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FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA

GUÍA DE PRÁCTICAS DE
BIOQUÍMICA III
GUÍA DE PRÁCTICAS
DE BIOQUÍMICA III

DOCENTE RESPONSABLE:
Mg. Miguel Angel Inocente Camones

DOCENTE COLABORADORES:

QF. Luis Aranguren Belaunde


INTRODUCCIÓN

El progreso en la ciencia se realiza mediante la observación y experimentación. Este aspecto es


particularmente importante en la Bioquímica, que es un área de la ciencia en donde se han
realizado prodigiosos avances en las últimas décadas gracias al desarrollo de nuevos métodos de
estudio y técnicas experimentales.

Este manual de práctica de Bioquímica incluye una breve explicación de las técnicas más
utilizadas en la investigación Bioquímica a decir la potenciometría, espectrofotometría,
cromatografía, electroforesis, centrifugación y otros.

Con la instrumentación de estas técnicas bioquímicas se pretende que al terminar el curso, los
alumnos estén inmersos e interesados en la experimentación que es la base de la Bioquímica.

Para la comprensión de las prácticas se requiere que se familiaricen con los contenidos teóricos de
cada experimento, los mismos que contienen una lista de referencias que sirven en el análisis y
elaboración del marco teórico. Al inicio se realizará una breve explicación de las técnicas y los
procedimientos que deben emplearse en el laboratorio.

Cada experimento llevará el nombre de la práctica, un marco teórico, fundamento, competencias,


interpretación clínica, materiales y equipos, procedimientos, resultados, conclusión, cuestionario,
fuentes de información basado en el sistema Vancouver.
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LABORATORIO DE BIOQUÍMICA III

PRÁCTICA N°1: NORMAS BUENAS DE LABORATORIO Y BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO


DE BIOQUÍMICA. MANEJO DE INSTRUMENTOS

Definición: Representa el conjunto de reglas, procedimientos operativos y prácticos adecuados para


garantizar que los datos generados por los laboratorios sean confiables.

La relación entre la BPL y el Sistema de Gestión de Calidad (SGC) tiene un efecto sinérgico, cualquiera
que sea el ámbito de aplicación, puesto que los requisitos generados del SGC contribuyen a garantizar
que se cumplan los requisitos de las BPL específicas.

La mayoría de los requisitos de la BPL se recogen en la norma ISO 9001/2008: tales como: control de
documentos, control de registro, auditorías internas, revisión de instalaciones por la dirección y personal;
con excepción de otros muy específicos que se tratan de forma minuciosa con las BPL (ISO 17025),
como los relacionados con los reactivos, medios de cultivo, materiales de referencia, con algunos
procesos como la esterilización y la filtración, los estudios de estabilidad y validación, monitoreo
ambiental de las áreas y el control de los desinfectantes, las características de los equipos, la higiene del
personal y el retiro de los productos del mercado.

La norma ISO 9001 contempla los requisitos que son vitales para desarrollar e implementar SGC
eficientes que garantice el cumplimiento permanente de los requisitos de los BPL, así como aquellos que
tiene que ver con la concepción de los SGC y los principios en que se sustente.

Los BPL constituyen documentos más específicos del sector, que identifican requisitos indispensables
para el desarrollo de las actividades y procesos relacionados con las producciones o ensayos, pero con
una visión menos integradora y sin abarcar asuntos indispensables para gestionar eficientemente tales
actividades y procesos.

Los requisitos técnicos para un laboratorio son la confiabilidad y validez de los resultados, rapidez en la
entrega y la entrega adecuada. Y los objetivos de un sistema de calidad son evitar que ocurran errores e
ineficiencias, detecta e identificar los elementos causantes de los errores, corregir y mejorar los procesos,
además de demostrar con evidencias que se han cumplido los requisitos.

La implementación exitosa de las Buenas Prácticas de Laboratorio, requiere regulación y reconocimiento


del rol del elemento humano, en todos los niveles de personal, en el diseño, implementación y evaluación
de un Programa de Aseguramiento de Calidad.

Existe una verdadera interrelación entre las BLP y la norma ISO/IEC 17025: 2005, ya que ambas trabajan
conforme a requisitos relacionados, equipo, materiales, procedimientos estandarizados, requisitos de
todas las actividades.
Los BPL contienen aspectos de bioseguridad que no contemplan las normas ISO/IEC 17025:2005. Por
otra parte esta norma contiene requisitos que ayudan a evaluar las necesidades del cliente: atención a
quejas, encuestas de satisfacción y un aspecto muy importante que es la mejora continua, lo que ayuda
al crecimiento de las organizaciones.
En el siguiente recuadro los cambios más significativos en cuanto a estructura entre ISO 9001/: 2008 vs
ISO 9001/: 2015.

ISO 9001/: 2008 ISO 9001/: 2015

1. Objeto y campo de aplicación. 1. Objeto y campo de aplicación.

2. Normas para tu consulta. 2. Referencias normativas.

3. Términos y definiciones. 3. Términos y definiciones.

4. Sistema de gestión de calidad. 4. Contexto de la organización.

5. Responsabilidad de la dirección. 5. Liderazgo.

6. Gestión de los recursos. 6. Planificación.

7. Realización del producto. 7. Soporte.

8. Medición, análisis y mejora. 8. Operación.

9. Evaluación del desempeño.

10. Mejora continua.

Que es ISO:

 Organización Internacional de Estandarización

 Sede: Ginebra (Suiza)

 Reconocida por más de 150 países.

 INDECOPI la representa en el Perú.

 Promueve y elabora normas a nivel Internacional para facilitar el comercio mundial. La reparación de
las normas internacionales normalmente se realiza a través de los comités técnicos de ISO.

La ISO / IEC 17025-2005 especifica los requisitos generales para la competencia para llevar a cabo los
ensayos y calibraciones, incluido el muestreo cubre los ensayos y la calibración realizada usando
métodos estándar, métodos no normalizados y métodos desarrollados para el laboratorio.

