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Proc. Nati. Acad Sci. Ee.Uu.

Vol. 74, nº 12, pp. 5463-5467, diciembre de 1977


Bioquímica

La secuenciación del ADN con inhibidores de terminación


de cadena
(Adn polimerasa/ secuencias de nucleótidos/bacteriófago 4X174)
F. SANGER, S. NICKLEN, y A. R. COULSON
Consejo de Investigaciones Médicas del Laboratorio de Biología Molecular, Cambridge CB2 2QH,
Inglaterra
Contribuido por F. Sanger, Octubre 3, 1977

veces, confirma-tory datos son


Resumen Un nuevo método para necesarios. W. M. Barnes (J. Mol.
determinar los nucleótidos se-cias Biol., en prensa) ha desarrollado
recientemente un tercer método,
indirectas en el ADN es descrito.
involucrando ribo-substi-tution,
Es similar a la de "plus y que tiene algunas ventajas sobre
Minus" [Método de Sanger, F. & el método más y menos, pero esto
Coulson, A. R. (1975)J. Mol. Biol. aún no se ha explotado
94,441-4481 pero hace uso de la ampliamente.
Otro método rápido y sencillo
2',3'-dideoxy y arabinonu- para que depende de determinados
Cleoside análogos de la normal de La degradación química del ADN ha
los trifosfatos deoxynucleoside,
sido recientemente descrita por
que actúan como inhibidores
Maxam y Gilbert (3), y esto ha sido
específicos de terminación de
cadena de ADN polimerasa. La utilizada también ampliar-
técnica ha sido aplicada al ADN clusivamente de secuenciación de
del bacteriófago 4BX174 y es más DNA. Tiene la ventaja sobre el
rápida y más precisa el método más método más y menos que pueda ser
o menos. aplicado al ADN de doble hebra,
pero requiere una hebra de la
separación o el equivalente de frac
El "más o menos" (método 1) es
relativamente rápida y tionation de cada fragmento de la
enzima de restricción estudiado, lo
Técnica sencilla que ha hecho
posible la determinación de cual hace que sea un poco más
La secuencia del genoma del laborioso.
bacteriófago 4X174 (2). Este documento describe un método
Depende del uso de ADN polimerasa adicional utilizando el ADN de
transcribir específicas
poli-merase, que hace uso de
Las regiones del ADN bajo
inhibidores que rescindir el
condiciones controladas. Aunque el
recientemente sintetizadas en las
método es mucho más rápido y cadenas de residuos específicos.
sencillo que otros
Las técnicas disponibles, ni el
"mas" ni el "menos" método es
totalmente exactas, y a fin de
establecer un se-quence ambos
deben utilizarse juntos y, a
Principio del método. Atkinson y Los derivados y los
cols. (4) demostraron que el arabinonucleosides dideoxy.
Actividad inhibitoria de 2',3'- Arabinosa es un Estereoisómero de
trifosfato (ddTTP la ribosa en el que el grupo 3'-
hidroxilo es ori- ented en posición
dideoxythymidine) sobre el ADN trans con respecto a la 2'-grupo
polimerasa I depende de su hidroxilo. La arabinosyl (ARA)
incorporar clasificado en la nucleótidos actúan como cadena de
terminación de Escherichia coli
creciente cadena de hibitors DNA POLIMERASA I en una
oligonucleótidos en lugar del ácido forma comparable al ddT (4), aunque
thymidylic (dT). Debido a que el las cadenas sintetizadas que
terminan en 3' araC pueden ampliarse
ddT no contiene 3'-hidroxilo
por algunos ADN polimerasas de
Grupo, la cadena no puede mamíferos (5). Con el fin de obtener
un modelo adecuado de bandas desde
ampliarse aún más, por lo que la
que una extensa secuencia puede ser
terminación ocurre concretamente leída, es necesario tener un ratio
de trifosfato de terminación A
en las posiciones donde dT deben
-phate triphos normal, de tal
incorporarse. Si una imprimación y manera que sólo la incorporación
parcial del terminador se produce.
la plantilla se incubaron con la Para los derivados dideoxy esta
ADN polimerasa en presencia de una proporción es aproximadamente 100,
y para el arabinosyl derivados
mezcla de ddTTP y dTTP, así como los alrededor de 5000.
otros tres deoxyribonucleoside los Métodos
trifosfatos (uno de los cuales Preparación del trifosfato
está marcado con 32p), una mezcla análogos. La preparación de ddTTP
de fragmentos todos de la misma 5' ha sido descrito (6, 7), y el
y con residuos de DDT en los material está disponible
extremos 3' cuando esta se obtiene. comercialmente. PDD ha sido

