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FORMACIÓN MÉDICA CONTINUADA

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real


Josep Costa

Servicio de Microbiología. Hospital Clínic i Provincial. Barcelona. España.

Hoy en día, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se La PCR convencional en el contexto


utiliza normalmente en la rutina asistencial de la mayoría de
nuestros laboratorios, pero su empleo se ha limitado, con
de la microbiología clínica
pocas excepciones, al campo de la virología y en especial a El proceso de detección de un agente infeccioso por am-
un reducido grupo de virus con gran interés económico, plificación genética se desarrolla de manera habitual en
para los que se dispone de ensayos comerciales bien tres etapas. La primera consiste en la extracción y purifi-
estandarizados. Por diversas razones, la PCR convencional cación de los ácidos nucleicos del microorganismo de la
se ha implementado poco en el diagnóstico de otras muestra biológica, seguido de la amplificación de un seg-
muchas enfermedades infecciosas a pesar de aportar mento seleccionado del genoma del microorganismo me-
indudables ventajas. La PCR a tiempo real combinada con diante reacción en cadena de la polimerasa, es decir, la
los nuevos sistemas automáticos para la purificación de PCR propiamente dicha. Finalmente, en la tercera etapa
ácidos nucleicos, ofrece una plataforma ideal para el se lleva a cabo la detección de los fragmentos amplifica-
dos en la PCR (amplicones) por electroforesis en gel de
desarrollo de una gran variedad de pruebas moleculares
agarosa y tinción con bromuro de etidio, o mediante hibri-
para la identificación y cuantificación de los agentes
dación con sondas específicas. En general todo este proce-
infecciosos de interés clínico. Debido a sus indudables so suele durar aproximadamente 24 h.
ventajas, como la facilidad de empleo, la mayor rapidez o el En el ámbito de la microbiología clínica, la PCR se ha
menor riesgo de contaminación, la PCR a tiempo real, irá aplicado en tres grandes campos:
reemplazando la PCR convencional y se extenderá a un
amplio abanico de aplicaciones microbiológicas. 1. Diagnóstico etiológico. La PCR es sobre todo útil en
ausencia de métodos de diagnóstico alternativos o cuando
Palabras clave: PCR a tiempo real. Diagnóstico molecular. éstos son muy complejos, para mejorar la eficacia diagnós-
Sondas fluorogénicas. tica complementando métodos convencionales o si se re-
quiere un diagnóstico rápido y precoz del agente etiológi-
co para poder iniciar el tratamiento específico lo antes
Real-time PCR posible.
2. Control del tratamiento con antimicrobianos. La
PCR se utiliza tanto para la selección de los pacientes que
PCR based assays are currently used routinely in most
deben ser tratados como para, una vez iniciado el trata-
microbiology laboratories. But, with few exceptions, they
miento, comprobar su eficacia, siendo importante para ello
are restricted to the field of virology, especially to a limited disponer de métodos cuantitativos.
number of viral targets with important economical interest 3. Caracterización genética de agentes infecciosos. Ge-
for which commercially well standardized assays are notipificación; identificación de mutaciones determinantes
available. For several reasons, it has had a poor de resistencias a fármacos o de virulencia; epidemiología
implementation of the PCR assays into routine diagnostics molecular; etc.
for other infectious diseases despite they are
advantageous. Combined with automated sample En los últimos 10 años se han desarrollado innumerables
isolation of nucleic acids, real-time PCR gives an ideal aplicaciones de la PCR en microbiología clínica. No obs-
platform for the development of molecular assays for a tante, desde el punto de vista asistencial, la PCR sólo se ha
consolidado como un procedimiento realmente útil en viro-
wide range of infectious agents with clinical interest.
logía, al ser una buena alternativa al aislamiento por culti-
Because of its advantages, as simplicity, rapidity and
vo celular. Salvo algunas excepciones, la introducción de
