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UNIVERSIDAD NACIONAL DE

PIURA
ESCUELA DE POSTGRADO

PROGRAMA DE MAESTRIA EN INGENIERÍA AMBIENTAL Y


SEGURIDAD INDUSTRIAL

TEMA: Biorremediación de Petróleo

CURSO: Microbiología Ambiental

PROFESOR: MSc. Cesar Torres

ALUMNOS: Aldo García Cerna

Febrero de 2016
INDICE

I. Introducción

II. Generalidades
a) El crudo Petróleo
b) Refinado del Crudo Petróleo
c) Biorremediación de Petróleo
diésel
d) Biosurfactantes

III. Objetivos

I V. Materiales y Métodos

V. Resultados

VI. Referencias

I . I n t r o d u c c i ó n :
La industria petroquímica es importante en una sociedad moderna, no obstante la
falta de un programa de protección ambiental, hace que el medio ambiente se contamine
al producirse derrames de petróleo, principalmente de crudo, por un deterioro de
los oleoductos, descargas de efluentes contaminados, afloramientos naturales a
través de fisuras de la corteza terrestre y debido a la producción, transporte y
almacenamiento de este recurso natural. A nivel mundial, el volumen de derrame de
petróleo es de 1.7 a 8.8 millones de toneladas métricas por año y en nuestra región
(Pacífico Sudeste) es de 6000 toneladas métricas al año. En el Perú se registran
derrames de petróleo desde 1978, uno de ellos fue el producido en el oleoducto
marino de Talara, estando entre los últimos el ocurrido el año 2000 en el río Marañón
que afectó la Reserva Pacaya-Samiria y el producido el 30 de enero del 2008 en el
que, debido a una explosión producida en un barco carguero, se derramaron frente al mar
de tumbes 1,300 barriles de crudo de petróleo. Pero no solo derrames mayores causan
contaminación si no también los constantes derrames accidentales en suelos de
nuestra selva, los que se producen por el rompimiento del Oleoducto Nor-Peruano,
debido a accidentes naturales y por la actividad extractiva. Los mar es del planet a
sufren cada año m illones de pequeños der ram es
cont am inantes procedentes de barcos, refinerías costeras y plataformas
petrolíferas. Un estudio de la Univer sidad Polit écnica de Cataluña advierte
de que el im pact o am biental de los pequeños vertidos diarios es mucho mayor
que el ocasionado por un gran accidente y han lanzado una seria advertencia sobre
el enorme impacto ambiental que provocan los pequeños vertidos de petróleo
-desde un litr o a unas 80 toneladas- por su excesiva frecuencia.

Los dispersantes químicos utilizados para favorecer la remediación de los ambientes


contaminados pueden causar un mayor impacto ecológico que el mismo derrame, por su
toxicidad y recalcitr ancia a la biodegr adación. Por tanto, una mejor
alternat iva de solución es el proceso de biorremediación, que es el tratamiento
biológico del suelo, aire y agua, mediante la biodegradación de compuestos
tóxicos para transformarlos en
compuestos de menor o ningún impacto ambiental. Así en la
biodegradación de hidrocarburos, se utilizan bacterias con alta
c a p a c i d a d d e g r a d a t i v a , e n t r e e s t a s : Brevibacterium, Spirillum, Xanthomonas,
Alcaligenes, Arthrobacter, Nocardia, Flavobacterium, Vibrio, Achromobacter , Acinetobacter ,
Micrococcus, Pseudomonasaeruginosa, Serratia rubidae, Bacillus sp,
Pseudomonas mendocina, Pseudomonasaureofasciens, etc., las cuales disminuyen
la concentración de hidrocarburos presentes en el ambiente y al mismo tiempo son
inocuas para la salud y el medio ambiente.
Estas bact er ias pr oducen bioemulsificantes y biosurfact antes que disminuy
en la tensión superficial entre el petróleo y el medio acuoso facilitando el
acceso microbiano a la fuente de carbono insoluble para su degradación.

I I . G e n e r a l i d a d e s :
a. El crudo de petróleo:
El crudo de petróleo se caracteriza por ser un líquido verdusco oscuro,
viscoso y con una composición química sumamente compleja, pudiendo
contener miles de compuestos, básicamente de la familia de los
hidrocarburos. Los hidrocarburos componen la familia predominante de
compuesto (un 50%-98% de la composición), por lo que constituyen uno
de los grupos de contaminantes ambientales más importantes, tanto por
su abundancia, como por su persistencia en distintos compartimentos
ambientales. Mayoritariamente son alcanos de cadena lineal (n-alcanos o
n-parafinas), alcanos ramificados (en menor cantidad), ciclo alcanos (o
naftenos) y cantidades variables de hidrocarburos aromáticos. La
composición elemental de un crudo está condicionada por la
predominancia de los compuestos tipo hidrocarburo: 84-87% de C, 11-14%
de H, de0-8% de S, y de 0-4% de O y N y metales como el níquel y el
vanadio. Los principales componentes se subdividen y purifican en
distintas fracciones: i) fracción saturada (n-alcanos, alcanos ramificados
con cadenas alquílicas y las ciclo parafinas),ii) fracción aromática (mono
aromáticos, di aromáticos e hidrocarburos aromáticos (HAPs), iii) fracción
de resinas y iv) fracción de asfáltenos que son menos abundantes y
consisten en compuestos más polares, pudiéndose encontrar hidrocarburo
heterocíclicos, hidrocarburos oxigenados y agregados de alto peso
molecular.
Fig. 1.1 Estructuras químicas de diferentes componentes de un crudo de petróleo

