g - - + + - + + - -
3 Enterobacter - + +g + -+ + + - - + - +-
Hafnia - + +g - -+ - + - -+ + - +
Klebsiella - + +g +- + - + -+ - + - +
Serratia + +g -+ - + + - - + - -
4 Proteus vulgaris - + +g - + + +- + + + + -
Proteus mirabilis - + +g - + + +- - + + + -
Proteus morgani - + +g - +- + - + - + + -
Proteus rottgeri - + +g - -+ + + + - + + -
Providencia - + +g - - + + + - + + -
I. INTRODUCCIÓN.
Muestra y Transporte
Estos alimentos usan como empaque para su venta, envases tales como: Botellas,
bolsas, cajas, etc.
Transporte de las muestras.- Esta operación debe variar en lapsos de tiempo 6-12 horas
antes de iniciarse el análisis, y mantener en refrigeración a rangos de 3 a 5ºC.
Muestreo en la fábrica o planta: La extracción de la muestra será efectuada por personal
profesional o un técnico bien entrenado, y cada vez que se realice el muestreo, la
muestra irá acompañada de su informe con los siguientes datos:
- Procedencia de la muestra.
II. OBJETIVO.
III.MATERIALES Y MÉTODOS.
1. Materiales.
- Solución salina peptona (S. S. P.)
- Agar Recuento u otro similar
- Matraces de 100, 250, 500 ml.
- Pipetas de 1, 2, 5, 10 ml.
- Tubos de prueba de 12 x 160mm
- Placas petri grandes
- Mecheros
- Muestra de alimentos.
2. Métodos.
IV. CUESTIONARIO.
1. Porqué se utiliza Solución Salina Peptonada (SSP), o suero Fisiológico en la
preparación de diluciones?.
2. Cuál es la importancia de las diluciones?.
3. Para la toma de muestras de alimentos sólidos, líquidos, semilíquidos, gaseosos;
¿Qué materiales utilizaría?. De ejemplos de estos tipos de alimentos.
4. Fundamente, Porqué utilizaría y en qué casos, siembra por Incorporación,
siembra por Extensión, siembra por Estrías; en los Análisis microbiológicos de
los alimentos?.
PRÁCTICA Nº 5. PRUEBAS MICROBIOLÓGICAS MÁS USADAS EN EL
CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LOS ALIMENTOS
(Expresión Microbiológica de la población microbiana de los
alimentos. Microorganismos Indicadores. Microorganismos
Indicadores de la Higiene Inadecuada: Bacterias Aerobias
Mesófilas Viables).
I. INTRODUCCIÓN.
2) Microorganismos Indicadores
De tal manera que existen grupos de microorganismos que nos indican por ejemplo
mal procesamiento, deficiencia del almacenaje, condiciones higiénicas inadecuadas,
contaminación fecal, tratamiento térmico inadecuado, etc. La presencia de estos
microorganismos en cierto número se considera como índice de que el alimento fue
tratado, conservado y manipulado en condiciones inadecuadas, que permitieron la
llegada o resistencia y proliferación de microorganismos patógenos. A estos se les
denomina MICROORGANISMOS INDICADORES.
c. También se puede afirmar que los recuentos altos indican que el producto va a
alterarse pronto.
NOTA: También es necesario advertir que existen casos en donde los recuentos
altos carecen de significado como es el caso de las salchichas,
encurtidos, quesos y otros productos lácteos, donde es natural una gran
multiplicación de los microorganismos, ya que tiene lugar una
"fermentación" o "maduración" del producto.
II. OBJETIVO.
- Enseñar al estudiante el significado y las operaciones a seguir en la ejecución de la
prueba microbiológicas más utilizadas en el control microbiológico de los
alimentos.
III. MATERIALES.
1. Materiales.
- Placas petri, tubos de ensayo, pipetas de 1, 2, 5, 10ml, frascos erlenmeyer,
licuadora, cuchillos y vaso de licuar.
- Agar Recuento, SSP (Solución Salina Peptonada), Estufas de incubación,
Mecheros.
- Diversas muestras de alimentos.
2. Métodos.
La forma de operar y calcular el recuento bacteriano es el siguiente:
Mezclar en placas estériles 1 ml. de la serie de diluciones con 15 ml. del medio de
cultivo, conservado a más o menos 50ºC. Luego de solidificado, adicionar una capa
fina de medio de cultivo a manera de "capa selladora" (más o menos 5 ml). Luego
incubar a 37ºC x 24 - 48 horas.
