Artículo de investigación

Revista de Química Física y

Biofísica Journa al of Química Física y Biophysics ISSN: 2161-0398
REAL TIME MONITORING THE MAILLARD REACTION INTERMEDIATES BY HPLC-
FTIR
Abstracto
Los productos de reacción de Maillard en los procesos relacionados con la alimentación, la nutrición y
la industria farmacéutica son de gran interés en los casos donde las sustancias involucradas son
químicamente reactivas o inestables. Datos detallados usando espectroscopia FTIR vibratoria
de los productos de reacción de tipo Maillard son limitados y necesitan evidencias más experimentales
con mecanismos explícitos de
la reacción para demostrar cómo se evitan los azúcares reductores al formular las sustancias que
contienen aminas. La combinación de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con
espectrometría de infrarrojo por transformada de Fourier (FTIR)
es una poderosa técnica instrumental de separación-estructura sensible que permite la caracterización
en tiempo real de las especies químicas separadas. En esta breve revisión demostramos los beneficios
de la técnica de acoplamiento HPLC-FTIR estudiando el modelo de reacción de Maillard Sistema de
fructosa / asparagina.
Monitoreo en tiempo real de los intermedios de reacción de Maillard por HPLC-FTIR
Aristos Ioannou y Constantinos Varotsis *
Departamento de Ciencia y Tecnología Ambientales, Universidad de Tecnología de Chipre, PO Box
50329, 3603 Lemesos, Chipre
Palabras clave : reacción de Maillard; Asparagina; Fructosa; HPLC- ATR-
FTIR
Introducción
La reacción de Maiilard involucra tres etapas diferentes en las cuales
reacciones complejas tienen lugar entre azúcares reductores y amino libre
grupos de aminoácidos o péptidos. La etapa inicial implica el
formación de la base de Schiff y la formación de los productos Amadori
sin la formación de compuestos para ceño. La segunda etapa
implica la deshidratación del azúcar y la degradación de aminoácidos. En el
etapa final Las melanoidinas son los compuestos finales de nitrógeno heterocíclico
que en realidad son sustancias poliméricas que contienen nitrógeno que son
difícil de descomponer (Figura 1). La formación de acrilamida sigue
una serie de rutas posibles en el marco de las reacciones de Maillard en los alimentos
productos, en los que la ruta asparagine es la principal. Acrilamida
se ha demostrado que se origina a partir de la reacción de Maillard del amino
asparagina ácida con azúcares reductores y compuestos carbonílicos
derivado de la reacción de Maillard o de los procesos de oxidación de lípidos
[1-5] durante el calentamiento. Sin embargo, se demostró que la asparagine
la vía es la más predominante para la formación de acrilamida
a través de experimentos de marcado de isótopos [1]. Esto fue apoyado adicionalmente
por estudios modelo que muestran que el N-glicosilo de asparagina generó
veinte veces más acrilamida, en comparación con los α-dicarbonilos y el
Compuesto Amadori de asparagina que concluye que α-hidroxicarbonilo
compuestos, como la fructosa y la glucosa son más efectivos que otros
compuestos carbonílicos en la generación de acrilamida [3]. Asparagina sola
puede formar acrilamida a través de descarboxilación y desaminación, pero
la reacción es ineficiente dando rendimientos extremadamente bajos. Sin embargo,
asparagina en presencia del resto hidroxicarbonilo de reducción
los azúcares pueden producir acrilamida en el rango de 1 mol por ciento en el modelo
sistemas [3].
Hay pocos estudios que utilizan la capacidad de monitoreo de
Técnica FTIR para dilucidar la red de reacción en la acrilamida
vía de formación [6,7]. La base de Schiff descarboxilada (azometina)
ylide) y el producto de Amadori descarboxilado son intermedios clave
contribuyendo a la formación de acrilamida (Figura 1). Su pariente
importancia se determinó cuando los dos intermedios fueron
sintetizado y sus habilidades relativas para generar acrilamida bajo
Se investigaron las condiciones de calor seco y húmedo [6]. Uno de estos
intermedios es oxazolidin-5-on que fue monitoreado recientemente por
FTIR en un sistema de reacción modelo seco [7]. Imines formó subsecuente
a las reacciones de carbonil-amina se caracterizaron por espectroscopía FTIR.
Recientemente, se aplicó un método de microespectroscopía DSC-FTIR para detectar
vías continuas en la reacción de asparagina / glucosa en estado sólido [8].
En este trabajo, demostramos la viabilidad de aplicar el
Técnica sensible a la estructura de separación HPLC-FTIR para el tipo Maillard
reacción de los productos de fructosa-asparagina en tiempo real.
Experimental
Productos químicos
La acrilamida (> 99.5%) fue comprada de Panreac Quimica SA
(Barcelona, España). L-Asparagina monohidrato (> 99%) y fructosa
(> 99.5%) se compraron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO,
ESTADOS UNIDOS). El agua utilizada fue agua de calidad milli-Q (Millipore, Irlanda).
Se prepararon soluciones madre de acrilamida y estándares de calibración
en agua y mantenerse a -20 ° C hasta su uso. Todas las muestras fueron filtradas con
filtros de jeringa desechables (tamaño de poro de 45 μm, PTFE, Millex, Millipore,
Irlanda) antes del análisis.
preparación de la muestra
Soluciones equimolares de fructosa y asparagina (0.2 M) fueron
preparado en tampón de fosfato (0,1 M) y el pH se ajustó a la
valor deseado (pH 8). Las muestras (10 ml) se calentaron en tornillo cerrado
tubos tapados a 100, 120 y 140 ° C en un horno de calentamiento (Memmert,
Alemania). En tiempos de calentamiento predeterminados (30, 60, 90 y 120 minutos),
se tomaron muestras y se enfriaron inmediatamente en hielo y se almacenaron a -20 ° C
antes del análisis.
Configuración experimental
HPLC: se formó el producto de reacción de Maillard (MPR)
monitorizado en un sistema Shimadzu Prominence 20A HPLC que consiste en
de una bomba cuaternaria con desgasificador en línea, una temperatura controlada
horno de columna y un detector UV-SPD. Se tomó una alícuota de muestra de 1 μl
inyectado para la separación de LC, mientras que una alícuota de 100 l de la misma muestra