LAS NORMAS BPL

Constituyen en esencia, una filosofía de trabajo, son un sistema de organización de todo lo que de alguna
forma interviene en la realización de un estudio o procedimiento encaminado a la investigación de todo
producto químico o biológico que pueda tener impacto sobre la especie humana.

Las normas inciden en como debe trabajar a lo largo de todo el estudio, desde su diseño hasta el archivo.
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PRÁCTICA N° 2: OBTENCIÓN DE LECITINA A PARTIR DE LA YEMA DE HUEVO

MARCO TEÓRICO

Lípidos son aquellas sustancias orgánicas extraíbles de tejidos animales o vegetales, por medio de solventes
orgánicos como éter, cloroformo, tetracloruro de carbono, benceno, etc. Los lípidos son insolubles en agua, son
sustancias de suma importancia, porque constituyen formas de almacenamiento de energía y porque forman
parte de estructuras celulares, principalmente de todo tipo de membrana biológica.Los lípidos extraídos de
material biológico representan una gran variedad de moléculas, estructuralmente diferentes, pero que
comparten la propiedad de ser solubles en solventes orgánicos, llamados por eso, solventes de las grasas.Entre
los lípidos existen moléculas no polares, como los triacilgliceroles, o triglicéridos, y moléculas polares como los
fosfoglicéridos, o fosfolípidos, y los esfingolípidos, y moléculas de tipo terpenoides los esteroides, los terpenos
y algunas vitaminas. .Entre los fosfoglicéridos más comunes, tenemos a los tres derivados del ácido fosfatídico,
a saber: fosfatidil colina, fosfatidil etanolamina y fosfatidil serina. A los fosfatidil colina se les conoce con el
nombre genérico de lecitinas. Existen varias lecitinas dependiendo de los ácidos grasos que contengan
esterificados en los carbonos alfa y beta glicerol.

LECITINAS: Las lecitinas son moléculas polares que existen en forma de sales internas, ya que contienen a
carga negativa del ácido fosfórico, y la carga positiva del grupo trimetilamino de la colina. El pH isoeléctrico de
una lecitina pura es generalmente de 6,7 o un poco mayor, lo cual concuerda con su estructura anfótera.

Las lecitinas puras son sustancias blancas de aspecto grasoso, que cuando se exponen a la luz y al aire toman
una coloración café, debido a la autooxidación y descomposición. Son solubles en los solventes ordinarios de
las grasas, excepto en acetona. Esta propiedad se emplea para su aislamiento. Son higroscópicas y se mezclan
bien con el agua formando soluciones coloidales nebulosas .La identificación de la lecitina puede hacerse por
saponificación, para separar los ácidos grasos, hidrolisis para separar la colin y después probar para presencia
de colina.

FUNDAMENTO DE LA PRÁCTICA

Se separará primero la yema de huevo por los medios manuales o mecánicos. En la yema se encuentran las
lecitinas en gran abundancia y además el colesterol en suficiente cantidad para hacer su aislamiento y detección
fácil.

Una vez separada la yema se hará una extracción general de lípidos con solventes orgánicos. Algunos autores
afirman que una mezcla cloroformo-éter a partes iguales es el mejor solvente para la extracción de los lípidos.
En ésta práctica se usará una mezcla etanol-éter 2:1. Se aprovechará el hecho de que las lecitinas son
insolubles en acetona para obtener su fácil precipitación. Después de precipitar las lecitinas, quedan en solución
muchas otras clases de lípidos entre los cuales está el colesterol. Se hace entonces una saponificación para
separar la fracción saponificable y quedarse con la insaponificable donde se encuentra el colesterol. Bastará
entonces solubilizarlo bien y agregar agua para precipitarlo, ya que es insoluble en agua. Se precipita en forma
cristalina.

MATERIAL

PRIMERA PARTE SEGUNDA PARTE

1 Matraz Erlenmeyer de 250 ml con tapón Vaso de precipitados de 250 ml


Probeta de 50 o 100 ml Agitador
Embudo 6 tubos de ensayo de 13x10
Vaso de precipitados de 250 ml Pipeta de 5 ml
Vaso de precipitados de 100 ml Probeta de 50 o 100 ml
Vaso de precipitados de 50 ml Baño María
Agitador Embudo
Baño María Gradilla
Mechero, triple y tela de asbesto Mechero, triple y tela de asbesto

PROCEDIMIENTO

OBTENCIÓN DE LECITINA

1. Separe la yema de huevo y vacíela en un Erlenmeyer de 250 ml. Hágalo con cuidado, de preferencia
en el lavatorio, procurando siempre la limpieza. La clara se descarta.
2. Añada 50 ml de alcohol etílico y 25 ml de éter. Tape el Erlenmeyer y agite con cuidado durante dos
minutos, destapando de tiempo a tiempo para desalojar cualquier presión que pudiera desarrollarse.
Deje reposar la mezcla por 10 minutos, agitando suavemente de tiempo en tiempo.
3. Filtre sobre papel Whatman 1 humedecido con etanol y doblado en forma de zigzag.
4. Pase el residuo que quede en el papel filtro a otro Erlenmeyer y añada 10 ml de etanol y 5 ml de éter.
Agite suavemente y deje reposar por 5 minutos.
5. Filtre nuevamente esta última extracción y combine los filtrados. El residuo se descarta.
6. Evapore el filtrado hasta sequedad en baño de agua hirviendo, en un vaso de precipitados lo más
ancho posible. Si usa mechero NO SE ASOME para ver si ya está terminando la evaporación, para
eso use unas pinzas grandes y con ellas saque el matraz y así haga su observación.
7. Disuelva el residuo en 10 ml de éter.
8. Lentamente y con agitación suave vacíe esa solución a un vaso de precipitados que contenga 30 ml
de acetona. Siga agitando con cuidado hasta que las partículas de lecitina cruda precipitada se
adhieran entre sí formando una bolita.
9. Filtre para separar la lecitina y guarde por separado la lecitina y el filtrado para usarlos en las
siguientes partes de la práctica. Si la lecitina formó una bolita más o menos firme, no habrá
necesidad de filtrar, bastará con decantar.

