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Capítulo 7

Crecimiento mícrobíano
n este capitulo se describen los métodos usados para medir el crecimiento microbia-
u no, asi como las diversas fases y modos de crecimiento. La exposición se centra en el
crecimiento de las bacterias unicelulares, ya que éstas son el material ideal para el estudio
del proceso de crecimiento, y han sido ampliamente utilizadas para aclarariu naturaleza.

DEFINICION DE CRECIMIENTO
En cualquier sistema biológico, el crecimiento puede ser definido como el aumento ordena-
do de todos los componentes quimicos. El aumento de masa, por sí solo, podria no indicar
un crecimiento real, ya que las células podrian estar incrementando su contenido única-
mente en productos de reserva, tales como el glucógeno o el poli-p-hidroxibutirato. En un
medio adecuado, y al cual se han adaptado perfectamente, las bacterias se encuentran en
un estado de crecimíento equilíbrado. Durante un periodo de crecimiento equilibrado, una
duplicación de la biomasa va acompañada de una duplicación de todas las demás propie-
dades medibles de la población, por ejemplo, proteinas, RNA, DNA y agua intracelular.
En otras palabras, los cultivos en crecimiento equilibrado mantienen una cómposición qui-
mica constante. La existencia del crecimiento equilibrado simplifica la tarea de medir la ve-
locidad de crecimiento de un cultivo bacteriano; como la velocidad de crecimiento detodos
los componentes de una población es la misma, la medid a de cualquíer componente basta
para determinar la velocidad de crecimiento.

195
196 Creci miento m icrob ia n o

ponentes del cultivo aumenten en un factor de Z.Larela-


NATURALEZA Y EXPRESION ción entre g y k puede deducirse de la ec.7.3, dado que
MATEUÁrrcA DEL cREcrM rENTo si el intervalo de tiempo considerado (t t) es igual ag.
-
entonces Z equ ivaldrá al doble d e Z o. Haciendo substi tu-
Un cultivo microbiano en crecimiento equilibrado imita ciones, se obtiene
una reacción autocatalitica de primer orden; es decir, la
velocidad de aumento de bacterias en un tiempo dado es 0,693
(7.6
proporcional al número o masa de bacterias presentes en g(l
ese tiempo.
En el ejemplo indicado, el tiempo de duplicación
velocidad de aumentod"r,lff promediog del cultivo elg: 0,693/2,303 : 0,42 he
:tl"H:side céruras¡ (7.r) ras, o sea, 25 minutos. Esta es una velocidad de creci-
miento relativamente alta para una bacteria, como se ob
La constante de proporcionalidad, k es un índice de serva en los ejemplos representativos indicados en la
la velocidad de crecimiento y, Por ello, se denomina tabla 7.1.
constante de velocídad de crecimiento. Dado que supo- Las anteriores ecuaciones matemáticas del creci-
nemos que el crecimiento es equilibrado, k también rela- miento bacteriano se han deducido a partir de la premisa
ciona la velocidad de crecimiento de cualquier compo- de que la velocidad de incremento es proporcional al nu-
nente celular determinado con la cantidad de ese compo- mero (o masa) presente en cualquier momento dado. A
nente, lo que en términos matemáticos es: partir de este supuesto, se demostró (Ec. 7.6) que el
tiempo de duplicacióng es constante durante unperíodo
{:dt k¡v,
#: u*, #: ot (7.2\ de crecimiento equilibrado. Las mismas ecuaciones pue-
den deducirse a partir de la premisa de que el tiempo de
duplicación promedio es constante, de lo cual se deriva
donde N es el número de células /ml,X es la masa de cé-
la conclusión de que la velocidad de incremento del nu-
lulas/ml, Zeslacantidad de cualquier componente celu- mero (o masa) es proporcional al número (o masa) en
lar/ml, f es el tiempo y k es la constante de velocidad de cualquier momento dado.
crecimiento. De hecho, estas ecuaciones describen ade-
cuadamente el crecimiento de la mayoría delos cultivos
de bacterias unicelulares. Otras formas de ellas (no dife-
renciales) son más útiles en la práctica. Por ejemplo, me-
diante la integración de la Ec. 7.2 se obtiene:
TABLA 7.I
ln Z - ln Zs: k(t - to) (7.3)
Velocidades máxlmas de creclmiento registradas para
y al convertir los logaritmos naturales en decimales, ciertas bacterias, a la temperatura óptima o cercena !
ella, en medios complejos a menos que se indique
otra cosa
log,o Z - logro tr : - ro) (7.4\
h(l Tiempo de
donde los valores de Z y Zo conesponden a la cantidad Temperatura duplicaciori
de cualquier componente bacteriano del cultivo en los Organismo CC) (horas)
tiempos t y to, respectivamente. Midiendo Z y Zo, puede
calcularse el valor de k, la constante de velocidad de cre- Víbrío natríegens 37 0,16
Bacillus 60 0,14
cimiento del cultivo. Así, si el cultivo contiene l0a célu-
las/ml en t0 y 4 horas más tarde 1S células/ml, la velo- stearothermophilus
Escherichía colí 40 0,35
cidad de crecimiento específica del cultivo es 40 0,43
Bacíllus subtilís
Pseudomonas putida 30 0,?5"
, (8 - 4)2,303
k:Y:2,3o3 horafl (7.s) Víbrio marinus l5 1,35
Rhodobacter 30 2,2
sphaeroides
El valork es suficiente para definir la velocidad de
de Mycobacterium 37 -6
crecimiento de un cultivo. No obstante, también se utili- tuberculosis
zanamenudo otros parámetros. Uno es el tiempo de du- Nítrobacter agilís 21 -2V
plicación promedio o tiempo de generación @'), que se
o Crecimiento en un medio sintético.
define como el tiempo requerido para que todos los com-
C rec i m iento m icrob ia no 197

FIGURA 7,1
Comparación de los métodos para re-
presentar gráficamente los datos del
crecimiento. La representación del lo-
gar¡tmo de la densidad de población
(número de células/ml. /V)de un culti-
¿ vo en crecimiento equilibrado, en fun-
k12,303 ción deltiempo, da una recta (a), cuya
= pendiente es la constante de veloci-
dad de crecimiento (/<) dividida por
2,303, y la ordenada en el origen es
log /Vo. La representación de la densi-
dad de población directamente en
función del tiempo da una curva ex-
ponencial (b).

