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1.2.

CROMATOGRAFÍA LIQUIDA

En la actualidad el uso de la cromatografía como técnica de fraccionamiento ha aumentado su uso,


dada su capacidad de superar algunas de las limitaciones de los métodos de fraccionamiento por
electroforesis bidimensional (2DE), lo que permite abordar proteínas difíciles de analizar dada su
estructura y composición, como las proteínas con puntos isoeléctricos extremos (ácidos y básicos)
y las proteínas hidrofobias, ya que dada su composición y escasa solubilidad están poco
representadas en los mapas electroforéticos bidimensionales obtenidos hasta el momento.

Otras que son difíciles de analizar son las de baja abundancia que dada a su escasez no puedan
apreciarse por la presencia de proteínas mayoritarias que opacan o se sobreponen ante estas,
imposibilitando de este modo su fácil detección. Es por ello, que en los últimos años ha existido la
tendencia a trabajar con los péptidos en vez de las proteínas tratando de solucionar las
limitaciones señaladas.

La cromatografía liquida (liquid chromatography, LC) es una técnica de fraccionamiento que puede
utilizarse para separar proteínas o péptidos según las propiedades físicas o químicas de estos.1

1.2.1. CROMATOGRAFÍA BI – DIMENSIONAL

La cromatografía líquida bi-dimensional es motivo de interés y experimentación desde hace ya


varios años. La ventaja principal de la cromatografía líquida bi-dimensional respecto a la
cromatografía líquida de alta resolución radica en la gran capacidad de picos que se puede lograr
utilizando diferentes mecanismos separativos, lo que es prácticamente indispensable en muestras
complejas por la cantidad y variedad de analitos presentes.

Históricamente, la cromatografía líquida bi-dimensional ha sido utilizada casi exclusivamente para


resolver mezclas con cientos de constituyentes. El experimento consiste básicamente en transferir
una o varias fracciones del eluyente de una columna cromatográfica a una segunda columna para
realizar otra etapa de separación adicional. Esta estrategia puede tener varios objetivos: a) poder
resolver componentes de una mezcla compleja que no puede ser separada en una única columna,
b) para separar la matriz de una muestra respecto de los componentes de interés, c) para
concentrar y purificar algún compuesto particular o d) hacer uso más eficiente del tiempo de
separación. Hay muchas formas de practicar la cromatografía bi-dimensional. El ejemplo más
simple podría ser realizar una cromatografía en capa fina con un solvente en una dirección y luego
utilizar un solvente diferente para realizar una segunda cromatografía a 90 grados respecto a la
primera. Sin embargo, muchos otros ejemplos se pueden obtener combinando diferentes formas
de cromatografía líquida (fase normal, reversa, exclusión, intercambio iónico) en ambas 6
dimensiones. El análisis del eluyente de la primera columna se podría realizar de varias formas. Si,
por ejemplo, uno está interesado solamente en una fracción de la primera dimensión (corte), ésta
única fracción es transferida a la segunda columna y analizada. Esta es la forma más común de
cromatografía bi-dimensional y se la conoce por varios términos diferentes, como ser “cambio de
columnas”, “cromatografía en serie”, “análisis secuencial” ó incluso “columnas acopladas”. La
principal ventaja radica en que los requerimientos instrumentales son menores y, en principio,
solo se precisaría una válvula para transferir el corte de la primera a la segunda columna.1

Figura 1. Cromatograma 2-D de muestra de proteínas: pico A, glucosa oxidasa; B, ovoalbúmina; C,


β-lactoglobulina A; D, tripsinógeno; E, α-simotripsinógeno A; F, conalbúmina; G, ribonucleasa A; H,
hemoglobina; M, defecto de “presión” del volumen de exclusión; N, defecto de “sal” del volumen
de inclusión. Ovoalbúmina y α-simotripsinógeno A a 0.2 %, las otras proteínas a 0.3 % (p/v).
Condiciones C1: 5 µL/min, 0 % a 100 % de buffer B desde 20 hasta 260 min; buffer A, 0.2 M
NaH2PO4, pH 5; buffer B, 0.2 M NaH2PO4/0.25 M Na2SO4, pH 5. Válvula accionada cada 6 min;
detección a 215 nm, datos colectados a 0.5 puntos/s; el gráfico muestra cada punto colectado
para la inyección 1 hasta la 60. Cada línea perpendicular al eje de tiempo IEC representa una
inyección en la columna SEC.
Las técnicas de cromatografía bi – dimensional (2D) tienen la ventaja que permite pueda ser
utilizada en muchas combinaciones multidimensionales aumentando de esta manera la capacidad
de generar los máximos niveles de resolución para las muestras de gran complejidad.