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J Phys Chem Biophys
ISSN: 2161-0398 JPCB, un diario de acceso abierto
Cita: Ioannou A, Varotsis C (2016) Monitoreo en tiempo real de los intermedios de reacción de
Maillard mediante HPLC-FTIR. J Phys Chem Biophys 6: 210.
doi: 10.4172 / 2161-0398.10002 10
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Volumen 6 • Número 2 • 1000210
fue inyectado para adquirir las mediciones FTIR. El análisis de HPLC fue
realizado en un tamaño de partícula de 4,6 × 250 mm, 5 μm, Zorbax SB-Aq
columna analítica (Agilent Technologies). Agua a un caudal de 0.5
ml / min se usó isocráticamente como la fase móvil a temperatura ambiente.
Los productos de reacción de Maillard (MPR) y la acrilamida se detectaron en
200 nm
FTIR: un espectrómetro Bruker Tensor 27 FTIR equipado con
Se usó un detector de sulfato de triglicina (TGS) para la adquisición de espectros
(Figura 1). Para controlar el espectrómetro, el paquete de software
Se usó OPUS 7.0 / IR / 3D (Bruker). La versión 7 de OPUS CHROM
El paquete de software (Bruker) se usó para adquirir espectros dependientes del tiempo
en el proceso de HPLC-FTIR acoplado. El resultado de la medida
realizado con el paquete OPUS CHROM fue una serie de espectros
tomado a intervalos de tiempo definidos y constantes. Durante la medición, el
los espectros adquiridos y las huellas generadas se muestran en tiempo real. UN
accesorio horizontal ATR (HATR) (Pike Technologies, Inc., Madison,
USA) se empleó para instalar un ATR líquido líquido de germanio
celda con diez reflejos internos. Esto permitió el bombeo de
soluciones sobre la superficie de Germanio ATR con volumen muerto mínimo.
El ATR horizontal está diseñado con un par de ópticas de transferencia para dirigir
el haz infrarrojo del espectrómetro a un extremo de la transmisión IR
Cristal ATR. Un par similar de óptica dirige el haz emitido desde
el otro extremo del cristal ATR al detector del espectrómetro. los
El cristal de germanio tiene forma trapezoidal con un grosor de 4 mm (Figura
1). Esta característica maximiza la señal al ruido de los espectros resultantes.
Los espectros se recolectaron en el rango de 900-1800 cm con una resolución de 8 cm
-1 -1