Tiempo Tiempo
(a) (b)

:-a curva de crecimiento dades. En consecuencia, las células en la fase estaciona-


ria tienen una composición quimica diferente a la de las
La ecuación7 .4 predice una relación lineal entre el loga- células en fase exponencial. La composición celular en
itmo del número de células (o cualquier otra propiedad la fase estacionaria depende del factor limitante especí-
nedible de la población) y el tiempo [figura 7.1 (a)1, con fico del crecimiento. A pesar de esto, pueden hacerse
'.rna pendiente igual ak/2,303 y una ordenada en el ori- algunas generalizaciones: las células en la fase estacio-
gen de log¡fo. Tomando antilogaritmos, la Ec. 7.4 pue- naria son más pequeñas que en la fase exponencial (dado
Je escribirse de forma exponencial: que la división celular continúa después que el incremen-
to de masa se ha detenido), y son más resistentes a agentes
Z: ZolÚ(r-ro)/2.3o3 (7.7) fisicos (calor, frío, radiaciones) y químicos adversos.

la cual predice una relación exponencial entre el número


Je células en la población (o cualquier otra propiedad La fase de muerte
nensurable) y el tiempo [figura 7.1 (b)1. Las poblaciones
Je bacterias que crecen de modo que se cumplen estas Las células bacterianas mantenidas en un estado en el
ecuaciones se dice que están enlafase exponencial olo- que no hay crecimiento llegan a morir. La muerte es con-
¿arítmíca de crecímiento. secuencia de diversos factores; uno importante es el ago-
Las poblaciones microbianas raramente mantienen
un crecimiento exponencial a altas velocidades durante
,argo tiempo. La razón es evidente si se consideran las
--onsecuencias del crecimiento exponencial. Una sola FIGURA 7.2
'racteria con un peso Curva generalizada de crecimiento de un cultivo bacteriano.
aproximado de l0-'2 gramos y un
-jempo de generación de 20 minutos produciria tras 48
:roras de crecimiento exponencial una descendencia de
:.2X 103' gramos, es decir, unas 4000 veces el peso de Fase de muerte
.a Tierra. go
-o
El crecimiento de las poblaciones bacterianas está li- .9
nitado normalmente por el agotamiento de los nutrientes 6>
p.t (E
Jsponibles o por la acumulación de productos tóxicos O=
Jel metabolismo. Como consecuencia, la velocidad de E .o)
'Eo
9o Fase
:recimiento disminuye y el crecimiento llega a detener- óE exponencial
se. En este punto se dice que el cultivo está en lafase es- JO
o
:acíonaría (figura 7.2).Latransición entre la fase expo- .tE
:rencial y la estacionaria implica un período de creci- c
níento desequílibrado, durante el cual los diversos com-
:onentes celulares son sintetizados a diferentes veloci- Tiempo
198 Creci miento m icrobia na

de iniciar el crecimiento. Este período de ajuste, denomi-


nadofase de latencía (figura 7 .2)tieneuna duración mu¡'
variable; en general su longitud está relacionada con la
duración de la fase estacionaria precedente.

=e Crec imie nto a ritmétlco


o
o
(¡)
o
En determinadas situaciones anormales. la cinética del
o
crecimiento bacteriano puede ser aritmética en vez de
o exponencial. En estos casos, la velocidad de incremento
o) es una constante, es decir,
E
(E

(!
q) dN
(! ü:c 0's
(l,
tn
(!
donde C es una constante; y tras la integración:

N - No: C(f - ro) 0.9

El número de células (M), y no su logaritmo, es fun-


ción lineal del tiempo (f).
Diversas condiciones pueden conducir al crecimien-
to aritmético. Por ejemplo, si a una bacteria que requiere
ácido nicotinico como factor de crecimiento se le priva
de este nutriente, es incapaz de sintetizar nucleótidos de
Tiempo piridina, de los cuales el ácido nicotinico es un precurso:
biosintético especifico. Como resultado de las funciones
FIGURA 7.3 de los piridin-nucleótidos en el transporte de electrones.
Crecimiento lineal de E. coli en un medro que contiene un análo- su concentración en la célula determina la velocidad glc'
go de aminoácido, p-fluorofenilalanina. El crecimiento exponen-
bal del metabolisño y, por tanto, del crecimiento. Cuan-
cial del cultivo (línea a trazos) se hace linear (línea continua)
después del momento en que se añade el análogo (indrcado por la do no puede haber síntesis de esos compuestos, la vele
flecha vert¡cal). cidad de crecimiento de la población se hace directa-
mente proporcional al suministro de nucleótidos de pin-
dina a las células; el poder catalitico total no incrementa
tamiento de las reservas celulares de energia. Al igual más. Por ello, la velocidad de incremento de células per-
que el crecimiento, la muerte es una función exponencial manece constante. La adición de¡fluorofenilalanina, un
y de aqui que en una representación semilogaritmica (fi- análogo del aminoácido natural fenilalanina, a un cul-
gúra 7 .2) la fase de muerte venga representada por una tivo, también ocasiona un crecimiento aritmético (frgu-
disminución lineal del número de células víables a lo lar- ra1 .3\. El análogo es lo suficientemente parecido al ami-
go del tiempo. La velocidad de muerte de las bacterias es noácido natural que es incorporado en vez de éste en las
muy variable y depende tanto del ambiente como del or- proteinas que se sintetizan de nuevo. Sin embargo, las
ganismo en concreto (por ejemplo, las bacterias entéri- proteinas que contienen p-fluorofenilalanina no sueler.
cas mueren muy lentamente, mientras que las células ve- ser funcionales y de aqui que no incrementen la capaci-
getativas de diversos Bacíllus ssp. lo hacen con rapidez). dad catalitica de la célula. En consecuencia, la veloc:-
dad de crecimiento no puede aumentar por encima de la
determinada por la capacidad catalitica de las células e::
La fase de latencia el momento de la adición del análogo al cultivo.
Ciertas mutaciones que impiden la sintesis de una
.-as células transferidas de un cultivo en fase estaciona- proteína esencial en un ambiente particular determinar.
lia a un medio fresco de igual composición experimentan un crecimiento aritmético cuando el cultivo es expuestc
Lrn cambio de composición quimica antes de ser capaces a ese ambiente.
199

¡' EDICIÓN DEL CRECIMIENTO


ln -guir el curso del crecimiento es necesario efectuar
u::ones cuantitativas. Tal como se ha comentado an-
¡r,r aTl€flte, el crecimiento exponencial es por lo general .g
o
.¡' .:brado, de modo que para poder determinar la velo- c(o
:r-i de crecimiento puede utilizarse la medición de -o
o
:r¡ quier propiedad de la biomasa. Por comodidad, las at,
o
r:e:edades habitualmente medidas son la masa celular
: :. rúmero de células.