minor risk of contamination, real-time PCR will go replace la PCR en la rutina asistencial en otros campos de la mi-
conventional PCR assays and its use will extend to a wide crobiología clínica ha sido muy limitada y su aplicación se
range of applications in clinical microbiology. ha restringido a aquellos microorganismos que no crecen o
crecen mal en los medios de cultivo convencionales y aún
Key words: Real-time PCR. Molecular diagnostics. en ese grupo, la implementación real de esta metodología
Fluorogenic probes. ha sido muy escasa. En términos generales, puede decirse
que la aplicación de la PCR en el laboratorio de microbio-
logía asistencial se ha restringido a un pequeño grupo de
Correspondencia: Dr. J. Costa.
Servicio de Microbiología. Hospital Clínic i Provincial. agentes infecciosos con gran interés económico para las
Villarroel, 180. 08025 Barcelona. España. empresas de diagnóstico microbiológico, como por ejemplo
Correo electrónico: costa@medicina.ub.es
virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), de la hepati-
Manuscrito recibido el 9-2-2004; aceptado el 12-2-2004. tis C (VHC), de la hepatitis B (VHB) o citomegalovirus,
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para los que se han comercializado sistemas bien estanda- La PCR a tiempo real
rizados y, en mayor o menor medida, automatizados. Para
otros agentes infecciosos con menor interés económico, En la PCR a tiempo real, los procesos de amplificación y
para los que no hay kits comerciales para llevarlos a cabo o, detección se producen de manera simultánea en el mismo
si los hay, no son de fácil aplicación, se emplean métodos vial cerrado, sin necesidad de ninguna acción posterior.
no comercializados, optimizados en los propios laborato- Además, mediante detección por fluorescencia se puede
rios, aunque, en general, su uso se ha limitado a centros medir durante la amplificación la cantidad de ADN sinte-
de referencia o a grandes hospitales. El empleo generali- tizado en cada momento, ya que la emisión de fluorescen-
zado de esos métodos “caseros” no parece muy aconsejable, cia producida en la reacción es proporcional a la cantidad
ya que diversos estudios efectuados hace algunos años de ADN formado. Esto permite conocer y registrar en todo
para evaluar su calidad revelaron graves deficiencias de momento la cinética de la reacción de amplificación4.
reproducibilidad, sensibilidad y especificidad en la mayoría Los termocicladores para llevar a cabo la PCR a tiempo
de los laboratorios participantes. Las causas de estas de- real incorporan un lector de fluorescencia y están diseña-
ficiencias son múltiples. Por ejemplo, la gran heteroge- dos para poder medir, en cualquier momento, la fluores-
neidad de las muestras que llegan al laboratorio y de los cencia emitida en cada uno de los viales donde se realice la
agentes infecciosos que deben ser identificados obliga a dis- amplificación. Los sistemas de detección por fluorescencia
poner de diferentes métodos de extracción, en algunos ca- empleados en la PCR a tiempo real pueden ser de dos ti-
sos muy complejos y laboriosos. La aparición, hace algu- pos: agentes intercalantes y sondas específicas marcadas
nos años, de métodos comerciales basados en columnas con con fluorocromos, diseñadas, como veremos más adelante,
matrices de silicatos y la reciente irrupción de robots que de manera especial.
llevan a cabo la extracción de ácidos nucleicos de manera
automatizada, en algunos tipos de muestras, representan Agentes intercalantes
una mejora considerable. La presencia en algunas mues- Son fluorocromos que aumentan notablemente la emi-
tras de sustancias que inhiben la PCR origina falsos nega- sión de fluorescencia cuando se unen a ADN de doble héli-
tivos, siendo recomendable introducir controles internos en ce. El más empleado en PCR a tiempo real es el SYBR Gre-
las reacciones de amplificación para detectarlas. Aunque en I. El incremento de ADN en cada ciclo se refleja en un
los problemas más importantes de la PCR en microbiología aumento proporcional de la fluorescencia emitida. Este sis-