La mezcla es fraccionado por preparado por


electroforesis de desnaturalización McCarthy et al. (8). Hemos seguido
Geles de acrilamida el patrón de su procedimiento esencialmente
bandas que muestra la distribución Y utiliza los métodos de tener (9)
de
y de atesorar y Ott (10) para
DTs en el ADN recién sintetizado.
convertirlo en el trifosfato, que
Utilizando análogo ter-minators
luego se purifica en
para los otros nucleótidos en
DEAE-Sephadex, usando un 0,1-1,0 m
incubaciones separada y ejecutar de desnivel de trietilamina el
los ejemplos en paralelo en el carbonato a pH 8.4. La preparación de
ddCTP y ddGTP no ha sido descrita
gel, un patrón de bandas se
previamente; sin embargo se les
obtiene a partir de la cual la aplicó el mismo método que el
secuencia se puede leer como en el utilizado para las soluciones
obtenidas para ddATP y
Otras técnicas rápidas antes
mencionados. Obtuvieron el requisito de
Dos tipos de terminación de los actividades terminantes. Los
trifosfatos se han utilizado el rendimientos fueron muy bajos y
esto difícilmente puede columna mediante un gradiente de
considerarse suficiente carbonato trietilamina (0.025-0.3
caracterización de producto
M) pero el trifosfato no fue
químico. Sin embargo, caben pocas
dudas de que la actividad era purificado.
correspondida a los derivados de la DdCTP fue preparada a partir de N-
dideoxy. anisoyl-5'-O-monomethoxy-
El material de partida para la Trityldeoxycytidine (Collaborative
ddGTP fue N-isobutyryl-5'-O- Research Inc., Waltham, MA) por el
monomethoxytrityldeoxyguanosine método anterior, pero la última
preparado por F. E.
purificación en
Baralle (11). Después tosylation
DEAE-Sephadex se omite porque el
del grupo 3'-OH (12) El compuesto fue
rendimiento fue muy bajo y la
convertido a los 2',3'-didehydro
solución contenida la actividad
con derivados
requerida. La solución fue utilizada
Methoxide de sodio (8). El grupo
directamente en los experimentos
isobutyryl fue parcialmente re-
descritos en este documento. Se hizo
movido durante este tratamiento y un intento de preparar el
extracción fue completado por trifosfato de la
incubación en NH3 (gravedad Didehydrodideoxycytidine intermedio
específica 0.88) durante la noche a porque Atkinson et
45°. El derivado didehydro fue Abreviaturas: los símbolos C, T, A y G se
utilizan para la deoxyri-
reducido a la dideoxy derivada (8)
Bonucleotides en secuencias de ADN; el prefijo
Y se convierte en el trifosfato dd es utilizada para la 2',3'- dideoxy derivados
(por ejemplo, ddATP es 2',3'-dideoxyadenosine
como para el ddATP. La mo-
5'-tri-
nophosphate fue purificada por Fosfato); el prefijo ara es utilizado para
fraccionamiento en DEAE-Se- phadex la arabinosa análogos.

5463
FIG. 1. Autoradiograph de los geles de acrilamida en la determinación de la secuencia de los
fragmentos de restricción A12D y A14 como cartillas sobre la
Complementaria de IX174 ADN. Los inhibidores utilizados fueron (de izquierda a derecha) , ddGTP ddATP, y
araCTP ddTTP. Electroforesis se en un 12%6 geles de acrilamida en 40 mA durante 14 h en la parte
superior 10 cm del gel no se muestra. La secuencia de ADN se escribe de izquierda a derecha y de
arriba junto a
Las bandas en el radioautograph correspondiente. La numeración es como se indica en la ref. 2.

al.
5464 Bioquímica:' 44 Sanger et
Al. (4) han demostrado que Aproximadamente 0.25
(La concentración del
es también activo como terminador.
allí
Sin embargo, tuvimos éxito
Compuestos parecen mucho Era insuficiente para determinar el rendimiento
dideoxy derivado.
pero la dilución requerida de la solución fue
araATP y araCTP fueron determinada
obtenidosexperimentalmente.)
bioquímicos Inc,Milwaukee, WI.