Después contar el número de colonias que se han desarrollado en las placas petri
que contienen entre 30 y 300 colonias, guardando siempre la relación de décimo
entre las diluciones contiguas. Calcular el número de bacterias viables por ml. o gr.
de muestra; el resultado debe ser expresado como:
N = a x bn
Donde: a, varía entre 1.1 - 9.9
b, es igual a 10
n, puede ser 2 ó más de 2
Ejemplo: 58'846,532
IV. CUESTIONARIO.
Lecturas
Dil. Nº 1 Nº 2
Lecturas
Dilución Nº 1 Nº 2
Se pide:
a) Encontrar el número de microorganismos por mL. de agua.
b) Fundamentar el porqué de la elección de los datos para los cálculos.
c) Discutir acerca de la importancia del agitado de la solución.
I. INTRODUCCIÓN.
Los microorganismos indicadores de la contaminación fecal, principalmente son:
Enterobacterias totales, Coliformes, Echerichia Coli, y Streptococcus del grupo de D
de Lancefield; por cuanto normalmente se les encuentra en el tracto digestivo del
hombre y de animales de sangre caliente.
Los enterococos pueden tener un papel muy importante como indicadores de una
limpieza y desinfección deficiente en las plantas y fábricas de los alimentos, a
causa de su gran resistencia a la desecación, a las altas temperaturas, a los
detergentes y a los desinfectantes. Debido a su mayor resistencia a la
congelación, los Streptococcus se prefieren como microorganismo indicadores de
la falta de limpieza y su desinfección de los alimento congelados y de modo
semejante pueden ser muy indicativos en los alimentos que fueron tratados por el
calor o deshidratado, procesos que destruyen organismos indicadores más
sensibles, tales como las Enterobacterias. Justamente, esta resistencia es la
razón de la impresión de estos cocos como indicadores generales de la
contaminación fecal ya que pueden sobrevivir en condiciones adversas , lo que
significa que guardan escasa relación la posible presencia de agentes patógenos
mucho menos resistentes, tales como la Salmonella spp. y Shigella spp., que aun
cuando hubiesen llegado al mismo tiempo que los cocos al alimento,
posiblemente no habrían sobrevivido.
Agar Rojo Violeta con Sales Biliales (VRBA), que tiene la siguiente composición:
- Cristal Violeta 2.0 mg.
- Rojo Neutro 30.0 mg.
- Extracto de levadura en polvo 3.0 gr.
- Sal Bilial N°3 1.5 gr.
- Lactosa 10.0 gr.
- Cloruro de sodio (Na Cl) 5.0 gr.
- Peptona 7.0 gr.
- Agar Agar 15.0 gr
- Agua destilada 1.0 L
Este método permite enumerar no solamente los bastones Gram (-) que fermentan
la lactosa (denominada bacterias coliformes o coli-aerógenes), como la E. coli,
Citrobacter freundii, Enterobacter aerógenes, etc., sino también las bacterias
intestinales lactosa (+), conocidas como Colifecales, patógenas indeterminados,
como la Salmonella, Arizona, Shigella, y las especies denominadas
“Paracolobactrun”. El medio se caracteriza porque lleva consigo un colorante
apropiado y sales biliales que van a inhibir el desarrollo de las bacterias que no
sean Coliformes.
-Medio para la reacción de Voges ProsKauer. Para las dos reacciones se utiliza el
mismo medio (MR-VP) y es inútil el ajuste del pH, repartir en tubos de ensayo
esterilizar a 121°C x 20 minutos.
-Medio para asimilación del Citrato. Se utiliza como medio el Citrato de Simmons.
D) Para Streptococcus del grupo “D” de Lancefield.- Método de Número Más Probable
(NMP).
Caldo glucosado con azida de sodio, para la prueba presuntiva para Streptococcus del
grupo “D” de Lancefield; cuya composición es:
- Triptosa 15.0 gr
- Extracto de carne en pasta 4.5 gr
- Glucosa 7.5 gr
- Cloruro de Sodio 7.5 gr
- Azida de Sodio 0.2 gr
- Purpura de Bromocresol 15.0 mg.
- Agua destilada 1.0 L.