afectan sobre todo a la especificidad. Debido a la elevada tema de detección tiene la ventaja de que la optimización
sensibilidad del método, el riesgo de contaminación cruza- de las condiciones de la reacción es muy fácil y además, es
da entre muestras es considerable. La fuente de contami- más barato que las sondas específicas. El principal incon-
nación más común son los fragmentos de ADN amplifica- veniente de los agentes intercalantes es su baja especifici-
dos previamente en el laboratorio (amplicones) que pueden dad, debido a que se unen de manera indistinta a produc-
contaminar reactivos, superficies y materiales y producir tos generados inespecíficamente o a dímeros de cebadores,
resultados falsos positivos. Para disminuir el riesgo de muy frecuentes en la PCR. Para mejorar la especificidad se
contaminación hay que tomar y respetar rigurosamente deben emplear condiciones de reacción óptimas y una se-
una serie de precauciones de diversa índole1, que inclu- lección cuidadosa de los cebadores para disminuir el ries-
yen una distribución del laboratorio en distintas áreas de go de formación de dímeros. Además. es recomendable ini-
trabajo (pre y post-PCR), la adopción de tediosos hábitos ciar la reacción de síntesis de ADN a temperaturas
de trabajo que minimizan el riesgo, el uso de material es- elevadas (hot-start PCR) lo cual disminuye de forma nota-
pecial o el empleo de sistemas anticontaminación, como la ble el riesgo de amplificaciones inespecíficas. Para ello se
irradiación de superficies y reactivos con luz ultravioleta pueden usar polimerasas recombinantes modificadas que
o los sistemas químicos como la isopsoralina2 o la uracil-N- sólo funcionan después de ser activadas a temperaturas
glucosilasa (UNG)3. elevadas5 o anticuerpos que bloquean el centro activo de la
Además, la cuantificación del ADN diana en la muestra polimerasa hasta que la reacción alcanza temperaturas al-
por PCR resulta complicada. La dificultad principal radica tas en las que el anticuerpo se desnaturaliza liberando la
en que la eficacia de amplificación de la PCR va disminu- polimerasa y permitiendo su actividad6. Además, la mayo-
yendo con el tiempo, hasta que la reacción llega a una fase ría de los equipos para PCR a tiempo real tienen la posibi-
de saturación en la que ya no se produce incremento de lidad de determinar la temperatura de fusión de los frag-
ADN. Puesto que los fragmentos amplificados se detectan mentos amplificados (Tm = temperatura a la que el 50%
al final de la PCR cuando la mayoría de reacciones han del ADN de la molécula está desnaturalizado). Cada frag-
alcanzado ya la fase de saturación, la cantidad de ADN ob- mento amplificado tiene una Tm característica, que depen-
tenido no suele guardar mucha relación con la concentra- de sobre todo de su longitud y de la composición de sus
ción inicial de ADN en la muestra. Además, al ser la PCR bases. Esta aplicación permite comprobar, aunque no
una reacción de tipo exponencial, pequeñas oscilaciones en siempre con absoluta garantía, la especificidad de los frag-
la eficacia de amplificación para cada muestra se traducen mentos detectados en la PCR. Por otra parte, los agentes
en importantes variaciones en la cantidad de ADN obte- intercalantes no permiten la identificación de polimorfis-
nido al final del proceso. Para superar este escollo se han mos en la secuencia diana.
desarrollado diversas estrategias. La más común consiste
en hacer que el ADN diana compita durante la amplifica- Sondas de hibridación específicas
ción con una cantidad conocida de control interno añadi- Son sondas marcadas con dos tipos de fluorocromos, un
da antes de iniciar el proceso (PCR competitiva). Sin em- donador y un aceptor. El proceso se basa en la transferen-
bargo, esos métodos son laboriosos, poco precisos y suelen cia de energía fluorescente mediante resonancia (FRET)
tener un rango de cuantificación limitado. entre las dos moléculas. Las más utilizadas son las sondas
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Costa J. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real