'''=r ción de la masa celular

i rnica manera directa de medir la masa celular es de- Masa celular bacteriana (miligramos
::rinar el peso seco del material celular en un volumen de peso seco por mililitro)
". : del cultivo. Para ello, hay que separar las células del
FIGURA 7.4
:edio, secarlas y pesarlas. Tal determinación requiere
: -:ho tiempo y es relativamente poco sensible. Con un Relación existente entre la absorbancia de una suspensión de
bacterias y la masa celular bacteriana. Puede observarse que la
::.:ipamiento ordinario es dificil pesarcon exactitud me- proporcionalidad es estricta solamente a valores bajos de absor-
r:s de I .g, y sin embargo este peso seco puede suponer bancia, y que varía a valores de mayor absorbancia; nótese tam-
:. equivalente a unos 5000 millones de bacterias. bién que las mediciones son más sensibles con luz de longitud de
La técnica más adecuada para medir la masa celular onda (I) más corta.
:e los microorganismos unicelulares es un método ópti-
r:r QU€ consiste en medir la cantidad de luz difractada por
::a suspensión de células. Esta técnica se basa en el he- nificado solamente cuando se usan conjuntamente con
::o de que las partículas pequeñas difractan la luz, den- una curva estándar como la representada en lafigura7.4.
:o de ciertos límites, de manera proporcional a su con- Como la difracción es inversamente proporcional a la
:entración. Cuando un haz luminoso pasa a través de cuarta potencia de la longitud de onda de la luz que se di-
-:na suspensión bacteriana, la reducción en la cantidad fracta, la sensibilidad de las mediciones incrementa ne
Ce luz transmitida a consecuencia de la difracción es pues tablemente si se utiliza luz de longitud de onda más cor-
una medida de la masa bacteriana presente. Tales medi- ta; en general, sin embargo, el límite inferiorde sensibili-
ciones se hacen normalmente con unfotómetro o un es- dad del método se alcanza cuando las suspensiones bac-
oectrofotómetro. Un espectrofotómetro está equipado terianas contienen unos l0 millones de células pormilili-
con un prisma o una red de difracción que permite la ilu- tro. Para medir con mayor sensibilidad la luz difractada
rninación de la muestra con luz de un margen estrecho y existen instnrmentos denomin ados nefelómetros, que pG
ajustable de longitudes de onda; un fotómetro tiene fil- seen un dispositivo sensor de luz colocado en ángulo rec-
tros intercambiables que permiten pasarun margen rela- to respecto alhazde luz incidente, porlo que pueden me-
tivamente amplio de longitudes de onda. Estos instru- dir directamente la luz difractada (flrgura 7 .5).
mentos miden en unidades de absorbancia(A); la absor-
bancia se define como el logaritmo del cociente entre la
intensidad de la luz incidente sobre la suspensión (10) y Medición del número de células
la de la luz transmitida por la suspensión (I):
El númerode organismos unicelulares de una suspensión
puede determinarse microscópicamente contando las dis-
I : loelf (7.10) üntas células que hay en un pequeño volumen medi-
do con exactitud. Tal operación se lleva a cabo habitual-
mente en unos portaobjetos especiales denominados có-
Estos instrumentos son adecuados para estimar con- maras de recuenfo. Estas cámaras van marcadas con
centraciones celulares y, cuando se calibran con suspen- cuadros de área conocida y admiten una fina capa de lí-
siones bacterianas de concentración conocida (figu- quido de profundidad conocida entre el portaobjetos y el
ra7 .4), constituyen un método exacto y rápido de deter- cubreobjetos. Ello permite conocer exactamente el ve
minar el peso seco bacteriano por unidad de volumen del lumen de líquido conespondiente a cada cuadrado de la
cultivo. Debe destacarse que tales mediciones tienen sig- cámara. El cómputo directo se denominarecuento total
200 Crecimiento m icrobia. :
Fotómetro Luz FIGURA 7.5
difractada Comparación entre la disposición de los compone.:i:
r_¡ ópticos de un fotómetro y de un nefelómetro. La ma.:
r-\
Vl=l
=--i I tl
Vríl
sensibilidad del nefelómetro se basa en que mide la -:
difractada en vez de la luz no difractada residual.

Tubo
Fuente luminosa fotoeléctrico
Lente Suspensión (sensor de luz)
- colimadora bacteriana

Nefelómetro

tl -"--a
.\_\\ Luz no difractada
H
EI
=_
uente luminosa
Lente
colimadora

Tubo fotoeléctrico
(sensor de luz)