Después de la disolución de los ingredientes, llevar el pH a 7.2 y repartir 9.0 ml., por
tubo de ensayo y esterilizar a 121°C x 15 minutos.
Este medio se caracteriza porque contienen la azida de sodio, que inhibe el
crecimiento de la mayor parte de otras bacterias que no sean Streptococcus. El
método a utilizar es el del NUMERO MAS PROBABLE (NMP), de manera similar que
para la determinación Escherichia coli.
Caldo Violeta de Etilo con azida de sodio (caldo EVA), para la prueba confirmativa para
Streptococcus del grupo “D” de Lancefield; cuya composición es:
- Triptosa 20.0 gr
- Glucosa 5.0 gr
- K2HPO4.3H2O 2.7 gr
- Azida de Sodio (NAN3) 0.4 gr
- Violeta de etilo 0.83 mg
- Purpura de Bromocresol 15.0 mg
- Agua destilada 1.0 L.
Después de la disolución llevar el pH a 7.2 y repartir 9.0 ml. Por tubo de ensayo y
esterilizar a 121°C por 15 minutos. En este medio, la azida de sodio y la violeta de etilo,
actúan como inhibidores estrictos de toda bacteria que no sea Streptococcus del grupo
“D” de Lancefield.
II. OBJETIVO.
Enseñar al estudiante las técnicas e interpretación de los microorganismos indicadores
de la contaminación fecal en los alimentos.
1) Materiales.
Placas Petri, tubos de ensayo, pipetas de 1, 2, 5 y 10 mL., frascos Erlenmeyer,
licuadora, cuchillos, vaso de licuar, mortero y pilón, estufas de incubación, baño
maría eléctrica, Agar Rojo Violeta con Sales Biliales (VRBA), Agar Mac Conkey,
Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis al 2%(CLVBB) de doble y simple
concentración caldo Glucosado con azida de sodio de doble y simple
concentración, Caldo Violeta de Etilo con Azida de Sodio, y muestras de alimentos
sospechosos.
2) Procedimiento.
Para el recuento de Enterobacterias. La forma de sembrar es como sigue: Mezclar
en placas petri estériles 1.0 mL. De la serie de diluciones con más o menos 15.0
mL. Del Agar Mac Conkey. Dejar enfriar hasta la solidificación, luego recubrir la
mezcla con más o menos 5.0 mL. del medio de cultivo. Luego de solidificado,
incubar a 37°C por 24 – 48 horas. Pasando el tiempo de incubación, contar las
colonias de las placas que contienen entre 30 y 300 colonias. Tanto en colonias
violetas con precipitado rojo violeta, como aquellas transparentes, amarillentas
verdosas y deducir el número de Enterobacterias por gr. o mL. de muestra.
Diluciones: 1: 100 =3
1: 1000 =1
1: 10000 =0
Este valor 3 – 1 – 0, se busca en la tabla del NMP, de tres alícuotas; y nos
dará la población de coliformes totales.
NMP
Población/gr. o mL. = --------- X fd (i)
100
43
2
N° = --------- X 1000 = 430 = 4.3 X 10 UFC /g. o mL.
100
Seguir trabajando solo con aquellos tubos con Kligler que hayan virado al
“amarillo” la parte superior a todo el medio (lactosa positivo).Descartar
aquellas que presenten además un precipitado negruzco o la parte superior
del tubo o todo el medio de color rojo. De los Kligler positivos, se siembran por
azadas en 4 tubos que contienen: Caldo Peptonado, caldo Rojo de Metileno,
Caldo Voger Proskauer, y Agar Citrato de Simmons; luego se incuban a
37°Cx24 horas.
Se consideran para las lecturas los siguientes resultados:
- Caldo Peptonado (l).
Se investiga la formación de Indol formando después de la incubación,
agregando gotas de reactivo de Kovac´s y agitando en seguida. La reacción
es positiva si la fase alcohólica esta coloreada de rojo claro u oscuro y
constante.
Tabla N° 1
============================================
I M Vi C
Escherichia coli + + - -
Enterobacter aerógenes - - + +
(O Aerobacter aerógenes).
Citrobacter -+ + - +
Klebsiella -+ - + +
D) Para Streptococcus del grupo “D” de Lancefield. Sembrar en los tubos con el medio
estéril, la serie del Número más probable, cuya técnica ya la hemos desarrollado
anteriormente, e incubar a 37°C x 24 – 48 horas.