CUESTIONARIO

1. Investigue bibliográficamente las estructuras completas de la Lecitina.


2. Investigue bibliográficamente la estructura de la membrana celular y cómo están en ella los
lípidos que la forman (fosfolípidos, glucolípidos y colesterol).
3. Investigue qué es y cómo se obtiene el éter de petróleo.
4. ¿Cuál es la función de la Acetona en la práctica?
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. David NELSON, Michael COX y Albert LEHNINGER: Principios de bioquímica - Lehninger. Sin lugar:

Editorial Omega, quinta edición.

2. ↑ Saltar a:a b David Rakel: Integrative medicine (capítulo 44: «Cholelithiasis»). Sin lugar: sin editorial

(segunda edición), sin fecha.

3. Ir a↑ Sandra L. Ladd et al. (1993). «Effect of Phosphatidylcholine on Explicit Memory». Clinical


Neuropharmacology 16: p. 540-549.

4. Ir a↑ Mei-Chu Hung, Koji Shibasaki, Riki Yoshida, Masao Sato and Katsumi Imaizumi (2001).
Learning behaviour and cerebral protein kinase C, antioxidant status, lipid composition in

senescence-accelerated mouse: influence of a phosphatidylcholine–vitamin B12 diet. British Journal

of Nutrition, 86, pp 163-171 doi 10.1079/BJN2001391

5. Ir a↑ Chung, Shu-Ying, Tomoe Moriyama, Eiko Uezu, Kayoko Uezu, Rieko Hirata, Noriko Yohena,
Yasnunobu Masuda, Toyohiko Kokubu, and Shigeru Yamamoto: «Administration of
phosphatidylcholine increases brain acetylcholine concentration and improves memory in mice with
dementia», artículo en The Journal of Nutrition, 125: págs. 1484-1489; 1995.

6. Ir a↑ Higgins, Julian; Leon Flicker (21 JAN 2009). «Lecithin for dementia and cognitive impairment.
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PRÁCTICA N° 3: OBTENCIÓN DE COLESTEROL – REACCIÓN DE GUPPERT SALKOWSKI Y


REACCION DE LIEBERMANN BURCHARD (IDENTIFICACIÓN Y VALORACIÓN DE EXTRACTOS
LIPÍDICOS)

Marco Teórico: El colesterol es una sustancia cerosa, de tipo grasosa, que existe naturalmente
en todas las partes del cuerpo. El cuerpo necesita determinada cantidad de colesterol para
funcionar adecuadamente. Pero el exceso de colesterol en la sangre, combinado con otras
sustancias, puede adherirse a las paredes de las arterias. Esto se denomina placa. Las placas
pueden estrechar las arterias o incluso obstruirlas.

Los niveles de colesterol elevados en la sangre pueden aumentar el riesgo de enfermedades


cardíacas. Los niveles de colesterol tienden a aumentar con la edad. El aumento de colesterol no
suele tener signos ni síntomas, pero puede detectarse con un análisis de sangre. Usted tiene
probabilidades de tener un nivel de colesterol alto si tiene antecedentes familiares, sobrepeso o
consume muchas comidas grasosas.

El Colesterol se cristaliza como placas rómbicas blancas. No tiene olor ni sabor. Es


insoluble en agua, ácidos y álcalis. Es muy soluble en éter, acetona, cloroformo y benceno.

COLESTEROL: Es el esteroide más abundante. No se precipita del éter por la acetona, y como es
insaponificable, puede extraerse con éter, después del tratamiento con hidróxido de potasio.

El colesterol, generalmente, cristaliza como placas rómbicas blancas. No tiene olor ni sabor. Si se expone a la
luz y al aire, se oxida lentamente, formando una mezcla de productos que bajan de fusión y cambian sus
reacciones de solubilidad, es insoluble en agua, ácidos y álcalis. Es poco soluble en soluciones jabonosas y
todavía más solubles en soluciones de ácidos biliares. Es muy soluble en éter, benceno, cloroformo, éter de
petróleo, disulfuro de carbono y acetona. Sus principales propiedades químicas se relacionan con su grupo
hidroxilo secundario y su doble ligadura.

PARTE EXPERIMENTAL

OBTENCIÓN DE COLESTEROL

1. Evapore el filtrado de la sección anterior, en baño de agua hirviendo hasta que se haga una pasta (el
residuo no debe oler ni a éter ni a acetona). Enfríe.
2. Añada 15 ml de la solución de potasa alcohólica al 10%. Agite y caliente la solución hasta que se
concentre hasta sequedad. Enfríe.
3. Añada 50 ml de éter y agite bien. Filtre por si hay algún precipitado de jabón.
4. Evapore el filtrado hasta sequedad.
5. Añada 5 ml de alcohol etílico y caliente en baño María por dos minutos. Transfiera la solución a un
tubo de ensayo.
6. Centrifugue por 5 minutos.
7. Transfiera el sobrenadante, después de la centrifugación, a un tubo de ensayo. Este sobrenadante
contiene colesterol en solución. Ahora añada gota a gota, agua destilada a la solución, hasta que no
aparezca más precipitado. Deje reposar por 15 minutos y centrifugue.
8. Descarte el líquido por decantación, (puede centrifugarse el residuo cristalino de colesterol, disolverlo
en 2 ml de alcohol caliente y volver a precipitarlo, añadiendo gota a gota agua. Esto dará un
colesterol un poco más puro). Deje secar los cristales de colesterol.

CUESTIONARIO

1. Investigue bibliográficamente las estructuras completas del Colesterol.


2. ¿Cuál es la función del yeso en la práctica? Y ¿Cuál es su fórmula química?
3. ¿En qué tipo de muestra biológica se obtuvo más Colesterol?

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

7. David NELSON, Michael COX y Albert LEHNINGER: Principios de bioquímica - Lehninger. Sin lugar:

Editorial Omega, quinta edición.