Procedimiento de secuenciación
enzima de restricción fueron
Obtenido de OX174 formulario replicativo
separados por elec-
Trophoresis en geles de acrilamida.
obtenido de 5
,Ug de OX174 replicativa
H20 fue mezclado con
1 Al viral o complementaria
y
1 Mi de H X 10 buffer
capilar, calentado
En 1000 durante 3 min, y
durante 30 min. El
Solución fue diluido al
muestras al.
Fueron tomadas para cada
2 ml de la ap-
Apropiado "mix" y 1 il de ADN
Klenow, Boehringer, Mannheim) (0,2 unidades).
mezcla con-
Nivel sostenido de 1,5 X
-32P]dATP ( actividad específica
Aproximadamente 100 mCi/,Mnwol) y el seguimiento de
otros trifosfatos.

DdT: 0,1 mM , 0,1 mM dGTP


0,5
MM ddTTP
DdA: 0,1 mM dGTP, dCTP de 0,1 mM, 0,1
dTTP
DdG: 0,1 mM , 0,1 mM dCTP
0,5
MM ddGTP
DdC: 0,1 mM , 0,1 mM dGTP
Inhibidores utilizados fueron (de izquierda a
derecha).
FIG. 2. Autoradiograph desde un experimento DdTTP. AraCTP, ddCTP, ddGTP y ddATP.
utilizando fragmento
R4 como imprimación sobre la complementaria de EDTA y 1 Al de la ribonucleasa
pX174 el ADN. Condi-ciones fueron como en la Fig.
1, con las siguientes excepciones: ddCTP fue
pancreática A a 10 mg/ml fueron
utilizado añadidos y se incubaron durante 60
Como inhibidor en lugar de araCTP. Tras la
incubación de las soluciones a temperatura min a 37°.
ambiente durante 15 min, 1 gl de dATP de 0,5 mM y
1 gl de re- Resultados
La enzima striction Hae III (4 unidades/0) Las Figs. 1-3 se muestran ejemplos
fueron agregadas y las soluciones se incubaron a del uso del método para determinar
370 durante 10 min. El Hae III cortes cerca del la secuencias del ADN de OX174. En el
HindII
Sitio y fue usado porque era más fácilmente experimento se muestra en la Fig. 1
disponibles. La elec- dos pequeños fragmentos de la enzima
Trophoresis fue en un 12% de acrilamida en 40 mA
durante 14 h. La parte superior de restricción (A12d
10,5 cm del gel no se muestra. Y la A14, ref. 2) fueron utilizados
como base en la hebra complementaria y
0,67 mM MnCl2) en lugar de en H no hubo ninguna fase de digestión
buffer. A 7 Ail de recocido final para cortar entre los
Fragmento se añade 1 ml de 10 mM rCTP, 2 Imprimación y la nueva síntesis de
,ul de H20 y 1 ADN. Esta es la forma más simple
,Ul de 10 X Mn de búfer. 5 Y la celeridad del procedimiento,
microcuries de secado "a-32P dTTP requiriendo solamente un recocido
Actividad específica preliminar
(aproximadamente de 1 mCi/gumol) fue De la plantilla y la imprimación,
disuelta en este y 1 ADN polimerasa incubación de las cuatro muestras
fue agregado. Incu- bation fue separadas
durante 30 min en el hielo. Un Con el ADN polimerasa y los
microlitro de EDTA fue de 0,2 M trifosfatos apropiados, seguida por
Antes de la carga añadida de 1 ml
columna Sephadex G-100. Col- umn fue una persecución con dATP sin
5 mM Tris buffer, pH 7.5/0.1 mnM etiquetar y aplicación para el gel de
EDTA. El fragmento etiquetado fue electroforesis. En estos experimentos
seguida por el monitor, recopilado en los inhibidores utilizados fueron
un volumen mínimo (aproximadamente DdGTP, ddATP, ddTTP y araCTP. Las
200 Atl), secado , y disuelto condiciones utilizadas para la "T",
nuevamente en 30 ,.l de 1 X H buffer. las muestras no fueron totalmente
2 muestras ( Al) de este fueron óptima, resultando en las bandas más
tomadas para el tratamiento como se rápida es relativamente débil.
indica arriba. Tras la grabacion de
la etapa, 1 Al de 0,1 M

