Desintoxicación de Aflatoxina B1 por Aspergillus oryzae de Meju, una cebolla de soja fermentada tradicional

coreana

Abstract: Las aflatoxinas se clasifican como Grupo 1 (carcinogénico para los seres humanos) por el
Centro Internacional de Investigaciones sobre el Cáncer En este estudio, se aislaron un total de 134 cepas de hongos
de 65 muestras meju, y se seleccionaron dos aislados fúngicos como posibles hongos de la aflatoxina B1 (AFB1) -
biodetoxificación. Estos hongos se identificaron como Aspergillus oryzae MAO103 y A. oryzae MAO104
secuenciando el gen de la beta-tubulina. Las dos cepas de A. oryzae fueron capaces de degradar más del 90% de
AFB1 (concentración inicial: 40 μg / l) en un caldo de cultivo en 14 días. Los efectos mutagénicos de AFB1 tratados
con A. oryzae MAO103 y MAO104 disminuyeron significativamente a 5,7% y 6,4%, respectivamente, en la
mutación de cambio de marco de las pruebas de Ames utilizando Salmonella typhimurium TA98. La mutagenicidad
sustitutiva de la base de AFB1 también fue disminuida por los dos hongos. Además, la producción de AFB1 por
Aspergillus flavus fue significativamente disminuida por las dos cepas de A. oryzae en placas de agar a base de
soja. Nuestros datos sugieren que las dos cepas de A. oryzae desintoxicantes con AFB1 tienen una aplicación
potencial para controlar AFB1 en alimentos y piensos.

Introducción
Las aflatoxinas son un grupo de micotoxinas producidas principalmente por Aspergillus flavus toxigénico y
Aspergillus parasiticus [1, 2]. A. flavus produce sólo tipos B de aflatoxinas, pero A. parasiticus produce tipos B y
G. Otras cepas de Aspergillus, como A. nomius, A. tamarii y A. pseudotamarii, también son capaces de producir
aflatoxinas [3, 4]. Se ha informado de que las aflatoxinas, en especial la aflatoxina B1 (AFB1), son mutagénicas,
carcinógenas, genotóxicas, hepatotóxicas e inmunosupresoras tanto para humanos como para animales [5 - 7]. Las
aflatoxinas se clasifican como Grupo 1 (carcinogénico para los seres humanos) por el Organismo Internacional para
la Investigación del Cáncer (IARC, 2002). Teniendo en cuenta el peligro potencial de la toxina para la salud
humana, los programas de vigilancia y las medidas reglamentarias para las aflatoxinas en diversos productos
básicos han sido aplicados por casi todos los países. Se han establecido niveles admisibles de contenido total de
aflatoxinas en los alimentos y piensos, que van desde la tolerancia cero a 50 μg / kg. Por ejemplo, la Unión Europea
ha decretado límites considerablemente inferiores a la toxina: 2,0 μg / kg para AFB1 y 4,0 μg / kg para aflatoxinas
totales en alimentos. Corea del Sur ha establecido un umbral de tolerancia reglamentaria de 10,0 μg / kg de AFB1
y 15,0 μg / kg de aflatoxinas totales para cereales, polvos de pimiento rojo y productos de soja fermentados para
consumo humano, que están de acuerdo con los límites AFB1 de la mayoría de los países (10-20 μg / kg AFB1 en
los alimentos)
Se han utilizado tres métodos para desintoxicar aflatoxinas en alimentos y piensos: físico, químico o biológico. Los
métodos físicos incluyen el autoclave [8], la pasteurización [9], los disolventes [10], los materiales adsorbentes [11,
12], la luz ultravioleta [13] y el procesamiento [14, 15] como el tostado, la limpieza, la separación y la molienda.
Los métodos de desintoxicación química incluyen el uso de H2O2 [16], ozono [17], amoníaco [18], urea [19],
Nahypochlorite [20] y Na bisulfito [21]. Sin embargo, estas dos categorías de métodos de destoxificación de la
aflatoxina sufren problemas como la reducción del valor nutritivo de los alimentos, la alteración de sus cualidades
organolépticas, los efectos indeseables en la salud y el elevado coste del equipo, limitando su aplicación a los
sistemas de fabricación de alimentos [22]. -24]. Por lo tanto, los medios más deseables para la destoxificación de
las aflatoxinas en los alimentos son métodos biológicos. Shantha [25] indicó que algunos hongos, como Rhizopus
sp., Trichoderma sp., Phoma sp., Sporotrichum sp., Y Alternaria sp., Inhiben la síntesis de AFB1. Además, se ha
informado que algunas bacterias, como Mycobacterium sp. [26], Rhodococcus sp. [24], Bacillus sp. [27], y
Myxococcus [28], tienen capacidades de desintoxicación. Recientemente, Samuel et al. [29] informó de que
Pseudomonas putida eficientemente degradado AFB1 en un 90% en un medio de glucosa de sal que contiene 40
ng / ml de la toxina.
Meju, un iniciador de productos tradicionales de la soja fermentada coreana, tales como doenjang, ganjang, y
kochujang, puede ser ocasionalmente contaminado con aflatoxinas a través de hongos aflatoxigénicos [30, 31]. Sin
embargo, se ha documentado que el doenjang y el ganjang contienen niveles mucho más bajos de aflatoxinas que
meju, una materia prima para los productos (Jeong et al., 2009). , Página 252). Esto sugirió que había una
posibilidad de destoxificación de aflatoxinas por algunos hongos en meju durante la fermentación de la soja y que
la capacidad de destoxificación de estos hongos podría aportar beneficios para la seguridad de los productos
fermentados porque AFB1 disminuiría durante la fermentación in situ. Además, estos hongos podrían inhibir el
crecimiento de hongos toxigénicos a través de la competencia. Como resultado, la cantidad total de toxinas en los
productos se reduciría eficazmente durante el proceso de fermentación. El objetivo del presente estudio fue
investigar la actividad destoxificante de AFB1 de dos cepas de A. oryzae aisladas de meju. Este es el primer informe
que muestra que A. oryzae es capaz de desintoxicar AFB1.
Materials and Methods