La reacción se considera positiva, cuando los tubos presentas una acidificación (viran
del rojo purpura al amarillo), las que posteriormente, para su confirmación, se
siembran inóculos de estos tubos sospechosos, por azadas, en un medio liquido
selectivo denominado caldo Eva e incubarlo a 37°C por 24 horas. La prueba se
considera positiva, si en el fondo del tubo con caldo EVA con el inoculo, se observa
un precipitado blanco violeta y redondo que da la impresión de ser una pastilla.
IV. CUESTIONARIO.
1. Que finalidad tienen las diluciones? Donde se requieren más diluciones, en una
muestra fresca o en una muestra procesada). Porque?.
5) Describa la función que desempeñan cada uno de los medios de cultivo descritos
en la presente práctica.
Medio VRBA
Dilución L - 1 L - 2
S.M. inf. 786
-2 589 286
-3 68 43
-4 13 8
II. OBJETIVO.
Enseñar al estudiante la interpretación de los procedimientos microbiológicos para la
numeración de Clostridium, Staphylococcus aureus, Bacillus spp, y Hongos (Mohos y
levaduras); e Investigación y Detección de Salmonella spp. en diversos alimentos.
1) Materiales:
- Muestras de alimentos sospechosos
- Tubos de ensayo, placas Petri, mecheros, pipetas, y otros.
- Solución Salina Peptonada en frascos Erlemmeyer y en tubos de ensayo.
- Agar sulfito de hierro, Parafina o agar simple al 15 %.
- Medio Oxitetraciclina Glucosa Agar (OGA) en placas.
- Agar Baird Parker en placas
- Agar Dextrosa Triptona o Agar Dextrosa Peptona.
- Caldo Manitado (simple y doble concentración) en frascos.
- Caldo Selenito, Caldo Tetrationato Base, Agar Kligler.
- Agar Desoxicolato Citrato, Agar Salmonella Shigella, Agar Bismuto Sulfito.
- Galeria Bioquimica OxNiGLUMoCISKAD.
2) Métodos y Procedimiento.
Contar las colonias que desarrollan tomando un color negro intenso. Los límites
para el recuento de colonias en estos tubos son 5 y 50; por tanto, MENOS A 5
COLONIAS ES CERO, Y MAYOR A 50 COLONIAS ES INFINITO. Los cálculos y las
expresiones de estas poblaciones se realizan de la misma forma que para los
recuentos en placas.
Agar Base
- Triptona 15.0 g.
- Extracto de Levadura 10.0 g.
- FeSO 4 7 H2O 0.2 g.
- Agua destilada 1.0 L.
Repartir 5 mL. por tubo de 160 x 16 mm. y esterilizar a 115°C por 15 minutos y
dejar enfriar en posición inclinada para obtener una gran superficie. La cepa de la
levadura se siembra por estría superficial y se incuba a 22 - 26°C (o temperatura
ambiente), por 10 -15 días. Al cabo se este tiempo se observa al microscopio una
extensión de estas levaduras, con el fin de determinar la forma, ordenamiento y
numero de esporas en las ascas.
Si se requiere una mejor visibilidad, se puede practicar una coloración Gram o con
azul de metileno.
MEDIO BASE:
- Triptona 10.0gr
- Extracto de carne 5.0 gr
- Extracto de levadura 1.0 gr
- Glicocola 12.0 gr
- Piruvato de sodio 10.0 gr
- Cloruro de litio 5.0 gr
- Agar agar 20.0 gr
- Agua destilada 1.0 L
50 ug/ml de Sulfamezatina. Preparar una solución stock al 0.2% p/v de sal sódica
de Sulfamezatina disolviendo 0.5 de Sulfamezatina pura (Imperial Chemical
Industries) en 25 ml de NaOH N/10 y llevar a 250 mL. con agua destilada.
- Triptosa 20.0 .r
- ADN 2.0 g.
- NaCl 5.0 g.
- Agar agar 15.0 g.
- Agua destilada 1.0 L.
- Triptona 10.0 g.
- D-manitol 10.0 g.
- Extracto de levadura polvo 1.5 g.
- Cloruro de sodio 5.0 g.
- Agar agar 15.0 g.