Las secuencias se pueden leer con


FIG. 3. Autoradiograph de un experimento con
precisión razonable a partir de 88
un fragmento8 como imprimación sobre la hebra
de viral ,X174 utilizando el ADN de un solo nucleótidos del extremo 5' del cebador
sitio ribo-
Método de sustitución. Fue en una electroforesis
en gel de 12% a 40 mA para
6 h de la parte superior de 5,5 cm no se muestra.
5466 Bioquímica: Sanger et al. Más allá de la posición de las
bandas de 4380 indican que se ha
Por sobre unos 80 nucleótidos producido un error en la secuencia
provisional (2), y más trabajo (será
(aparte de cierta dificultad en la publicado más adelante) ha
posición 3459 con A12D). Durante los demostrado que la trinucleotide C-G-
próximos 50 nucleótidos existe cierta C debe ser insertada entre las
incertidumbre en el número de posiciones 4380 y 4381.
Esta técnica se utiliza cuando los
nucleótidos en "ejecución" porque no productos son cortados con una
hay bandas efectivamente resueltas. enzima de restricción como
anteriormente, surgen dificultades
Con una larga restricción de si hay un segundo sitio de la enzima
fragmentos de enzimas como base es de restricción cerca del primero,
Necesario seprarla de las cadenas de porque esto dará lugar a un patrón de
ADN recién sintetizado antes de la bandas que se superpone en la normal,
electroforesis. Esto se hace haciendo imposible la
normalmente por digestion con una interpretación. Una manera de que
enzima de restricción. Fig. 2 esto pueda evitarse es el método
muestra un exp fragmento en que R4 fue del único sitio de ribo-
utilizada como base en la hebra sustitución (N. L. Brown, inédito).
complementaria de OX174 ADN. En este Luego del recocido del patrón y la
experimento sólo los trifosfatos base una solo ribonucleotido es
dideoxynucleotidos fueron utilizados incorporado por incubación de ADN
como inhibidores porque los polimerasa en presencia de
resultados con el araC fue mucho manganeso y el trifosfato
menos satisfactorio cuando una ribonucleotido apropiado.
enzima restrictiva fue utilizada para Extensión de la base se llevó a cabo
la posterior separación. Esto puede con los inhibidores separados como
prever a la araC siendo removido por antes y la base se separó al
la actividad exonucleasa 3' de la ribonucleotido por ribo-nucleasa o
ADN polimerasa durante la incubación alkali. El método es
en 370 (que es necesario para la enzima particularmente adecuado para el
de restricción ), resultando en la uso con fragmentos obtenidos con
división algunas bandas C sea muy la enzima de restricción Alu, que
débil o ausente. Alternativamente, la divide a la secuencia
enzima puede ser capaz de extender más tetranucleotida A-G-C-T. Esta
allá de la araC algunas cadenas a enzima es en efecto inhibida por el
mayor temperatura al ser incapaz de ADN de una sola cadena y no se
hacerlo a bajas temperaturas. AraATP, utiliza para la posterior división
que sólo se ha utilizado en estas de la base de la cadena de ADN
Condiciones, muestra las mismas recién sintetizado. La
limitaciones que araCTP. Estos no se incorporación inicial es llevar a
plantean problemas cuando se utiliza cabo en presencia de rCTP y [a-
ddCTP en esta reacción. 32Pl]dTTP. La en-
Corporación del 32P facilita la
Con una excepción (posiciones 4330-
4343, véase más abajo), una depuración posterior en la columna
secuencia de 120 nucleótidos, Sephadex.
comenzando en una posición 61 Fig. 3 se muestra un ejemplo del
nucleótidos desde el sitio de la uso de este método con el fragmento
enzima de restricción, podría A8 en el Strand viral de OX174 ADN.
leerse; la secuencia acordada en la Una secuencia de aproximadamente
primera publicación. Esta región se 110 nucleótidos a partir de 33
cree que contienen el origen de residuos del principal sitio que se
replicación strand viral (2, 14). puede leer. En la secuencia
provisional (2) Esta región fue aparecen como bandas, evitando así
considerada como muy tímida. La una fuente de error en el método plus
mayoría de es confirmada por esta