Aislamiento de Hongos AFB1-Degradantes

Para el aislamiento fúngico, se utilizó agar dicloran-rose-bengal chloramphenicol (BD Difco, EE.UU.). Cada
aislamiento se transfirió en agar de dextrosa de patata (PDA, MB Cell, Corea), y se prepararon suspensiones de
esporas con solución de Tween 80 al 0,05%. Las suspensiones de esporas fúngicas se almacenaron en una solución
de glicerol al 20% a -20ºC hasta su uso. El medio para determinar la capacidad de degradación de AFB1 fue el
medio Soytone-Czapek (SC), que estaba compuesto de 3 g de soja, 1 g de K2HPO4, 0,5 g de KCl, 0,5 g de
MgSO4.7H2O, 0,01 g de FeSO4 · H2O, 30 g de sacarosa, Y 1 L de agua destilada. Para identificar la capacidad de
degradación, los aislamientos fúngicos se cultivaron en 50 ml de medio SC que contenía 40 μg / l de AFB1 después
de inocular 105 esporas de hongos. El cultivo se incubó a 25 ° C con agitación a 130 rpm.

AFB1 Análisis de Biodegradación por TLC

Para el análisis cualitativo de la biodegradación de AFB1, se realizó un análisis de TLC. AFB1 en medio de cultivo,
que se cultivaron como se ha descrito anteriormente, se extrajo por extracción líquido-líquido (LLE). Brevemente,
el caldo de cultivo de hongos se filtró usando papel de filtro de vidrio Whatman GF / A (Whatman Inc., USA)
después de la incubación durante 7 y 14 días. A continuación, se mezclaron 1 ml de filtrado y 3 ml de acetato de
etilo mediante agitación en vórtex durante 30 segundos. Después de que la mezcla se colocó a temperatura ambiente
durante 30 minutos, se transfirieron 2 ml de la capa superior a un nuevo vial de vidrio. Se añadieron dos mililitros
de acetato de etilo a la capa inferior, se mezclaron y después se combinó la capa superior con el primer extracto.
Los extractos de acetato de etilo se evaporaron hasta
Sequedad bajo una suave corriente de N2. Se disolvieron los extractos obtenidos en 50 μl de benceno-acetonitrilo
(98: 2 (v / v)). Para el análisis de TLC, se colocaron 30 μl de la solución en una placa de TLC pre-recubierta (TLC
Silica gel 60 F254, Merck Millipore, EE.UU.). El desarrollo se realizó a temperatura ambiente en una cámara de
TLC de vidrio previamente saturada con ácido benceno-metanol-acético (180: 10: 10 (v / v / v)) como disolvente
de revelado. Después del desarrollo, se retiró la placa de TLC del tanque, se secó a temperatura ambiente y se
iluminó bajo luz UV a λ= 365 nm en una cámara oscura (Chambre Noires darkroom, Vilber Lourmat, Francia) [32
- 34].

