1

https://es.khanacademy.org/science/biology/energy-and-enzymes/introduction-to-enzymes/a/enzymes-and-the-active-site
 binding energy

Efecto de un catalizador biológico en una reacción química

Consultar en detalle el mecanismo catalítico de la quimotripsina.

2
 ENZIMAS. Características

I. ALTA ESPICIFICIDAD.
• Especificidad de sustrato. El sustrato (S) es la
molécula sobre la que la enzima ejerce su acción
catalítica.
• Especificidad de reacción. Cada reacción está
catalizada por una enzima específica.
II. ALTA EFICIENCIA
Las enzimas aceleran las reacciones químicas aumentando su
velocidad millones de veces o incluso más.

3
 Eficiencia de las reacciones catalizadas por algunas
enzimas

Enzima Velocidad en Velocidad de reacción Rendimiento

ausencia de enzima catalizada
Anhidrasa carbónica –1 6 6
1,3 X 10 1,0 X 10 7,7 X 10
Corismato mutasa –5 50 6
2,6 X 10 1,9 X 10
Triosafosfato isomerasa 4,3 X 10 –6 4300 1,0 X 109
Carboxipeptidasa A 3,0 X 10 –9 578 1,9X 1011

AMP nucleosidasa 1,0 X 10 –11 60 6,0 X 1012

Nucleasa estafilococal 1,7 X 10 -13 95 5,6 X 1014

4
 EFICIENCIA CATALÍTICA
La mayoría de las reacciones catalizadas por enzimas son muy
eficientes, son del orden de 106 a 1014 veces más rápidas que
la misma reacción en ausencia de la enzima. Típicamente,
cada molécula de enzima es capaz de transformar cada
segundo de 100 a 1000 moléculas de sustrato en producto.
El número de moléculas de sustrato transformadas a producto
por molécula de enzima en cada segundo, se conoce como el
número de recambio o K cat .

Todas las reacciones en los sistemas biológicos son catalizadas por

enzimas.
Una reacción tan sencilla como la hidratación del CO2 es catalizada
por una enzima, la anhidrasa carbónica. Cada molécula enzimática
puede hidratar 105 moléculas de CO2 en un segundo.
5
(pK1 = 6,35)
 Nomenclatura y Clasificación
Cada enzima es designada por:
• Nombre recomendado: corto y apropiado para su uso general.
• Nombre sistemático: que identifica la reacción que cataliza.
• Número: se emplea cuando se necesita la identificación inequívoca
de la enzima.
No. Clase Tipo de reacción catalizada
1 Oxidoreductasas Transferencia de electrones (iones hidruro o átomos de H)
2 Transferasas Reacciones de transferencia de grupo
3 Hidrolasas Reacciones de hidrólisis (transferencia de grupos
funcionales al agua)
4 Liasas Adición de grupos a dobles enlaces o formación
de dobles enlaces por remoción de grupos
5 Isomerasas Transferemcia de grupos dentro de la misma molécula
para producir isómeros
6 Ligasas Formación de enlaces C-C, C-S, C-O y C-N 6
por reacciones de condensación acopladas a ruptura de ATP
CLASIFICACIÓN INTERNACIONAL DE LAS ENZIMAS
Cada enzima tiene asignado un número de clasificación de cuatro dígitos y un nombre
sistemático que identifica la reacción que cataliza.

ATP + D-Glucosa ADP + D-glucosa 6-fosfato

El nombre sistemático formal de la enzima es: ATP: glucosa transferasa que indica que cataliza la
transferencia de un grupo fosforilo del ATP a la Glucosa.

E.C. 2.7.1.1. El primer dígito (2) indica el nombre de la clase (transferasa), el segundo (7) la
subclase (fosfotransferasa), el tercer dígito (1), una fosfotransferasa con un grupo hidroxilo
como aceptor, y el cuarto dígito (1), D-glucosa el grupo aceptor del fosforilo. Nombre común
HEXOQUINASA. 7
 LA CATÁLISIS ENZIMÁTICA Y SU CONTROL
SON INDISPENSABLES PARA LA VIDA

Únicamente se catalizan las reacciones necesarias

para la célula, en un momento determinado.