- Púrpura de la bromocresol 15.0 mg.
- Agua destilada 1.0 L.
Entre las colonias que se cuentan están las siguientes especies de Bacillus.
Bacillus subtilis. Colonias enlazados, lisas o rugosas, de 4.5 mm. de diámetro en Agar
Dextrosa Triptona, con un halo amarillo.
Bacillus cereus: Colonias grandes, irregularmente planas, como “vidrio molido “de 4-6
mm. cuando crecen en Agar Dextrosa Triptona; con producción de ácido.
Preparación del medio de Cultivo. Agar Dextrosa Triptona (o Agar Dextrona Peptona).
Triptona (ó peptona) 10.0 g.
Dextrosa 5.0 g.
Púrpura de bromocresol al 1.6% 3.0 mL. (0.048g)
Agar agar 12.0 g.
Agua destilada 1.0 L.
Se disuelve por calentamiento, ajustar el pH a 6.6- 7.0, luego esterilizar a 121 oC por
15-20 minutos. Mantener el medio a 50 oC para utilización en el análisis. El producto
podrá conservarse en refrigeración.
f. Procedimiento para Investigación y Detección de Salmonella spp.
Enriquecimiento: Sembrar 0.5 mL. de Caldo Manitado positivo en cada uno de los
siguientes medios: Caldo Selenito y Caldo Tetrationato. Incubar a 37ºC por 24
horas.
Caldo Tetrationato:
Proteosa peptona 5.0 g.
Sales biliares 1.0 g.
Tiosulfato de Calcio 10.0 g.
Agua destilada estéril 1.0 L.
pH del medio 7.0
2 ml. de solución Yodada: (Yodo cristalizado, 6.0 g.; yoduro de potasio (IK), 5.0 g.;
Agua destilada estéril, 20 ml.) Preparación extemporánea.
La mezcla de ambos, repartir en tubos de ensayo estéril a razón de 10-12 ml. cada
tubo. No calentar después de añadir la solución yodada. La prueba será positiva
cuando se produce un precipitado en el fondo del tubo y una fase líquida superior
turbia.
Caldo Selenito:
Triptona 5.0 g.
Lactosa 4.0 g.
Selenito de Sodio 4.0 g.
Fosfato de Sodio 10.0 g.
Agua destilada 1.0 L.
pH del medio 7.0
Los medios de cultivo Selectivos son Salmonella Shigella Agar (SSA) y Desoxicolato
Citrato Agar (DCA). También se puede utilizar Bismuto Sulfito Agar (BSA). Una vez
sembrado se incuba a 37ºC por 24 horas, al cabo de los cuales se aíslan las colonias
que presentan las siguientes características:
Ox Ni G L U Mo C I S K A D
Salmonella spp + Ag - - -+ + - +- - - +
Shigella spp + + A - - - + + - - - -
IV. CUESTIONARIO.
I. INTRODUCCIÓN.
Los principales medios a través del cual los microorganismos patógenos alcanzan los
suministros de agua, es la contaminación fecal. Las enfermedades más importantes
que pueden tener su origen en el agua son la fiebre Tifoidea, otras salmonelosis, cólera,
y disentería bacilar y amébica.
Los agentes virales de infecciones como hepatitis y poliomielitis son organismos fecales
y pueden estar presentes en agua contaminada. El método para el examen
bacteriológico del agua está destinado a darnos un índice de la contaminación fecal. Los
microorganismos patógenos no se multiplican necesariamente en el agua, pero sin
embargo pueden estar presentes en gran número y fácilmente de detectarse si hay
contaminación fecal. Entonces un cuadro demostrativo de E. coli en agua, nos indica
una fuente fecal de los organismos.
II. OBJETIVO.
1. Materiales.
2. Métodos.
- Un disco filtrante estéril se pone en la unidad de filtración.
- Se hace pasar un volumen de agua (100 ml) por el disco filtrante las bacterias
serán detenidas en la superficie de la membrana.
- Se quita el disco filtrante y se pone sobre una almohadilla absorvente que se ha
saturado previamente con el medio de cultivo apropiado (2 ml aproximadamente).
Las almohadillas absorventes con los discos filtrantes se acomodan en placas petri
de tamaño especial y se incuban a 35º por 20 horas.
- Después de la incubación se desarrollan colonias sobre el disco filtrante en
cualquier lugar donde haya quedado atrapado por la filtración.