8. ↑ Saltar a:a b David Rakel: Integrative medicine (capítulo 44: «Cholelithiasis»). Sin lugar: sin editorial

(segunda edición), sin fecha.

9. Ir a↑ Sandra L. Ladd et al. (1993). «Effect of Phosphatidylcholine on Explicit Memory». Clinical


Neuropharmacology 16: p. 540-549.

10. Ir a↑ Mei-Chu Hung, Koji Shibasaki, Riki Yoshida, Masao Sato and Katsumi Imaizumi (2001).

Learning behaviour and cerebral protein kinase C, antioxidant status, lipid composition in
senescence-accelerated mouse: influence of a phosphatidylcholine–vitamin B12 diet. British Journal

of Nutrition, 86, pp 163-171 doi 10.1079/BJN2001391

11. Ir a↑ Chung, Shu-Ying, Tomoe Moriyama, Eiko Uezu, Kayoko Uezu, Rieko Hirata, Noriko Yohena,

Yasnunobu Masuda, Toyohiko Kokubu, and Shigeru Yamamoto: «Administration of


phosphatidylcholine increases brain acetylcholine concentration and improves memory in mice with
dementia», artículo en The Journal of Nutrition, 125: págs. 1484-1489; 1995.

12. Ir a↑ Higgins, Julian; Leon Flicker (21 JAN 2009). «Lecithin for dementia and cognitive impairment.
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PRÁCTICA N° 4: IDENTIFICACIÓN Y VALORACIÓN CROMATOGRÁFICA DE


EXTRACTOS LIPÍDICOS
MARCO TEÓRICO

Los lípidos pueden clasificarse en lípidos neutros, como acilgliceroles y esteres de colesterol, y lípidos
anfipáticos, los cuales están compuestos por una porción polar y otra no polar, como fosfolípidos y colesterol
libre. Dada su estructura molecular, son sustancias poco solubles en solventes polares, lo que permite aislarlos
de los tejidos fácilmente utilizando solventes orgánicos.

Para separar los lípidos de una muestra se utilizan habitualmente técnicas cromatografías, como la TLC o
cromatografía en capa delgada. La misma puede realizarse en forma monodimensional o bidimensional,
dependiendo de la naturaleza del compuesto a separar. Para separar fosfolípidos individuales se utiliza la
cromatografía bidimensional en placas de sílica gel 60 en soporte de vidrio, utilizando como solvente de corrida
una mezcla de solventes orgánicos alcalinos en la primer dimensión y una mezcla a pH acido en la segunda,
distinguiéndose bandas correspondientes a fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol,
fosfatidilserina, ácido fosfatídico, etc.

La cromatografía monodimensional en palca de sílica gel 60 se utiliza en cambio para la separación de


acilgliceroles, pudiéndose identificar bandas correspondientes a monoacilglicerol, 1,2 diacilglicerol, 1,3
diacilglicerol y triacilglicerol. Para la identificación de los compuestos en ambas técnicas se utilizan patrones
conocidos y se revelan mediante la exposición de las placas a vapores de iodo (I2), los cuales colorean las
distintas bandas permitiendo su visualización.

FUNDAMENTO DE LA PRÁCTICA

El fundamento de cualquier tipo de cromatografía es la separación de los componentes de mezclas en base a


la diferencia de propiedades físicas de aquéllos. Son técnicas analíticas de separación de materiales que utilizan
la distribución de las sustancias entre dos fases, una móvil y otra estacionaria. La primera, también conocida
como eluyente, de naturaleza líquida o gaseosa tiene como misión arrastrar las sustancias a través de la fase
fija. En la estacionaria o fija se verifica la separación de la mezcla.

Según la naturaleza de las dos fases se puede hablar de diversos tipos de cromatografía: cromatografía en
papel, en capa fina, líquido-líquido, gaseosa, de filtración en gel, líquida de alta presión o HPLC (High-Pressure
Liquid Chromatography), de intercambio iónico, de afinidad, etc.

COMPETENCIA

En este método se utilizan como soporte placas de vidrio, plástico, aluminio, etc. en las que se deposita una
fina capa de adsorbente (gel de sílice, almidón, polvo de celulosa, etc.) cuyo espesor puede ajustarse a
conveniencia. En el mercado se encuentran disponibles ya fabricadas placas comerciales.
A la altura de 1,5 cm (aproximadamente) de una de las bases se marca débilmente con un lápiz fino una línea
teniendo cuidado de no romper la capa adsorbente. Esta línea servirá de base para situar las muestras a
analizar. Con una micropipeta de vaciado automático se depositan 5 µl sobre un punto o varios en la línea de
base (línea de aplicación) teniendo siempre cuidado de no tocar la placa con la punta de la pipeta para no
dañarla.

Tras aplicación de la muestra, se deja secar a temperatura ambiente o con ayuda de un pequeño secador. A
continuación la placa se introduce en una cubeta que contiene el disolvente de desarrollo adecuado en cada
caso, cuyo nivel no debe nunca llegar a la línea de siembra. Su ascenso por capilaridad produce el efecto
cromatográfico. Si se realizan dos desarrollos consecutivos con eluyentes apropiados en cada caso, se habla
de cromatografía bidimensional.

Las sustancias se visualizan en la placa una vez desarrollada mediante su color, absorción ultravioleta o
revelado específico que produce una reacción coloreada. Para su cuantificación, se raspa la parte donde se
ubique el componente que se quiere medir, se extrae con los disolventes adecuados y se analiza según el
método empleado.

La diversidad de adsorbentes (ver anteriormente) y eluyentes disponibles, permiten que esta técnica sea de
utilidad para separar e identificar un amplio repertorio de biomoléculas: aminoácidos, hidratos de carbono,
lípidos, proteínas, etc.

Una vez revelada la placa se puede establecer un coeficiente de relación entre la distancia alcanzada por el
frente y la distancia alcanzada por una sustancia específica, a esta relación se conoce con el nombre de Rf (Rf
= distancia de la sustancia/frente de la fase móvil).