y 16 escaneos co-agregados cada uno (función de apodización: Blackman-Harris-

3-término). Se logró una resolución temporal de 8 espectros por minuto.
La velocidad del escáner fue de 20 kHz (frecuencia HeNe). Un fondo
espectro fue recolectado antes de cada medición de muestra con solo
agua que fluía pensó que la celda ATR. Esto fue usado para calcular el
espectros de absorción durante la medición de CHROM. El solo puro
se inyectaron sustancias y se realizó una ejecución cromatográfica.
Estos se usaron como espectros de referencia para la identificación asparagine
y azúcares. Los cambios de intensidad de los espectros en función del tiempo
se almacenaron como rastros en un archivo 3D para todas las mediciones de FTIR. Datos
la extracción y el procesamiento se llevaron a cabo utilizando el OPUS 7.0 / IR / 3D
(Bruker) software. Los espectros fueron extraídos del conjunto de datos 3D
del pico máximo cromatográfico y se representaron gráficamente
utilizando el software Origin Pro v8.0.
Resultados y discusión
Una nueva configuración analítica que permite la identificación simultánea de
se describen precursores y productos de la reacción de Maillard. Es
basado en cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con UV-
vis detector y una celda de flujo FTIR-ATR acoplados en serie. Separación
y determinación cualitativa de especies individuales de Maillard han sido
logrado usando varias técnicas cromatográficas, incluyendo GC-MS
y Cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento (HPAEC)
[9]. La principal ventaja de HPLC sobre GC en el contexto de análisis de MR
es que los compuestos solubles en agua no volátiles se pueden analizar directamente
sin la necesidad de derivatización previa. Sin embargo, alto rendimiento
la cromatografía líquida (HPLC) por sí sola tiene una capacidad limitada para
resolver adecuadamente y dar información sensible a la estructura cuando
analizando los compuestos de reacción de Maillard. Las fracciones recolectadas fueron
luego se analizó mediante la técnica ATR-FTIR.
Glicoconjugados, como N-glucósidos y compuestos relacionados
formado en la fase temprana de la reacción de Maillard se han propuesto
como intermedios clave que conducen a la formación de acrilamida [10]. Esta
la hipótesis fue apoyada por el trabajo de Yaylayan et al. y Zyzak et
Alabama. [1,11]. Ambos grupos proporcionaron evidencia de la importancia de Schiff
base de asparagina que se forma después de un paso de deshidratación. El Schiff
la base se forma temprano en la reacción de Maillard como resultado de la eliminación
de agua del conjugado de glucosa y asparagina [1,3].
El siguiente paso es la transformación de la base intermedia de Schiff
a un producto Amadori a través de una reorganización de Amadori. Siguiendo
esto, hay una reacción de descarboxilación del producto Amadori al
producto de Amadori descarboxilado. Por lo tanto, se considera que
paso mecanicista clave es la descarboxilación de la base Schiff líder
a otros productos intermedios que pueden liberar directamente acrilamida (Figura
2). Con respecto a la estructura, la asparagina sola es en teoría capaz de
se convierte térmicamente en acrilamida a través de la descarboxilación y
reacciones de desaminación, aunque experimentalmente este no fue el caso
siendo la maleimida el principal producto de reacción [11].
Cuando la asparagina y la fructosa reaccionan a altas temperaturas es
evidente principalmente a partir de los datos de HPLC que hay una mezcla de reactivos
y múltiples productos en el recipiente de reacción (Figura 3). Tiempo y
evolución dependiente de la temperatura de los productos de reacción de Maillard
(MRP), incluido el de la acrilamida fueron monitoreados en el Zorbax
columna que es altamente selectiva para moléculas polares en fases acuosas.
A pesar de que solo hubo una separación parcial de los dos
reactivos notamos que a 140 ° C hay degradación de asparagina y
fructosa como podemos observar desde los picos de absorción en el momento de reacción
(Rt) 5.4 y Rt 6.0 mins respectivamente (Figura 3). También es evidente que
el pico en Rt 5,7 minutos correspondiente a asparagine aumenta con el tiempo
a 140 ° C (Figura 3). En los espectros FTIR, el rango espectral entre
1200 y 1800 cm se muestra donde la mayoría de la asparagina FTIR
-1

las absorciones se encuentran [12-30].

En la Figura 4a-c mostramos los espectros HPLC-FTIR acoplados en la habitación
temperatura (Figura 4a) y T = 140 ° C (Figura 4b), en la Rt 5.5-6.5

Figura 1: Esquema del diseño experimental de la HPLC-FTIR acoplada

técnica. Las separaciones cromatográficas se realizaron por sistema HPLC
utilizando la columna Zorbax SB-Aq. La fase móvil se dirige a través de
una celda de flujo dedicada que comprende una célula de ATR de germanio que se usó para
detección de FTIR en línea.

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Monitoreo en tiempo real de los intermedios de reacción de Maillard mediante HPLC-FTIR. J Phys
Chem Biophys 6: 210.
min y 1200-1700 cm región espectral. Todos los rastros en la Figura 4a son
-1

reactivos no calentados a temperatura ambiente. Todos los rastros en la Figura 4b son aquellos
de los productos de reacción a T = 140 ° C. Todos los rastros en la Figura 4c son
espectros de diferencia del producto de reacción de asparagina-fructosa calentado en
el Rt = 5.5-6.5 min rango a pH 8 y T = 140 ° C (Figura 4b) menos el
los espectros no calentados se muestran en la Figura 4a. Los espectros en la Figura 4b revelan
cambios de intensidad en la región de la banda C = O de Asn a 1675 cm -1