2. IDENTIFICACION POR ESPECTROMETRIA DE MASAS


La espectrometria de masas (MS) es una tecnica valiosa cuyos inicios se remontan a los primeros
dias del siglo pasado. Entre las tecnicas analiticas. MS tiene un lugar especial y que mide con
precision el peso de una molecula y/o mas exactamente su relacion masa/carga (m/z).2

En sus inicios, la MS no era aplicable a las proteinas, debido a la ausencia de tecnicas suaves de
ionizacion que permitieran realizar el paso de grandes biomoleculas a iones en fase gaseosa sin
una fragmentacion excesiva de las mismas, es decir, que no se volatilizaban. A partir de la decada
de 1980 y en mayor escala en la decada de 1990, espectrometria de masa ha desempeñado un
papel cada vez mas importante en las ciencias biologicas, gracias al desarrollarlo de dos tecnicas
de ionizacion que permitieron realizar el analisis de proteinas y peptidos, entre otras biomoleculas
por M.S. La primera de ellas, se denominan MALDI por sus siglas en ingles “Matriz - Assisted Laser
Desorption/Ionizacion” (desorcion/ionizacion laser asistida por matriz) y la segunda de ellas es la
ionizacion por electroespray “electrospray ionizacion” (ESI), desarrollada por Fenn y
colaboradores.1

Los mayores avances para el estudio de las proteinas se han dado en la etapa de preparacion de
las muestras para la MS; un area importante para la viabilidad y la sensibilidad del analisis. A partir
de 1993, se comienzan a publicar varios algoritmos, y programas informaticos, diseñados con el
objetivo de permitir la correlacion de los datos de espectrometria de masas obtenidos para una
proteina y los obtenidos en las bases de datos, cada vez mas amplias.2

La MS ha evolucionado rapidamente convirtiendose en un campo central de la genomica


funcional. Este proceso se debe al desarrollo de las tecnologias en el area instrumental y de las
herramientas de analisis. A continuacion se describe algunos quipos instrumentales, como sus
componentes y caracteristicas.
Espectrómetro de masas

Los espectrómetros de masas se componen de tres elementos básicos, que en orden


secuencial de acción en un análisis por MS serian: la fuente de ionización, el analizador de
masas y el detector.

La fuente de ionización convierte las moléculas en iones en fase gaseosa para que pasen al
analizador de masa, donde son separadas según su relación masa/carga y hace que
lleguen al detector secuencialmente. Las señales captadas por el detector son integradas
por un sistema informático que genera un gráfico denominado espectro de masas, donde
se representan la abundancia (intensidad) de los iones en el eje de coordenadas y la
masa/carga (m/z) en las abscisas esta permitirá la identificación del compuesto.1

Fig. 2 Esquema de las partes principales de los equipos de espectrometría de masas.


La fuente de ionización es el elemento del espectrómetro que ioniza el material a ser analizado (el
analíto). Luego los iones son transportados por los campos magnéticos o eléctricos al analizador
total. Las técnicas para la ionización han sido claves para determinar qué tipos de muestras se
pueden analizar mediante espectrometria de masas. Las dos técnicas a menudo usadas para el
análisis de líquidos y muestras solidas son MALDI y el ESI.3
2.1. ESI: Ionización por electrospray

El desarrollo de ESI dio lugar a que John Fenn obtuviera el premio Nobel en Química en
2002 «for the development of soft desorption ionisation methods for mass spectrometric
analyses of biological macromolecules
(electrospray)».

Es una ionización a presión atmosférica que se aplica a un amplio grupo de muestras y


especialmente se utiliza para la caracterización de biomoléculas. En la ionización por
electrospray, la muestra disuelta en un disolvente adecuado pasa a través de un capilar
metálico, en cuyapunta se aplica un potencial de 3 a 4 KV y una presión de 1 atmósfera. Se
produce una fina niebla de gotas de elevada carga y la evaporación del solvente hace que
aumente la densidad de carga, produciéndose la desorción en fase gaseosa.
El análisis por ESI, se puede hacer provocando una ionización positiva o negativa. Se
selecciona la polaridad de los iones que se desea analizar mediante el voltaje del capilar.

Permite la obtención del ión molecular, y si se desea obtener una fragmentación, se puede
inducir aumentando el voltaje en la punta del cono del capilar. Este proceso se utiliza con
frecuencia en espectrometría de masas en tándem. La ESI de especies poliméricas,
proporciona espectros que contienen una serie de múltiples iones cargados del siguiente
tipo: [M+ nH]n+ y [M–nH]n–. En muchos casos, se pueden determinar masas moleculares
de macromoléculas con una precisión de ± 0,005%. La ionización por electrospray
constituye la mejor interfaz cuando se acopla la cromatografía de líquidos (LC) o la
electroforesis capilar (CE) con MS.