TABLA 1. Principales moléculas fluorescentes empleadas


como marcadores en la PCR a tiempo real A
Fluorocromo Máx abs (nm) Máx em (nm)

Cascade blue (varios) 374-403 422-430


YOYO-1 491 509
Bodipy 503 512
Fluoresceína (FITC) 494 520 B
SYBR Green I 497 520
TOTO-1 513 532
FAM 495 535
Luciferina 430 540
TET 522 550
JOE 525 555
HEX 530 560 C
Cy3 552 565
POPO-3 534 570
Rodamina 540 570
NED 553 575
TAMRA 560 580
Naranja de acridina 460,502 526,650 Figura 1. Mecanismo de las sondas de hidrólisis.
Cy5 643 667
Quantum Red/Red 670 480,565 670
Bromuro de etidio 526 605
ROX 580 605
Red 613 480,565 613
Rojo de Tejas 596 615
Homodímero de etidio 534 616 Sonda
Yoduro de propidio 536 617
IRD 700 685 705
Cy7 743 767
IRD 800 795 849
PCR: reacción en cadena de la polimerasa.
ADN diana

de hidrólisis, denominadas también sondas TaqMan, las


sondas molecular beacons y las sondas FRET.

1. Sondas de hidrólisis. Son oligonucleótidos marcados


con un fluorocromo donador en el extremo 5’ que emite fluo-
rescencia al ser excitado y un aceptor en el extremo 3’ que
absorbe la fluorescencia liberada por el donador. Para que
esto ocurra, las moléculas donadora y aceptora deben estar
espacialmente próximas. Además, el espectro de emisión de
la primera se ha de solapar con el espectro de absorción Hibridación
de la segunda. En la tabla 1 se relacionan los fluorocromos
más empleados y sus espectros de excitación y emisión.
Mientras la sonda está intacta, la fluorescencia emitida Figura 2. Molecular beacons.
por el donador es absorbida por el aceptor. Sin embargo, du-
rante la amplificación de ADN diana, la sonda se hibrida
con su cadena complementaria. Al desplazarse a lo largo una estructura secundaria en forma de asa, en la que re-
de la cadena, en su acción de síntesis, la ADN polimerasa de side la secuencia de unión específica con el ADN diana.
Thermus aquaticus, que tiene actividad 5’ exonucleasa, hi- Los extremos permanecen plegados cuando la sonda no
droliza el extremo libre 5’ de la sonda, produciéndose la li- está hibridada, lo que conlleva que donador y aceptor es-
beración del fluorocromo donador7. Como donador y aceptor tén muy cerca uno de otro. En esta conformación la fluo-
están, ahora, espacialmente alejados, la fluorescencia emi- rescencia emitida por el donador es absorbida por el acep-
tida por el primero es captada por el lector (fig. 1). tor y no es captada por el lector del equipo. Sin embargo, al
2. Molecular beacons. Son sondas parecidas a las ante- hibridar con el ADN diana la sonda se abre, alejándose do-
riores. Tienen una molécula donadora en el extremo 5’ y nador y aceptor, pudiendo ser detectada la fluorescencia
una aceptora en el extremo 3’ pero, además, presentan emitida por el primero8 (fig. 2).
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más elevado que el SYBR Green y la optimización de las


condiciones de la reacción resulta más difícil.
A
Equipos para PCR a tiempo real
En la tabla 2 se describen los equipos para llevar a cabo
la PCR a tiempo real y sus fabricantes. Están compuestos
por un termociclador y por un lector de fluorescencia y dise-
ñados para poder efectuar la lectura de la fluorescencia emi-
tida en cada uno de los viales usados y en cualquier momen-
to de la reacción. Los más utilizados son los equipos
fabricados por Applied Biosystems y Roche Diagnostics,
pero en general todos los modelos actuales permiten todas
las aplicaciones que se detallan en el capítulo siguiente. Las
diferencias más importantes entre estos equipos hacen re-
ferencia a la rapidez y al número de muestras que se pueden
procesar al mismo tiempo. El número de canales de lectura
que presentan los equipos también es importante. Disponer
B de varios canales de lectura permite detectar la emisión de
Lector distintos fluorocromos a la vez. De esa manera, se pueden
usar varias sondas marcadas con distintos fluorocromos,
para identificar diferentes tipos de ADN diana en la misma
reacción (PCR múltiple) o incorporar controles internos a la
reacción, para detectar la presencia de inhibidores.