Identificación de Aislamientos Fúngicos

Para la identificación morfológica, se inocularon hongos en el PDA y se incubaron a 25ºC durante 5 días. Para
identificar los aislados fúngicos en el nivel de género, se observaron morfologías de colonias y
microscópicas. Para la identificación molecular, se inocularon esporas de hongos (105) en un caldo de dextrosa
de patata (PDB) y se incubaron a 25ºC durante 48 h. Después de que los micelios fúngicos se recogieron de los
medios, el ADN cromosómico total se extrajo utilizando un HiGene Genomic DNA Prep Kit (BIOFACT, Corea).
La región beta-tubulina se seleccionó para la identificación molecular y la PCR se realizó con dos cebadores
específicos, Bt2a y Bt2b (5'-GGT AAC CAA ATC GGT GCT TCC-3 'y 5'-ACC CTC AGT GTA GTG ACC
CTT GGC -3 '), utilizando un ciclador térmico PC708 (Astec, Japón) [35]. La mezcla de PCR contenía 5 μl de
tampón de PCR 10X (BIOFACT), 3 μl de desoxirribonucleótido trifosfato (BIOFACT) 2,5 mM, 0,4 μl de cada
100 μmol de cada cebador (Neoprobe, Corea), 0,3 μl de Taq polimerasa (BIOFACT), 39,9 μl de agua estéril
desionizada, y 1 μl de ADN molde. La PCR se realizó de la siguiente manera: predenaturación durante 4 min a 95
° C, desnaturalización durante 1 min a 95 ° C, recocido durante 1 min a 65 ° C, extensión durante 2 min a 72 ° C
y una post-extensión de 7 Min a 72 ° C. La PCR se repitió durante 35 ciclos.
Los productos de PCR fueron secuenciados por BIOFACT [36]. La herramienta de búsqueda de alineación local
básica se usó para encontrar regiones de similitud entre las secuencias de los aislamientos de hongos y las cepas de
GenBank en la base de datos de nucleótidos del National Center for Biotechnology Information (NCBI). Cada
secuencia del gen de la beta-tubulina de las dos cepas de A. oryzae se usó para determinar las relaciones
filogenéticas con las de la cepa del tipo A. oryzae y de las cepas Flavi de la sección de Aspergillus. Un árbol
filogenético fue construido por un vecino de unión árbol utilizando MEGA5 [37, 38]. Los datos de ADN se
procesaron usando el modelo de cálculo de distancia de parámetros de Tamura-Nei con tasas de sustitución
distribuidas gamma con el fin de analizar las posiciones taxonómicas de las dos cepas de A. oryzae. Para determinar
el soporte para cada clado, se realizó análisis de bootstrap con 1.000 repeticiones.

Prueba de producción de aflatoxinas por aislados de hongos

Con el fin de determinar si la aflatoxina es producida o no por los aislamientos de A. oryzae, se realizaron análisis
moleculares a nivel de ADN y análisis de producción por cultivos fúngicos. Para el análisis molecular de la
aflatoxigenicidad, el análisis genético de 17 genes en la vía biosintética aflatoxina se llevó a cabo de acuerdo con
Tao y Chung [36]. Para el ensayo de producción de aflatoxinas, se utilizaron medios de extracto de levadura-
sacarosa (medio YES: extracto de levadura al 2%, sacarosa al 20%) [39] y medios SC. Se inoculó un mililitro de
cada suspensión de esporas fúngicas (105/ml) en 100 ml de medio y se incubó durante 3 semanas a 25ºC con
agitación a 130 rpm. La cantidad de aflatoxinas en el medio de cultivo se analizó por HPLC después de LLE.