Experimento, pero existe una clara y menos métodos estimando el número
revisión necesaria en las posiciones de nucleótidos en una carrera. En
3524-3530. La secuencia de la hebra teoría cabría esperar las diferentes
viral DEBE LEER UN- T-C-A-A-C, bandas en una carrera para tener la
SUSTITUYENDO A-T-T-C- - -A-C que misma fuerza, pero esto no es
figura en el programa provisional siempre el caso. Frecuentemente, el
Secuencia. Hay dificultad en la primer nucleótido es el más fuerte,
lectura de la secuencia en el 3543-
pero en el caso de la segunda ddCTP
3550, donde hay una considerable
es la más fuerte (véase Fig. 2).
variación en la distancia
Las razones de estos efectos no se
Entre bandas, sugiriendo la
entienden, pero generalmente no
presencia de una estructura en
causan dificultades con deducir las
bucle. Trabajo adicional en el que secuencias. A largo de las
la electroforesis se realizó a una secuencias en la que las bandas
temperatura más elevada indica que separadas en una carrera no se
la secuencia es actu-aliado G-C-T- resuelven, la experiencia ha
C-G-C-G (viral strand); es decir, demostrado que con frecuencia es
posible estimar el número de
una inserción de C-tween posiciones
nucleótidos de la fortaleza y la
3547 y 3548 en la orden
anchura de la banda.
provisional.
El método de inhibición puede
Discusión también ser utilizado en menor
El método descrito aquí tiene un
escala que el método más y menos
número de ventajas sobre los métodos
porque la mejor incorporación de 32P-
más y menos. En primer lugar, es
etiquetados se obtiene los
más sencillo realizar ser causa de
trifosfatos. Esto es probablemente
que no requiere ninguna extensión
debido al largo período de
preliminar, evitando así una
incubación utilizados, lo que
La incubación y la purificación en
permite una más extensión
columna Sephadex. Solo se requiere
cuantitativa de base de cadenas.
la ADN polimerasa I disponible
En general, las secuencias de 15 a
comercialmente (Klenow fragmento).
aproximadamente 200 nucleótidos desde
Los resultados parecen ser más
el sitio de cebado puede determinarse
claros con menos bandas de
con razonable precisión usando un
artefactos, y generalmente se puede
cebador. Con frecuencia, es posible
leer más que con los métodos más y
leer los geles aún más y, en
menos. Nucleótidos intermedios en
ocasiones, una secuencia de
"ejecuta"
aproximadamente 300 nucleótidos
desde el sitio de cebado se ha en el lado opuesto. Probablemente
determinado. Ocasionalmente se esta consideración se aplica a todos
los otros métodos disponibles
observan artefactos, pero éstos también. La principal desventaja de
generalmente pueden ser este método es la dificultad en
obtener todos los inhibidores
identificados fácilmente. Parece
especialmente ddGTP, que no está
probable que estos son generalmente disponible comercialmente.
debido a contaminante en los
fragmentos. Las más graves
dificultades debidas a "pile-ups" de
bandas, que generalmente son
causadas por el ADN formando base-
emparejado los bucles en las
condiciones de la electroforesis en
gel de acrilamida. Estos pile-ups
son vistos como una serie de bandas
en la misma posición o inusualmente
cerca uno del otro en la
electroforesis. Generalmente ocurren
en diferentes posiciones cuando el
cebado se hace en sentido inverso a
lo largo del ADN a través de la
misma secuencia. Un ejemplo de este
efecto se ve en la Fig. 2 en la
posición 4330, donde hay una sola
banda resistente en el canal G que
representa, de hecho, cuatro G
residuos. Presumiblemente están
formando un lazo estable mediante el
emparejamiento con las cuatro
posiciones de Cs en el 4323-4326.
Otro ex-más grande está en la Fig. 3
posiciones en 3545-3550. Este efecto
puede ser encontrado en todas las
técnicas rápidas que utilice gel
electroPhoresis.
Se estima que para una determinación
exacta de la secuencia no se debe
confiar completamente en solo los
resultados obtenidos mediante este
método solamente sino que la
confirmación debe ser obtenida por
alguna otra técnica o por el cebado