de células e incluye tanto las células viables como las no celular. [,os orificios que se usan habitualmente pa::
viables, ya que, al menos en el caso de las bacterias, no contar bacterias tienen 30 micrometros de diámetro. Pc'
se pueden distinguir unas de otras por examen micros- consiguiente, el liquido de la suspensión debe estar es-
cópico. crupulosamente libre de partículas extrañas (por ejee
La limitación principal del recuento microscópico di- plo, polvo), ya que las más pequeñas serían contada¡
recto de poblaciones bacterianas viene impuesta por como células y las mayores obturarían el orificio.
la necesidad de utilizar suspensiones celulares relativa- El cómputo de organismos unicelulares puede tan-
mente concentradas. El gran aumento que es necesario bién realizarse por recuento en placa, ya que las célula,
para observar las bacterias limita el volumen de liquido viables, separadas unas de otras por dispersión sobre :
que puede examinarse cuidadosamente al microscopio; dentro de un medio de agar, dan lugar al crecer a colc-
al mismo tiempo, el número de células que debe haber en nias independientes visibles macroscópicamente. De aL
el volumen determinado hade ser suficientemente eleva- que si se preparan diluciones apropiadas de unapoblacic'-
do para que elrecuento sea estadisticamente significati- bacteriana y se siembra con ellas un medio conveniente
vo. Por consiguiente, en las cámaras de recuento diseña- puede calcularse el número de células viables en la pt-
das para bacterias sólo pueden contarse con cierto gra- blación inicial contando el número de colonias que se de-
do de exactitud las suspensiones que contienen l0 o más sarrollan después de incubar las placas y multiplicand:
millones de células por mililitro. dicho valor por el factor de dilución. Este método c:
Para el recuento directo de células de una suspen- cómputo se denomina a menudorecuento víable,ya que
sión puede utilizarse también un instrumento electró- en contraste con el recuento microscópico directo y co:
nico llamado contador de Coulter, según el nombre de el recuento electrónico, mide sólo aquellas células qu:
su inventor. Se hace pasar una parte pequeña de la sus- son capaces de crecer en el medio sólido empleado. E
pensión al interior de un tubo de vidrio a través de un ori- recuento de viables es con mucho el método más sensibl:
ficio muy pequeño. Este orifrcio cierra un circuito eléc- para la determinación del número de bacterias ya qu:
trico establecido, a través del liquido de suspensión, en- permite detectar incluso una sola célula viable en un:'
tre un electrodo del interior y otro del exterior del tubo. suspensión. Su exactitud depende de que se tomen cie:-
La detección se basa en las diferencias de conductividad tas precauciones. El número de colonias que se cuenta:.
entre las bacterias y el liquido de suspensión (que con- debe ser significativo (el error estándar es aproximada-
duce bien la electricidad). La conductividad disminuye mente igual a la raiz cuadrada del número de colonia.
cadavez que una bacteria pasa a través del orificio; esto contadas); preferentemente se deben contar dos o tres
es detectado y registrado electrónicamente. El aparato placas con varios cientos de colonias en cada una. As:-
puede evaluar la magnitud y duraeión de los cambios de mismo, si se está determinando el número de células d.
conductividad, por lo que puede registrar tanto el nú- un cultivo en crecimiento, es importante tener en cuent¿
mero como la distribución de tamaños de una poblaciÓn que ese número continúa creciendo durante el proceso de
Creci m i ento m i crob ia no 201
divisiones celulares y se examina con el microscopio de
contraste de fases. En estas condiciones, resulta fácil
identificar las células viables, ya que forman microco-
lonias, pudiéndose determinar con precisión su propor-
ción respecto a las no viables, que no se multiplican (fi-
gura 7.6).

Medición de un constituyente celular

FIGURA 7.6 A veces, a causa del tipo de crecimiento (las células pue-
Determinación de la viabilidad bacteriana por combinación del
den formar filamentos o grupos dificilmente dispersa-
crecimiento con el examen microscópico. Se extendió una mues- bles), o de la complejidad del medio, resulta muy poco
tra de un cultivo sobre una fina capa de un medio con agar, y se práctico medir la masa o el número de células. En estos
fotografió después de una incubación de 3,5 h. Las células via- casos, el crecimiento puede medirse calculando la canti-
bles formaron microcolonias. Tomado de J. R. Postgate. J. E.
dad de un constituyente celular determinado (por ejem-
Crumpton y J. R. Hunter; <The Measurement of Bacterial Viabili-
ties by Slide Culture¡t, J. Gen. Microbiol. 24, 15 (1961). plo, proteinas, peptidoglicano, DNA, RNA o ATP) en
el medio. Con frecuencia, tales mediciones son también
el método más práctico de calcular la masa y el creci-
miento microbianos en un ambiente natural.
dilución, incluso si el líquido utilizado para ésta no es
adecuado para mantener un crecimiento continuado. El
crecimiento celular no puede ser detenido sin afectar la
viabilidad. Un enfriamiento rápido antes o durante la di- EFICIENCIA DEL CRECIMIENTO:
lución puede ocasionaren ciertos casos lamuerte de una RENDIMIENTO
parte considerable de la población, fenómeno denomina-
do choque por frío. La cantidad neta de crecimientode un cultivo bacteriano
Para determinar la fracción de células viables de la es la diferericia entre la masa celular (o número de cé-
población puede utilizarse una combinación de los re- lulas) utilizada como inóculo y la masa celular (o núme-
cuentos total y viable, ya señalados. De modo alternati- ro de células) presente en el cultivo cuando se llega a la
vo, la fracción de viables puede determinarse directa- fase estacionaria. Cuando el crecimiento está limitado
mente mediante una técnica que combina el examen mi- por un nutriente determinado, existe una relación lineal
croscópico con el crecimiento. Se extiende una muestra frja entre la concentración inicial de dicho nutriente y el
de la población convenientemente diluida sobre una fina crecimiento neto resultante, según muestra la figura 7.7.
capa de un medio con agar vertido sobre la superficie de La masa de células producida por unidad de nutriente
un portaobjetos estéril. Se incuba durante un periodo de limitante es, por consiguiente, una constante (It) conoci-
tiempo suficiente para permitir que tengan lugar varias da como rendímíenfo (<growth yield>). El valor de Iz

2.0 _T
a<
=t
9x
:F e3
93
E3
'=o
9b
to-
1.0 trcL FIGURA 7.7
óo
ge Relación existente entre el crecimiento total de
@(o
s= oot u;ra bacteria aeróbica lPseudomonas sp.) y la
E
.0)
O
concentración inicial del nutriente limitante(fruc-
tosa). Los experimentos se llevaron a cabo en un
medio sintético con fructosa como única fuente
de carbono y energía. La pendiente de la línea es
24 el rendimiento (n de la bacteria creciendo con
Concentración de azúcar (mg/ml) fructosa (véase el texto).
202 Crecimiento microbiano
puede calcularse a partir de mediciones del crecimiento En el caso de los microorganismos quimioheterotrG
total mediante la ecuación ftcos, el rendimiento medio en función de la cantidad de
substrato orgánico utilizado, suministra un índice de la
Y: X-Xo (7.t l) eficiencia de conversión del substrato en masa bacteria-
na. Los resultados de la figura7 .7 se obtuvieron con una
pseudomonas quimioheterotróficas aeróbica estricta cre.
ciendo en un medio sintéüco que contenía fructosa como
donde X es el peso seco/ml de las células cuando el única fuente de carbono y energía. El examende la gr¡ifi-
cultivo entra en la fase estacionaria, Xo el peso seco/ml ca indica un rendimiento de aproximadamente 0,4. Te-
inmediatamente después de la inoculación y C la con- niendo en cuenta que el contenido en carbono de la fruc-
centración del nutriente limitante. tosa y del material celular es, respectivamente, el40 y 50
El rendimiento puede medirse paracualquier nutrien- por ciento, la fracción de carbono de la fructosa que se
te que se imponga y una vez determinado puede emplear- convierte en carbono celular es 0,5. Es decir, este micrc'
se luego para calcular la concentración de dicho nutrien- organismo utiliza la mitad del carbono de la fructosa e:
te en una mezcla desconocida, midiendo sencillamente producir material celular, y oxida la otra mitad a CO.
qué crecimiento soporta una muestra de la mezcla desco- Experimentos con otras bacterias quimioheterotrófr c a¡
nocida cuando se añade a un medio completo en todos aeróbicas, gü€ utilizan azúcares como única fuente c
los aspectos en el nutriente limitante. La determinación carbono, indican que la fracción de carbono de los az'*
de este tipo se conoce como bioensayo. Hace algunos cares convertida en carbono celular puede oscilar enn
años, se uülizaba generalmente el bioensayo para calcu- el20 y el50 por ciento. Las diferencias existentes refle
lar la concentración de aminoácidos y vitaminas en ali- jan probablemente la distinta eficiencia con que puede:
mentos. Ahora se han hecho más frecuentes los métodos utilizar el substrato para generar ATP; a continuación s
químicos y fisicos, aunque el fundamento del bioensayo describen pruebas que apoyan esta interpretación.
sigue siendo una herramienta de investigación para de- Cuando ciertos microorganismos fermentadores e>-
tectar y cuantihcar compuestos con actividades favore- trictos se cultivan en medios ricos,los experimentos cc:
cedoras del crecimiento. Para realizar un bioensayo so- marcadores radiactivos muestran que poca o ningur::
lamente se requiere una cepa microbiana para la cual la cantidad de carbono del substrato fermentable se co:.-
substancia a ensayar sea un nutriente esencial. vierte en material celular. En estas condiciones. el maI:-