AFB1 Análisis de biodegradación por HPLC

Para el análisis cuantitativo de la biodegradación de AFB1, los medios de cultivo fúngicos se tomaron a los 0, 1, 3,
5, 7, 10 y 14 días en triplicados. Después de que el medio de cultivo se filtró a través de un filtro de microfibra de
vidrio (GF / A, Whatman Inc.), se extrajo AFB1 de 1 ml de filtrado con 3 ml de acetato de etilo mediante LLE
como se ha descrito anteriormente. Para el ensayo de unión micelial AFB1, se recogieron los micelios de A. oryzae
MAO 103 y MAO 104 de cultivos de 7 días y 14 días y se secaron, y la toxina se extrajo con 10 ml de acetato de
etilo. Para la derivatización de AFB1, se usó ácido trifluoroacético (TFA, Sigma-Aldrich, EE.UU.) como agente de
marcaje. Las muestras de cultivo secas se trataron con 1 ml de TFA-acetonitrilo al 10% (10:90 (v / v)) y se
mezclaron mediante un mezclador vórtice (Fisher Scientific, EE.UU.) durante 30 segundos. La mezcla se colocó
en la oscuridad durante 3 h, y luego se filtró a través de un filtro de jeringa (13 mm x 0,2 \ mu m, GHP). La mezcla
patrón AFB1 también se derivatizó con TFA usando el mismo procedimiento. Las muestras y la mezcla patrón de
AFB1 se programaron para inyectar 50 μl y durante 20 min a través de una columna CAPCELL PAK C18 (4,6 mm
x 250 mm, 5 μm, Shiseido, Japón). La fase móvil fue acetonitrilo-metanol-agua (15:15:70 (v / v / v)) bombeada a
un caudal constante de 1 ml / min. La determinación de AFB1 se llevó a cabo utilizando un detector de fluorescencia
con 360 nm y 440 nm para la excitación y la emisión, respectivamente [30, 40].

Prueba Ames (finalidad)

Se inocularon hongos degradadores de AFB1 en 50 ml de medio SC suplementado con 800 μg / l de AFB1 y luego
se incubaron a 25ºC con agitación a 100 rpm durante 14 días. El cultivo se filtró con un filtro Whatman GF / A y
luego un filtro de jeringa estéril (25 mm x 0,45 μm, GHP) antes de su uso. Una muestra de control sin el cultivo de
hongos contenía también 800 μg / l de AFB1 en medio SC. El ensayo de preincubación se llevó a cabo de acuerdo
con el método descrito por Sugimura et al. [41]. Se utilizaron cepas de Salmonella typhimurium TA98 (CCARM
0272) y TA100 (CCARM 0273) como cepas de ensayo. La activación metabólica se realizó en una mezcla de
reacción que contenía 0,1 ml de muestra de ensayo, 0,1 ml de medio de cultivo y 0,5 ml de fracción de enzima
hepática S9 (Moltox, EE.UU.) durante 30 minutos a 37ºC. Después de la etapa de activación, el agar superior con
la fracción activada se vertió sobre una placa de agar de glucosa mínima preparada con 50 ml de glucosa al 40%,
20 ml de sales 50 x VB, 15 g de polvo de agar (Daejung Chemicals & Metals Co., Korea) Y 930 ml de agua
destilada. Se incubó durante 48 h a 37 ° C. Cada muestra se probó por triplicado.

AFB1 Producción de A. flavus M 2034 Co-cultivado con AFB1- Biodegradación de A. oryzae en medio a
base de soja.
Cada AFB1 biodegarding A. oryzae aislamiento o A. oryzae KACC 46464 fue co-cultivado con aflatoxigénica A.
flavus M 2034 (aislado de meju) [42] en soja a base de medios. Los medios a base de soja se prepararon de la
siguiente manera: se hierven 500 g de soja blanca con 1 l de agua y después se extrae el agua de soja apretándola a
través de una estopilla. Se preparó una placa de agar a base de soja combinando el extracto acuoso de soja con
polvo de agar al 2% (Daejung Chemicals & Metals Co.). Cada cepa de A. oryzae se inoculó en el lado derecho de
la placa y A. flavus M 2034 en el lado izquierdo y se incubó durante 7 días. La cantidad de AFB1 producido por
A. flavus M 2034 en el medio a base de soja se analizó por HPLC después de la extracción [43]. Brevemente, se
homogeneizó la masa celular de hongos más agar en la placa y se extrajo aflatoxina con metanol-cloroformo (1:
2). Cada experimento se realizó por triplicado.
Tabla 1. Número y frecuencia de aislamientos fúngicos del menú
Muestras.
Frequency
Fungal species Number (%)
Aspergillus section
Flavi 47 35.1
Aspergillus section
Nigri 6 4.5
Other Aspergillus sp. 25 18.7
Penicillium sp. 20 14.9
Mucor sp. 27 20.1
Unknown 9 6.7
Total 134 100
The fungal strains were obtained from DRBC agar plates, transferred onto PDA plates, and incubated for 5 days at
25oC. Los resultados se consideraron significativos cuando los valores de p fueron <0,05.Las pruebas de
comparación múltiple de Tukey se utilizaron cuando se encontró la diferencia. Los análisis estadísticos fueron
Realizado con el software SPSS (SPSS, USA).

