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También se puede identificar por PCR esta técnica genera resultados más exactos
sobre la especie y genero del microorganismo para ello se analizan las secuencias
ITS según (Gutiérrez & bustamante, 2013) utilizando los siguientes cebadores
universales 5´-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3´ y 5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´ y los siguientes
específico s para Fusarium Oxysporium 5´-GCGACGATTACCAGTAACGA-3 y 5′-
AACTCCCAAACCCCTGTGAACATA-3′ las condiciones para el termociclador son 40 ciclos con
desnaturalización de 30 segundos a 95°C, anillamiento a 55°C por 30 segundos y extensión
durante 1 minuto a 72°C para la posterior amplificación y revelado de la electroforesis .
BACTERIA
1. IMPORTANCIA ECONÓMICA DE Xanthomonas.
Una enfermedad común es la bacteriosis producida por la bacteria Xanthomonas
campestris pv. phaseoli (Smith)(Xcp), dicho patógeno, se reconoce como la bacteria
causante de atacar principalmente cultivos de frijol, y considerándose como el principal
reductor del rendimiento en cultivos para este tipo de grano (Yoshii, K.1980). las
condiciones que favorecen la aparición y prevalencia del patógeno son una humedad
relativa alta a una temperatura de entre 28-30° C, pudiendo ésta llegar a causar pérdidas
significativas en el rendimiento, que, según informes de Colombia, Estados Unidos y
Canadá, varían entre 10 a 45% (Pastor-Corrales, M., 1985). La variedad phaseoli es un
patógeno de importancia por varias razones. Principalmente porque atacan a uno de los
cultivos de granos que más se consumen en el mundo como lo es el frijol (P. vulgaris); este
representa dietariamente, varios constituyentes esenciales en la dieta humana; proteína
vegetal, vitaminas y minerales como ácido fólico y hierro, así como agentes antioxidantes y
poca cantidad de grasa además de fibra, almidón, y oligosacáridos. Este organismo
patógeno tiene la capacidad de infectar de igual forma follaje, tallos, vainas y semillas. Su
diseminación se da a través de la semilla, como también mediante residuos de las cosechas
(Saettler, A. W., 1989). En el mundo, en 2006, la industria del frijol tuvo una valuación entre
180 y 1,200 millones de dólares en Canadá y los Estados Unidos respectivamente. En países
como Brasil y México donde la actividad agrícola es una importante fuente de trabajo y de
intercambio comercial por la exportación del producto se ve severamente perjudicada por
la afectación de amplias extensiones de cultivo por esta bacteria. (Saettler, A. W., 1989)
Finalmente, el manejo y el control de la enfermedad terminan por afectar el costo de
producción de los granos, lo que conlleva a aumentos en los precios para los distribuidores
y por lo tanto a los consumidores. A raíz de esto se hace especial énfasis en la prevención
de la enfermedad
2. SÍNTOMAS EN LA PLANTA
Los síntomas en la planta se pueden presentar de las siguientes formas
Manchas y tizones: Cuyas variedades patógenas producen: el tizón común del frijol,
la mancha foliar angular del algodón pv, el tizón foliar bacteriano del arroz, el tizón
bacteriano o raya de los cereales, la raya foliar bacteriana del arroz, la mancha
bacteriana de los frutos de hueso y del tomate y chile, la mancha foliar de la begonia,
el tizón foliar de la gladiola, la mancha foliar y pudrición del tallo del geranio y el
tizón del nogal (Agrios. 2005).
Marchitamientos vasculares: Pudrición negra o nervadura negra de las cruciferas
(X. pv. campestris) y la gomosis de la caña de azúcar (X. vasculorum)( Agrios. 2005).
Cancros: Produce el cancro bacteriano de los cítricos. (X. campestris pv. citri)( Agrios.
2005).
Pruebas morfológicas:
Una vez obtenidos los cultivos puros y las colonias aisladas se proceden a la observación de
sus características en los medios de cultivo sólidos. Se observa la elevación, borde, tamaño
y color de las colonias, y producción de exopolisacáridos, entre otras características que
permiten a simple vista separar estos microorganismos (Díaz y Ferrán, 2003)
Pruebas bioquímicas:
Los aislados que resultan ser bacilos Gram negativos son sometidos a las pruebas de
actividad de catalasa y de oxidasa, fermentación de glucosa y de lactosa, hidrólisis de
almidón y de esculina, licuefacción de gelatina, y producción de mucosidad (Schaad et al.,
2001)
Extracción del ADN total:
los aislados se inoculan en 5 ml de Caldo Nutritivo (CN) y se incuban a 28°C de 12 a 18h. Del
medio inoculado se toman 2 ml y se centrifugan (Eppendorf) a 8 000 rpm por 5 min. El
precipitado celular se lava con 1 ml de agua destilada estéril por tres veces y se centrifuga
a 8 000 rpm (Nunes et al.2008)
Los ADN se almacenan a -20oC hasta su posterior uso en la PCR.
Identificación molecular. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR):
Para la identificación molecular se usa ADNs totales, aislados a partir de los cultivos
bacterianos puros. Se utiliza la pareja de cebadores específicos p7X4c y p7X4e que
amplifican un fragmento de 800pb procedente de un segmento de 3,4 Kb del ADN
plasmídico (P7) de X. axonopodis pv. phaseoli (Audy P et al.1994 – Grimault et al.2014). Como
control negativo se utiliza el ADN total de la cepa de referencia de Xanthomonas campestris
pv.vesicatoria Xcv20.
