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Universidad Autónoma de Yucatán

Campus de Ciencias de la Salud


Facultad de Química

Laboratorio de biociencias
Dra. Ana Ly Arroyo Herrera

Reporte práctica 4: Transformación de plásmidos en


células bacterianas.

Grupo 3
Elaboró:
Br. Cetina Pérez Irving Adrián
Br. Novelo Sarabia Patricia
Br. Sabido Che Amauri
Br. Serrano Gómez Nidia Rosa
Br. Torres Rivero Fernando Miguel

Mérida, Yucatán
21 de Marzo de 2018
Práctica 4: Transformación de plásmidos en células bacterianas.

Antecedentes

La clonación de genes o clonación molecular son un conjunto de métodos


experimentales utilizados en biología molecular que se utilizan para ensamblar
moléculas de ADN y lograr su copiado dentro de organismos receptores. El proceso
de clonación molecular implica la transferencia de una secuencia de ADN de interés
a una célula de un microorganismo. A continuación, se cultiva el microorganismo
para que reproduzca la secuencia de ADN junto con su complemento de ADN. De
aquí pueden aislarse grandes cantidades de la secuencia de interés en forma pura. 1

El desarrollo de endonucleasas de restricción bacterianas (también denominadas


enzimas de restricción), son enzimas que reconocen secuencias de cadena doble
específicas en el ADN y las rompen en el lugar de reconocimiento, o cerca de éste.
La enzima corta el ADN en ese lugar introduciendo una muesca en cada cadena
entre dos nucleótidos. El corte genera dos fragmentos, cada uno con un segmento
de cadena simple de cuatro bases en su extremo. Estos extremos “pegajosos” son
útiles para reacciones posteriores de construcción de moléculas de ADN
recombinante. 2

El corte de una molécula de ADN con una determinada enzima de restricción dirige
el ADN en una colección de fragmentos característica y reproducible, que refleja la
frecuencia y la localización de los lugares de corte específicos.

Las enzimas de restricción se denominan según el organismo en el que se


descubrieron, utilizando un sistema alfanumérico. Hay dos tipos de enzimas de
restricción:

 Las enzimas de tipo I cortan las dos cadenas del ADN en una posición
aleatoria a ciertas distancias del sitio de restricción
 Las enzimas de tipo II, reconocen una secuencia específica y cortan las dos
secuencias de la molécula de ADN con absoluta precisión dentro de las
secuencias reconocidas. Las secuencias reconocidas por las enzimas de
Tipo II son simétricas (palindrónicas), es decir, la secuencia de una de las
cadenas leída en dirección 5´ 3´ es la misma que la secuencia de la cadena
complementaria leída también en dirección 3´5´.3
La transformación es el proceso por el cual ciertas bacterias (llamadas
competentes), son capaces de incorporar ADN exógeno proveniente de otras
bacterias, que está libre en el medio. El proceso de transformación bacteriana se
refiere a la alteración del genotipo y el fenotipo de una célula bacteriana por la
captura de ADN extraño y desnudo del ambiente circundante.

La transformación requiere tanto la captación del ADN del medio que rodea a la
bacteria como su incorporación al cromosoma bacteriano o a un plásmido. Las
bacterias que captan el ADN son competentes ya que captan el ADN con mayor
facilidad que otras; la competencia se ve influida por el estadio de crecimiento, la
concentración de ADN disponible y la composición del medio.

A medida que el fragmento de ADN ingresa en la célula en el transcurso de la


transformación, una de las cadenas se hidroliza mientras la otra se mueve a través
de la membrana y puede aparearse con una región homóloga e integrarse al
cromosoma bacteriano.2

Otras especies no entran de manera de manera natural en el estado competente,


pero pueden volverse permeables al ADN por medio de tratamientos con sustancias
que modifican la envoltura de la célula, lo cual posibilita la transformación artificial.
El tratamiento con sales, con shock térmico o con un campo eléctrico vuelve las
membranas más porosas y permeables al ADN y la eficiencia de la transformación
puede incrementarse también mediante la utilización de concentraciones elevadas
de ADN. Estas técnicas posibilitan la transformación de bacterias como E. coli que
no son naturalmente competentes. 2

Un vector es una molécula de ADN que puede replicarse de manera autónoma en


un huésped, de las que posteriormente puede ser aislado en forma pura para ser
analizado. Los vectores son, esencialmente, moléculas de DNA transportadoras.
Para servir de vector, una molécula de DNA debe tener unas determinadas
características:

 Debe poder replicarse independientemente junto con el segmento de DNA


que transporta.
 Debe contener algunos sitios de corte para enzimas de restricción, presentes
sólo una vez en el vector. Estos sitios de restricción se cortan con una enzima
de restricción y se utilizan para insertar segmentos de DNA cortados con la
misma enzima.
 Debe tener algún marcador de selección (normalmente genes de resistencia
a antibióticos o genes de enzimas que la célula huésped no tiene) para poder
distinguir las células huésped que transportan el vector de las que no lo
contienen.
 El vector de la célula huésped debe ser fácil de recuperar.
Actualmente se utilizan tres tipos principales de vectores: los plásmidos, los
bacteriófagos y los cósmicos.3

 Plásmidos. Los plásmidos son moléculas de DNA de doble cadena


extracromosómicas de origen natural que tienen un origen de replicación
(ori+) y que se replican autónomamente en las células bacterianas. Para
poder utilizarlos en ingeniería genética, se han modificado o diseñado
muchos plásmidos de manera que contengan un número limitado de sitios
de restricción y genes de resistencia a antibióticos específico.4
 Bacteriófagos: otro vector que se utiliza con frecuencia es la bacteriófaga
lambda, un virus bacteriano con una molécula de ADN de doble cadena
relativamente larga. Tras infectar una célula de E. coli, el lambda se replica
para producir enormes cantidades de virus infecciosos que finalmente,
rompen las células bacterianas liberando alrededor de un millón de
bacteriófagos.4
 Los cósmidos: son vectores híbridos construidos utilizando partes del
cromosoma del fago lambda y de DNA plasmídico. Contienen la secuencia
“cos” del fago lambda, necesaria para el empaquetamiento del DNA del fago
dentro de su cubierta proteica, y secuencias plasmídicas de replicación y de
genes de resistencia a antibióticos, que permiten identificar las células
huésped que los contienen. El DNA de los cósmidos que contiene insertos
de DNA se empaqueta en la cápside proteica de lambda para formar
partículas fágicas infectivas. Una vez el cósmido entra en la célula huésped,
se replica como un plásmido. Puesto que la mayoría del genoma de lambda
se ha delecionado, los cósmidos pueden transportar insertos de DNA mucho
más grandes que los que lambda puede llevar. Los cósmidos pueden
transportar casi 50kb de DNA insertado, mientras que los vectores fágicos
pueden acomodar insertos de DNA de unas 15kb y los plásmidos
generalmente están limitados a insertos de 5-10kb.4

La expresión de proteínas recombinantes se ha realizado tanto en células


procariotas como en células eucariotas, siendo las primeras las más conocidas y
estudiadas. Dentro de los sistemas procariotas, uno de los modelos de expresión
más utilizados ha sido Escherichia coli. El éxito de Escherichia coli se basa
principalmente en; i) la facilidad de manipulación del DNA; ii) el elevado número de
mutantes y vectores de expresión disponibles; iii) el amplio conocimiento de la
fisiología de la célula, que permite alcanzar densidades celulares elevadas con un
medio de cultivo económico, y; iv) el conocimiento del efecto de la sobreexpresión
de proteínas sobre la bacteria. 5

El sistema de expresión en Escherichia coli está constituido por dos componentes:


una bacteria huésped y un vector de expresión que posee los elementos génicos
necesarios para realizar los procesos de transcripción y traducción en dicha
bacteria. Respecto al vector de expresión es preciso tener en cuenta varios criterios
con el fin de obtener una expresión eficiente: el origen de replicación, que influye en
el número máximo de copias del vector de expresión por cada célula, las
características de las secuencias de inicio y final de la transcripción, entre las que
se incluyen los promotores y terminadores, las señales de comienzo de la
traducción, como son el codón de inicio de la traducción y los sitios de unión al
ribosoma, la localización subcelular de la proteína que se va a expresar (citoplasma
o periplasma) y el control de la segregación plasmídica.5

Las cepas de E. coli recomendada son:

Aplicación Cepa Destacable Resistencia


DH5α Buen rendimiento plásmido
Insertos estables ---
Plásmidos gran tamaño
Clonajes XL1Blue MRF´ Insertos estables Permite Tet
rutinarios preparaciones ssDNA Clonaje
DNA sin metilar
Top 10 Buen rendimiento plásmido Str
Insertos estables
Sure 2 Deficiente en los genes implicados Tet/Kan
en reordenación y delección de
DNA. Mejora insertos DNA
inestable
HST08 Clonaje cDNA Clonaje DNA
---
metilado Vectores hasta 10Kb
JM110 Deficiente en las metilasas Dam y Str
Dcm
DH10Bac Clonaje baculovirus. Genera Kan/Tet
bacmidos para transfectar células
de insectos.
Clonaje
difícil XL10 Gold Aumenta la transformación de Tet/Cam
DNA de gran tamaño. Deficiente
en endonucleasas y sistemas de
restricción
Able K Reduce el número de copias en Kan/Tet
vectores derivados de ColE1,
aumentando la probabilidad de
propagar clones tóxicos.
JM101 Sistemas de restricción y
recombinación intactos ---
DB3.1 Para propagar plásmidos que Str
contienen el operón ccdB

El proceso de clonación de un fragmento de ADN en un vector de clonación


plásmido <Ori> señala un origen de replicación para el plásmido en células
bacterianas <amp> y <tet> señalan los genes bacterianos que confieren resistencia
(figura 1). Los plásmidos que se usan en la clonación contienen un gen de
resistencia a antibióticos. Por lo tanto, todas las bacterias se colocan en una placa
con antibióticos para seleccionar las que recolectaron el plásmido. Las bacterias sin
plásmido mueren. Cada bacteria Cada bacteria con plásmido da lugar a una colonia
o comunidad de bacterias idénticas que contiene el plásmido. Varias colonias se
analizan para identificar una con el plásmido adecuado. Una de las técnicas para el
análisis de los plásmidos es la PCR. 6

Figura 1. Clonación de fragmento de ADN

La reacción de la cadena de la polimerasa mediante termocicladores es una técnica


que permite copiar millones de veces una secuencia de ADN. Una de sus ventajas
es que la secuencia por copiar (ADN matriz o templado) puede estar en muy pocas
moléculas e incluso en una sola. Por lo tanto, se puede amplificar el ADN a partir de
una sola célula o de pocas células. 7

La PCR se basa en el mecanismo usual de replicación de ADN, en sus propiedades


de hibridación y en la presencia de enzimas de síntesis de ADN (polimerasas) en
bacterias termófilas, que son resistentes a altas temperaturas (70°-90° C).

La PCR requiere de un molde a partir del cual se generan las copias, dos
oligonucleótidos (cebadores o primers) específicos complementarios a una porción
de la región que se desea amplificar, una enzima capas de sintetizar ADN utilizando
como molde ADN y los deoxinucleótidos (dNTPs) que serán incorporados a las
cadenas nacientes de ADN.7

En general cada ciclo de la reacción se divide en 3 partes.

1. Desnaturalización: en esta etapa, el ADN molde de doble cadena se


desnaturaliza y sus hebras se separan. Esto se logra aumentado la
temperatura de la reacción, en general a 94° C para asegurar que todas las
moléculas se encuentran en simple hebra y permite que ocurra el segundo
pasó.
2. Hibridación: en esta etapa, la temperatura de la reacción disminuye para
permitir que los oligonucleótidos cebadores que delimitan el fragmento que
se desea amplificar se unan a su región blanca. La temperatura de unión de
los cebadores dependerá de la composición de la base de estos.
3. Elongación: en este paso, la temperatura de la reacción es aquella que
permite la actividad óptima de la enzima polimerasa presente en la reacción.7
Figura 2. Esquema del primer ciclo en la reacción de la cadena de la polimerasa.

Una vez que el ADN ha sido amplificado mediante la PCR los amplicones se
visualizan empleando la electroforesis en geles de agarosa para conocer si dicha
amplificación ocurrió eficientemente. La electroforesis se basa en la separación de
cierta molécula a través de una matriz sólida la cual funge como filtro al separar a
la molécula en un campo eléctrico de acuerdo con su tamaño y carga. En el caso
del ADN su grupo fosfato les otorga una carga negativa, teniendo que durante la
electroforesis migran hacia el polo positivo. El gel se prepara diluyendo agarosa en
un buffer y solidificándola de nuevo, mientras que el bromuro de etidio se añade ya
que permite la visualización de los amplicones al ser irradiado por luz UV. El
marcador molecular se carga en el gel junto con los amplicones (al contener un
segmento conocido de ADN facilita su identificación). 8
Objetivos

 Obtener el conocimiento, así como las habilidades para obtener células


transformadas de una cepa bacteriana de interés para el mantenimiento y
replicación de un vector de clonación.
 Obtener el conocimiento, así como las habilidades para la preparación de
una mezcla de PCR en la variante de PCR colonia, la programación del
ciclaje de amplificación y la separación de productos de PCR en geles de
agarosa.