TABLA 7.2
Rendlmientos de crecimiento de microorganismos fermentadores
calcul¡dos mediante la glucosa fermentada o del ATP producido

Rendimíento molar, expresado en


Moles de ATP formados gramos de materia celular por mol, dt
Fermentación por mol de glucosa
Organísmo v ntta fermentada Glucosa fermentada ATP produc::

S ac c haro my ce s c erev i s í ae Alcohólica: 2l 10,5


(levadura) Embden-
Meyerhof
Streptococcus faecalís Homoláctica; 22 I 1,0
EmMeb
Meyerhof
Lactobacillus Homoláctica; 2L 10,5
delbruckií EmMen-
Meyerhof
Zvmomonas mobilis Alcohólica; 8,6 8,6
Entner-
Doudoroff
Crecimiento microbiano 203
rial celular procede de los otros componentes del medio FIGURA 7.8 FIGURA 7.9
(aminoácidos, purinas, pirimidinas, etc.), y el substrato Técnica de Helmstetter- Crecimiento sincrónico de E. coli en
fermentable sirve únicamente como fuente de energía. El Cummings para obtener medio mfnimo de glucosa. Elefluen-
rendimiento en ATP de muchas fermentaciones es conG cultivos sincrónicos. te de un cultivo adherido a un filtro
de membrana (técnica de Helmstet-
cido,y el celular (gramos de peso seco) por mol de ATP ter-Cummings) fue recogido duran-
producido (It^*) es de unos l0 gramos de material te 3 minutos e incubado a 3O"C. Se-
celular/mol de ATP, lo que sugiere que la energía re- gún A. G. Marr. P. R. Paintery E. H.
querida para poümenzar elementos estruchrrales car- Nilson, aGrowth and Division of In-
dividuaf Bacteriar. en Microbial
bonados a macromoléculas no varia mucho entre di- Growth, 19 Symposium de la So-
ferentes microorganismos. Esta constancia no se ob ciety of General Microbiology (Cam-
serva si consideramos el rendimiento celular por mol bridge: Cambridge University Press,
1969).
de substrato fermentado, y aque distintos microorganis-
mos pueden fermentar un mismo substrato por rutas que
difieren en el rendimiento de ATP. Por ejemplo,Zymo- E
\.4
monas mobilis fermenta la glucosa dando alcohol etíli- ov
I
o
co a través de la ruta de Entner-Doudoroff, produciendo
x
I mol de ATP por mol de glucosa; las levaduras, por el o4
.E
contrario, fermentan la glucosa a alcohol etílico a través
.(l,
de la ruta de Embden-Meyerhof, produciendo 2 moles de =('t e
c'
ATP por mol de glucosa. Laslevaduras producen consi- E
derablemente más células por mol de glucosa fermenta- o
o2
da que Zymomona.t, pero aproximadamente la misma E
rJ
cantidad por mol de ATP originado en la fermentación z
(tabla 1 .2).Laconstancia aproximadade Yn* puede uti- r.0 2.0 3.0
lizarse para deducir el rendimiento en ATP de una ruta Tiempo (horas)
disimilatoria desconocida.

CRECIM I ENTO SI NCRÓNICO


Hasta ahora se ha descrito el modelo de crecimiento de por centrifugación. En estudios fisiológicos son prefe-
poblacíones bacterianas. Estos estudios no permiten con- ribles las técnicas basadas en la selección a las basadas
cluir nada sobre el tipo de crecimiento de las distintas ce- en la inducción, ya que las técnicas de inducción pueden
lulas, ya que en la mayoria de los cultivos bacterianos ocasionar cambios cíclicos que no son tipicos del ciclo
el tamaño celulkar (y, por lanto, la edad celular) está celular normal.
distribuido al azar. Para obtener información sobre el Un método excelente de selección para obtener cul-
tipo de crecimiento de las distintas bacterias, debe recu- tivos sincrónicos es la técnica de Helmstetter-Cummings,
rrirse aloscultívos síncrónrcos, es decir, a cultivos com- basada en el hecho de que ciertas bacterias se adhieren
puestos por células que se encuentran todas en la misma fuertemente a las membranas de filtros de nitrato de celu-
etapa del ciclo celular. Las mediciones llevadas a cabo losa. La técnica consiste en filtrar un cultivo asincrG
en tales culüvos equivalen a las realizadas en las mis- nico a través de un filtro, invertir el filtro y hacer pasar
mas células. medio fresco a través de él (frgura 7.8). Después que
Los cultivos sincrónicos de bacterias pueden obte- las bacterias ligadas débilmente han sido lavadas del fil-
nerse mediante diversas técnicas. La sincronia puede ser tro, las únicas células bacterianas en el medio efluente
índucída por manipulación, generalmente cíclica, de las son aquéllas que se han originado por división. Por con-
condiciones ambientales. En determinadas bacterias esto siguiente, todas las células del efluente están recién for-
se consigue, o bien por cambios repetitivos de tempera- madas y se encuentran en la misma etapa del ciclo ce-
tura o bien suministrando nutrientes a cultivos que aca- lular.
ban de entrar en la fase estacionaria. Alternativamente, La figura 7.9 representa el crecimiento de un cultivo
una población sincrónica puede ser seleccionada a par- de E. colí sincronizado de la manera indicada. El núme-
tir de una población aleatoria mediante la separación ro de células del cultivo permanece aproximadamente
fisica de células que están en la misma etapa del ciclo ce- constante durante cerca de una hora, mientras las célu-
lular. Esto se puede conseguir por filtración diferencial o las recién formadas aumentan de tamaño. Luego, el nú-
204 C reci m iento m icrob ia n o

