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Escuela de Ingeniería Industrial

PRÁCTICA 3: INMOVILIZACIÓN BIOCATALIZADOR

ASIGNATURA: REACTORES Y BIOTECNOLOGÍA

Autores:
Claudia Álvarez López
Irene Fernández Rivadulla
Marina Jiménez Cheda
OBJETIVOS
El objetivo de esta práctica es emplear en la reacción de hidrólisis de almidón la enzima
α-amilasa inmovilizada previamente.
Para la inmovilización empleamos un método físico, atrapamiento en geles, basado en
la retención de la enzima en las cavidades interiores de una matriz sólida porosa.

METODOLOGÍA
En primer lugar preparamos la disolución de almidón la cual mezclaremos un citrato
fosfato (solución tampón) para que no se produzca ninguna variación del pH que afecte
a la actividad enzimática posterior.
A continuación realizamos la inmovilización, para ello preparamos una mezcla de
disolución enzimática con disolución de alginato de sodio. En otro vaso depositamos la
disolución de CaCl2 sobre la cual hacemos gotear con ayuda de una jeringuilla la
disolución de alginato. Una vez goteado todo el volumen recuperamos las bolitas
mediante un colador.

Figura 1: Bolitas de enzima inmovilizado


Acto seguido añadimos las bolitas de alginato a la disolución de almidón y dejamos que
la reacción transcurra durante media hora.

Figura 2: Reactor de hidrólisis de almidón.

Terminada la reacción hacemos diluciones en tubos de plástico a las cuales les añadimos
DNS y llevamos a ebullición durante cinco minutos. Una vez detenida la reacción
medimos la absorbancia en el espectrofotómetro. Gracias a la medida de esta
absorbancia y empleando la recta patrón obtenida en la Práctica 1 somos capaces de
calcular la concentración de azúcares producidos en la reacción de hidrólisis.
RESULTADOS
RECTA OBTENIDA EN PRÁCTICA 1
Tabla 1.1: Valores ABS según concentración de glucosa
Tubo 0 1 2 4 5 3
Glucosa(g/L) 0 0.4 0.8 1.6 2 1.2
ABS1 0.185 0.21 0.48 0.967 1.302 0.592
ABS2 0.185 0.135 0.437 0.967 1.291 0.641
MediaABS 0.185 0.1725 0.4585 0.967 1.2965 0.6165
Ref. DNS 0 0 0.1725 0.4585 0.967 1.2965 0.4315

1.4
y = 0.6217x
R² = 0.9908
1.2

0.8
ABS640

0.6

0.4

0.2

0
0 0.5 1 1.5 2 2.5
Concentración Glucosa (g/L)

Figura 1.1: Representación ABS640 frente concentración de glucosa

En la ecuación de la recta obtenida en la práctica 1, y=0,6217x, sustituimos el


valor de “y” por la absorbancia obtenida, y=0,510=0,6217x. Despejamos la “x” y
obtenemos un valor de concentración de 0,82 g de azúcares reductores/L de
disolución.
Sabiendo que la disolución era de 1 mL, entonces la cantidad de azúcares
reductores es de 0,82 mg. Además, como la cantidad de enzima utilizada fue de 1 mg,
podemos concluir que la actividad enzimática de las bolitas de alginato expresando la
concentración como azúcares generados por mg de enzima es de 0,82 mg de
azúcares/mg enzima.
Escuela de Ingeniería Industrial

PRÁCTICA 4: CINÉTICA MICHAELIS MENTEN

ASIGNATURA: REACTORES Y BIOTECNOLOGÍA

Autores:
Claudia Álvarez López
Irene Fernández Rivadulla
Marina Jiménez Cheda
1. Objetivo
La finalidad de esta experiencia es la determinación de la expresión cinética de la
reacción de oxidación del tinte azul de bromofenol, mediante el método de las
velocidades iniciales.

