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LABORATORIO DE QUIMICA ANALITICA II

PRACTICA No. 3
CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO:
SEPARACION DE LOS COMPONENTES DE UNA MUESTRA PROTEICA DE HONGOS

INTRODUCCIÓN. La cromatografía de intercambio iónica es conocida desde hace 30 años. Se basa


en el equilibrio de intercambio entre una fase sólida que contiene grupos sulfónicos o dicarboxílicos
(para la separación de cationes) o grupos amino cuaternarios, ternarios o secundarios (para la
separación de aniones). Estos recubrimientos se depositan sobre pequeñas esferas de sílice, vidrio o
de algún polímero que son capaces de soportar las altas presiones comúnmente usadas en la
cromatografía líquida de alta resolución. Una vez eluida la muestra, la atracción de cargas opuestas
entre los componentes y la fase estacionaria, permitirá que estos se retengan con un mayor o menor
grado según sea su carga. Por lo que componentes con mayor carga opuesta, serán retenidos más.
Para obligarlos a separarse se necesitara de una molécula de mayor carga, para que al aumentar su
concentración en el eluyente (fase móvil), desplazará a los componentes gradualmente, es decir se
intercambiarán.

OBJETIVO: Que el alumno aprenda los fundamentos y la técnica de separación de la cromatografía


de intercambio iónico, efectuando la elusión de una muestra proteica de hongos.

MATERIALES REACTIVOS
Cromatografo de Líquidos de Baja Presión Agua Desionizada (4 L)
(profesor) Etanol
Columna Q-Sepharosa (profesor) Hidróxido de Sodio
Unidad de Filtración (profesor) Tris-HCl (Tris Hidrocloruro)
3 Filtros de celulosa (45µm de porosidad) NaCl
Alumnos:
1 Bomba de vació
1 Tapa de plástico (agua purificada)
1 Matraz Aforado de 1 L
(Soluciones)
1 Matraz Aforado de 250 mL
Equipo 1: 1 L de solución Tris-HCl 50 mM pH 7.3
1 Piceta con agua
Equipo 2: 1 L de Solución Tris-HCl 50 mM pH 7.3
1 Vaso de precipitados de 500 mL
en NaCl 0.5 M
1 Agitador Magnético
Equipo 3: 250 mL de solución NaCl 2M
1 Matraz Kitazato de 500 mL
250 mL de solución 70% de Etanol en agua
1 Manguera de Latex
Equipo 4: 250 mL de solución NaOH 1M
1 Parrilla Eléctrica
1 L de Agua Desionizada Filtrada por 45µm.
METODOLOGÍA
Tratamiento de soluciones (previo a la práctica)
Una vez preparada las soluciones (mencionadas anteriormente), filtrar utilizando un filtro de 45 m de
porosidad, acoplado a la unidad de filtración. Colocar cada una de las soluciones filtradas en un
matraz Kitazato de 500 mL limpio, adicionar un agitador magnético y tapar la boca del matraz con
una tapa de plástico. Conectar este matraz a una bomba de vació durante 15 minutos con agitación
constante. Etiquetar las soluciones. Cada solución que ingrese al cromatógrafo deberá pasar por este
tratamiento.

Tratamiento de la muestra (previo a la práctica)


Macerar en un mortero un fragmento de 1 g de hongo seta en 5 mL de solución de Tris-HCl 50 mM pH
7.3, y colocar este macerado en un tubo de centrifuga de 25 mL y efectuar el proceso a 10,000 rpm
durante 15 minutos. Posteriormente ,el sobrenadante es aforado a 10 mL con solución de Tris-HCl 50
mM pH 7.3.

Acondicionamiento del Equipo (previo a la práctica)


El equipo consta de dos mangueras de ingreso de líquidos, la entrada A y la B y dos mangueras de
salida. Las condiciones a las que trabajará siempre la bomba peristaltica es un flujo de 5 mL/min. La
limpieza de las mangueras del equipo deberá efectuarse con las soluciones anteriormente tratadas.
Este proceso comienza por limpiar las mangueras y la columna (HiPrep, fase estacionaria: Q-
sepharosa), transportando un volumen total de 100 mL agua des ionizada a un flujo volumétrico de 5
mL/min. Posteriormente pasar por las mangueras 80 mL de 2M de NaCl, seguido de 50 mL de agua
desionizada. Posteriormente 80 mL de NaOH y después 50 mL de agua desionizada. Por último 80 mL
de etanol al 70% y 50 mL de agua.