NanoESI: Ionización por nanoelectrospray. Es una versión miniaturizada de un sistema de


ionización por electrospray convencional que permite operar con un flujo del orden de
microlitros. Existen algunas diferencias desde el punto de vista práctico. En un nanoESI se
utiliza un capilar recubierto de oro de un diámetro de 1 a 3 μm, frente a los 100 μm que
tienen los capilares utilizados en un ESI convencional. En segundo lugar, el voltaje
aplicado para que se produzca la ionización de la muestra es mucho más bajo, entre 500 y
800 V. Otra diferencia es que no es necesario un sistema de bombeo externo para mantener
un flujo constante. La velocidad de desorción de los iones en las pequeñas gotas es mucho
mayor que en las gotas grandes, por eso en el sistema de nanoESI, se incrementa la
sensibilidad en varios órdenes de magnitud con respecto al sistema ESI convencional.3
Fig. 3. Esquema de un sistema de ionización ESI: electrospray.

2.2. MALDI: Ionización por desorción con láser asistida por una matriz

El desarrollo de este sistema de desorción se realizó por dos grupos de investigación siendo
merecedor del Premio Nobel en 2002 Koichi Tanaka, compartido con John Fenn. Ha
significado una revolución para el estudio de biopolímeros, ya que ha permitido el análisis
de proteínas y otras biomoléculas cuyas masas exceden los 200 Kdalton, con una
sensibilidad de varios órdenes de magnitud.

El sistema MALDI (matrix-assisted laser desorption ionization) se realiza mediante una


radiación láser y con el concurso de una matriz adecuada. Se opera mezclando una
disolución de la muestra con una sustancia matriz que se encuentra en mucha mayor
proporción que la muestra (10.000:1); la mezcla se deposita en un dispositivo
portamuestras especialmente diseñado para este sistema de ionización. Tras la evaporación
del disolvente, los cristales de la mezcla muestra-matriz se irradian con un haz láser de
elevada potencia (106 Wcm–2) y de pulsos cortos durante algunos nanosegundos que
desorben e ionizan las moléculas de la muestra y la matriz, manteniéndolas en fase gaseosa.
La clave del éxito del MALDI, se debe a que la matriz es capaz de absorber gran cantidad
de energía a la longitud de onda del láser y posteriormente sufre una relajación, cediendo la
energía emitida a las moléculas de la muestra de una forma controlada, de manera que
permite la desorción de las moléculas quedando como iones intactos en fase gaseosa. Se
utilizan diferentes tipos de matrices dependiendo de las aplicaciones y de la naturaleza del
analito: matrices orgánicas sólidas y líquidas, líquidos iónicos y materiales inorgánicos.

La matriz utilizada en el sistema MALDI, juega un papel muy importante en el proceso de


ionización de la muestra y tiene dos misiones, la primera es absorber el fotón de energía
procedente del haz láser, la segunda actúa como un disolvente del analito reduciendo las
fuerzas intermoleculares y disminuyendo la agregación de moléculas de analito al mínimo.
Los iones generados mediante MALDI son mayoritariamente moléculas protonadas con
una sola carga, también se forman iones oligoméricos protonados con doble y triple carga.
Además, se forman aductos de las moléculas de la muestra con Na+ y K+, especialmente en
muestras de origen biológico. Se pueden formar iones con carga negativa.
Una matriz debe tener las siguientes características: fuerte absorción de radiación a la
longitud de onda del láser. Buena capacidad de mezcla con el analito, para que se formen
unos microcristales bien definidos. Una baja temperatura de sublimación que permita la
formación de forma instantánea de un conjunto matriz-muestra durante la duración del
pulso de láser. Participación en algún tipo de reacción fotoquímica, que permita que las
moléculas de la muestra puedan protonarse o desprotonarse con una elevada eficacia.