Opciones de los equipos de PCR a tiempo real


Los programas de los equipos de PCR a tiempo real tie-
nen diversas opciones:
Figura 3. Sondas FRET.
1. Amplificación y detección de ADN o ARN diana en la
muestra.
3. Sondas FRET. El sistema se compone de dos sondas 2. PCR múltiple.
que se unen a secuencias adyacentes del ADN diana. Una 3. Cuantificación del ADN o ARN diana en la muestra9.
de las sondas lleva un donador en el extremo 3’ y la otra Se puede cuantificar la concentración inicial de ADN (o
un aceptor en el extremo 5’. Cuando las sondas están hi- ARN) diana en la muestra de manera muy sencilla, aña-
bridadas, los dos fluorocromos están próximos. Al ser exci- diendo simplemente unos controles externos con concen-
tado, el donador transfiere su energía al aceptor que, a su traciones conocidas y crecientes de ADN diana (curva pa-
vez, emite la fluorescencia que detecta el lector del equipo trón) en la tanda de amplificación. En la PCR a tiempo real
(fig. 3). el programa informático va registrando el incremento de
fluorescencia (proporcional al aumento de ADN) en cada ci-
En todos estos sistemas, el incremento de ADN en cada clo, y esta información se refleja gráficamente en curvas
ciclo se corresponde con un aumento de hibridación de las de cinética de la reacción para cada una de las muestras y
sondas, lo que conlleva un aumento en la misma propor- controles (fig. 4). Por lo tanto, se puede controlar la ampli-
ción de fluorescencia emitida. El empleo de sondas garan- ficación en las fases iniciales, cuando la concentración de
tiza la especificidad de la detección y permite identificar los reactivos todavía no es limitante y el efecto de la varia-
polimorfismos o mutaciones puntuales, pero su coste es bilidad en la eficiencia de amplificación es menos impor-
tante. Para cada muestra el programa informático calcula
el número de ciclo en el que el lector empieza a detectar
un incremento de fluorescencia significativo, con respecto a
TABLA 2. Equipos para PCR a tiempo real la señal de base. El ciclo en el que se empieza a detectar el
Instrumento Fabricante
Sistema Tiempo
Capacidad
aumento de fluorescencia se denomina punto de corte (Cp,
térmico de reacción de crossing point) o ciclo umbral (Ct, de threshold cycle) y
Serie GeneAmp Applied Convencional 2h 96 es inversamente proporcional a la concentración inicial de
Serie AbiPrism Biosystems ADN diana presente en la muestra. Con las concentracio-
ICycler iQ BioRad Convencional 2h 96-384 nes previamente conocidas de los controles externos y sus
Cp correspondientes se dibuja una curva patrón. Interpo-
LightCycler Roche Aire 20-60 min 32
Diagnostics lando en ella los valores de los Cp de cada muestra proble-
ma se puede inferir su concentración de ADN inicial.
SmartCycler Cepheid Placa
cerámica 40-60 min 16-96 4. Análisis de curvas de disociación. Se basa en la apli-
cación de un gradiente de temperaturas creciente después
MX4000 Stratagene Convencional 90 min 96
de la PCR para monitorizar la cinética de disociación de los
Rotor Gene Corbett Aire 50 min 32 fragmentos amplificados. Mediante esta aplicación se pue-
Research de determinar la Tm de los amplicones para comprobar su
PCR: reacción en cadena de la polimerasa. especificidad. También permite el análisis de mutaciones
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puntuales, que se puede abordar de diferentes maneras. Un


enfoque sencillo consiste en usar una sonda complementa-
ria con el ADN diana de tipo salvaje, que abarque la posi-
ción del polimorfismo. El híbrido formado entre sonda y
ADN de tipo salvaje tendrá una estabilidad mayor que el
formado entre la sonda y el ADN mutado, puesto que en
este caso la complementariedad no es absoluta. La mayor
estabilidad de la unión entre la sonda y el ADN salvaje se 105