Lista de materiales y equipo

 Medio de cultivo LB sólido con ampicilina (100g/mL) en cajas de Petri: 10g


de triptona; 5g extracto de levadura; 5g de NaCl. Adicionar agua destilada,
disolver, ajustar pH a 7.5 (con NaOH 10N) y llevar a un volumen final de 1L.
Agregar 15 g de agar. Esterilizar en autoclave. Dejar enfriar el medio a 55°C
y añadir el antibiótico referido a la concentración final especificada. Distribuir
en cajas de Petri con ~ 24-30 mL de medio.
 Medio SOC: Contiene 2g de triptona, 0.5g de extracto de levadura, 1mL de
NaCl 1M, 0.25mL de KCl 1M, 1mL de Mg2+ stock 2M (MgCl2*6H2O 1M,
MgSO4*7H2O 1M, esterilizado por filtración), 1mL de glucosa 2M esterilizado
por filtración. Adicionar la triptona, extracto de levadura, NaCl y KCl a 97mL
de agua destilada. Disolver, esterilizar en autoclave y enfriar a temperatura
ambiente. Añadir Mg2+ stock 2M y glucosa 2M. Filtrar por medio de un filtro
de 0.2 m.
 Células químicamente competentes de una cepa de E. coli de interés (XL1-
Blue, DH5a, TOP10).
 Solución stock de un vector de clonación: pDL (10pg/L).
 Termoblock con temperatura regulable o Baño de agua con temperatura
regulable.
 Picofuga o Microcentrífuga.
 Micropipeta de 1000mL con puntas estériles.
 Micropipeta de 200mL con puntas estériles.
 Baño de hielo.
 Asas de vidrio para plaquear.
 Cultivo bacteriano en agar LB-Ampicilina de clonas transformadas.
 Micropipeta de 200 µL con puntas estériles.
 Micropipeta de 10 µL con puntas estériles.
 Mezcla de PCR: Agua estéril, amortiguador de polimerasa 10X, nucléotidos
trifosfatados (dNTPs), Cloruro de Magnesio 25 mM, Taq polimerasa 5U/μL,
Oligonucleótido sentido (S), oligonucleótido antisentido (AS).
 Agarosa.
 Placa de calentamiento.
 Bromuro de etidio (10 mg/mL).
 Marcadores de peso molecular de ADN de 50 pb.
 Cámara de electroforesis horizontal con fuente de poder.
 Termociclador.
 1 L de Amortiguador TAE (Tris-Acetato-EDTA) 1x.
 Amortiguador de carga de muestras de ADN 6x.
Metodología

A)Cultivo de la cepas de interés

Descongelar en hielo una alícuota de 100 L de células competentes (~5-10


min).

Descongelar en hielo la solución stock del vector de clonación (pLD) y


centrifugar brevemente para colectar el contenido en el fondo del tubo.

Adicionar 2L de ADN (solución stock del vector de clonación) a las células
competentes. Esto se hace en condiciones estériles.

Mezclar suavemente con los dedos e incubar en baño de hielo de 20 a 30


minutos.

Incubar las células a 42°C durante 50 segundos (No agitar, punto crítico:
temperatura exacta y tiempo exacto).

Inmediatamente incubar las células en baño de hielo por 2 minutos.

Añadir 900L de medio SOC e incubar durante 45 minutos a 37°C y en


agitación (150-200 rpm)

Plaquear 25, 50 y 100 mL del cultivo transformado en medio de cultivo LB


sólido en cajas de Petri.

Incubar las cajas durante ~16 horas (toda una noche) a 37° C.
R1-2
B) PCR y Electroforesis
B)PCR y Electroforesis

Descongelar en hielo los componentes de la mezcla de PCR.