MATERIALES Y EQUIPOS:

 Baño María
 Placas de vidrio recubiertas con gel de sílice activado (20 x 20 cm).
 Cámaras de cromatografía.
 Cámaras secadoras.
 Cámara de revelado con vapor de yodo.
 Estufa de desecación (40 – 200º C)
 Pipetas de 1 – 5 ml.
 Micropipetas o pipetas de pistón.
 Vasos de precipitado.

REACTIVOS:
 Agua destilada.
 Solventes orgánicos.
 Suero sanguíneo.

PROCEDIMIENTO:
Extracción de los lípidos de la muestra biológica

1. Se toma 1 ml de suero.

2. Se agregan 2 ml de una mezcla cloroformo-metanol (2:1)

3. Se pone la muestra en un baño termostatizado a 50ºC durante 30 min.

4. Se enfría y dejan separar las fases.


5. Se centrifuga a 3000 rpm durante 10 min y se separa la fase clorofórmica, pasándola a un tubo de vidrio
hasta su total desecación en un baño o corriente de aire.

Aplicación y desarrollo cromatográfico


1. Se reextrae el extracto seco con 0.5 ml de cloroformo.

2. Se indica en la placa de vidrio con gel de sílice la línea de aplicación u origen, siempre por encima de la
mezcla del eluyente presente en la cámara separadora.

3. Se aplican las muestras en volúmenes de 5, 10 y 20 µL y se colocan controles en igual cantidad.

4. Se introduce la placa en la cámara separadora conteniendo el solvente adecuado.

5. Se deja desarrollar la placa hasta que la línea de frente del solvente haya recorrido 13–15 cm desde la línea
de aplicación.

Revelado cromatográfico
1. Se introduce la placa, una vez finalizado el desarrollo de la muestra, en una cámara saturada de vapores de
yodo.

2. Se compara el desarrollo de las muestras con el de los controles y tablas.

RESULTADOS
Tras pocos minutos de exposición al sublimado de yodo, aparecen una serie de fracciones o manchas cuya
intensidad y superficie varía con la cantidad de muestra aplicada. El raspado de estas manchas y su
correspondiente extracción con solventes apropiados permitirá la medición cuantitativa de las diferentes
fracciones, menester que puede conseguirse mediante procedimientos espectrofotométricos o con sistemas
tales como la cromatografía gaseosa y HPLC.

El desarrollo cromatográfico de estas muestras proporcionará las fracciones que se muestran


esquemáticamente en las figuras A (lípidos neutros) y B (fosfolípidos).

CONCLUSIONES
A partir de las dos corridas en sílica gel se logrará separar los lípidos constituyentes de la muestra incógnita.
Los lípidos neutros serán separados por cromatografía en capa fina (TLC) monodimensional mientras que para
los fosfolípidos se empleará TLC bidimensional.

Las técnicas que se aplican en este trabajo no pueden ser utilizadas para determinar la concentración de las
sustancias presentes. Para este fin pueden utilizarse técnicas colorimétricas.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1.-González de Buitrago JM (1985): Cromatografía. En González de Buitrago JM (eds): “Técnicas de
Laboratorio Clínico”, 1ª Ed. Editorial Alambra (Madrid, España), pp. 128 – 141.
Disponible en: www4.ujaen.es/~mjayora/docencia_archivos/.../Tema6.pdf

2.-González de Buitrago JM (1998): Osmometría. Cromatografía. Electroforesis. Técnicas electroquímicas. .


En González de Buitrago JM, Arilla E, Rodríguez Segade M, Sánchez A (eds): “Bioquímica Clínica”, 1ª Ed.
Editorial McGraw-Hill Interamericana (Madrid, España), pp. 17-27 Disponible en:
https://www.congresoaep.org/2012/readcontents.php?file.../04...pdf

3.-Lozano J (1988): Cromatografía. En: Lozano JA, Tudelo J (eds): “Prácticas de Bioquímica. Experimentación
y Simulación”, 1ª ed. Editorial Síntesis (Madrid,España), pp. 25 – 35.

CUESTIONARIO

1.-Dar un concepto de Cromatografía

2.-Qué técnicas de Cromatografía conoce?

3.-Mencione las ventajas y desventajas que puede encontrar con el HPLC.

4.- De qué están constituidos los solventes orgánicos (eluyentes) utilizados según el tipo de lípidos a separar.
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LABORATORIO DE BIOQUÍMICA III

PRÁCTICA Nº5: DETECCIÓN DE HORMONAS - TEST DE


EMBARAZO

MARCO TEORICO

El sistema endocrino es un conjunto de órganos y tejidos del organismo que liberan un tipo de sustancias
llamado hormonas. Los órganos endocrinos también se denominan glándulas in conducto, debido a que sus
secresiones se liberan directamente en el torrente sanguíneo, mientras que las glándulas exocrinas liberan sus
secreciones sobre la superficie interna o externa de los tejidos cutáneos, la mucosa del estómago o el
revestimiento de los conductos pancreáticos.

Las hormonas secretadas por las glándulas endocrinas regulan el crecimiento, desarrollo y las funciones de
muchos tejidos, y coordinan los procesos metabólicos del organismo. La endocrinología es la ciencia que
estudia las glándulas endocrinas, las sustancias hormonales que producen estas glándulas endocrinas, sus
efectos fisiológicos, asi como las enfermedades y transtornos debidos a alteraciones de su función.

También hay hormonas que actúan sobre la misma célula que las sintetiza (autocrinas). Hay algunas hormonas
animales y hormonas vegetales como las auxinas, ácido abscísico, citoquinina, giberelina y el etileno.

Son transportadas por vía sanguínea o por el espacio intersticial, solas (biodisponibles) o asociadas a ciertas
proteínas (que extienden su vida media al protegerlas de la degradación) y hacen su efecto en determinados
órganos o tejidos diana (o blanco) a distancia de donde se sintetizaron, sobre la misma célula que la sintetiza
(acción autocrina) o sobre células contiguas (acción paracrina) interviniendo en la comunicación celular.