Resultados y discusión detección de Hongos

AFB1-Biodegradables
Se aislaron ciento treinta y cuatro hongos de 65 bultos de mejú que se recogieron de la mitad y Sur de Corea del
Sur (Cuadro 1). El hongo aislados fueron divididos en cinco géneros por morfológicos examen: Aspergillus sección
Flavi, Aspergillus sección Nigri, otros Aspergillus sp., Penicillium sp., Y Mucor sp. Los aislamientos
predominantes pertenecían a la sección de Aspergillus Flavi (35,1%). Los aislamientos de hongos fueron analizados
para AFB1- Biodegradante utilizando TLC. Dos aislamientos de hongos (MAO 103 y MAO 104) mostraron la
biodegradación de AFB1 ocupaciones; La Fig. 1A muestra los resultados de TLC de los cultivos de 14 días de los
dos aislamientos fúngicos. El brillo de las manchas azules (AFB1) de las muestras de cultivo de 7 dıas se desvaneció
en comparación con la muestra de control y, además, las manchas de AFB1 de las muestras de cultivo de 14 días
fueron sólo visible en la placa TLC. La biodegradación AFB1 actividad de los dos aislamientos fúngicos (MAO
103 y MAO 104) también se analizó por HPLC (Figuras 1B y 1C). Similar al resultado de la TLC, los
cromatogramas de HPLC mostraron disminución de las cantidades de AFB1 en el cultivo de 7 días y 14 días
muestras.

Identificación de los hongos AFB1-Biodegradantes

Se identificaron las dos cepas de hongos biodegradables AFB1 mediante el examen morfológico y la secuenciación
del ADN Beta-tubulina. El color de la MAO 103 de 7 dıas y las colonias de MAO 104 era una aceituna pálida en
las placas de PDA. Y más tarde cambió a un marrón claro (Figuras 2A y 2B).
Bajo examen microscópico, mostraron el típico Características de Aspergillus sp., Tales como conidióforos en un
estipites no ramificado con una vesícula hinchada, fialides llevados directamente sobre la vesícula, y conidios
radiados en el fialides de la vesícula (Figuras 2C y 2D). La región de betatubulina se seleccionó para la
identificación molecular ya que los dos aislamientos pertenecían a Aspergillus sp. Sobre la base de la morfología
fúngica. Los tamaños del producto de PCR del gen de beta-tubulina de Aspergillus MAO 103 y MAO 104 fueron
497 y 496 pb, respectivamente. El Aspergillus MAO 103 y MAO 104 se identificaron como Aspergillus oryzae por
comparación de las secuencias de nucleótidos en los productos de PCR de la beta-tubulina con secuencias en la
misma región de cepas seleccionadas de la base de datos de NCBI (NCBI ID de acceso: KY020433 para A. oryzae
MAO 103, KY020434 Para A. oryzae MAO 104). Las posiciones taxonómicas de las dos cepas A. oryzae
biodegradables AFB1 con cepas representativas de la sección Flavi de Aspergillus basadas en el gen de la beta-
tubulina se muestran en la Fig. 3. Como se esperaba, las dos cepas de A. oryzae fueron clusted con el A. Oryzae
(A. oryzae T CBS100925 EF203138) y cepa de tipo A. flavus (A. flavus T CBS 100927 EF203132) en un grupo.

Como se ha informado de que las cepas de A. oryzae tienen una similitud genética con Aspergillus flavus, que
produce AFB1 y AFB2 [44], un análisis genético de 17 genes en la aflatoxina biosintética vía se realizó para
verificar la no-producción de la toxina por los dos A. oryzae aislamientos [36]. Las dos cepas de A. oryzae poseían
sólo siete genes biosintéticos de aflatoxina (aflG, aflI, aflK, aflM, aflO, aflP y aflQ), y no 10 genes de biosíntesis
de aflatoxina (Tabla 2).

Fig. 1. Detección de hongos AFB1-biodegradantes.