Equilibrio Químico de la columna


Para efectuar este proceso se colocan los amortiguadores que servirán como fase móvil del
experimento, de manera que se colocaran en forma permanentemente en las mangueras de
entrada A y B. Se hacen pasar 100 mL de amortiguador de Tris-HCl 50 mM pH 7.3, por la manguera de
entrada A. Posteriormente 100 mL de amortiguador Tris-HCl 50 mM pH 7.3 con NaCl 0.5 M por la
manguera B y por último 100 mL del primer amortiguador por A.

Rutina programada del Equipo, Inyección y Elusión de la Muestra


El equipo deberá programarse por intervalos de tiempo, de la siguiente forma antes de que se
inyecte la muestra:

 De 0 a 16 minutos pasará solamente la solución de Tris por la entrada A.


 De 16 a 80 minutos el equipo mezclara en forma gradual de 0 a 100%, la solución de la
entrada A, con la de Tris-NaCl por la entrada B.
 Un último paso, de 80 a 90 minutos solamente pasará por B, 100% de solución Tris-NaCl.

El aparato cuenta con un dispositivo colector de fracciones, en donde se colocan previamente 80


tubos limpios y cuando inicie la rutina, se depositarán 5 mL de las soluciones eluidas por cada tubo en
cada minuto.

El proceso cromatográfico comienza al iniciar la rutina programada. Cuando se cumpla un minuto


pausar esta rutina , sacar la manguera A de la solución y colocarla en el matraz con la muestra, que
será absorbida en su totalidad, posteriormente regresar la manguera A a la solución respectiva,
reiniciar la rutina
Se puede monitorear la elusión, ya que existe un detector de conductividad eléctrica, que medirá la
concentración relativa de los iones en la fase móvil y un detector de absorción UV-Visible que medirá
la concentración de las proteínas en solución, a una longitud de onda de 280nm. Estos dos
detectores están acoplados a las mangueras y a una computadora. Esperar a que se cumpla la
rutina en su totalidad.
Informe:
Reportar en una gráfica el comportamiento de la señales registradas por los dos detectores.
Efectué los comentarios pertinentes sobre las señales registradas y relacione con los
componentes de la muestra.
Comente que otros métodos se pueden aplicar, para conocer el contenido de cada tubo en
las fracciones colectadas durante el experimento.
Investigue que características tiene la columna utilizada.
Describa las características de los dos detectores utilizados.
CUESTIONARIO
1. ¿Si deseo mayor separación entre cada señal (picos) registrada que condiciones podría mover en el
experimento? Justifique su respuesta.
2. ¿Como afecta la concentración del eluyente en los tiempos de retención de los analitos?
3. ¿Como afecta el pH de la fase móvil sobre el poder de elusión de un analito?
4. Efectué una tabla de 5 soportes cationicos y 5 anionicos utilizados, colocando la carga del grupo
funcional importante
5. Efectué una tabla de 10 amortiguadores que se pueden utilizar para cada fase móvil indicando el pH de
trabajo en la cromatografía de intercambio ionico.
6. Una vez utilizadas, ¿Que condiciones de almacenamiento se debe tener en las columnas
preempacadas?
7. Que cuidados se debe tener en el manejo de soluciones, equipo y de las muestras que se están
separando.
BIBLIOGRAFIA
Handbook “Ión Exchange Chromatography, Principles and Methods”, Amersham Pharmacia 2000
J. Weiss (1995). Ion Chromatography, 2nd Edition VCH.
Harris, D. C. (2001). Análisis Químico Cuantitativo. Ed. Reverté S. A., España. Ed. Mac Graw Hill
Interamericana.
Luna-Rangel, R. 1981. Fundamentos de Química Analítica. Vol. I. Ed. Limusa México
Zweig, G. and Sherma, J. (eds). 1978. Handbook series in chromatography. CRC Handbook Series
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Willard, H. H., Merritt, Jr. L. L. And Dean , J. A. 1981. Métodos Instrumentales de Análisis. C.E.C.S.A,
México.