b. Refinado del crudo de petróleo:


Para comprender la naturaleza química de los diferentes derivados de
petróleo que potencialmente pueden se contaminantes en el medio
ambiente, hay que entender el proceso de refinado del crudo utilizado para
la obtención de estos productos petrolíferos.
El refinado pasa por un proceso de destilación, con la finalidad de eliminar
el color y olor, así como también, los compuestos del azufre. Se destila a
temperaturas crecientes obteniendo 4 fracciones principales: gasolina,
queroseno, destilados medios (querosenos, gasoil, aceites lubricantes) y
un residuo. Este residuo se destila al vacío obteniéndose otros aceites
lubricantes (más pesados), ceras y parafinas y bitumes asfálticos
(alquitranes).
Durante el proceso de refinado, se eliminan componentes de la fracción
asfalténicas (altamente recalcitrante) lo que implica
que los refinados intermedios (gasoil, fueles, querosenos y también las
gasolinas) sean productos relativamente más biodegradables que los
coques o alquitranes residuales. Así pues, la composición química de la
gasolina es diferente a la del gasoil debido a que se han obtenido como
productos de la destilación del petróleo a partir de diferentes intervalos de
temperatura (Tabla 1.4). La obtención de gasolina es menos directa que la
de los fueles y gasóleos, ya que en una primera fase se obtiene por
destilación del crudo entre 20-180ºC. Esto implica una composición de n-
alcanos más ligera (C6-C11) que los fueles y gasóleos (C10-C25). En la
gasolina encontramos como componentes más abundantes: n butano,
isopentano, pentano, mono y dimetilpentanos, hexano, BTEX, mono y
dimetil hexanos, trimetilbencenos, metiletilbencenos, y en menor cantidad
los naftalenos, sus mono y dimetilados y heptano (de menor índice de
octanaje).
Los fueles ligeros y gasoil forman parte de la fracción intermedia de la
destilación en el proceso de refinado, lo que implica un rango de puntos
de ebullición entre 185-345ºC, encontrando compuestos de 10 a 25
átomos de carbono, siendo los más abundantes los C15-C17. (fig. 1.2). Su
composición es de un 30% en parafinas (n-alcanos e isoprenoides), 45%
de naftenos (cicloalcanos) y un 25% de aromáticos. En concreto a nivel de
compuestos aromáticos encontramos alquilbencenos, y más
abundantemente, el naftaleno y sus alquilados. También se ha encontrado,
en cantidades menores el fenantreno y el fluoreno. No contienen pireno
ni fluoranteno (compuestos de 4 anillos aromáticos), cuyos puntos de
ebullición son más elevados que el intervalo utilizado en la destilación de
fracciones intermedias.

Tabla 1.4 Fracciones que obtienen durante el refinado por destilación de


un crudo de petróleo

c. Biorremediación de petróleo Diésel usando diversos microorganismo :


La biorremediación es la adición de materiales a ambientes contaminados
para producir una aceleración del proceso natural de biodegradación.

Biodegradación: se refiere al proceso natural mediante el cual bacterias u otros


microorganismos alteran y convierten moléculas orgánicas en otras sustancias, como
ácidos grasos y CO2

La elevada complejidad del crudo de petróleo y derivados, implica la


existencia de una amplia capacidad enzimática si se quiere conseguir una
degradación significativa del crudo. La mayor parte de los estudios
realizados se han llevado a cabo con cepas bacterianas individuales o con
la combinación de diferentes cepas aisladas.
En la mayoría de los casos, son degradadoras de alcanos, debido a que
los alcanos son los componentes más abundantes del crudo de petróleo.
No obstante en algunos casos, estas cepas tienen la capacidad de oxidar
selectivamente las cadenas alquílicas de ciertos HAPs alquilados,
compuesto abundantes en el crudo. Recientemente, se han descrito
algunas cepas con la capacidad de degradar tanto HAPs de elevado peso
molecular como alcanos pero ésta, no parece que sea una norma general.
De hecho los degradadores de alcanos citados habitualmente en la
bibliografía generalmente no son capaces de romper el anillo aromático de
los HAPs, mientras que los degradadores de HAPs generalmente no
crecen con alcanos.
La alternativa a la utilización de cepas individuales es la obtención y
utilizaciónde cultivos mixtos, los cuales pueden ser consorcios definidos y
consorcios nodefinidos. Los consorcios definidos se caracterizan por ser
una combinación de cepas aisladas con capacidades degradativas
conocidas que son complementarias entre sí. Los consorcios no definidos
se caracterizan por ser el resultado de procesos directos de
enriquecimiento a partir de muestras ambientales con historia previa de
contaminación y por lo tanto no son el resultado de una combinación de
cepas previamente aisladas.