Fundamento Teórico:

Los análisis básicos para detectar compuestos químicos en materiales biológicos son tres: biológicos,
fisicoquímicos y de unión. Los análisis o técnicas de unión se han definido como aquellos que utilizan moléculas
que se enlazan específica y reversiblemente a las sustancias que interesen detectar o cuantificar. Estas técnicas
se utilizan frecuentemente para cuantificar moléculas que están presentes en fluidos biológicos, en
concentración de nano gramos por mililitro (10-9 g/mL) o de pico gramos por mililitro (10-12 g/mL).

En la actualidad, mediante las técnicas de unión se realizan cotidianamente la detección de hormonas que se
encuentran en cantidades muy pequeñas en fluidos biológicos. Son varias las técnicas de unión, algunas de
éstas son: los inmunoanálisis, el ensayo de enlace competitivo con proteína transportadora y el ensayo de unión
con receptor.
COMPETENCIA

La primera prueba "moderna" para el embarazo detecta la inhibición del factor de preñez temprana (EPF, en
inglés). El EPF se puede detectar en la sangre en las 48 horas siguientes a la fertilización. Sin embargo, las
pruebas del EPF son caras y toman mucho tiempo.

La mayor parte de las pruebas químicas buscan la presencia de la subunidad beta de la gonadotropina coriónica
humana (hCG) en la sangre o en la orina. El hCG se puede detectar en la orina o la sangre después de la
implantación del producto en la matriz, que ocurre de seis a doce días después de la fertilización. Los métodos
cuantitativos (suero beta) pueden detectar niveles de hCG tan pequeños como 1 mIU/mL, mientras que las
pruebas de orina requieren de 20 a 100 mIU/mL, según la marca. Las pruebas cualitativas de sangre
generalmente tienen un umbral de 25 mIU/mL, así que tienen menor sensibilidad que algunas pruebas de orina
caseras.

Existen signos positivos, probables e hipotéticos de embarazo, pero sólo los positivos confirman con certeza la
existencia de un embarazo. La determinación de HCG es un método hipotético, ya que puede ser positiva aun
en ausencia de embarazo. Sin embargo, de todos los métodos disponibles en la actualidad es el que permite la
detección más temprana y es la base de los rápidos test inmunitarios actuales.

PROCEDIMIENTO

1.-Se recolecta la muestra de orina de una mujer (no gestante)

2.-Se recolecta la muestra de orina de otra mujer (gestante).

3.-Ambas muestras se llevan en los recipientes. Colocar en forma vertical las tiras reactivas en cada recipiente
por el espacio de 30 segundos. Notar las líneas formadas.

4.-Observar si hay una línea (el resultado sería negativo) si hay dos líneas (el resultado sería positivo)

RESULTADO

Prueba de embarazo, por medio de la orina, con resultado negativo

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. ↑ [MedlinePlus] (octubre de 2008). «Prueba de embarazo» (en español). Enciclopedia médica en

español. Consultado el 17 de enero de 2010.

2. Ir a↑ Clark, Stephanie Brown. (2005). Jan Steen: The Doctor's Visit. Literature, Arts, and Medicine

Database. Último acceso 27 May 2007.

3. Ir a↑ Ariel Iván Ruiz Parra. HISTORIA DE LA GINECOLOGÍA Y OBSTETRICIA (en español). Revista

Colombiana de Obstetricia y Ginecología Vol. 55 No.2; 2004, (pág 167-173).

4. Ir a↑ Fan XG, Zheng ZQ (1997). «A study of early pregnancy factor activity in preimplantation». Am. J.
Reprod. Immunol. 37 (5): pp. 359-64. PMID 9196793.

5. ↑ Saltar a:a b Wilcox AJ, Baird DD, Weinberg CR (1999). «Time of implantation of the conceptus and loss of
pregnancy.». New England Journal of Medicine 340 (23): pp. 1796-1799. PMID 10362823.

6. Ir a↑ Waddell, Rebecca Smith (2006). «FertilityPlus.org». Home Pregnancy Test hCG Levels and FAQ.

Consultado el 17-06-2006.

7. ↑ Saltar a: a b Woo, Joseph (2006). «Why and when is ultrasound used in pregnancy?». Obstetric

Ultrasound: A Comprehensive Guide. Consultado el 27-05-2007.

8. ↑ Saltar a: a b Boschert, Sherry (2001-06-15). «Anxious Patients Often Want Very Early Ultrasound
Exam». OB/GYN News (FindArticles.com).

9. Ir a↑ Weschler, Toni (2002). Taking Charge of Your Fertility (Revised Edition). New York:

HarperCollins. pp. 374. ISBN 0-06-093764-5.

10. Ir a↑ Ellington, Joanna (2004). «Sperm Transport to the Fallopian Tubes». Frequently Asked

Questions with Dr. E. INGfertility Inc. Consultado el 13-08-2006.

11. Ir a↑ Phillips, Pat (2007). «Early Pregnancy Tests». Pregnancy Test FAQ. Consultado el 04-03-2007.

CUESTIONARIO

1.-Defina qué es hormona. Mencione sus funciones e importancia. 2.- ¿En

qué casos pueden dar resultados falsos positivos?

3.-Dar ejemplos de hormonas y ¿Qué técnicas de laboratorio utilizaría?


FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA III

PRÁCTICA Nº6: EXTRACCIÓN DE ADN EN TEJIDO ANIMAL

INTRODUCCION

El ácido desoxiribonucleico o ADN (DNA) es la molécula que guarda el código genético de todas las células.
Sin importar que el organismo sea multicelular o unicelular, eucariota o procariota, todos tienen el DNA
como vehículo de su código genético.

Durante el laboratorio de hoy estaremos utilizando un método rápido para aislar DNA a partir de tejidos
animales.