2. Procedimiento
En esta práctica se estudia la evolución de la concentración de tinte frente al
tiempo, siendo la ecuación de velocidad representada mediante la expresión de
Michaelis Menten.
Comenzamos realizando una recta de calibrado a partir de la representación de la
absorbancia vs tiempo. Esta recta relaciona la absorbancia y la concentración, de tal
forma que conociendo la absorbancia de cada una de ellas nos permitir hallar la
concentración existente en cada disolución.
Aplicando el método de las velocidades iniciales, se preparan 7 muestras de
distintas concentraciones. Puesto que el pH afecta a la actividad del enzima debemos
de preparar la solución de tinte en un medio tamponado. A continuación, se toman los
valores de cada absorbancia obtenida mediante las mediciones en el
espectrofotómetro.
Una vez obtenidos dichos datos se cogen y enumeran 7 cubetas. En ellas se
introduce 1 ml de la disolución correspondiente preparada anteriormente y 240 µl de
preparado enzimático 5000 U/L.
Inmediatamente después de que se introduzca la enzima, se comienzan a
cronometrar 30 min al mismo tiempo que se mide la absorbancia en el
espectrofotómetro a 590nm Abs, siendo esta la absorbancia correspondiente a tiempo
0, T(0).
Finalmente, transcurrido los 30 min se toman de nuevo las absorbancias a 590 nm
Abs, correspondiendo estas a Abs T(30).
Con todos los datos conseguidos se sustituye en la recta de calibrado las Abs T(0) y las
Abs (30), hallando las respectivas concentraciones, C0 y C.
3. Análisis de los resultados.
Ctinte (g/L) ABS ABS tras 30 min C30 (g/L) -ra'(g/L*min) 1/-ra'(L*min/g) 1/C(L/g)
0.028 0.997 0.684 0.0181809 0.00060603 1650.087719 35.714286
0.024 0.919 0.633 0.0168253 0.00056084 1783.033175 41.666667
0.02 0.812 0.585 0.0155494 0.00051831 1929.333333 50
0.016 0.611 0.484 0.0128648 0.00042883 2331.942149 62.5
0.008 0.285 0.2 0.005316 0.0001772 5643.3 125
0.004 0.147 0.113 0.0030036 0.00010012 9988.141593 250
0 0 0 0 0

ABS 590 vs Ctinte


1.2
y = 37.622x
R² = 0.9922
1

0.8
ABS 590

0.6

0.4

0.2

0
0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03
Concentración tinte (g/l)

Inversa de ra vs C
12000
y = 40.215x + 101.53
R² = 0.9925
10000
-1/ra (L*min/g)

8000

6000

4000

2000

0
0 50 100 150 200 250 300
1/C (L/g)
Como se puede observar en el Excel mostrado anteriormente primero calculamos la
concentración tras haber transcurrido la reacción ayudándonos de la recta de
calibración previamente realizada con las absorbancias y concentraciones iniciales. Para
ello despejamos la concentración de la ecuación de la recta de calibración.
A continuación, calculamos la velocidad como la variación de la concentración con
respecto al tiempo (30 min). En nuestro caso, como hemos omitido el paso de medir la
absorbancia a tiempo 0 y por consiguiente no tenemos la concentración a tiempo 0,
entonces nuestra variación de la concentración se corresponde directamente con la
concentración tras los 30 min de reacción. Como lo que estamos calculando realmente
es –ra, en vez de hacer concentración final menos concentración final, hay que hacer
concentración inicial menos final, pero como acabamos de explicar, en nuestro caso solo
tenemos concentración final.
El siguiente paso es representar la inversa de la velocidad frente a la inversa de la
concentración (en nuestro caso la concentración de tinte inicial, puesto que no tenemos
la concentración de tinte a tiempo 0).
Al linealizar la cinética de Michaelis Menten, obtenemos la siguiente expresión:

Que es del tipo y=ax+b. Como b=101.53 (L*min/g)=1/rmáx, entonces podemos calcular
rmáx y obtenemos un valor de 0.00984931 (g/L*min).
Por otra parte como a=40.215 (min*L/g)=KM/rmáx , y sabiendo el valor de rmáx ya que lo
hemos calculado, podemos despejar KM, que es la constante de Michaelis Menten y
obtenemos que:
KM=0.396 g/L.