Preparar la mezcla de PCR en tubos de 0.2 mL con la fórmula del cuadro


4.1

Tomar 1 colonia de la caja de crecimiento con la ayuda de una punta de


micropipeta y homogenizarla en la mezcla de PCR.

Colocar en el termociclador y programar una corrida estándar de 3 pasos


con el ciclaje del cuadro 4.2.

Preparar en un matraz 30 mL de agarosa al 1% en amortiguador TAE 1X y


calentar en la placa hasta la disolución. Evitar la ebullición prolongada.

Colocar 3 μL de BrEt a la agarosa disuelta y verter en la cama de la cámara


de electroforesis y colocar el peine y dejar gelificar por al menos 15 a 20
min.

Una vez solidificado el gel, retirar el peine en forma vertical, retirar los topes
de la cama y verter amortiguador TAE 1X hasta cubrir por completo el gel
de agarosa.

Cargar 3 μL de marcador de 50 pb en carril 1, a partir del carril 2 cargar 10


μL de muestras de PCR proporcionadas mezcladas con 2 μL de
amortiguador de carga de ADN 6X.

Correr la electroforesis a 80 V por 40-45 min hasta la separación de los


colorantes “tracking”. Visualizar con la lámpara de UV con la ayuda del R2-3
fotodocumentador.
Cuadro 4.1 Mezcla de PCR

Componente Volumen
Agua 18 μL
Amortiguador 10X 2.5 μL
dNTPs 0.75 μL
Cloruro de Mg 1.5 μL
Oligonucleótido S 1 μL
Oligonucleótido AS 1 μL
Taq Polimerasa 0.25 μL

Cuadro 4.2 Ciclo de ciclaje

Temperatura (°C) Tiempo Ciclos


94 10 minutos 1
94 30 segundos 30
57.5 30 segundos 30
72 40 segundos 30
72 5 minutos 1
Diagrama ecológico

Cuadro 4.3 Residuos generados en la práctica

Símbolo Residuo generado Contenedor


Caja de Petri con cultivo RPBI esterilizable
R1 bacteriano.

Puntas de plástico RPBI no esterilizable (bote


R2 Guantes bolsa roja)
Cubrebocas
Gel de agarosa con bromuro Bote gris para Bromuro de
R3 de etidio. etidio
Resultados

Una vez realizada la inserción del gen, la cepa de E. coli fue inoculada
observándose un crecimiento sin colonias aisladas (véase Figura 3).

Figura 3. Crecimiento de la cepa de E. coli.

Empleando electroforesis en gel de agarosa se realizó la visualización del amplicón


analizado, la Figura 4 muestra dicho gel irradiado por luz UV. Se observa el
marcador molecular (A) y el amplicón analizado (B), las demás bandas
corresponden a la muestra de otros equipos.
Figura 4. Electroforesis en gel de agarosa. A, marcador molecular. B, amplicón
analizado por el equipo.

Discusiones
En la práctica de la primera semana, se realizó como primer paso la inserción del
gen que confiere resistencia a la ampicilina, al plásmido de una cepa bacteriana; en
este caso a la cepa de E. coli (XL1-Blue, DH5α, TOP10, etc.), a este procedimiento
se le nombró transformación bacteriana. La captación de dicho inserto se logró
identificar a través del crecimiento bacteriano en cultivo de agar LB-Ampicilina y se
atribuyó al procedimiento utilizado para favorecer la captación de ADN exógeno;
choque térmico. Para esta metodología empleada fue importante el cambio brusco
de temperatura y la duración, ya que, para obtener óptimos resultados, los tubos
con la suspensión celular se deberían sacar directamente del hielo, situarlos en un
baño a 42 º C durante 50 segundos y ponerlos inmediatamente en hielo otra vez, es
muy rutinario dada la facilidad de realización del mismo y la no necesidad de utilizar
aparatos sofisticados, a diferencia de la electroporación. No obstante, la eficiencia
del mismo puede resultar baja, según el caso.9