Cuando los recursos químicos son abundantes se

hace síntesis y almacenamiento de glucosa y otros
metabolitos.
Cuando las fuentes químicas son escasas, éstos
depósitos son usados para el metabolismo celular
energético.
8
 ENZIMAS
Algunas enzimas requieren un COFACTOR (molécula u ión
inorgánico) para su funcionamiento.

Iones inorgánicos
COFACTOR
Molécula orgánica

Coenzima: Unión débil. Ejemplos:NAD, NADP, FAD,

FMN, ATP, CoA, Vitaminas.

Grupo prostético: Coenzima u ión metálico unido fuertemente

a la enzima, a veces covalentemente.
Ejemplo: Los Citocromos (grupo hemo) 9
 Apoenzima + Cofactor = Holoenzima

Holoenzima:
Enzima catalíticamente activa unida a su coenzima u iones
metálicos.

Apoenzima:
Parte protéica de una enzima sin su coenzima o grupo prostético
10
Elementos inorgánicos como cofactores de algunas enzimas

11
Coenzimas que actúan como transportadores transitorios de
átomos o grupos funcionales

12
 SITIO ACTIVO
La catálisis eficiente depende de efectos de proximidad y
orientación.

El microambiente del sitio activo promueve la catálisis.

Algunas enzimas son esteroespecíficas.
13
Características de los sitios activos

1. El sitio activo es una porción relativamente pequeña del volumen

total de la enzima.
2. El sitio activo es una unidad tridimensional formada por grupos
funcionales de residuos aminoacídicos del polipéptido.
3. Los sustratos se unen al sitio activo de las enzimas por numerosas
fuerzas débiles.
4. Los sitios activos son hoyos o hendiduras complementarias a la
estructura de los sustratos.
5. La especificidad de la unión E-S depende de la disposición
definida de los átomos del sitio activo.
14
 Las enzimas afectan la velocidad de las reacciones no el
equilibrio
k1 k2
ES ES EP
k 1 k2
binding energy

Coordenada de reacción

Las enzimas aceleran las reacciones disminuyendo G †, la energía de

activación.

15
El poder catalítico de las enzimas reside en su:
Facilidad para tener cambios conformacionales durante la
reacción enzimática.
Capacidad de formar enlaces covalentes transitorios con el
sustrato.
Capacidad de formar muchísimas interacciones débiles con el
sustrato.
La mayoría de la energía requerida para disminuir la energía
de activación proviene de las interacciones no covalentes entre
la enzima y el sustrato.
La actividad catalítica de las enzimas también depende de la
estabilización del estado de transición, efectos de proximidad
y orientación, ajuste inducido y catálisis electrostática.
16
17
 MECANISMO DE ACCIÓN DE ENZIMAS
PURIFICADAS
Hay varias aproximaciones: experimentales y
computacionales:

• Métodos estructurales
• Métodos de mutagénesis dirigida que permiten
examinar el rol de aminoácidos específicos
• Métodos de CINÉTICA ENZIMÁTICA. Son los más
antiguos y los más importantes, aún hoy día.
1. Determinar la velocidad de la reacción.
2. Determinar los cambios en la reacción en respuesta a
cambios en parámetros experimentales. 18
 1. Catálisis ácido-base
Mecanismo catalítico en el que la transferencia de un protón de un
ácido o la remoción de un protón por una base reducen la energía
libre del estado de transición.

Cadenas laterales de aminoácidos que

pueden actuar como catalizadores ácido-base

Dado que las funciones catalíticas

de estos residuos dependen de su
estado de protonación o
desprotonación, la actividad
catalítica de la enzima puede ser
sensible a los cambios de pH.
19
 2. Catálisis covalente
Mecanismo catalítico en el que la formación de un enlace covalente entre la enzima
y el sustrato reduce la energía libre del estado de transición.