Un aspecto crítico que hay que considerar es la preparación de la muestra, tratando de


evitar la posibilidad de que se produzca una disgregación entre las moléculas del analito y
la matriz durante el proceso de cocristalización, lo que conlleva que la preparación no sea
homogénea, dando lugar a una señal inadecuada en el analizador. El mecanismo por el que
se produce la ionización MALDI no es todavía bien conocido. Se proponen tres
mecanismos para explicarlo, el primero corresponde a un modelo de ionización
fotoquímico, el segundo a un modelo de ionización «cluster» y el tercero propone un
modelo de transferencia pseudoprotónica. En el modelo de ionización fotoquímica, los
iones de la matriz se producen por un proceso de ionización multifotónica y colisión, los
iones de las biomoléculas, a su vez, se producen por la protonación o desprotonación entre
los iones de la matriz y las biomoléculas durante un proceso de colisión en fase gaseosa.
En el modelo que propone una ionización «cluster» (asociaciones entre iones de muestra y
moléculas del disolvente) se considera que la radiación láser provoca la desorción de los
«cluster», lo que hace que se produzcan los iones de las biomoléculas por desolvatación de
las moléculas de la matriz. En el modelo que propone una pseudotransferencia de protones,
los iones de biomoléculas se producirían durante un proceso de cocristalización de la
matriz, tras la absorción de la radiación láser. Actualmente se sigue investigando sobre el
mecanismo de ionización para mejorar el análisis de biomoléculas por MS. Dado que el haz
de radiación láser es pulsante, el sistema MALDI es muy adecuado para utilizar un
analizador de tiempo de vuelo (TOF) y a este equipo se le denomina MALDI-TOF.3
Fig. 4 Esquema de un sistema de ionización MALDI: desorción con láser, asistida por
una matriz.

2.2.1. MALDI – TOF (analizador de tiempo de vuelo)

El analizador tiene dos misiones fundamentales: separar los iones en función de su relación
m/z y enfocar los iones separados hacia un determinado punto. El movimiento de las
partículas cargadas permite distinguir unas de otras en función de la energía cinética de
cada ión, de la velocidad o del momento de fuerzas. Los distintos analizadores aprovechan
alguna o varias de estas propiedades para separar los iones de distintas masas.

Es uno de los analizadores más sencillos, pero actualmente tiene una gran presencia en los
laboratorios. El principio de los espectrómetros de tiempo de vuelo (time of flight) se basa
en la relación entre la masa y la velocidad de los iones. Se mide el tiempo que necesitan los
iones acelerados para recorrer una distancia (L), que depende de las características del
instrumento, sin que los iones estén sometidos a un campo eléctrico y/o magnético.
Las prestaciones del TOF son especialmente interesantes, sobre todo en cuánto a la
resolución y la exactitud en la determinación de la masa ya que se consiguen valores
inferiores a partes por millón.

Se han incorporado algunos elementos en el instrumento como son unos espejos


electrostáticos denominados «reflectrón» para aumentar la resolución y mejorar la
separación de los haces de iones.

Los equipos MALDI-TOF son muy utilizados para el análisis de biomoléculas, siendo sus
principales ventajas:
 Análisis muy rápidos, algunos instrumentos que se encuentranen el mercado pueden
procesar cien muestras en menos de diez minutos.
 Permite la determinación de masas en un amplio intervalo, se pueden medir desde
péptidos de pequeña masa hasta proteínas mayores de 100.000 Dalton (Da).
 Se obtienen espectros de masas sencillos, debido a que la mayoría de los iones
tienen una carga única, sólo un pequeño porcentaje es de doble carga y rara vez se
observan iones de triple carga.
 Posibilidad de obtener una imagen espacial molecular o incluso de un tejido, debido
a que el haz de radiación láser se puede enfocar en un pocillo muy estrecho (5 μm).
También depende de las lentes focalizadoras utilizadas en el equipo MALDI-TOF.
 Una sensibilidad muy elevada que puede llegar a detectar cantidades del orden de
atomoles de péptidos de pequeño tamaño.3

Las limitaciones del MALDI-TOF también existen y se pueden resumir en las siguientes:

 Baja reproducibilidad debido a la dificultad para controlar el proceso de


cristalización y la producción de iones debido a la fuerte influencia del láser.
 Una relativamente baja resolución para la determinación de las masas, debido a que
la energía de las biomoléculas se dispersa durante el proceso de desorción, así
como, a la posible unión a la matriz y a la posible fragmentación de la biomolécula.3

Fig.5 Esquemas de diversos analizadores


Bibliografía

[1]. De la Torre C. Aplicación de técnicas de proteómica para el estudio de enfermedades


neuromusculares [Tesis]. Universidad de Barcelona. 2004.
[2]. Castagnino J. Proteómica y sus aplicaciones en medicina humana. Acta Bioquím Clín
Latinoam 2008; 42 (2): 179-82.
[3]. Martín C. Ballesteros M. Espectrometría de masas y análisis de biomarcadores.
Facultad de Farmacia.Universidad de Alcalá. Madrid.