El primer paso en la purificación del DNA consiste en homogeneizar las células y distar los núcleos de los
cuales se extrae el DNA. El medio de extracción de ordinario contiene un detergente, que sirve para lisar los
núcleos y liberar el DNA, hecho que aumenta notablemente la viscosidad de la solución. El detergente
inhibe también cualquier actividad nucleasa en la preparación.

El objetivo de los pasos de purificación es separar el DNA de materiales contaminantes, como RNA y
proteínas.

La desproteinización se logra en general agitando la mezcla con un volumen de fenol. El fenol (o


alternativamente cloroformo) es un desnaturalizador activo de proteínas que suprime la solubilidad de las
proteínas en la preparación y las precipita. Puesto que el fenol y la solución salina amortiguadora no se
mezclan, solo se requiere centrifugar la suspensión para separar las bases, permaneciendo el DNA (y el
RNA) en la solución dentro de la fase acuosa de arriba y la proteína presente como un precipitado
concentrado en la interfase. La fase acuosa se retira del tubo y se somete a ciclos repetidos de agitación
con fenol y centrifugación hasta agotar toda la proteína de la solución. Añadiendo etanol frío. El etanol frío
forma una capa arriba de la solución acuosa del DNA, el cual, se enrolla sobre una varilla de vidrio conforme
sale de la solución. En la interfase el RNA sale de la solución salina.

En contraste, el RNA sale de la solución como precipitados que se asienta en el fondo del vaso. Luego de
este primer paso de purificación, se disuelve el DNA y se trata con ribonucleasa mediante tratamiento con
una proteasa. Enseguida se quita la proteasa por desproteinización con fenol y se vuelve a precipitar el
DNA.

La electroforesis es una de las técnicas más empleada en bioquímica y biología molecular, usada para
separar y a veces purificar macromoléculas, especialmente proteínas y ácidos nucleicos, que difieren en
tamaño, carga o conformación. Cuando las moléculas cargadas son sometidas a un campo eléctrico, migran
hacia el polo positivo (ánodo) como es el caso de los ácidos nucleicos o negativo (cátodo) de acuerdo a sus
cargas.

Los fragmentos de ADN lineal migran a través del gel de agarosa con una movilidad inversamente
proporcional al log10 de su masa molecular, situándose los más pequeños más cerca del polo positivo,
adoptando una apariencia similar a un código de barras. Cada barra contiene un fragmento de ADN de un
tamaño determinado más o menos cada 23 pares de bases. Entre los diferentes factores que afectan la
movilidad de los fragmentos de ADN en el gel de agarosa que pueden optimizarse para la separación de los
fragmentos está la concentración de agarosa.

La mayoría de los estudios de electroforesis son para comparar una secuencia conocida como el ADN
plásmido con una no conocida; El ADN plasmidico presenta tres líneas, circular abierta - lineal - circular
covalente cerrado.
EXTRACCION DE ADN EN TEJIDO ANIMAL

FUNDAMENTO
El ADN se encuentra en el interior del tejido celular, disperso y muy plegado, unido a proteínas para
formar la cromatina. Para extraerlo es necesario homogenizar el tejido y romper las células para
separar el núcleo, romper esta para liberar el ADN,
separarlo de las proteínas y precipitarlo para
extraerlo de la solución. Aparecerá como un
agregado de fibras blanquecinas que se
adhieren a la varilla de vidrio. Por último, se
puede situar sobre una porta, teñirlo con un
colorante básico y observarlo al microscopio.

OBJETIVO
En esta práctica realizaremos la extracción de
ADN de células animales poniendo de
manifiesto su estructura fibrilar y el grado de
arrollamiento que permite el empaquetamiento
en el núcleo celular. Tras la extracción se
realizara una tinción del ADN obtenido.

MATERIALES

- Tejido animal ( hígado)


- Papel de filtro
- Pipeta
- Alcohol 96°
- Mortero
- Arena fina
- Varilla de vidrio
- Embudo
- Probeta
- Vaso precipitados
- Espátula
- Termómetro
- Balanza

REACTIVOS

- Edeta
- Cloruro de Sodio 1%

PARTE EXPERIMENTAL

1. Pesar el hígado aproximadamente 2gr, Triturar la muestra de hígado, en el mortero junto con
arena (la arena favorece la ruptura de membranas).
2. Colocar en un vaso precipitado lo triturado y añadir unos 30 ml de agua destilada y remover
suavemente pero mezclando a fondo.

3. Medir el volumen del filtrado final con una probeta. Añadir al filtrado un volumen igual de
cloruro sódico 1%. Con esto conseguimos producir el estallido de los núcleos para que
queden libres las fibras de cromatina. Verterlo todo en un vaso de precipitado.

4. Se coloca en una cadena de frio para bajar la temperatura de la muestra de 4 a 10°C, y se le


adicionara a la muestra 1ml de EDETA (interviene en la separación del ADN).
5. Después de haber obtenido la muestra se procederá a guardar a una temperatura de 4 a
15°C.

CONCLUSIONES

 Se utiliza la arena en este procedimiento porque rompe muchas células liberando su


contenido.

 En conclusión, puedo decir que con la realización de esta práctica se cumplió con los
objetivos, ya que se extrajo DNA y RNA de tejidos animales y lo identificarlos como tales.

 También utilizamos unas sencillas técnicas para poder extraer el ADN de un producto
natural. Y observar la estructura del ADN.

 La cadena de frio sirve para que se pueda separar bien el ADN de los demás componentes
y así poder obtener el puro ADN que nos interesa estudiar

 Porque la solución forma complejos con los lípidos y las proteínas, permitiendo que los
mismos sean separados del ADN por filtración. Así se libera el ADN. La sal permite que el
ADN precipite en una solución fría de alcohol y que las cadenas de ADN no se corten.