En la Figura 3 no se logra observar colonias aisladas a simple vista, sin embargo,


debido al color del crecimiento (blanco), resulta como indicativo a un procedimiento
correcto de transformación, debido a que el IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactosido),
análogo de la lactosa, no puede ser utilizado como fuente de carbono o energía por
las bacterias, ocasionando que al cultivo de una bacteria que posee el operón lac,
inactive al represor lacZ, induciendo así la transcripción del operón lac. La cepa
utilizada sintetiza una beta-galactosidasa, la cual es puesta en evidencia utilizando
el sustrato cromogénico X-gal (volviéndose un compuesto azul insoluble). La
inserción del fragmento de DNA exógeno (Gen) en la zona de policlonado del vector,
resulta en la producción de una subunidad de beta galactosidasa que no será capaz
de complementar la actividad enzimática, por lo que las colonias portadoras del
plásmido conteniendo el inserto, no serán capaces de metabolizar el sustrato
cromogénico y se observarán incoloras en los cultivos, tal como se muestra en la
Figura 3.10 sin embargo, este método de selección, puede presentar resultados
erróneos ya que existe la posibilidad de que la inserción no inactive la capacidad de
complementación (sobre todo cuando se trata de insertos menores de 100pb que
no cambian el marco de lectura) y que no todas las colonias blancas porten
plásmidos recombinantes.10

Para corroborar que las colonias seleccionadas poseen el inserto de interés se


realizó la extracción de ADN plasmídico y corroborar por restricción enzimática y/o
PCR específica la presencia del inserto.10

En la segunda semana de práctica, se trabajó con cultivo bacteriano en agar LB-


Ampicilina de clonas transformadas, en la que se tomó una colonia aislada para
poder verificar por medio de la técnica PCR- colonial, si las células de E. coli se
transformaron, es decir, si contenían el inserto recombinante.

Durante el proceso de PCR, se tuvo como objetivo la amplificación del ADN


plasmídico de la célula, la cual a una temperatura inicial (94°) causó la liberación de
dicho material genético, comenzando así con el proceso de amplificación a una
temperatura de 94°C; la cual logra separar o desnaturalizar las cadenas de ADN
proporcionando los moldes, se prosiguió con la disminución de la temperatura a
57°C, con la finalidad de que los cebadores introducidos en el Master Mix puedan
unirse a la secuencia especifica del inserto utilizado en la cepa de E. coli en su
transformación y para culminar con un ciclo, se elevó de nuevo la temperatura a
72°C, ocasionando que la enzima Taq Polimerasa extienda los cebadores y sintetice
las nuevas cadenas de ADN de interés (inserto).9 Debido al número de ciclos (30)
procesados por el equipo (termociclador), se tardó dos horas. La viabilidad del
experimento dependió principalmente del ADN polimerasa termoestable, la Taq
polimerasa y la especificidad de los cebadores para unirse únicamente a la región
de ADN de interés.11

Al culminar con el proceso de amplificación del inserto de interés, se recurrió a la


visualización de los mismos por medio de la técnica de electroforesis en gel de
agarosa al 1%. Como se logra observar en la Figura 4, en la columna del pozo 5,
se encuentra una banda fluorescente como consecuencia a la exposición del
pigmento unido al ADN con la luz UV y de acuerdo al marcador molecular utilizado
en la práctica, se interpreta como la presencia del inserto de interés; gen de
resistencia a la ampicilina. Debido a que la técnica es dependiente al voltaje de la
corriente eléctrica, para impulsar los fragmentos de ADN al polo positivo sobre el
gel; es un factor importante para la observación concisa de la muestra, ya que una
sobrecarga de voltaje ocasiona un barrido obligado de la muestra, así como el
tiempo en el que se mantiene. Para nuestra muestra se corrió a un voltaje de 120 V
por 20 minutos, por lo que se logra ver como si fuera una degradación de la muestra,
sin embargo, es debido a las condiciones utilizadas. Una banda de ADN contiene
muchas copias de la región blanco de ADN y debido al tamaño microscópico del
mismo, se necesita de la existencia de muchas copias para lograr verlo, es el motivo
por el cual la PCR es una herramienta importante.11

Conclusión

En conclusión, se logró la transformación de plásmidos en células bacterianas, por


medio de la inserción de un vector de clonación a una cepa de E. coli, verificada en
el gel de agarosa previa amplificación por PCR en la variante PCR colonia. Se ha
obtenido tanto el conocimiento como las habilidades para la obtención de células
transformadas de una cepa bacteriana de interés para el mantenimiento y
replicación de un vector de clonación, la preparación de una mezcla de PCR en la
variante de PCR colonia, la programación del ciclaje de amplificación y la separación
de productos de PCR en geles de agarosa.

Referencias
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España 2005. pp 348-349.
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