d. Biosurfactantes:
Se dice que un soluto es un agente tenso activo o surfactante cuando da
lugar a un descenso significativo de la tensión superficial. El descenso
de la tensión facilita la eliminación de las partículas de la suciedad de las
superficies sólidas. Son moléculas que contienen un segmento liposoluble
(soluble en aceite) y otro hidrosoluble (soluble en agua o disolventes
polares). La solubilidad parcial tanto en agua como en aceite permite al
surfactante ocupar la interface. Así pues, reducen la tensión superficial
y las tensiones interfaciales entre moléculas individuales en la superficie y
la interfase, respectivamente. Tienen propiedades emulsionantes.
Atendiendo a estos criterios un biosurfactante sería una molécula
biológica (orgánica) con propiedades surfactantes o tenso activas
producidas sobre superficies vivas, mayormente superficies de células
microbianas, o excretados al medio extra celular.
Con excepción del poder bactericida de ciertos surfactantes, fenómeno del
cual no hay una explicación absolutamente segura, se pude decir que
todas las propiedades y uso de los surfactantes provienen de dos
propiedades fundamentales de estas sustancias: su capacidad de
absorberse a las interfaces y de otra parte su tendencia a asociarse para
formar estructuras organizadas.

Fig. Diferentes estructuras producidas por la asociación de surfactantes


Clasificación de los biosurfactantes.
Los surfactantes microbianos son moléculas complejas que cubren un
amplio rango de estructuras químicas incluyendo péptidos, ácidos grasos,
fosfolípidos, antibióticos, lipopéptidos, etc. Los microorganismos también
producen en algunos casos, surfactantes que son combinaciones de
muchas estructuras químicas como los surfactantes microbianos
poliméricos. Muchos surfactantes microbianos han sido purificados y sus
estructuras químicas son conocidas. Mientras que los de alto peso
molecular son generalmente heteropolisacáridos polianiónicos que
contienen tanto polisacáridos como proteínas, los de bajo peso molecular
suelen ser glicolípidos. Podemos clasificar los biosurfactantes atendiendo
a tres criterios: naturaleza química, peso molecular y carga iónica de la
parte superficialmente activa de la molécula.
1. Naturaleza química
a) Lípidos, b) Hidratos de carbono, c) Aminoácidos, d)Glucolípidos, e)
Lipopéptidos
2. Peso molecular
a) Bajo peso molecular: Suelen ser glicolípidos. El más estudiado es el
rhamnolípido, producido por diversas especies como Pseudomonas . La
función principal de estos biosurfactantes es reducir la tensión superficial
entre fases (agua-roca por ejemplo).
b) Alto peso molecular: Suelen ser polisacáridos, proteínas, lipoproteínas,
lipopolisacaridos o mezclas de estos polímeros. Estos biosurfactantes no
son tan eficaces en cuanto a la reducción de la tensión superficial entre
fases, pero si son buenos emulsionantes. Además se ha demostrado que
son muy eficaces a bajas concentraciones y poseen una considerable
afinidad por el sustrato. Un ejemplo sería Alasan
producido por Acinetobacter radioresistens.
3. Carga iónica
a) Agentes aniónicos: Contiene generalmente uno de cuatro grupos
polares solubles-carboxilato, sulfonato, sulfato o fosfato- combinado con
una cadena hidrocarbonadahidrófoba. Si esa cadena es corta son muy
hidrosolubles y en el caso contrario tendrán baja hidrosolubilidad y
actuaran en sistemas no acuosos como aceites lubricantes. Se usan
principalmente en la industria de jabones y detergentes.
b) Agentes catiónicos: Están compuestos por una molécula lipofílica y otra
hidrofílica, consistente de uno o varios grupos amonio terciario o
cuaternario. Son utilizados comúnmente en detergentes, agentes
limpiadores, líquido de lavaplatos, tratamiento de textiles, como sustancias
activas antimicrobianas y en cosmética.
c) Agentes no iónicos: No se disocian en iones hidratados en medio
acuoso. Las propiedades hidrofílicas son provistas por hidratación de
grupos amido, amino, éter ohidroxilo.
d) Otros tipos de surfactantes: La combinación en la misma molécula de
un grupo con tendencia aniónica y de un grupo con tendencia catiónica
produce un surfactante anfotérico, como por ejemplo los aminoácidos, las
betainas o los fosfolípidos. Según el pH del medio una de las dos
disociaciones prevalece. Este tipo de surfactante se usasólo en casos
particulares debido a su alto costo.
Utilización de los Biosurfactantes. Los contaminantes hidrofóbicos presentes
en los hidrocarburos del petróleo, suelos y aguas del medio ambiente
requieren su solubilización antes de ser degradados por la célula
microbiana. La mineralización está gobernada por la desor ción de los
hidrocarbur os del suelo. Los surfactantes pueden aumentar el área de
los materiales hidrofóbicos, como pesticidas en suelos y agua del medio,
aumentándose así su solubilidad en agua. Por lo tanto, la presencia de bio
surfactantes puede aumentar la degradación microbiana de los
contaminantes. Se le ha dado unas atenciones considerables a la
producción de moléculas tensas activas de origen biológico por sus
aplicaciones en el procesado de alimentos, aromatización de bebidas
alcohólicas, reciclaje de papel, fabricación de pulpa de papel, en
farmacología, y la industria del aceite. En relación a esa última aplicación,
los accidentes que llevan a vertidos de aceite han llegado a ser
numerosos y han causado catástrofes tanto sociales como ecológicas. La
habilidad de los bio surfactantes para emulsionar hidrocarburos mezclados
con agua ha sido ampliamente divulgada. Estas propiedades
emulsionantes también se ha demostrado que favorecen la degradación
delos hidrocarburos en el medio ambiente, por tanto los hacen muy útiles
para el control de la contaminación por vertidos de aceites. En
la biorremediación en vertidos de petróleo, estudios recientes han
mostrado que se puede utilizar el poder solubilizante de las micelas para
extraer ciertas sustancias contaminantes aun cuando su concentración
sea extremadamente baja.
FIG. Casos de asociación entre micela y un contaminante