BIBLIOGRAFIA

 http://www.educ.ar/educar/tecnologia-del-adn-recombinante.html

 http://www.geneticaycancer.es/doc.phpop=molecular&ap=tecnicas_molecular&id=8
 cienciainteractiva.wordpress.com/.../extraccion-del-adn-de-higaditos-de-

 bioquimicacetis110.blogspot.com/2012/05/analisis-de-dna.html
FACULTAD DE CIENCI AS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA III

PRÁCTICA N ° 7: CUANTIFICACIÓN DE ÚREA

Reactivo para determinación enzimática de urea en suero, plasma y otros fluidos biológicos.
Para uso en el diagnostico in Vitro
SIGNIFICANCIA CLÍNICA
La urea es el producto final mayoritario del metabolismo del nitrógeno proteico en los seres humanos. Constituye
la fracción más abundante del nitrógeno no proteico. La urea se produce en el hígado y es excretada por la
orina. Su elevación es producto de trastornos en la función renal o hepática, problemas diabéticos, diabetes y
otros.
FUNDAMENTOS DEL MÉTODO
La urea presenta en la muestra, es desdoblada a amonio por acción de la enzima ureasa, según la proposición
de Faucet y Scott

UREA-S
(NH2)2CO + 2H2O 2NH3 + CO2
H2O
El amonio producido reacciona con salicilato e hipoclorito en ambiente alcalino, formándose un complejo de
color verde. La intensidad del color producido es directamente proporcional a la cantidad de urea presente en la
muestra, y su absorbancia se lee a 600nm.
REACTIVOS
Conservados entre 2° y 8°C y protegidos de la luz, estables hasta le fecha de caducidad indicada en cada
etiqueta.
 Suspensión de Ureasa
Ureasa
Estabilizantes y preservantes no reactivos
 Reactivo Salicilato
Acido Salicilico
Nitroprusito
 Reactivo Hipoclorito
Hipoclorito
NaOH
 Solución Standard
Urea
Equivalente Nitrógeno Ureico
Estabilizantes y preservantes no reactivos

MUESTRAS
Suero, plasma u orina diluida 1:100. El plasma debe obtenerse utilizando anticoagulantes libres de amonio. No
utilizar fluoruro pues inhibe la acción de la enzima ureasa. La urea es estable en el suero por a los menos 24
horas a temperatura ambiente, varios días entre 2° y 8°C más de seis meses a -20°C.
EQUIPO REQUERIDO
Espectrofotómetro o fotocolorímetro de filtros capaz de leer absorbancia a 600nm. (Rango 580 a 620 nm),
cronometro, pipetas y opcionalmente baño termorregulador a 37°C.
TECNICA
PREPARACION DEL REACTIVO DE TRABAJO
Mezclar 1ml. de Reactivo Salicilato con 50 ul de suspensión de Ureasa, o preparar el volumen requerido
manteniendo la proporción. (i.e. 30 ml. Reactivo Salicilato + 1,5 ml suspensión ureasa). Almacenar el reactivo de
trabajo es estable por 20 días almacenado entre 2° y 8°C y protegido de la luz.
Blanco Standard Desconocido
Muestra (ml) --- --- 0.01
Standard (ml) --- 0.01 ---
Reactivo de Trabajo (ml) 1.00 1.00 1.00
Incubar 5 minutos a temperatura ambiente (20° a 25°C), o 3 minutos a 37°C. Agregar a cada tubo:
Reactivo hipoclorito (ml) 1.00 1.00 1.00
Mezclar e incubar 10 minutos a temperatura ambiente (20° a 25*C) o 5 minutos a 37°C. Leer las absorbancias
dentro del plazo de una hora
Adaptaciones para la utilización de este reactivo en autoanalizadores están disponibles a solicitud. Es
responsabilidad del laboratorio validar esta aplicación.

Cálculos

FACTOR= 66
Absorbancia Standard

Urea (mg/dl) = Factor x Absorbancia desconocido

ADVERTENCIA:
 Es conveniente analizar junto con las muestras sueros controles valorados.
 La calibración con el Standard acuoso puede dar lugar a errores sistemáticos en métodos automáticos.
En este caso, se recomienda utilizar un calibrador sérico .
 Para expresar los valores obtenidos como nitrógeno ureico (mg/dl), multiplicar el valor obtenido por
0.455.
 Los volúmenes de reacción pueden ser modificados proporcionalmente sin alteración en los resultados.

ESPECIFICACIONES DE DESEMPEÑO:
 Linealidad: Hasta 300 mg/dl.
Para valores superiores a 300 mg/dl, diluir la muestra con suero fisiológico y el resultado obtenido se
multiplica por el factor de dilución.
 Límite de detección: 1,3 mg/dl
 Interferencias: Hemoglobina sobre 0,2 gr/dl, bilirrubina sobre 20 mg/dl y la lipemia (triglicéridos sobre
100 mg/dl) podrían interferir en la técnica. Otros medicamentos y sustancias podrían interferir.
 Exactitud. Un reactivo no debe mostrar diferencias sistemáticas significativas cuando se comparan con
otros reactivos. Repetibilidad intraserie: n=20

Nivel Media (mg/dl) C.V


Normal 41,4 0.92%
Patológico 143 0,26%

Reproducibilidad interserie: n=20


Nivel Media(mg/dl) C.V.
Normal 26,75 3,23%
Patológico 70,82 2,77%
Estos datos han sido obtenidos utilizando un autoanalizador. Los resultados pueden variar al cambiar de
instrumento o al realizar el procedimiento manualmente.
 Certificado de conformidad y trazabilidad disponible a solicitud

Rangos de referencia
 Suero o plasma:
Urea: 10 a 50 mg/dl
Nitrógeno Ureico: 4.5 a 22.7 mg/dl
 Orina:
Urea: 15 a 30 g/24 hrs.
Nitrógeno Ureico: 7 a 14 g/24 hrs.

BIBLIOGRAFIA
1. Berthelot, N.P.E., Repertoire de Chemie Applique 1(284), 1959.
2. Fawcet, J.K. & Scott, J.E., J. Clin. Path
3. Chaney. A.L. & Marbach. C.P., Clin.Chem. 8(130), 1962.
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4. Young D.S., effects of drugs on clinical laboratory tests, 4 ed. AACC Press, 1995.