de determinarse la distríbucíón del tamaño celular en


1.25 un cultivo en crecimiento exponenc¡al. Esas dos distri-
o buciones permiten calcular la velocidad de crecimiento
c
.9 100 en función del tamaño celular (figura 7.10). La relación
o
-E es bastante compleja: las células pequeñas crecen len-
o
c) 075 tamente, las de tamaño intermedio lo hacen más rápida-
o
E mente y las de mayor tamaño crecen, de nuevo, con
E'
(! 0.50 lentitud.
p Un cálculo similar pennite estimar la distribución de
o
o las células de diferentes edades (o sea, el tigmpo transcu-
o 025
rrido desde la división que las produjo) en un cultivo ex-
ponencial (figura 7.11). La relación es, otra vez, algo
o.25 0.50 0.75 1.00 1.25 r 50 1.75 compleja y refleja la existente entre velocidad de cre-
Tamaño celular (¡rm3) cimiento y tamaño celular. La hgura 7.11 muestra una
propiedad general de cualquier poblpción en expansión:
la predominancia numérica de los individuos jóvenes.
FIGURA 7.10
Quizás la más clara ilustración del hecho de que la
Vetocidad de crecimiento (¡rm!/hora) de células de E. coli en cinética del crecimiento de las células individuales no
un medio sintético en función del tamaño celular (p-t) Según A.
puede deducirse de la cinética del crecimiento de la pe
G. Marr. P. R. Paintery E. H. Nilson, aGrowth and Division of Indi-
vidual Eacteriar, en Microbial Growth, 1 9 Simposium de la Socie- blación total la aporta el crecimiento de Caulobacter.
ty of General Microbiology (Cambridge: Cambridge University Una población de esta bacteria unicelular está compuesta
Press, 1969). siempre por dos tipos celulares de diferente estn¡ctura-
células con prosteca y células nadadoras (véase el capr-
mero de células se duplica de manera bastante brusca. tulo l7). Las células conprostecacrecensiempre signifi-
En el segundo ciclo de división, la meseta está menos cativamente más de prisa que las nadadoras (véase la
diferenciada y el incremento de la población se extiende página 442), aunque la población total crece exponer
durante un período más largo, lo que indica que se está cialmente a una velocidad constante.
perdiendo la sincronización. En el tercer ciclo de divi-
sión casi no existe ya sincronia.
[,os cultivos sincrónicos pierden rápidamente esta
propiedad porque las diversas células de una pobla-
ción no se dividen todas al mismo tamaño (o edad, es EFECTO DE LA CONCENTRACION
decir, el tiempo transcurrido desde la división anterior). DE NUTRIENTES SOBRE LAVELOCIDAD
A partir de la velocidad de la pérdida de sincronia puede DE CRECIMIENTO
calcularse la distríbución de Ia edad de las células en la
divísíón. Utilizando técnicas de recuento electrónico pue-
En muchos aspectos, el crecimiento bacteriano pued:
compararse a una reacción química en la cual los compc'
FIGURA 7.1 1 nentes del medio (los reactantes) producen nuevas célu-
Comparación de la d¡stribuc¡ón de los tiempos entre divtsiones y las (el producto de la reacción), un proceso catalizadc
de f a edad de las células en una población de E. coli en crecimien- por la población bacteriana. La velocidad de las reaccic'
to exponencial. Según A. G. Marr, P. R. Painter y E. H. Nilson, nes quimicas viene determinada por la concentración C"
<Growth and Division of Individual Bacteriar, en Microbial Growth,
los reactantes, pero, tal como se ha visto, la velocidad C.
l9 Simposium de la Society of General Microbiology (Cam-
bridge: Cambridge University Press, 19691. crecimiento bacteriano permanece constante hasta qu:
en el medio prácticamente se ha agotado el nutriente
limitante. Esta aparente paradoja se explica por la ac-
cion de las permeasas, que son capaces de mantener con-
.g
(,
centraciones intracelulares saturantes de nutrientes er
c un amplio margen de concentraciones externas (capitu-
o
)
ct Tiempo entre d¡visores lo 8). No obstante, a concentraciones extremadamente
(D
L
l¡- bajas de nutrientes externos, los sistemas de las perrnea-
sas no son ya capaces de mantener las concentracionet
intracelulares saturantes, con lo que disminuye la velo
Tiempo cidad de crecimiento.
Creci m i ento m i c ro b ia no 205

0.8

€ !. o.o
E9
trc
EÉoo
sE
u o.z

0.0
5101520 246
Concentración de glucosa (¡r,M) Concentración de triptófano (pM)
(b)

FIGURA 7,12
Efecto de la concentración de nutrientes sobre la velocidad específica de crecimiento de E. coli.
(a) Efecto de la concentración de glucosa. (b) Efecto de la concentración de triptófano en un mu-
tante que requiere este aminoácido. Tomado de T. E. Shehata y A. G. Marr. afffs6t of Nutrient
Concentration on the G rowth of Escherichia coli>, J. Bacteriol. 1O7 , 21 O (1 97 1 ).