El ensayo de amplificación se realiza en una mezcla de reacción de 25µl de volumen final, que
contiene GoTaqADN polimerasa a 1,25 U/reacción, solución Tampón de la enzima a 1X, cloruro de
magnesio (MgCl2) a 1,5 mM, dNTP a 0,4 µM, cada cebador a 0,8 µM y 2 µl de ADN molde. La PCR se
efectúa en un Termociclador (Eppendorf, Mastercycler) programado para 28 ciclos, usando el
programa recomendado. El fragmento de ADN amplificado se visualiza por irradiación con luz
ultravioleta en un transiluminador (Syngene InGenius L, Syngene, EE.UU) sobre un gel de agarosa al
1% en TBE al 0,5 X teñido con bromuro de etidio. Se emplea el marcador de peso molecular de 1.0Kb
(Ladder, Promega).
Control cultural.
Con frecuencia se alude que el empleo de semillas libres de enfermedades es la adecuada
para el control de esta enfermedad. No obstante, aún con el empleo de semilla no
contaminada es posible la aparición de síntomas, debido principalmente a que con la
presencia de una semilla contaminada por cada 20,000 es suficiente para la transmisión del
inoculo al campo de cultivo (Darrasse et al., 2007). La rotación de cultivares puede ser clave
en el control de la enfermedad, no obstante, se ha observado que plantas resistentes en
zonas templadas son susceptibles bajo otras condiciones como en las zonas tropicales (Gent
et al., 2005).
Control biológico.
En estudios de confrontación se ha observado que algunas cepas de Paenibacillus polymixa
producen metabolitos de naturaleza peptídica que inhiben el crecimiento de X. campestri
pv. phaseoli in vitro después de 12 h de incubación, también reducen la incidencia de la
enfermedad in vivo de hasta un 28 (Mageshwaran et al., 2011). De igual manera, algunas
cepas de Pseudomonas sp. y Rahnella aquatilis han mostrado controlar eficientemente
hasta en un 39 % esta enfermedad al ser aplicados desde las semillas, principalmente por
la formación de compuestos fenólicos y la alta actividad peroxidasa (da Silva et al., 2008).
Control por mejoramiento genético.
El mejoramiento de las plantas de frijol ante este patógeno ha sido realizado mediante la
identificación y aprovechamiento de Locus de Caracteres Cuantitativos distribuidos a través
de todo el genoma, los cuales se expresan bajo la influencia del ambiente, presión de
selección del patógeno, madurez y tejido de la planta (semilla, hoja o vaina) (Santos et al.,
2003). A partir de esto, se han desarrollado dos líneas promisorias con alto rendimiento y
resistencia al estrés hídrico que manifiestan características de resistencia al tizón común
bacteriano como la línea TRAS-MST1, la cual proviene del cruce de 2 cultivares de frijol
desarrollados en México (Porch et al., 2012).
MOLLICUTE
1. IMPORTANCIA ECONÓMICA DE Mollicutes
Las enfermedades denominadas como amarillamientos son conocidas desde inicios del siglo
XX. La enfermedad conocida como "amarillamiento del aster", se reportó por primera vez
en 1902 (Kunkel, 1926). Desde el año 1967 hasta el año 1994 se identificaron organismos
bacterianos que carecían de paredes celulares y fueron denominados como los “organismos
parecidos a las micoplasmas” como agentes causales de los amrillamentos en cambio de los
virus como se creía anteriormente, para 1994 el nombre vulgar de "fitoplasma" fue
adoptado por el Equipo de Trabajo de fitoplasma en el 10° Congreso de la Organización
Internacional de Micoplasmología, sustituyendo el término anterior. (Doi et al.).
Entre las enfermedades que causan más perdidas de tipo económico encontramos causadas
por Fitoplasmas se encuentra el “amarillamiento del áster” que se observa en diversos
cultivos, tales como papa, zanahoria, maíz, tomate, cebolla, chile, y flores de todo el mundo
(Dickinson y Hodgetts, 2012).Gran cantidad de especies vegetales son víctimas de la
infección por Fitoplasmas en todo el mundo; la afectación sobre viñedos en el pacífico sur
(Australia) tiene un rango entre el 13 y 54 % a causa de Fitoplasmas; sobre los cultivos de
papa la incidencia en Europa es del 86 % (Costanzo, 2012).
Los Fitoplasmas también son responsables de algunas enfermedades presentes en cultivos
de tipo hortícola y árboles frutales. En la actualidad, el control de estos patógenos debido a
que actualmente no se cuenta con pesticidas que puedan reducir sus efectos sobre las
plantas. Entre las estrategias necesarias para alcanzar un manejo exitoso de Fitoplasmas
está el control preventivo constituido mediante el uso de material vegetal sano, así como
la detección de mecanismos de trasmisión junto con la identificación de plantas
hospederas.
Como cualquier tipo de infección las perdidas de agricultor se traducen en aumento de
costos para el consumidor, de ahí radica la importancia del control preventivo en la
aparición de las enfermedades producidas por los Fitoplasmas.
2. SÍNTOMAS EN LA PLANTA
Sintomatologías en especies hortícolas
Durante el desarrollo de las plantas se pueden observar síntomas en el equilibrio hormonal
de la planta; la fotosíntesis; las sustancias de reserva, así como:
1. Amarillamiento o clorosis.
2. Enrojecimiento precoz de las hojas.
3. Esterilidad de las flores.
4. Virescencia, donde los pétalos tienen color verde, sin desarrollo del color característico
de la flor.
5. Enanismo generalizado.
6. Desarreglos vegetativos, como el desarrollo de grandes cúmulos de hojas o flores sin
desarrollarse, acumulándose generalmente en lugar de las yemas axilares.
7. Enrollamiento de hojas.
8. Decaimiento general.
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