Las funciones que harían estos biosurfactantes a la hora de aumentar la biodisponi


bilidad serían:
- Dispersar el petróleo aumentando la superficie de contacto.
- Aumenta la biodisponibilidad de compuestos hidrofóbicos. Serían en este
caso sobre todo los de bajo peso molecular.
- Poseen también funciones evolutivas para los propios microorganismos. Pueden
ayudar a los microorganismos productores a desprenderse de las gotas de
petróleo una vez se ha agotado la fuente de hidrocarburo que utilizaba. Hay que
tener en cuenta que un microorganismos suele utilizar un solo tipo de hidrocarburo
entre la mezcla que existe. Por eso les sería útil poderse desprender de estas
interacciones hidrofóbicas que mantiene la membrana con la gota de petróleo,
para así ir en busca de nuevas fuentes de carbono. Además deja un micro cápsula
alrededor de la gota favoreciendo así a toda la población. Una propiedad de los
biosurfactantes curiosa es su actividad bactericida. Dicha actividad se debe a su
capacidad detergente.
Surfactantes Microbianos, el interés por los surfactantes microbianos ha estado en
aumento en los últimos años debido a sus diversas deseables tales como una
efectiva selectiva, respuetuos para la naturaleza, su estabilidad a elevadas
temperaturas, a pH y concentración de sales. Hay que añadir que los
biosurfactantes han aumentado la versatilidad en comparación a muchos
surfactantes sintéticos y tienen la ventaja de poder producirse por fermentación.
Hay células microbianas intactas con una superficie celular altamentehidrofóbica q
ue son ellas mismas surfactantes. En algunos casos, los propiossurfactantes
juegan un papel natural en el crecimiento de las células microbianas sobre
sustratos insolubles en agua. Los surfactantes extracelulares están implicados en
la adhesión celular, emulsión, dispersión, floculación, agregación celular y
fenómenos de desorción. Aunque el tipo y cantidad de surfactanten microbiana
producido depende del organismo productor, factores como el carbono
y el nitrógeno, elementos traza, temperatura, y aireación, también afectan a su
producción por el organismo. Existen varios biosurfactantes producidos por
bacterias, entre ellos tenemos:

Algunos ejemplos de bacterias y la producción de biosurfactantes:


1. Bacillus pumilus (estirpe 28-11) produce biosurfactantes con una gran capacidad
deemulsionar y eliminar compuestos hidrocarbonatos. Esto hace que se considere
estaestirpe como prometedora en el campo de la tecnología medio ambiental.
2. Candida ishiwade (Tailandia) es una levadura termotolerante que produce
monoacilgliceroles y glicolípídos.
3. Pseudomonas sp. Pueden reducir la tensión superficial, estabilizar emulsiones,
y promover la formación de espumas y generalmente son no tóxicos, no peligrosos
y biodegradables. Debido a su diversidad, inocuidad para el medio ambiente,
posibilidades producción a gran escala, selectividad, efectividad bajo condiciones
extremas
en pequeñas cantidades, producción sobre recursos renovables, y sus aplicacione
s potenciales para la protección del medio ambiente, los biosurfactantes han
ganado importancia frente a los surfactantes químicos. Hay que añadir el valor del
carbohidrato presente, la ramnosa de los ramnolípidos bioserfactantes, es usada
para el transporte de drogas insolubles en humanos y actua como precursor de
componentes de saborizantes de alta calidad. Los biosurfactantes potencian la
emulsión de hidrocarburos y por eso tienen el poder de solubilizar contaminantes
hidrocarbonados y aumentar su disponibilidad para la degradación microbiológica.
Así los microorganismos productores de bio surfactantes pueden jugar un
importante papel en la biorremediación acelerada de lugares contaminados con
hidrocarburos. Debido al alto costo de los procesos de remediación y otras
aplicaciones potenciales, la necesidad de aumentar la producción de
biosurfactantes es determinada por la genética de
microorganismo, otros factores tales como las condicionesambientales y la
naturaleza del sustrato también influyen en el nivel de expresión. Así, la
optimización de esas condiciones puede llevar a una producción elevada y segura
de biosurfactante. Existen estudios para el desarrollo de métodos económicos
para aumentar la producción usando materias primas a bajo costo
4. Pseudomonas aeruginosa LBI es un ejemplo claro de estructura química,
propiedades superficiales y actividad biológica en la producción de
biosurfactantes. La naturaleza química de los biosurfactantes producidos seria en
este casi ramnopilidica, cuya estructura de ramnosa contiene propiedades de
biosurfactantes.
5. Pseudomona putida PCL1445 produce biosurfactantes interesantes a nivel
industrial.En este caso se caracterizó dos lipopéptidos con actividad
biosurfactante: putisolvin I y putisolvin II; los cuales inhiben la formación
de biopelículas o provoca la destrucciónde las mismas. Esta estirpe PCL1445 fue
aislada de la raíz de una planta, crecida en unazona contaminada con PAHs
(hidrocarburos aromáticos policíclicos).Se vio que la estirpe de PCL 1445 produce
actividad biosurfactante hasta el final de la fase de decrecimiento.
Teniendo en cuenta el uso potencial de los tensioactivos en las tecnologías de
biorremediacion, la utilización de lo biotensoactivos parece tener más potencial
que los tensioactivos de síntesis (químicos), debido a la mayor diversidad
estructural, biodegradabilidad y biocompatibilidad de los biotensioactivos. Los
biotensoactivos más estudiado han sido los emulsanos acinetobacter sp.