A) Análisis de TLC de medios de cultivo extraídos utilizando acetato de etilo.
Cada cepa se cultivó en caldo SC con 40 μg / l de AFB1 añadido. STD indica el estándar AFB1 (50 μg / l). (B)
El cromatograma HPLC de AFB1 en un caldo de cultivo de MAO 103. El tiempo de retención del pico AFB1
fue de 8,4 min. 1. Medio de control (cultura de 0 dıa). 2. MAO 103 (cultivo de 7 días). 3. MAO 103 (cultivo de
14 días). (C) El cromatograma HPLC de AFB1 en un caldo de cultivo de MAO 104. El tiempo de retención del
pico AFB1 fue de 8,4 min. 1. Control (cultivo de 0 dıas). 2. MAO 104 (cultivo de 7 días). 3. MAO 104 (cultivo
de 14 días).
 Fig. 2. Examen morfológico de dos
aislamientos. (A) La colonia de A. oryzae MAO
103 (cultivo de 7 días) en PDA, y examen
microscópico de A. oryzae MAO 103. (B) La
colonia de A. oryzae MAO 104 (cultivo de 7
días) sobre PDA, Y el examen microscópico de
A. oryzae MAO 104.

Fig. 3. Árbol filogenético que representa las posiciones taxonómicas de A. oryzae MAO 103 y A. oryzae
MAO 104. Las secuencias de ADN de los genes beta-tubulina de cada hongo se obtuvieron a partir del
NCBI y se compararon. El árbol filogenético fue construido con MEGA5. La "T" después del número de
recogida indica la cepa tipo de la especie.

A partir de este resultado, A. oryzae MAO 103 y MAO 104 podrían ser genéticamente discriminados de A. flavus
aflatoxigénica. Además, ni A. oryzae MAO 103 ni MAO 104 produjeron aflatoxinas durante cultivos de 3 semanas
en medios SC y medios YES, mientras que A. flavus M 2034 produjo cantidades considerables de AFB1.
(≥ 15mg/l)

Degradación de AFB1 durante el cultivo de A. oryzae MAO 103 y MAO 104

La actividad cuantitativa de biodegradación de AFB1 durante el cultivo de A. oryzae MAO 103 y MAO 104 se
investigó por análisis de HPLC. Las dos cepas de A. oryzae mostraron una actividad de biodegradación AFB1
dependiente del tiempo y fueron capaces de degradar más del 90% de la AFB1 en los medios de cultivo durante 14
días (Figura 4).
 Fig. 4. Tiempo transcurrido de la degradación de AFB1 en un caldo de cultivo de A. oryzae MAO 103 y MAO 104. Cada
cepa se cultivó en caldo SC. Las concentraciones de toxina se muestran como la media de tres repeticiones. Las barras de
error corresponden a la desviación estándar.

A. oryzae MAO 103 mostró una actividad de biodegradación más rápida que MAO 104 después de 7 días. En el
cultivo de A. oryzae MAO 103, se detectó una fuerte disminución de la toxina entre 3 y 7 días, con una reducción
de casi 70% de AFB1 medida a los 7 días. Por otra parte, A. oryzae MAO 104 degradado AFB1 gradualmente
durante 14 días. Las degradaciones de la toxina en el cultivo de 14 días fueron de 97,4% y 96,1 (p <0,001) en A.
oryzae MAO 103 y MAO 104, respectivamente. Entre otros derivados de la aflatoxina, la aflatoxina B2 (AFB2)
disminuyó significativamente 69,8% y 67,7% (p <0,001) por A. oryzae MAO 103 y MAO 104, respectivamente,
en medio de cultivo de 14 días (concentración inicial de AFB2: 40 μg / l ). Sin embargo, no hubo disminución
significativa en la aflatoxina G1 (AFG1) or G2 (AFG2) (Fig. S1).

Pruebas de AFB1 Union Micelial

Se ha informado de que las bacterias de levadura y ácido láctico pueden reducir las aflatoxinas por adhesión a sus
componentes de la pared celular [45 - 47]; Por lo que probamos si el micelio de hongos se une a AFB1 utilizando
los cultivos de 7 días y 14 días de A. oryzae MAO 103 y MAO 104. Las cantidades de AFB1 detectadas tanto en
el caldo de cultivo como en el micelio se muestran en la Tabla 3.

Tabla 2. Amplificación por PCR de genes biosintéticos de aflatoxinas en el grupo de genes de A. oryzae MAO 103, A. oryzae
MAO 104 y A. flavus M 2034.

En la amplificación por PCR: +, presente la señal de amplificación; -, ausencia de señal de amplificación. En la producción
de aflatoxinas: +, producción de aflatoxinas; -, sin producción de aflatoxinas. Para pruebas de producción de aflatoxinas,
se usaron medios YES y medios SC, y cada hongo se cultivó durante 3 semanas.