Las curvas que relacionan la velocidad de crecimien- nutrientes no se renuevan y, por consiguiente, el creci-
to con la concentración de nutrientes son tipicamente hi- miento es exponencial sólo durante unas pocas genera-
perbólicas (figura 7 .12), y cumplen la ecuación ciones. Las poblaciones microbianas pueden ser man-
tenidas en estado de crecimiento exponencial durante
C un largo período de tiempo mediante la utilización de un
k:k^*K+C (7.r?',,
sistema de cultivo continuo (figura 7.13). El recipiente
de cultivo está conectado a un depósito de medio estéril.
donde k es la velocidad de crecimiento específica a la Una vez que se ha iniciado el crecimiento, se añade
concentración de nutriente limitante (C), k,- es la velo- medio fresco del depósito de manera continua. El volu-
cidad de crecimiento a la concentración saturante, y K, men del líquido en el recipiente de cultivo se mantiene
es una constante análoga a la constante de Michaelis- constante eliminando el volumen en exceso por un sifon
Menten en la cinética enzimática; K, tiene un valor nu- de rebosamiento.
mérico igual a la concentración de substrato que soporta Si el medio fresco entra a velocidad constante, la
una velocidad de crecimiento igual a*k^",. Los valores concentración de bacterias en el recipiente de cultivo per-
deK, para la utilización de glucosa y triptofano por E. colí manece también constante después de un período inicial
(figura 7.12) son de I X 10-6 y 2 X l0-' M, respecti- de ajuste. En otras palabras, las bacterias del recipiente
vamente, es decir,0,l8 y 0,03 microgramos por milili- de cultivo se reproducenjusto lo suficientemente de pri-
tro. Esos valores tan bajos deben atribuirse a las eleva- sa como para reemplazar a las que se pierden por el rebe
das afrnidades caracteristicas de muchas permeasas bac- samiento. Si se cambia la velocidad de entrada del me-
terianas, lo cual puede interpretarse como una adapta- dio fresco, se produce otro periodo de ajuste, seguido por
ción evolutiva al crecimiento en disoluciones extrema- el establecimiento de una población constante con una
damente diluidas. A este respecto,los medios de labora- nueva concentrac ión celul ar, la ve locidad de crecimien-
torio habituales son muy diferentes de muchos ambien- to varía para compensar la nueva velocidad de pérdida
tes naturales. de células. Un sistema de cultivo continuo responde de
esta manera a una amplia variación de velocidad de en-
trada del medio fresco. No obstante, cualquiera que sea
la velocidad de entrada del medio, las bacterias no pue-
CULTIVO CONTINUO den crecer más rápidamente de lo que lo harían en un
DE M ICROORGAN ISMOS cultivo discontinuo.
La pregunta planteada por la observación de que la
[,os cultivos de los que se ha tratado hasta ahora se densidad de población en el cultivo continuo permanece
denominan cultivos díscontínuos (<batch cultures>); los constante es la siguiente: icómo la velocidad de adición
Crecimiento m icro b a -,r
206
FIGURA 7.13
Esquema simplificado de un sistema de cultivo co-' '
- -

de medio estéril
-------De!ósito

Llave de control del flulo-


Entrada de aire
+ para la aireación
forzada y la agitación

Abertura para la inoculación


v salida de aire

Sifón de
rebosamiento
Recipiente de cultivo

del medio fresco determina la velocidad de crecimiento rebosamiento, la densidad continuará aumentando. la
del cultivo? La explicación está en el hecho de que la ve- concentración del nutriente limitante en el recipiente de
locidad de crecimiento de las bacterias en el cultivo con- crecimiento continuará disminuyendo Y, erl consecuen-
tinuo está siempre limitada por la concentración de uno cia, la velocidad de crecimiento se reducirá hasta que la
de los nutrientes. En consecuencia, la velocidad de adi- velocidad de incremento de células por crecimiento igua-
ción de medio fresco determina la velocidad de creci- le exactamente la velocidad de pérdida de células por
miento del cultivo; el sistema está autorregulado. Supon- rebosamiento. Si la velocidad de crecimiento se hiciera
gamos un cultivo continuo que opera con una velocidad transitoriamente menor que la velocidad de pérdida de
constante de adición de medio fresco. Tras la inocula- células, la densidad de población disminuiría, aumentaria
ción, el cultivo crecerá primero con lamáxima velocidad la concentración del nutriente limitante, y la velocidad
(K*",). Según aumenta la densidad poblacional del cul- de crecimiento se incrementaría hasta que se alcanzase
tivo, la velocidad de utilización de los nutrientes aumen- deóuevo el equilibrio entre la velocidad de crecimiento y
tará hasta que el agotamiento de un nutriente empiece a la pérdida
- de células.
limitar la velocidad de crecimiento. Mientras la veloci- Considerando el hecho de que la concentración celu-
dad de crecimiento exceda a la velocidad de pérdida por lar de un sistema de cultivo continuo pennanece cons-
C rec im ie nto m i c rob i a n o 207
tante y es autorregulable, el sistema puede describirse asi
en términos matemáticos: Margen del
quimiostato
/Vetociaaa
producción\ _ / Velocidad perdida \
\ células crecimiento /-
1células rebosamienn )
Mediante la ec. 7 .2 seha descrito previamente la veloci-
dad de producción de masa bacteriana (dx/dt\ como:

dX
:kX
ü
La velocidad de pérdida de células por rebosamiento
(dx/dt) puede expresarse como:
dxf:7: (7.13) D = kmax
ü ',* FIGURA 7.14
donde la velocidad de flujo (/) se mide en volúmenes de
Relación entre la densidad poblacional. X, concentración del nu-
cultivo ( V) por hora. Despejando D, que se denomina ye- triente l¡mitante, C, y velocidad de dilución, D, en un sistema de
locidad de dilucíó,n, se tiene cultivo continuo.
n- f -dX
u: vx: dtx Q-14\
Despejando k de la ec.7.2 anterior, resulta donde C, es la concentración del nutriente limitante en el
,ü(
*: depósito y dc/dt es la velocidad de utilización del nu-
dtx triente limitante en el crecimiento. substituyendo dc/dt
y, por lo tanto, k : D (7.rs) por (dX/dt)(dc/dX),y puesto quedX/dt: kX y dc/dx :
: l/Y, se tiene
según lo cual la velocidad de crecimiento es igual a la
velocidad de dilución en un sistema estabilizado de cul- KX
tivo continuo. Substituyendo en la ec. 7 .12 k por su igual, DC,: Y + DC (7.1e)