Factores que condicionan la biorremediación de un suelo. La biodegradabilidad de


una mezcla de hidrocarburos presente en un suelo contaminado depende de
diversos factores como son: la presencia de una población microbiana
degradadora potencialmente activa, la estructura molecular del contaminante, su
concentración y bio disponibilidad, y factores ambientales como el pH,
temperatura, humedad del suelo, presencia de aceptores de electrones
disponibles, y la existencia de nutrientes inorgánicos (fuente de N y P) disponibles.
El pH, temperatura y la humedad
Cada cepa microbiana tiene un determinado rango de tolerancia a factores
ambientales como son: la temperatura, el pH y la salinidad, los cuales pueden
afectar al crecimiento y actividad de las poblaciones microbianas. En
consecuencia, cuanto mayor sea la diversidad de microorganismos existentes,
potencialmente mayor será el rango de tolerancia. No existen unas condiciones
preestablecidas que sean óptimas en todos los casos, pero en términos generales
a pH y temperaturas extremas y en suelos salinos la biodegradación se ralentiza,
siendo los rangos óptimos para la biodegradación: pH entre6- 8 y temperaturas
entre 20-30ºC.
La variación del pH del suelo afecta a la actividad microbiana y también a la
solubilización y adsorción/absorción de los contaminantes y de los iones. Las
formas catiónicas (NH4+, Mg2+, Ca2+) son más solubles a pH ácido mientras que
las formas aniónicas (NO3-, NO2-, PO43- Cl-) son más solubles a pH alcalino. En
general, el pHóptimo para las bacterias heterótrofas es neutro (pH 6-8), mientras
que es más ácido para los hongos (pH 4-5).
El pH óptimo establecido para procesos de biodegradación es neutro (pH 7,4-
7,8).La temperatura es uno de los factores ambientales más importantes que
afecta la actividad metabólica de los microorganismos y la tasa de biodegradación.
La mayor parte de estudios realizados indican que las condiciones mesofílicas
(20-30ºC) son las óptimas para la biorremediación de suelos contaminados. No
obstante, también se ha descrito biodegradación de hidrocarburos temperaturas
extremas: a 10ºC en suelos subárticos y subalpinos, 5ºC en suelos árticos y hasta
60ºC por una cepa termófila de Bacillus stearothermophilus aislada de un suelo
contaminado con crudo de petróleo del desierto kuwaití. La humedaddel suelo
puede limitar de forma severa biodegradación fundamentalmente en suelos
superficiales afectados por oscilaciones importantes en el contenido de agua. No
obstante el nivel óptimo de humedad depende de las propiedades de cada suelo,
el tipo de contaminación y si la biodegradación es aeróbica o anaeróbica. Un
déficit de agua puede disminuir el transporte de nutrientes y de contaminantes, así
como también la migración bacteriana a través del suelo. El exceso de agua en un
suelo desplaza el aire residente en los poros del suelo, generándose con mayor
facilidad condiciones anaeróbicas, al agotarse el oxígeno disuelto en agua.
Estructura química de las distintas familias de hidrocarburos del petróleo, la n-
alcano y los alcanos ramificados (isoprenoides) de cadena intermedia (C10-C20)
son los sustratos más fácilmente degradables por los microorganismos del suelo, y
que por lo tanto tienden a ser eficazmente biodegradados. Sin embargo, los
alcanos de cadena larga (>C20) son más difíciles de degradar debido a su
(elevado peso molecular) y su baja solubilidad enagua. Los cicloalcanos, por
norma general, se degradan más lentamente que la n-alcano y alcanos
ramificados. Asimismo, los HAPs que contienen de 2 a 3 anillos
aromáticos pueden ser biodegradados eficazmente en el suelo en condiciones
ambientales óptimas, mientras que los HAP de 4 anillos, y especialmente, los de 5
o más anillos bencénicos presentan una mayor recalcitrancia inherente y una baja
solubilidad. Las fracciones de resinas y asfaltenos son las que presentan una
menor degradabilidad debido a las complejas estructuras químicas y al elevado
peso molecular de sus moléculas. Biodisponibilidad
La tasa de degradación depende tanto de la capacidad de transporte y del
metabolismo microbiano, como de la transferencia de masas del compuesto. La
relación entre estos factores se conoce como biodisponibilidad. En los suelos uno
de los factores limitantes para biodegradación es la transferencia de masas ya que
los microorganismos de los suelos contaminados, suelen tener amplias
capacidades de estar expuestos a una gran variedad de compuestos orgánicos
diferentes. Por lo tanto la adsorción, la absorción, desadsorcion, disolución y la
difusión son fenómenos, propios de la transferencia de masas, que condicionan la
biodisponibilidad de los contaminantes es el envejecimiento de ageing, que se
define como la perdida de biodegradabilidad de los compuestos a lo largo del
tiempo en el suelo (aunque la población microbiana de los compuestos a lo largo
del tiempo en el suelo (aunque la población microbiana mantenga intacto su
potencial catabólico), el cual es más importante en suelos con elevado contenido
en materia organica. Este efecto se produce por una serie de fenómenos como
son:
l a a d s o r c i ó n c o n l a m a t e r i a particulada del suelo, absorción a la materia
orgánica del suelo, a la baja difusividad de los compuestos, principalmente desde
los micro poros; a la disolución en fases líquidas no acuosas (FLNAs), o a la
formación de uniones covalentes con la materia orgánica e inorgánica del suelo.
Con finalidad de aumentar la biodisponibilidad de los contaminantes. Existen
numerosos ejemplos en la bibliografía de la utilización de la utilización de
tensioactivos sintéticos y biotensioactivos en la biorremediacion de suelos
contaminados por hidrocarburos.
Presencia de aceptores de electrones la mayor parte de hidrocarburos
presentes en los productos petrolíferos son degradados con mayor extensión
y rapidez de forma aeróbica (O2 como aceptor final de e l e c t r o n e s ) , y a q u e
e n a u s e n c i a d e O 2, y e n p r e s e n c i a d e a c e p t o r e s d e e l e c t r o n e s
alternativos (NO3-, SO42-, CO2, Mn4+ y Fe3+) los hidrocarburos pueden ser
degradados, pero con unas tasas de biodegradación muy inferiores a las
aeróbicas.