F
reflejará en una Tm superior. Las diferencias en la tempe- 104
ratura de disociación de los híbridos nos permitirá discrimi- 103
102
nar perfectamente entre el ADN de tipo salvaje y el de tipo 101
mutado, pudiéndose establecer además, de forma relativa,
la cantidad de ADN de tipo salvaje y la de tipo mutado
cuando ambos están presentes en la misma muestra (fig. 5).
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Ventajas de la PCR a tiempo real Ciclos
La primera gran ventaja de la PCR a tiempo real es su
rapidez, puesto que no se necesita ningún proceso adicio-
nal de detección. Si el equipo empleado es el Light Cycler Figura 4. Curva patrón para cuantificación.
o equivalente, esta ventaja todavía es más acusada, pu-
diéndose completar el proceso de amplificación y detección
en 30-40 min. Además, gracias a su rapidez, estos equi-
pos se pueden rentabilizar al máximo, permitiendo un flu-
jo mucho mayor de muestras y de ensayos. Otra ventaja Tm: 56 Tm: 59
muy importante de la PCR a tiempo real es que al utili- Tipo mutado Tipo salvaje
zar sistemas cerrados, el riesgo de contaminación dismi-
nuye de forma muy importante. Los sistemas a tiempo
real permiten cuantificar la concentración inicial de ácido
nucleico presente en las muestras de manera mucho más
F

sencilla, más precisa y sobre todo en un rango mucho ma-


yor (5-6 log) que en los procedimientos convencionales
(2-4 log). Asimismo, la determinación de mutaciones pun-
tuales que pueden estar relacionadas con resistencias a
medicamentos antimicrobianos o con factores de virulen-
cia, es mucho más fácil. Los equipos para PCR a tiempo
real tienen una capacidad muy elevada ya que en el mis- 0
mo instrumento se pueden llevar a cabo ensayos cualitati- Temperatura
vos, cuantitativos, determinación de mutaciones, PCR
múltiple, etc., mientras que para los procedimientos con-
vencionales se requieren múltiples equipos. Figura 5. Determinación de mutaciones puntuales mediante análisis de cur-
vas de disociación.
Aplicaciones de la PCR a tiempo real
en la microbiología clínica
Las aplicaciones de la PCR a tiempo real en el campo gran variedad de pruebas moleculares para la identifica-
de la microbiología clínica no difieren de las que ya se han ción o cuantificación de esos agentes infecciosos. Es el caso
comentado al principio de esta revisión para la PCR con- de muchos virus10,11 (familia de los Herpesvirus, virus res-
vencional. No obstante, es previsible que gracias a sus in- piratorios, enterovirus, virus JC, virus BK, etc.) o de bac-
dudables ventajas y a la sencillez de su empleo, la PCR a terias que no crecen en medios de cultivo como Trophery-
tiempo real vaya reemplazando la PCR clásica, y que su ma wippeli12, o que crecen mal como Bordetella pertussis13
aplicación se extienda a un número cada vez mayor de o Bartonella14 o muy lentamente como Mycobacterium tu-
agentes infecciosos, implementándose progresivamente en berculosis15. También, de micosis invasivas16, especial-
la rutina asistencial. Algunas empresas de diagnóstico mente por Aspergillus ssp. o de infecciones parasitarias
(Roche Diagnostics, Artus, Abbott, Celera) han hecho ya como las ocasionadas por Toxoplasma gondii17 en líquido
una apuesta decidida por la nueva tecnología y tienen dis- amniótico o en líquido cefalorraquídeo (LCR).
ponibles, o los tendrán en breve, kits para el diagnóstico Otro campo potencial de aplicación de la PCR a tiempo
de los agentes infecciosos de mayor interés comercial me- real es en la identificación de organismos fácilmente cul-
diante sistemas de PCR a tiempo real (VIH, VHB, VHC, tivables, cuya detección rápida sea beneficiosa por algún
citomegalovirus). Sin embargo, hay muchas enfermedades motivo. Por ejemplo, la identificación de Streptococcus del
infecciosas, con menor interés comercial, en las que el uso grupo B (S. agalactiae) en frotis vaginales18. La coloniza-
de métodos moleculares de diagnóstico aporta indudables ción del tracto genital de mujeres parturientas por este
ventajas. La PCR a tiempo real, combinada con los nue- agente se relaciona con un mayor riesgo de infección neo-
vos sistemas automáticos para la preparación de las mues- natal grave. El tiempo necesario para el aislamiento de
tras, ofrece una plataforma ideal para el desarrollo de una esta bacteria mediante cultivo es de 1-2 días, mientras que
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por PCR a tiempo real su identificación se puede llevar a Bibliografía