Residuos aminoacídicos que pueden actuar como catalizadores

covalentes

20
 Tríada catalítica de la quimotripsina

La quimotripsina utiliza catálisis ácido-base y catálisis

covalente para acelerar la hidrólisis de enlaces peptídicos.
21
Mecanismo catalítico de la quimotripsina y otras serinproteasas.

RN:F, W, Y (C)
H: catalizador básico

H: catalizador básico

H: catalizador ácido

H: catalizador ácido
Hidrólisis del
enlace peptídico
por quimotripsina

22
 3. Catálisis por ion metálico

Mecanismo catalítico que requiere la presencia de un ion metálico

para reducir la energía libre del estado de transición de una reacción.

Los iones metálicos pueden participar en reacciones enzimáticas

mediante procesos de oxidorreducción, o promoviendo la reactividad
de otros grupos en el sitio activo de la enzima a través de efectos
electrostáticos.

23
 CINÉTICA ENZIMÁTICA

k1 k2
ES ES EP
k 1 k2

k2 k2
ES EP ES EP
k2

Este paso de la reacción limita la velocidad de la reacción total. La

velocidad total es proporcional a la concentración de ES.
24
http://es.wikipedia.org/wiki/Cin%C3%A9tica_enzim%C3%A1tica
La velocidad de la reacción va aumentando a medida que aumenta la
concentración de sustrato hasta que la enzima se satura.
En cualquier momento de la reacción, la enzima puede existir en dos
formas: libre (E) o en el complejo (ES).
La velocidad máxima de la reacción catalizada por la enzima se presenta
cuando la concentración de ES es máxima y la concentración de E es
despreciable.
En estas condiciones la E esta “saturada” con el sustrato, así que un
aumento en la S  no tiene efecto sobre la velocidad. 25
Efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad
de una reacción catalizada por una enzima
Reacción “in vitro” catalizada por una enzima purificada

Es complicado puesto que la S  cambia con el curso de la

reacción.

Una aproximación en los estudios de cinética es medir la

velocidad inicial, V0 , cuando la concentración de S  es,
generalmente, más grande que la E.

Si la medida se hace en un tiempo muy corto, se pueden

considerar los cambios en la S  como despreciables y puede
considerarse a la S como una constante.
26
 k2
EP
k1
ES
k 1 ES
La V0 está determinada por la ruptura del complejo ES para
formar el producto, el que depende de la ES ; es decir:

V0 k2ES
Puesto que no se puede medir fácilmente la ES  se debe encontrar
una expresión alternativa.
Se introduce el términoEt  y el término enzima libre EEt ES


Con esto en mente, se procede a encontrar una expresión para la V0

en términos de parámetros que puedan medirse de manera fácil. 27
 k1
ES ES
k2
EP
k 1
Paso 1:
Las velocidades de formación y ruptura del complejo ES están
determinadas por las constantes de formación K1 y de ruptura
K1  K2 . E 
Velocidad de formación de ES= k1 (  Et    ES )  S 
Velocidad de ruptura de ES k1ES
k2ES

Paso 2:
Se hace la suposición de que la V0 de la reacción refleja un estado
estacionario en el que la ES es constante. Es decir que la velocidad
de formación es igual a la velocidad de ruptura.

k1 ( Et    ES )  S  = k 1  ES  + k 2  ES 
28
Paso 3: k1 ( Et    ES )  S  = k 1  ES  + k 2  ES 
Se realizan una serie de transformaciones algebráicas. Primero en el lado
izquierdo se aplica la ley distributiva y en el derecho la asociativa.


k
1t
ES
k
1 

ES
S
k

1k
2

ES
Se suma el término K1ESS a ambos lados de la ecuación y se
simplifica para dar:


k
1Et
S

k
1S
k
1k
2

ES
Resolviendo la ecuación para ES  , se obtiene:

ES
 k
1
E t

S
k
1
S k 1
 k2
29
 Simplificando y combinando las constantes de velocidad tenemos:

ES  t
kk 
E 
S

ES
 k
1E
t

S 2 1 
S
k
1
S k1
 k2
k
1

Constante de Michaelis K m
Haciendo la sustitución en el término de la derecha, obtenemos:

ES
 
EtS
Paso 4: K m S
En el estado estacionario la velocidad de formación del producto V0
Vmáx
es VmáxS
K 2  E t  S  V0 
V0  k2 [ ES ]= KmS
Km + S 
Ecuación de Michaelis-Menten
30
 
VmáxS
Ecuación de Michaelis-Menten V0 
KmS

Una relación numérica importante emerge de esta ecuación y es el

caso especial en el que la V0 es exactamente un medio de la Vmáx .
Entonces:
Vmáx V

S
máx
2 K m S
1

S
Dividiendo por Vmáx , obtenemos:
2 Km S

Resolviendo para K m obtenemos KmS2S , o:

1
K m =  S  , cuando :V0 = Vmáx 31
2
Efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad
de una reacción catalizada por una enzima.

VmáxS
Ecuación de Michaelis-Menten V0 
KmS

V0 k2ES
Velocidad inicial, Vo ( µM/min)‫‏‬

1 K
m
S, 
cuand
:
V0
1
Vm
Vmáx 2
2
k1 k2
ES ES EP
k 1 k2

Concentración de sustrato, S  (mM)‫‏‬

32
El complejo ES es la clave para comprender este comportamiento cinético
Determinación de Km y Vmáx experimentalmente
Procedimiento:
1. Mantenga la [Et] constante durante
todo el experimento.
2. Utilice diferentes concentraciones de
sustrato: [S1], [S2] [S3]...[Sn].
3. Mida la [P] formado en función del
tiempo.
4. Obtenga la mejor línea recta con los
datos obtenidos para determinar V =

V, unidades=[P]/t
∆[P]/ ∆t
5. Repita los pasos 2, 3 y 4 para cada
concentración de sustrato.
6. Grafique los valores de V obtenidos
en un gráfico de V versus [S].
7. Determine Km y Vmax en un gráfico de [S]
33
dobles recíprocos.
 TRANSFORMACIONES DE LA ECUACIÓN DE
MICHAELIS-MENTEN
V0 

VmáxS
KmS
GRÁFICA DE LINEWEAVER-BURK
O DEL DOBLE RECÍPROCO

Permite la obtención del valor de la Km de una manera más precisa

34
Km para algunas enzimas y sustratos

35
 k1 k2 k3
ES ES EP EP
k 1 k2

Número de recambio K cat  K 3 

Es el número máximo de moléculas de sustrato procesadas/sitio

activo (moles de sustrato/moles de sitio activo):

K V
cat /E
máx total

36
Kcat (No. de recambio) para algunas enzimas

37
 kcat
km

Enzimas para las que la relación Kcat/Km esta cerca al límite

de difusión de 108 a 109 M-1s-1

38
39
Enzimas interconvertibles de
inactivas a activas, o lo contrario,
por acción de otras enzimas
40
 INHIBICIÓN ENZIMÁTICA

Sin inhibidor

Con inhibidor

Constituye el principal mecanismo de control en los sistemas

biológicos

Muchos fármacos y agentes tóxicos actúan inhibiendo a las

enzimas. 41
 INHIBICIÓN ENZIMÁTICA

REGULADORES son moléculas que aumentan o disminuyen la

velocidad de las reacciones catalizadas.
Pueden ser utilizados como drogas. Por ejemplo la aspirina (ácido
acetilsalisílico) inhibe el primer paso de la síntesis de prostaglandinas.

El estudio de los inhibidores también ofrece información sobre los

mecanismos enzimáticos y ayuda en la definición de rutas metabólicas.