Nutrientes inorgánicos.
Las concentraciones de nitrógeno y fósforo asimilables presentes en el
suelo, suelen ser lim it antes para un increment o y activación de la
población m icr obiana, m ient ras que otros nut rientes esenciales
como el Ca2 Na+, Fe2+y SO42- ya est án presentes en cantidades suficientes
en el suelo. La adición de fuent es de N y P inor gánicas, gener alm ente
tiene un efecto positivo incrementando las poblaciones microbianas y las
tasas de biodegradación de hidrocarburos en suelos contaminados. Las
proporciones molares de C:N:P, descritas en la bibliografía, r especto al
cont enido de carbono a degr adar son muy dist int as. La Agencia de
Protección Ambiental de USA recomienda utilizar proporciones C:N
de100:10 a 1000:10 para la biodegradación de suelos contaminados por
hidrocarburos, y dentr o de est e intervalo se han descr it o proporciones
C: N de 600:10, 500: 10 y de 100:10:1 a 300:10:1 respecto al Carbono
Orgánico Total a degradar. Aunque en general la adición de fuentes inorgánicas
de N y P al suelo es beneficiosa para los procesos de biodegradación,
existen estudios que han descrito efectos inhibitorios en la adición de
nutrientes inorgánicos. Además es importante destacar que la acción de los
nutrientes inorgánicos puede estar limitada debido a la interacción química con los
minerales del suelo (el amonio se puede unir a las arcillas por intercambio
catiónico y el fosfato puede unirse y precipitar con iones calcio, hierro y aluminio).
Microorganismos reportados como degradadores de Petróleo:
- Todos los ecosistemas acuáticos y marinos contienen algún tipo de
microorganismo degradadores degradadores de petróleo, entre los géneros
reportados están:

- Bacterias:
- H o n g o s :

- También se ha reportado la utilización de dos especies camarones en la


biodegradación del petróleo, siendo estos Peanus duorarum y Peanus
aztecuz cuya capacidad de degradar los hidrocarburos casi en su totalidad van
desde los compuestos de 12 carbonos hasta los compuestos de 22 carbonos.
-La cantidad y diversidad de los microorganismos degradadores de petróleo
depende de la exposición de las aguas a estos hidrocarburos.
-La velocidad de degradación de los compuestos presentes en el petróleo es
como sigue:
HC saturados > aromáticos ligeros > aromáticos de alto PM > asfáltenos,
Resinas

I I I . O b j e t i v o s :
-Aislar bacterias degradadoras de Petróleo Diesel.
-Cuantificar la actividad degradativa del Petróleo Diesel de cada una de
las bacterias aisladas.

I V. M a t e r i a l e s y M é t o d o s :

Materiales:
 Muestra: 100 g de suelo de servicentro contaminado con Petróleo Diesel.
 Medios: Agar Bushnell Hass, Agar Tripticasa Soya, Petróleo Diesel.
 Frascos estériles.
 Tubos de dilución
 Tubos medianos
 Placas de Petri
 Gradillas
 Mechero Bunsen
 Asas bacteriológicas
 Viales
 Pipetas
 Jeringas
 Biorreactores tipo tanque Bacht Air Lift

Método:
Enriquecimiento de las muestras de suelo y adaptación de losmicroorganismos a
concentraciones crecientes de petróleo.
 Diseñar y acondicionar dos biorreactores tipo tanque Bacht Air Lift con flujo
descendente de 1 L de capacidad.
 Pesar 50 g de muestra de suelo previamente tamizada y llevarla hacia un
biorreactor conteniendo 100 mL de caldo Bushnell Hass (BH) con 1% dePetróleo
Diesel.
 Incubar a 30 ºC durante 72 h.-Tomar 10 mL de la muestra enriquecida y llevarla
hacia el segundo biorreactor conteniendo 100 mL de caldo BH con 2% de Petróleo
Diesel. Lavar y esterilizar el primer biorreactor.
 Incubar a 30 ºC durante 72 h
 Tomar 10 mL de la muestra enriquecida y llevarla hacia el primer
biorreactor conteniendo 100 mL de caldo BH con 4% de Petróleo Diesel.
 -Incubar a 30 ºC durante 72 h.
Aislamiento de las bacterias degradadoras de Petróleo Diesel.
 A partir de la m uestr a enr iquecida en caldo BH con 4% de Petr óleo
Diesel (PD) tomar una alícuota y sembrarla mediante la técnica de
agotamiento y estría sobre la superficie de placas de Petri conteniendo Agar BH
con 4% de PD.
 Incubar a 30 ºC durante 48 h.
 Seleccionar y repicar las cinco colonias que presenten la
m a y o r b i o m a s a y m a y o r rapidez en el crecimiento hacia viales
conteniendo agar BH con 4% dePD y agar Tripticasa Soya (TSA).
 Incubar a 30 ºC durante 48 h.
 Conservar las cepas de bacterias biodegradador as de PD en
refr igeración
Cuantificación de la actividad degradativa sobre el PD de cada una de las cepas de
bacterias aisladas.
La actividad degradativa sobre el PD de cada una de las cepas bacterianas aisladas será
cuantificada a través del tiempo requerido para la utilización del PD como fuente
de carbono y energía y del número de Unidades de Actividad Emulsificante (UAE) de
cada una de ellas.
Preparación del inóculo:
 Reactivar cada una de las cepas bacterianas degradadoras del PD en 5 mL
de caldo nutritivo a 30 ºC durante 24 h.
 Centrifugar el caldo nutritivo a 3500 RPM durante 15 min; eliminar el
sobrenadante y lavar el sedimento con SSFE por dos veces.
 Con el paquete celular obtenido preparar una suspensión de células en
SSFE y estandarizarla con el tubo Nº 3 del Nefelómetro de McFarland
(9x108 células/ml)