cabo en 30 min. La reducción del tiempo de diagnóstico 1. Higuchi R, Kwok S. Avoiding false positives with PCR. Nature 1989;339:237-8.
puede mejorar la prevención de esas infecciones en recién 2. Cimino GD, Metchette KC, Tessman JW, Hearst JE, Isaacs ST. Post-PCR
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tuberculosis21. También se han descrito procedimientos using fluorogenic probes and real-time PCR. J Clin Microbiol 2002;40:4143-7.
para la identificación de mutaciones asociadas con resis- 16. Loeffler J, Henke N, Hebart H, Schmidt D, Hagmeyer L, Schumacher V, et
al. Quantification of fungal DNA by using fluorescence resonance energy
tencia a agentes antivíricos, como la lamivudina22 en VHB. transfer and the Light Cycler system. J Clin Microbiol 2000;38:586-90.
Hoy día ya están disponibles kits comerciales para algu- 17. Delhommeau F. Forestier F. Quantification of Toxoplasma gondii in amnio-
nas aplicaciones comentadas en este apartado y en el futu- tic fluid by rapid cycle real-time PCR. En: Reischl U, Wittwer C, Cockerill,
editors. Rapid Cycle Real-Time PCR. Methods and Applications. Microbio-
ro irán apareciendo muchos otros. Incluso para las enfer-
logy and Food Analysis. Berlin: Springer-Verlag, 2002; p. 133-8.
medades infecciosas menos frecuentes están, o estarán 18. Ke D, Ménard C, Picard FJ, Boissinot M, Ouellette M, Roy PH, et al. Deve-
disponibles, protocolos bien optimizados, sencillos y rápidos lopment of conventional and real-time PCR assays for the rapid detection of
para que puedan ser implementados en la rutina asisten- group B streptococci. Clin Chem 2000;46:324-31.
19. Ostrowsky BE, Trick WE, Sohn AH, Quirk SB, Holt S, Carson LA, et al.
cial. No obstante, hay que hacer hincapié en que esta poten- Control of vancomycin-resistant enterococcus in health care facilities in a re-
te metodología sólo será útil si los laboratorios de microbio- gion. N Eng J Med 2001;344:1427-34.
logía clínica participan en programas de control de calidad 20. Reischl U, Linde HJ, Metz M, Leppmeyer B, Lehn N. Rapid identification of
methicillin-resistant Staphylococcus aureus and simultaneous species confir-
bien definidos como el Quality Control for Molecular Diag-
mation using real-time fluorescence PCR. J Clin Microbiol 2000;38:2429-33.
nostics (QCMD; http://www.qcmd.org) desarrollado por The 21. Torres MJ, Criado A, Palomares JC, Aznar J. Use of real-time PCR and fluo-
European Society for Clinical Virology y The European So- rimetry for rapid detection of rafampin and isoniazid resistance-associated
ciety for Microbiology and Infectious Disease o el programa mutation in Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol 2000;38:3194-9.
22. Whalley SA, Brown D, Teo CG, Dusheiko GM, Saunders NA. Monitoring the
de control de calidad de la Sociedad Española de Enferme- emergence of hepatitis B virus polymerase gene variants during lamivudi-
dades Infecciosas y Microbiología Clínica (SEIMC). ne therapy using the LyghtCycler. J Clin Microbiol 2001;39:1456-9.