Tabla 3. Las cantidades de AFB1 residual en el filtrado y micelio de caldo de cultivo y la degradación total de AFB1 por A.
oryzae MAO 103 y MAO 104.
Las cantidades de AFB1 eliminado de los cultivos totales de A. oryzae MAO 103 y MAO 104 fueron 92,4% y
78,4% de la cantidad inicial de toxina, respectivamente, a los 14 días. Teniendo en cuenta la reducción total de la
toxina en el caldo de cultivo, la adsorción de AFB1 a micelios fúngicos fue relativamente baja tanto en MAO 103
de A. oryzae como en MAO 104. Esto indica que la actividad principal de biodegradación AFB1 de A. oryzae
MAO 103 y MAO 104 no fue debido a la adsorción de hongos.

Pérdida de Mutagenicidad de AFB1 por A. oryzae MAO 103 y MAO 104

El ensayo de Ames se ha utilizado para medir la mutagenicidad de los productos químicos y mezclas complejas
[48, 52]. Se sabe que AFB1 es mutagénico en el sistema Ames y que la mutagenicidad es generalmente eficaz en
los sistemas de preincubación [53, 54]. Los resultados de las pruebas de Ames utilizando dos mutantes que
requieren histidina de S. typhimurium (TA98 y TA100) se muestran en la Fig. 5.

Figura. 5. Reducción de los efectos mutagénicos de AFB1 por A. oryzae MAO 103 y MAO 104. Se utilizaron S. typhimurium
TA98 y TA100 como cepas de ensayo, que se incubaron con un caldo de cultivo de 14 días de A. oryzae MAO 103 y MAO
104. SC Se usaron medios de cultivo con 800 μg / l de AFB1 para el cultivo de cepas de A. oryzae y el control (sin
inoculación de hongos). Las muestras en blanco fueron medios SC sin inoculación de toxinas ni hongos. Los ensayos se
realizaron por triplicado para cada muestra de ensayo. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas
entre el control y las muestras tratadas (*** p <0,001); Las barras de error corresponden a la desviación estándar. MAO
103 y MAO 104.

El efecto mutagénico de AFB1 disminuyó mediante el tratamiento con A. oryzae MAO 103 y MAO 104. La muestra
de control AFB1 no tratada, después de incubación durante 72 h a 30 ° C, todavía tenía fuertes respuestas
mutagenicas en ambas cepas de Salmonella, mientras que los resultados De las muestras tratadas con A. oryzae
MAO 103 y MAO 104 mostraron que los efectos mutagénicos de AFB1 disminuyeron a 5,7% y 6,4% (p <0,001)
en mutaciones de desplazamiento de marco de la cepa TA98, respectivamente. La mutagenicidad de la sustitución
de bases ensayada con la cepa TA100 también disminuyó en muestras tratadas con cepas de A. oryzae (49,5% en
MAO 103 de A. oryzae y 50,8% en MAO 104, p <0,001) a los mismos niveles que en una muestra en blanco
(52,3%). Estos resultados indican que los efectos mutagénicos de AFB1 disminuyeron por los dos hongos
degradantes de AFB1. Se ha informado que los efectos mutagénicos de AFB1 fueron causados tanto por la porción
lactona como por el resto dihidrofuranofurano de la molécula [55-57]. Nuestros datos de prueba de Ames sugieren
que la pérdida de las estructuras mutagénicas de AFB1 puede haber ocurrido a través de los cultivos de A. oryzae
MAO 103 y MAO 104.

Análisis de AFB 1 biodegradación de Productos

Cuando el caldo de cultivo de 14 días de cada cepa de hongos fue Examinado para detectar productos de
degradación usando HPLC, Ninguno se observó. Estos resultados son similares a los de anteriores investigadores
[58-60]. Nakazato et al. [61] informó Que varios hongos, entre ellos Aspergillus niger y A. flavus, convirtió AFB
a aflatoxicol y viceversa. Esta Se observó Inter conversión en el caldo de cultivo de hongos y los sistemas libres de
células obtenidos a partir de micelios alterados, pero no en los filtrados de cultivo de micelios intactos del mismo
Cepas de hongos.
En nuestros resultados, los filtrados de hongos no mostraron degradación de actividad de AFB-1 , que estaba de
acuerdo con sus resultados. Por otro lado, no había Aflatoxicol en los cultivos fúngicos de A. oryzae MAO 103 y
MAO 104. Esto sugiere que la AFB 1 es probable que se metaboliza productos de biodegradación con diferentes
propiedades químicas. Recientemente, Iram et al. [62] propusieron varios productos de la desintoxicación de
AFB 1 por Corymbia citrodora Extractos de plantas cuando se usan LC / MS / MS. En su estudio, la toxicidad de
estos productos degradados fue significativamente reducido debido a la eliminación del doble enlace en el anillo
furano terminal. Nuestros resultados mostraron reducción del efecto mutagénico en los resultados de la prueba
Ames. Investigaremos los posibles productos degradados AFB 1 por A. oryzae MAO 103 y MAO 104 así como
AFB 1degradación en un estudio futuro.