Ti em po requer ido para la uti lización del PD como f uent e de carbono y


ener gí a:
 De cada inóculo bacter iano pr eviament e estandar izado t omar 1 mL
einocular por triplicado en tubos de prueba de 16 x 150 mm conteniendo10
mL de caldo BH con 0,2 mL de resarzurina y 0,1 mL de PD (dejar untubo con
medio de cultivo no inoculado como testigo).
 Incubar a 30 ºC hasta por 5 días en agitación constante (150 RPM).
 Observar diariamente en busca del cambio de coloración del
indicador resarzurina (azul a rosado brillante) que será interpretado como
positivo para la utilización del PD como fuente de carbono y energía. -
Cuant if icación de las Unidades de Act ividad Emulsificant e:
 De cada inóculo bact eriano pr eviament e est andarizado t omar 1 m L e
inocular por triplicado con tubos de prueba de 16 x 150 mm conteniendo10 mL de
caldo extracto de levadura más 0,2 mL de etanol. Dejar un tubocon medio de
cultivo no inoculado como testigo.
 Incubar a 30 ºC durante 3 días en agitación constante (150 RPM).
 Diariamente observar en busca de la información de burbujas y turbidezdel medio
de cultivo.
 Centrifugar el contenido de cada uno de los tubos, a 2000 RPM durante30
min.
 Tomar 1 mL de cada uno de los sobrenadantes y colocarlos en tubos
de prueba conteniendo 9 mL de caldo levadura etanol más de 0,2 de
PD.Tapar herméticamente los tubos y agitarlos durante un min. Hasta lograr la
emulsión.
 Calibr ar a cero el espectr ofotómetr o con tubo “ blanco”
cont eniendocaldo ext racto de levadur a con etanol no inoculado
(testigo) y leer la absorvancia de cada una de las muestras a 540 nm.
 Realizar la conversión de la absorvancia de cada una de las muestras
aUAE considerando 0.816 de absorvancia como una Unidad de
ActividadEmulsificante por mL (1 UAE/mL).

V. R e s u l t a d o s :
-Tiem po requer ido par a la ut ilización del PD com o fuent e de carbono y
ener gí a:

-El indicador utilizado en este proceso de cuantificación fue el “púrpura de bromocresol”.


Este indicador se caracteriza por virar de acuerdo al pH, siendo amarillo a un pH menor o
igual a 5.2 y violeta a un pH mayor o igual a 6.8.

Inóculos a 15 días

-Cuantificación de las Unidades de Actividad Emulsificante:

Con el tubo blanco se lee la absorbancia a 540 nm. Luego los resultados obtenidos se los
divide entre 0.816 (1 UAE = 0.816).-Identificación de las cepas aisladas:
VI. Referencias:

- LU CHAU, T. (2006). Biorremediación. Dpto. de Ingeniería Química.Universidad de


Santiago de Compostela. Obtenido el 24 de marzo de 2008 en
http://www.usc.es/uscmn/investigacion/documento/Prestige-Biorremediaci%F3n.pdf
-VIÑAS C., M. Biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos:
caracterización microbiológica, química y ecotoxicológica. Facultad de Biologia.
Universidad de Barcelona. Obtenido el 24 de marzo de 2008 Biología. Universidad de
Barcelona. Obtenido el 24 de marzo de 2008 en
http://www.tesisenxarxa.net/TESIS_UB/AVAILABLE/TDX-0920105085623//
- Altamirano, M.G (2005). Aislamiento e identificación de bacterias hidrocarbuliticas
provenientes de un suelo sometido a biorremediación.
- Ortiz, J. y J. RODRIGUEZ (2007). Biomarcadores y su utilidad en laevaluación de la
biodegradación del petróleo. Obtenido el 24 de marzo de 2008
en http://ingenierosdeminas.org/docu/documentos/biomarcadores_petroleo.pdf
-V. BOTELLO, A. (1974) Utilización y degradación del petróleo crudo por
dosespecies de camarón: Penaeus duorarum y Peneaus aztecas Universidad Nacional
Autónoma de México. Centro de Ciencias del Mar y
Limnología.Obtenido el 24 de marzo del 2008 en

http://biblioweb.dgsca.unam.mx/cienciasdelmar/centro/1975-1/articulo11.html20