Competitivos
1. INHIBIDORES REVERSIBLES No competitivos
Acompetitivos

2. INHIBIDORES IRREVERSIBLES
42
 Inhibición enzimática
I. Inhibición reversible:
Hay disociación del complejo EI
• Competitiva: el S y el I compiten por el sitio activo de la enzima.
Un Inhibidor competitivo disminuye Km. Puede superarse
aumentando [S].

• No competitiva: El I se fija a la enzima en un sitio de la molécula

que no es el activo. Actúa disminuyendo el número de recambio
de la enzima y no la [ES]. No puede revertirse aumentando [S].

• Acompetitiva: el I se combina con el complejo enzima-sustrato

para formar un complejo inactivo enzima-sustrato-inhibidor, el
cual no experimenta su transformación posterior en producto.43
II. Inhibición Irreversible:
El inhibidor se une fuertemente a la enzima puede ser de
manera covalente o no, y su disociación es lenta.
Acción de gases neurotóxicos sobre la acetilcolinestarasa.

Los agentes alquilantes, como la iodoacetamida, pueden

inhibir irreversiblemente la actividad enzimática
modificando la cisteína y otras cadenas laterales de
aminoácidos.

E-CH2SH + ICH2-C-NH2 E-CH2-S-CH2-C-NH2 + HI 44

 INHIBICIÓN REVERSIBLE COMPETITIVA



1 

K 
m 1
 
1
V 
0 V 

máx
S Vmáx

El inhibidor se une al sitio activo de la

enzima compitiendo con el sustrato:

Aumenta Km

No cambia Vmáx

45
 INHIBICIÓN REVERSIBLE COMPETITIVA

Una terapia médica basada en el conocimiento del mecanismo

de inhibición competitiva es el tratamiento de la intoxicación
con metanol.

Alcohol deshidrogenasa + Metanol Formaldehído

CEGUERA

Alcohol deshidrogenasa + Etanol Acetaldehído

46
INHIBICIÓN REVERSIBLE NO COMPETITIVA

1 K
 m


1

'


 
0 
V V S V
máx máx 47
INHIBICIÓN REVERSIBLE ACOMPETITIVA

El inhibidor se une al complejo ES

estabilizándolo, pero impidiendo la
formación de producto:

Disminuye Km
48
Disminuye Vmáx
Son proteínas catalíticas con dos o más sitios de unión de moléculas
diferentes que interactúan funcionalmente.
Esto significa que tienen al menos dos sitios capaces de enlazar ligandos
(sustratos, inhibidores, etc.) en diferentes posiciones. La unión de un
ligando en un sitio altera las propiedades del otro u otros sitios y la
actividad de la enzima.

Las enzimas alostéricas son oligómeros que adquieren conformaciones

inducidas por enlace con los moduladores.
Sustrato
Activadores
MODULADORES Molécula diferente
Inhibidores
Los moduladores alostéricos inducen cambios conformacionales entre formas activas e
inactivas de las enzimas y su efecto sobre la cinética es distinto del de los otros
inhibidores. 49
50
51
 Vmáx

V S h

0 h
máx
V
1
Vmáx
K0,5S
h

2
Cuando h=1 la enzima no es alostérica.
K 0,5

Son las que adquieren “otras‫‏‬formas”‫‏‬o‫‏‬conformaciones‫‏‬

inducidas por interacción con moduladores
52
INTERACCION DE SUBUNIDADES
EN ENZIMAS ALOSTERICAS

53
 V S
h

0 h
máx
V
Cuando h=1 la enzima es no alostérica K 
0,5S 
h
54
Inhibición por feedback alostérico

La conversión de L-treonina a
L-isoleucina es catalizada por una secuencia
de enzimas (E1 a E5).

La Treonina deshidratasa (E1) es inhibida por

feedback alostérico (retroalimentación
alostérica) por la L-isoleucina el producto final
de la secuencia, pero no por ninguno de sus
cuatro intermediarios (A to D).