Fig. 6. La biodegradación de AFB1 por A. oryzae MAO 103 y MAO 104 en placas de agar a base de soja. Af, producción de
AFB1 con A. flavus M 2034; Af + Ao 46464, AFB1 Producción de A. flavus M 2034 co-cultivada con A. oryzae KACC
46464; Af + Ao 103, producción de AFB1 de A. flavus M 2034 co-cultivadas Con A. oryzae MAO 103; Y AF + Ao 104,
producción AFB1 de A. flavus M 2034 co-cultivadas con A. oryzae MAO 104. Los resultados Se obtuvieron a partir de pruebas
triplicadas. Los asteriscos indican estadísticamente las diferencias significativas entre la producción de AFB1 en placas Af y
los de Af + Ao 103 o Af + Ao 104 placas (** p <0,01); Barras de error Corresponde a la desviación estándar.

La reducción de AFB 1 producido por AFB 1 -Biodegradante A. oryzae MAO 103 y MAO 104
Utilizamos medios a base de soja para proporcionar una similar a la de la soja fermentada coreana Productos tales
como doenjang. Después de 7 días de incubación, un crecimiento de hongos en las placas de agar a base de soja
pudieron ser observados y las cantidades de AFB 1 en las placas eran determinadas por HPLC. Parecía que no había
hongos, la competencia en el crecimiento entre A. flavus y A. oryzae, A. oryzae KACC 46464, A. oryzae MAO
103, y A. oryzae MAO 104, excepto en las fronteras de contacto de dos Hongos A. flavus M 2034 produjo 105,1
ng / g AFB 1 en unos 7 días de cultivo, y A. flavus M 2034 co-cultivadas con A. oryzae KACC 46464 produjo 93,1
ng / g, que no fue significativamente diferente en AFB 1 de producción. Sin embargo, A. flavus M 2034 Co-
cultivadas con A. oryzae MAO 103 y MAO 104 produjeron 34,3 y 48,0 ng / g AFB 1, respectivamente (Fig. 6). Esto
indica que la producción AFB 1 en agar a base de soja co-cultivadas placas con los dos AFB 1 -detoxifying aislados
de A. oryzae MAO 103 y MAO 104 se redujo significativamente a 32,6% Y al 45,7% (p <0,01), respectivamente,
en comparación con el A. flavus M 2034. Al considerar las diferencias de AFB 1 de producción por cultivos de A.
flavus M 2034, A. oryzae KACC 46464, y los dos aislamientos de A. oryzae, el AFB 1 de producción en el co-
cultivo de A. oryzae MAO 103 o MAO 104 era debido a su capacidad -biodegradante de AFB 1 en vez que la
competencia fúngica. Estos resultados sugieren que A. oryzae MAO 103 y MAO 104 pueden utilizarse
conjuntamente como una herramienta para el control de AFB 1 en sistemas alimentarios. Liu et al. [63] encontraron
una AFB 1 -degrading seta.
En otros estudios, los microorganismos AFB 1 biodegradación eran aislados del suelo [26, 58, 64], los cultivos
contaminados [61, 65, 66], o heces de animales [28]. Los métodos de biodegradación, la desintoxicación de
aflatoxinas puede estar limitada en su potencial Aplicable a procesos de fermentación de alimentos. sin embargo,
el dos hongos de este estudio, A. oryzae MAO 103 y MAO 104, podría aplicarse directamente a la fermentación
de la soja porque estaban aislados de una fuente de alimento, meju. Además, A. oryzae figura en la lista de los
microrganismos seguros por la FDA [67, 68]. En conclusión, la actividad de degradación de AFB 1 de A. oryzae
MAO 103 y MAO 104 fue de 97,4% y 96,1%, respectivamente,
En medios de cultivo de 14 días. La pérdida de AFB 1 mutagenicidad vía cepas fue implicado como un método
potencial para desintoxicación de AFB 1 en sistemas alimentarios. A. oryzae MAO 103 Y MAO 104 podría
aplicarse a los sistemas alimentarios fermentados para el control de contaminación de AFB 1 Este es el primer
informe que ha identificado la capacidad de AFB 1 desintoxicación por A. oryzae