- Con una lupa o utilizando el microscopio con el objetivo de menor aumento
examine la superficie del filtro para las colonias que poseen una superficie brillosa,
verduzca. Cuente el número total de éstas colonias "brillosa -verdosas" sobre el
filtro.
IV. CÁLCULOS .
V. CUESTIONARIO.
2. Comente sobre los diferentes tipos de agua (río, agua de caño, manantial, agua de
lluvia, pozos.).
3. Cómo procedería Usted para poder utilizar esas aguas arriba mencionadas, en la
industria y el consumo humano?. Explique por separado cada uno de ellos.
4. Comente y explique acerca de las aguas que se usan en la Región San Martín para el
consumo humano y la industria.
PRÁCTICA Nº 09. MICROBIOLOGÍA DE LA LECHE
I. INTRODUCCIÓN
No hay necesidad de que los utensilios de vidrio utilizados para esta prueba sean
estériles, pero su contaminación puede reducirse al mínimo tratándoles con agua
hirviente o vapor que circule libremente.
La prueba del azul de metileno, por su sencillez y la rapidez con que se obtienen los
datos, es fácil, práctica y económica; sin embargo este método tiene sus limitaciones y
son las siguientes:
2) Las distintas bacterias tienen capacidad diferente por lo que respecta a rebajar el
potencial de óxido-reducción de la leche.
- Las bacterias psicrófilas y termófilas tendrán muy poca o ninguna actividad durante la
prueba.
II. OBJETIVOS.
1. Materiales:
- Muestras de leche.
- Materiales de vidrio: Pipetas, placas petri, tubos ensayo.
- Medios de cultivo para Gérmenes Viables y Coliformes.
- Solución saturada de azul de metileno.
- Mecheros.
- Estufa de incubación.
- Agua estéril.
2. Métodos:
I. R. : Inicio de Reducción.
M. R. : Muestra para Reducción.
F. R. : Final de Reducción.
Interpretación de Resultados.
Precauciones.
- Se debe mantener los tubos en Baño de agua fría hasta completar el lote de
muestras para colocar en baño de agua caliente, pero si se tiene que esperar un
tiempo conveniente antes de la incubación, almacenarlos entre 0 y 4.4ºC.
Tabla de calificación.
Más de 4 horas. Muy Buena (A)
De 3 a 4 horas. Buena (B)
Más de 30 min. a menos de 3 horas. Aceptable (C)
Hasta de 30 minutos. Mala (D)
IV. CUESTIONARIO.
1) Explique las causas por las que en algunas muestras de leche es rápida la reducción
del Azul de Metileno.
I. INTRODUCCIÓN
II. OBJETIVOS
- Dar a conocer al alumno las pautas a seguir para llevar a cabo un control de calidad
microbiológica de alimentos enlatados (conservas).
1. Materiales:
- Muestra problema.
- Caldo Cerebro Corazón.
- Caldo Cerebro Corazón + Cisteína + Almidón.
- Caldo Oxitetraciclina Glucosa.
- Abridor de latas estéril.
- Espátulas, Tijeras, Pinzas (Estériles).
2. Método.
- A 32 – 37ºC X 15 - 21 días.
- A 55ºC X 7 - 10 días.
c. Preparación de las latas para el examen: Desinfectar con alcohol al 7% todas las
latas a examinar. Flamear la parte a ser abierta con la ayuda de un mechero por
el lado que no tiene número de control. Abrir con un abridor de latas estéril,
eliminar totalmente la tapa y abrir la conserva con la base de una placa estéril.
Investigación de aerobios.
Medio de cultivo: Caldo Cerebro Corazón (CCC), o Brian Hearth Infusion (BHI).
- Tomar tres (03) tubos que contengan 20 ml de CCC, agitar para eliminar el
oxígeno disuelto en su seno, y añadir a cada tubo 2 - 3 gr. de muestra
problema.
Investigación de anaerobios.
- Proceder de igual forma que para aerobios; además añadir una capa de parafina
estéril (punto de fusión 45 – 55ºC).
- Finalmente incubar por 24 - 48 Horas, a la misma temperatura que se
pre-incubó la conserva.
- Usar una serie de tres tubos que contenga el medio antes indicado, y cada tubo
añadir la misma cantidad de muestra problema anteriormente indicado.