En el estado sostenido, D: k;de aquí que despejan-


k^^- C :D do X se obtiene:
-"'K.r+c-" (7.16)

y despejando C: X:Y(C,-C) (7.20\

. C:x'ffi (7.17',) que establece la relación fundamental entre la densidad


de población (,Q y la concentración del nutriente limi-
lo cual establece la relación fundamental entre concen- tante (C) en el recipiente de cultivo. Coqiuntamente,las
tración del substrato (C) en el recipiente de cultivo y la ecuaciones 7 . I 7 y 7 .20 nos permiten ver la relación exis-
velocidad de dilución (D). tente entre densidad de población, concentración del nu-
Durante el funcionarrriento del cultivo continuo en triente limitante y velocidad de dilución(figura 7 .14).La
estado sostenido (es decir, con mantenimiento de una densidad de población y la concentración del nutriente li.
densidad de pobl ación estabili zada), la concentración del mitante cambian poco a bajas velocidades de dilución.
nuEiente limitante (C) también permanece constante. Por Cuando la velocidad de dilución se aproxim a a k,n ,la
lo tanto, la velocidad de adición del nutriente debe igua- densidad de población desciende rápidamente a ceio, y
lar la velocidad a la cual es utilizado por el cultivo junto la concentración del nutriente limitante se aproxima a su
con la pérdida por rebosamiento: concentración en el deposito (C,).

/ suuro". añadido \ - / Substrato *"oo \


del deposito cl crecimiento,/
\ / \t""
Ouimiostatos y turbidostatos
( Substrato pcrdido \
-' Por rcbos¡miento
(7. r 8)
\ ) L,os sistemas de cultivo continuopueden hacerse funcio-
es decir, nar como Químíostafo.s o como turbidostatos. En un
quimiostato la velocidad de flujo se mantiene a un va-
DC,:ff * O' lor determinado y la velocidad de crecimiento del culti-
vo queda ajustada a esa velocidad de flujo. En un turbi-
208 Crec im iento m icrob i a n o

dostato el sistema incluye undisposiüvo óptico que mide cidad de entrada de la fuente de energía es insuficiente
la absorbancia del cultivo(densidad del cultivo) en el re- para aportar más ener$a que la requerida para el man-
cipiente de crecimiento; una señal eléctrica de ese dispo- tenimiento, no puede haber crecimiento. La energía de
sitivo regula la velocida{ de flujo. Así pues, la absorban- mantenimiento puede expresarse matemáticamente de
cia del culüvo controla la velocidad del flujo y la de cre- esta manera:
cimiento del cultivo se ajusta a este flujo.
En lapráctica, los quimiostatos y los h¡rbidostatos se
hacen funcionar a diferentes velocidades de dilución.
En el quimiostato la máxima estabilidad se alcanza en un
ff=,#-* (7.21 t

margen ile velocidades de dilución en el que la concen- donde a es la constante de velogidad espectfica de mar-
tración celular cambia sólo ligeramente al cambiar la tenimiento. Como el término'Y dc/dies iguat alcx..t
velocidad de dilución, es decir, a bajas velocidades de di- ecuación 7.21 es una variante de la ecuación de cres-
lución. Por el contrario, en el turbidostato la máxima sen- miento (ec.7.2), que se aplica si la velocidad de cresF
sibilidad y estabilidad se consiguen a altas velocidades de miento está limitada por el aporte de energía. Puesto que
dilución, dentro de un margen en el cual la biomasa del los valores de ¿ son típicamente bajos (por ejemplc.
0,018 h-' para la cepa ML30 deE coli-creclendo óon glu
cultivo cambia rápidamente con la velocidad de dilución
(figura 7.14). Un turbidostato puede funcionar a valores cosa a 37"C), el efecto de la energía de mantenimientc
k .' ajustando un valor de absorbancia que mantenga sobre la velocidad de crecimiento es habitualmente in-
una concentración celular insuficiente para originar la significante en cultivos discontinuos pero puede sermu)'
bajada de algun nutriente hasta una concenhación limi-
significativo en medios naturales con limitación de nu-
trientes o en quimiostatos operando a bajos valores de D
tante de la velocidad de crecimiento. .

La ecuación7 .21introduce cierta complicación en el


concepto de Y. Hemos definido previamente f como la
Aplicación de los sistemas de cultivo continuo relación de masa de las células producidas por substrato
consumido. Sin embargo, la ecuación 7.21 excluye la
Los sistemas de cultivo continuo ofrecen dos caracteris- cantidad de substrato utilizado para el mantenimiento
ticas para el estudio de los microorganismos. Aportan En vez de redefinir IZ para el caso especial de un substra-
una fuente constante de células en fase exponencial de to que sirve éomo fuente de energía, se puede usar ur
nuevo parámetro, Yo, que cumple la definición origina-
crecimiento y permiten el crecimiento de los cultivos de
modo continuo a concentraciones de substrato muy ba- de IZ; el término Y se reserva entonces para el casb de
jas. Las ventajas prácticas de lo primero son eviden- substratos usados para crecimiento y mantenimientc
tes. El crecimiento a bajas concentraciones de subs-. Esto lleva a un nuevo parámetro, elcoeficíente de men-
trato resulta ventajoso en estudios de regulación de la tenímíento (m) para describir el mantenimiento según
síntesis o del catabolismo del substrato limitante, en la
selección de diversas clases de mutantes v en estudios de Velocidad global
Velocidad de Velocidad de
tipo ecológico. de : utilización para *
utilización utilización para
del substrato crecimiento mantenimiento
(7.22,

ENERGIA DE MANTENIMIENTO que se convierte en

En la figura 7.14 puede apreciarse que las curvas de la


densidad de población y de la concentración del nutrien-
#:(f)".(#)" (723

te limitante no se han extendido alazona de velocida-


des de dilución muy bajas. Esto es porque la respuesta de
un cultivo a velocidades de dilución muy bajas depende lml + (7.21
de la naturalezadel nutriente limitante. Si el nutriente li- -:
YkYc- -
mitante es la fuente de energia, el crecimiento cesa a ve-
locidades de dilución muy bajas porque una cierta canti- El coeficiente de mantenimiento m y lavelocidad es-
dad de energia, denominadaenergía de mantenímíento, pecifica de mantenimiento ¿ están relacionados por la
es utilizada siempre para otros fines distintos del cre- ecuación
cimiento, como la movilidad, los mecanismos de repara-
ción del DNA y la acumulación de nutrientes en la célu-
la contra un gradiente de concentración. Cuando la vele m: alYe
Cre c im i e nto m icro b ia no 209
LECTU RAS AD IC IONALES

Libros
KusltscHsr, H. E.,Introductíon to Research wíth Con- Gerurnnor. P., ed. Manual of Methods for General Bacte-
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