así como un gran ensanchamiento en la región de Asn δ (NH ) a 1621 cm . 2 -1

Sin embargo, a partir de los datos FTIR absolutos debido a las vibraciones superpuestas
con las especies que no han reaccionado y dado que en las especies recién formadas
ν (C = O) y δ (NH ) se espera que retengan frecuencias similares con
2

aquellos sin reaccionar, no es posible asignar las vibraciones de

la nueva especie con certeza. Los espectros de diferencias FTIR en la figura
4c revela características a 1660, 1575 y 1387 cm . Basado en nuestro HPLC
-1

datos en Rt = 5.5-6.5 esperamos que los espectros FTIR tengan contribuciones

de la formación del grupo Schiff base Imine, el grupo enaminol
frecuencia de estiramiento y / o del Amadori y descarboxilado
Productos Amadori con distintas vibraciones C = O en los 1700 cm -1

región. Para la base de Schiff, el carbonilo (C = O) y NH grupos tienen 3

frecuencia muy similar con la de la Asn sin reaccionar y por lo tanto

son espectadores en la reacción sin ninguna contribución a las bandas
observado en los espectros de diferencia. Imines bajo las reacciones de Maillard
se han caracterizado, y como el primer paso en la carbonil-amina
interacción se han propuesto para jugar un papel crucial en la formación
de la base de Schiff y la degradación de los productos Amadori hacia
la formación de la 3-aminopropionamida y la acrilamida (Figura
1). La característica principal en el espectro FTIR de la imina (base de Schiff)
especie es la vibración de ν (-C = N) a 1660 cm . Dado que el 1660
-1

El modo cm se origina de la base de Schiff. Asignamos las otras vibraciones.

-1

a 1569 cm a HN-C y a 1388 cm a ν (C -N = C ). Tenemos

-1 -1 Fru Asn

excluido la posibilidad de que las especies que hemos observado originen

de Amadori o el producto Amadori descarboxilado debido
la falta de una vibración C = O en la región de 1700 cm . Sin embargo, no podemos
-1

excluir la posibilidad de que las especies que hemos observado provengan de

la isomerización de la base de Schiff solamente, formando el resto de enaminol
C -NH = CH (1660 cm ). En este caso, el 1589 y 1388 cm
Fru Asn -1 -1

modos se originan a partir de las vibraciones de estiramiento NH y C-N de la

resto de enaminol C -NH = CH , respectivamente. se debe notar que
Fru Asn

la concentración de la imina intermedia se incrementa a elevada

temperaturas y en condiciones alcalinas sin convertir
a un producto Amadori. Nuestros datos encuentran también apoyo de los resultados
de los sistemas modelo donde se demostró que las iminas se convierten
a los productos Amadori solo en condiciones ácidas y elevadas
temperaturas [12]. Esto sugiere que la amina desprotonizada inicial
ataque es favorecido por una forma protonada de la imina con el fin de proceder
a los productos Amadori y más allá. Otra característica que es claramente
evidente es la pérdida de la banda de asparagina de 1502 cm correspondiente a -1

el grupo amino y / o carboxilato de la cadena principal. Este apoyo adicional

la hipótesis de que hay pérdida del grupo amino de la cadena principal y
se produce una reacción de descarboxilación sucesiva.
El nuevo enfoque de la aplicación HPLC-FTIR para Maillard
la reacción tiene aplicaciones a otras reacciones químicas similares en los alimentos,
industria nutricional y farmacéutica sin la necesidad de aislar
la especie y caracterizarlos por separado. Este es el principal
Figura 2: Vía mecánica general de la reacción entre asparagine
y fructosa (R = CH OH, = CH O).
1 2 R2 2

Figura 3: cromatogramas de HPLC del tiempo y la temperatura (T = 25-140 ° C)

evolución dependiente de los productos de reacción de Maillard (MRP) a pH 8,0.
Figura 4: Espectros HPLC-FTIR de la mezcla de reacción de asparagina y fructosa
(pH 8,0) a 140 ° C. (a) Temperatura ambiente (b) Espectros de diferencia calentados (c).

ventaja de esta técnica de acoplamiento. Se puede concluir que lo real

tiempo de monitoreo de los enlaces imina se informa por primera vez
en el sistema fructosa-asparagina en condiciones fisiológicas.
Además, la formación de acrilamida a T = 140 ° C plantea una mayor
preocupaciones sobre la seguridad en el uso de fructosa con asparagina en tales
temperaturas Aunque los datos en nuestro manuscrito solo están cubiertos
análisis cualitativo un análisis cuantitativo más detallado en términos de
monitorear el porcentaje de conversión es necesario. Estos experimentos
están en progreso en nuestro laboratorio [31-41].
Expresiones de gratitud
Este proyecto fue cofinanciado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional
y la República de Chipre a través de la Fundación de Promoción de la Investigación (Proyecto
Salud / Alimentos / 0311 (ΒΙΕ) / 04).