El cierre de la lata debe ser adecuado para retener la calidad de los productos
enlatados, requiriéndose una resistencia permanente, contra presiones externas o
internas que pueden tener lugar durante el procesamiento, embarque y
almacenamiento.
Inspección visual.
La detección puede ser: Visual o táctil y los defectos pueden ser: Sellos
incompletos, falsos sellos, caídas de un reborde, presencia de arrugas, etc.
Mediciones Externas
IV. RESULTADOS
V. CUESTIONARIO
GAS
NO HAY GAS (liso)
DESCENSO DE pH
H2S
(Generalmente fugas)
Olor a H2S, maíz y
AGRIADO POR MESÓFILOS
guisantes,
color negro,
TERMÓFILOS
Putrefacción
sulfhídrica
CO2
LEVADURA
ALCOHOLICA
CARNES
CURADAS
(Bacillus spp.)
TERMÓFILOS MESÓFILOS
(Olor ácido)
I. INTRODUCCIÓN
La microbiología abarca las ciencias de los hongos filamentosos, las levaduras, las
bacterias. Aquellos seres microscópicos que se denominan microorganismos de la
industria de la fermentación o más brevemente “MICROORGANISMOS
FERMENTATIVOS”, son aquellos que mediante sus procesos metabólicos transforman
los hidratos de carbono en alcoholes o ácidos orgánicos (eventualmente aldehídos y
cetonas) con o sin formación de anhidrido carbónico u otros gases.
A partir de que sirve para conservar los alimentos y para contribuir la variedad de la
dieta del hombre, tiene otras consecuencias importantes. Varios de sus productos
finales, particularmente los ácidos y alcoholes, son inhibidores de los microorganismos
patógenos comunes que logran introducirse en los alimentos; como en la incapacidad
del Clostridium botulinum de crecer y producir toxina cuando el índice de pH es inferior
a 4,5.
Las bacterias que amenazan la salud del hombre y de los animales, se llaman
patógenos. Estos representan la menor parte de todas las bacterias existentes, su
peligrosidad se fundamenta en la capacidad de formar sustancias tóxicas o de destruir
tejidos.
II. OBJETIVO
- Dar al estudiante las pautas necesarias preliminares para la elaboración de productos
agroindustriales, mediante el uso de microorganismos.
III. MATERIALES Y MÉTODOS
1. Materiales
A. YOGUR
- Leche fresca
- Leche en polvo
- Cultivo de Yogur
- Cocinilla eléctrica
- Baño maría
- Refrigeradora
- Materiales diversos de vidrio
- Saborizantes
B. VINO
- Materia prima e insumos (Uva, Azúcar)
- Equipo de fermentación
- Baldes y Bandejas de plástico
- Materiales diversos de vidrio
2. Método.
B. Para Vino.
MATERIA PRIMA (Uva)
ESTRUJADO
ADICIÓN DE AZÚCAR
DESCUBADO
SEGUNDA FERMENTACIÓN (20 - 30 días)
TRASIEGO
CLARIFICADO, FILTRADO
ENVASADO
V. CUESTIONARIO.
1. Hacer una lista de productos agroindustriales que se elaboran mediante el uso de
microorganismos. Mencionar al o a los microorganismos responsables de cada
producto.
2. Hacer una lista de los productos que se elaboran en la Región San Martín por acción
de microorganismos. Nombrar a las empresas productoras.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
4. DIFCO, 1984. “Dehydrated Culture Media and Reagements for Microbiología”, 10th
ed., Detroit-Michigan-USA.
5. DIGESA, 2008. “Norma sanitaria que establece los criterios microbiológicos de calidad
sanitaria e inocuidad para alimentos y bebidas de consumo humano”.
NTS N° 071 – MINSA/DIGESA V.01. Resolución Ministerial N° 591-
2008-MINSA. Lima – Perú.
7. ICMF., 1984. “Ecología Microbiana de los Alimentos”, Ed. Acribia S. A., Zaragoza-
España.
10. MERCK E. 1994. “Manual de medios de cultivo: Más que 100 años. Medios
de cultivos Merck”. Darmstadt, R. F. Alemania.
13. RATTO M. A., VEGA C., GARRIDO T. 1983. “Control Microbiológico de Leches
y Productos Lácteos: Métodos Recomendados”, Lima-Perú.