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Introducción En PCR, el ácido desoxirribonucleico (ADN) es el analito.

Por tanto, una

buena muestra implica siempre un correcto proceso de obtención de esta molécula a partir de material
biológico. La extracción de ADN consta de una etapa de lisis, que consiste en romper las estructuras que
confinan el citoplasma y liberar al medio su contenido y otra de purificación, que implica la retirada de la
solución final de la mayoría de elementos que pueden interferir en la PCR. De los tres pasos críticos que
componen el análisis de patógenos por PCR (Fig. 1), la extracción de ADN es quizás el más desconocido y
sobre el que más control podemos ejercer.

La extracción del ADN de las células o virus donde se halla confinado es un paso previo en muchos
procedimientos analíticos y diagnósticos

Etapas en la extracción de ADN Los pasos necesarios para una


correcta extracción y purificación del ADN mediante un
procedimiento químico son:
1. Lisis de las células o virus. Las sales caotrópicas ayudan a romper la estructura tridimensional de
macromoléculas como las proteínas o los ácidos nucleicos consiguiendo su desnaturalización. La adición de
un detergente como el SDS es necesaria a menudo para eliminar las membranas.

2. Degradación de la fracción proteica asociada al ADN. Se consigue mediante la adición de una proteasa. La
fracción proteica puede precipitarse mejor con la ayuda de sales como el acetato de amonio o el acetato
sódico.

3. Purificación. Consta de 3 fases:

• Precipitación del ADN. El ADN es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar etanol frío o
isopropanol i recuperar mediante una centrifugación. El alcohol del sobrenadante se llevará las sales
añadidas previamente.

• Lavado del pellet. Se realiza con alcohol frío volviendo a centrifugarse

• Recuperación. El sedimento se puede re suspender en agua o tampón Tris tras ser secado
completamente. La confirmación de la presencia de ADN se lleva a cabo mediante electroforesis en un gel
de agarosa i posterior tinción con bromuro de etidio y observación con luz UV o directamente al
espectrofotómetro mediante espectro de absorción de 200 a 350 nm. El ADN purificado se puede cuantificar
con un espectrofluorímetro mediante el uso de fluoróforos específicos (Picogreen®, Molecular Probes) El
paso 3 puede realizarse con la ayuda de mi

ni columnas equipadas con una membrana de sílica que retiene específicamente el ADN permitiendo el paso
de las moléculas y sales que acompañan la reacción de lisis. Finalmente se lava con alcohol y se eluye el
contenido