55
56
 La cinética de la mayoría de las enzimas alostéricas (reguladoras)
puede estudiarse mediante un modelo sencillo que tiene las siguientes
características:

Estado R activo Estado T inactivo

• La enzima puede existir en dos estados conformacionales: T (estado

tenso, no funcional, KM aumentada) y R(relajado, funcional, KM
baja). En ausencia de sustrato los dos estados R y T están equilibrio.
• Un cambio en el estado conformacional cambia las propiedades de
los centros activos y así algunos moduladores se unen
preferentemente a una conformación, mientras que los otros se unirán
a la otra.
57
58
59
EFECTO DEL pH Y DE LA TEMPERATURA
SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

60
pH
Las enzimas poseen un pH característico donde su actividad es
máxima: por encima o por debajo de ese pH la actividad disminuye.
La relación pH – actividad enzimática, constituye un factor de
regulación intracelular de la actividad enzimática.
El pH puede afectar de varias maneras:
•El sitio activo puede contener aminoácidos con grupos
ionizados que pueden variar con el pH.
•La ionización de aminoácidos que no están en el sitio
activo puede provocar modificaciones en la
conformación de la enzima.
•El sustrato puede verse afectado por las variaciones del
pH.
La pepsina del estómago, presenta un óptimo a pH=2,
61
y la fosfatasa alcalina del intestino un pH= 12
pH ÓPTIMO DE ALGUNAS ENZIMAS

62
Temperatura
La velocidad de las reacciones enzimáticas
aumentan por lo general con la temperatura, dentro
del intervalo en que la enzima es estable y activa.
La velocidad, por lo general, se duplica por cada 10
C° de aumento de temperatura. A bajas
temperaturas, la velocidad de reacción disminuye o
se detiene.
Por encima de la temperatura óptima, las enzimas
se desnaturalizan y pierden su capacidad catalítica.
63
 [S] v 1/[S] 1/v
(M/min)-1 x
(M) x 10-5 (M/min) x 109 (M-1)x 10-4 10-7
[S] v
M nmoles/Lmin 0.833 13.8 12.00 7.24
8.33x10-6 13.8 1.00 16.0 10.00 6.25
1.00x10-5 16.0
1.25 19.0 8.00 5.26
1.25x10-5 19.0
1.67x10-5 23.6 1.67 23.6 6.00 4.24
2.00x10-5 26.7 2.00 26.7 5.00 3.74
2.50x10-5 30.8
2.50 30.8 4.00 3.25
3.00x10-5 34.3
3.33x10-5 36.3 3.00 34.3 3.33 2.91

4.00x10-5 40.0 3.33 36.3 3.00 2.75

5.00x10-5 44.4
4.00 40.0 2.50 2.50
6.00x10-5 48.0
8.00x10-5 53.4 5.00 44.4 2.00 2.25

1.00x10-4 57.1 6.00 48.0 1.67 2.08

2.00x10-4 66.7 8.00 53.4 1.25 1.88

10.00 57.1 1.00 1.75

64
20.00 66.7 0.50 1.50
 80

70

60

Vo [M/S]
50

40

30

20

8 10

0
7 0 5 10 15 20 25
1/v(M/min)-1x10-7

[S] M
Intercepto = -1/Km=2.5x10 4

Intercepto=1/Vmax=1.25x107=0.8x10-7M/min
1

0
-3 -1 1 3 5 7 9 11

1/[S] (M)-1 x 10-4 65

Km=4 x 10-5 M
Este material ha sido organizado por Martha Cecilia Daza
Espinosa, profesora de la Universidad Industrial de Santander para
el curso de Bioquímica para la carrera de Química.

Buena parte de la información es tomada del libro:

David, L. Nelson, Michael M. Cox. Lehninger Principles of

Biochemistry. 2006. Fourth Edition. Worth Publishers

66