NOTA

Los artículos publicados en la sección “Formación Médica Continuada” forman parte de grupos
temáticos específicos (antibiograma, antimicrobianos, etc.). Una vez finalizada la publicación de
cada tema, se irán presentando al Sistema Español de Acreditación de la Formación Médica Conti-
nuada (SEAFORMEC) para la obtención de créditos.

Una vez concedida la acreditación, ésta se anunciará oportunamente en la revista y se abrirá un


período de inscripción gratuito durante 3 meses para los socios de la SEIMC y suscriptores de la
Revista, al cabo del cual se iniciará la evaluación, durante 1 mes, que se realizará a través de la web
de Ediciones Doyma.

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Costa J. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real

ANEXO 1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real


1. El bromuro de etidio se utiliza habitualmente en:
a) La hibridación molecular.
b) El proceso de amplificación de ADN.
c) La detección de productos de PCR.
d) La extracción de ácidos nucleicos.
e) La PCR a tiempo real.

2. El punto de corte (Cp) es


a) La temperatura de fusión de los amplicones.
b) Es el ciclo en el que se alcanza la saturación de la reacción.
c) Es el ciclo en el que se empieza a detectar un incremento de fluorescencia significativo por encima de la basal.
d) Es la temperatura a la que se efectúa la lectura de fluorescencia en cada ciclo.
e) Ninguna de las anteriores respuestas es cierta.

3. Habitualmente la identificación por PCR a tiempo real con el sistema LightCycler suele durar
aproximadamente:
a) 2 h.
b) 4 h.
c) 24 h.
d) 30-40 min.
e) 10 min.

4. Se puede disminuir la amplificación inespecífica mediante:


a) Una selección adecuada de los cebadores.
b) La detección de los amplicones en gel de agarosa.
c) La detección con sondas de hidrólisis.
d) “Hot start PCR”.
e) Las respuestas a) y d) son correctas.

5. Se puede aumentar la especificidad de la detección de agentes infecciosos por PCR:


a) Con una selección adecuada de los cebadores.
b) Con una temperatura de desnaturalización menor.
c) Con la detección de los amplicones mediante sondas moleculares.
d) Con “hot start PCR”.
e) a), c) y d) son correctas.

6. En las sondas FRET:


a) La fluorescencia emitida por el donador es absorbida por el aceptor cuando están libres en la solución.
b) La fluorescencia que detecta el fluorímetro es emitida por el aceptor.
c) La fluorescencia que detecta el fluorímetro es la emitida por el donador.
d) La fluorescencia no se detecta cuando las sondas están hibridadas con el ADN diana.
e) Las sondas FRET no son fluorogénicas.

7. Una ventaja importante de la PCR a tiempo real con respecto a la convencional es:
a) Posibilidad de usar un solo cebador para la reacción de amplificación.
b) Menor riesgo de contaminación.
c) Menor coste.
d) Mayor especificidad.
e) Ninguna de las anteriores es correcta.

8. El análisis de curvas de disociación permite:


a) Confirmar la especificidad de los fragmentos amplificados.
b) Cuantificar la concentración de ADN diana en la muestra.
c) Aumentar la sensibilidad de la reacción.
d) Reducir el tiempo de amplificación.
e) Determinar la concentración de adenina en la muestra diana.

9. En la PCR a tiempo real la detección de los productos amplificados:


a) Se lleva a cabo simultáneamente con la amplificación.
b) Se lleva a cabo mediante electroforesis en gel de agarosa.
c) Se lleva a cabo por hibridación molecular en filtros de nitrocelulosa.
d) No es necesaria.
e) Ninguna de las anteriores respuestas es cierta.

10. El uso de uracil-N-glucosilasa (UNG) sirve:


a) Para mejorar la sensibilidad de la PCR.
b) Disminuir el riesgo de contaminación.
c) Reducir el tiempo de reacción.
d) Detectar mutaciones puntuales.
e) Reducir la fluorescencia de base.

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