Revista EIA, ISSN 1794-1237 Número 7, p. 137-144.

Junio 2007
Escuela de Ingeniería de Antioquia, Medellín (Colombia)

PRODUCCIÓN DE BIOMASA Y
EXOPOLISACÁRIDOS DE Grifola frondosa
BAJO CULTIVO SUMERGIDO UTILIZANDO
FUENTES DE CARBONO NO
CONVENCIONALES

Paola Zapata1, Diego Rojas1

Carlos Fernández2, David Ramírez3
Gloria Restrepo4, Viviana Orjuela4
Marcela Arroyave4, Tatiana Gómez4
Lucía Atehortúa5

Resumen

Grifola frondosa es un hongo Basidiomycete comestible y medicinal que produce polisacáridos tipo
glucanos (β-1,6 y β-1,3) con actividad antitumoral e inmunomoduladora. Para el presente trabajo, el objetivo
fue evaluar la incidencia de diferentes fuentes de carbono (FC) en la producción de biomasa y exopolisacári-
dos (EPS), bajo condiciones de cultivo sumergido, utilizando un diseño estadístico factorial con dos factores:
fuente de carbono (FC(1-7)) y medio (MB y MS). La máxima producción de biomasa micelial (21,10 ± 0,82)
g/l y la máxima producción de EPS (6,53 ± 0,14) g/l se logró utilizando el medio MB suplementado con FC4.

1
Laboratorio de Biotecnología y Biotecnología Vegetal, Universidad de Antioquia. Medellín.
1
Químico Farmacéutico, Universidad de Antioquia. MSc en Biología. Grupo de Biotecnología, Universidad de Antio-
quia. paozapata@gmail.com, diferova@gmail.com.
2
Licenciado en Educación, MSc. Departamento de Ciencias Básicas, Escuela de Ingeniería de Antioquia.
pfcafer@eia.edu.co
3
Estudiante de Bioingeniería, Laboratorio de Biotecnología, Universidad de Antioquia. darax83@gmail.com
4
Estudiantes de Química Farmacéutica, Universidad de Antioquia. Grupo de Biotecnología, Universidad de Antioquia.
glorico85@gmail.com, viviorjuelav84@yahoo.es, marcearroyave@hotmail.com, tatigomez22@hotmail.com
5
Bióloga, MSc. PhD, Coordinadora Grupo de Biotecnología, Universidad de Antioquia. latehor@yahoo.es.

Artículo recibido 20-IX-2006. Aprobado 16-VI-2007

Discusión abierta hasta diciembre de 2007
 Producción de biomasa y exopolisacáridos de Grifola frondosa bajo cultivo sumergido...

Además de lo anterior, se logró desarrollar un medio de cultivo que cumple con el objetivo de disminuir
costos, de Col $18.455 a $656 por litro de medio, produciendo (14,14 ± 0,82) g/l de biomasa y (5,16 ± 0,14)
g/l de EPS, utilizando el medio MS suplementando con FC4. Estos resultados abren nuevas alternativas y
posibilidades en nuestro país para el desarrollo de productos a partir de esta especie con costos que estén
al alcance de la población.

PALABRAS CLAVE: hongo medicinal; bioprocesos; biomasa micelial; bioactivos.

Abstract

Grifola frondosa is a Basidiomycete fungus edible and medicinal, it produces polysaccharides such a
glucans (β-1,6 and β-1,3) with anti-tumor and inmuno-stimulating activity. For this work, the aim was evalu-
ate the incidence of different carbon sources (FC) in biomass and exo-polymer (EPS) production, under
submerged culture conditions, by using a factorial statistical design with two factors: carbon source (FC(1-7))
and medium (MB and MS). The maximal yield of mycelial biomass (21,10 ± 0,82) g/l and the maximal yield in
EPS (6,53 ± 0,14) g/l was achieved by using the MB medium supplemented with FC4. Besides, it was possible
to develop a medium that fulfills the objective of reducing costs from $18.455 to $656 Colombian pesos for
each liter of medium used, which produces (14,14 ± 0,82) g/l of biomass and (5,16 ± 0,14) g/l of EPS, using
the MS medium supplemented with FC4. This result opens new alternatives and possibilities in our country
for developing products of this species with cost that can be reached by population.

KEYWORDS: medicinal mushroom; bioprocess; mycelial biomass; bioactives.

hipoglicemiante, hipocolesterolemiante y antiinfla-

INTRODUCCIÓN
Grifola frondosa es un hongo Basidiomyicete,
del orden Aphyllopherales de la familia Polyporaceae
(Lee et al., 2003); crece en las montañas del noroeste
de Japón, en Norteamérica y Europa, donde tra-
dicionalmente se le atribuyen un gran número de
propiedades y efectos benéficos para la salud (Hsieh
et al., 2006).
matorio (Smith et al., 2002). Actualmente a partir
de la biomasa micelial o del cuerpo fructífero se
producen polvos, infusiones, jarabes y cápsulas
(Hsieh et al., 2006) como suplemento dietario para la
prevención y tratamiento de algunas enfermedades
como infecciones comunes, VIH, diabetes mellitus,
hipertensión, hipercolesterolemia e infecciones del
tracto urinario (Smith et al., 2002).

Este hongo es mundialmente reconocido y Por lo anterior, está en aumento la demanda

valorado, debido a que su cuerpo fructífero y bio-
masa micelial poseen alto valor, tanto nutricional
como medicinal. Se caracteriza por su alto conte­
nido de polisacáridos tipo glucanos β-1,6 y β-1,3,
que poseen actividad antitumoral e inmunomodu-
ladora (Matsui et al., 2001) y por contener péptidos
con actividad inhibitoria de la enzima convertidora
de angiotensina I (Choi et al., 2001). Además otras
actividades biológicas reportadas son: antioxidante,
de cuerpos fructíferos y productos de G. frondosa,
que los sistemas convencionales de cultivo no tienen
la capacidad de cubrir, porque estos sistemas tienen
grandes desventajas: el largo tiempo de obtención
de productos de interés (4-6 meses), la dificultad
para garantizar la esterilidad de los procesos, la he-
terogeneidad de productos y la imposibilidad para
controlar las variables y condiciones de cultivo (Cui
et al., 2006).

138 Revista EIA

 Debido a esto, las investigaciones están enca-
minadas a la búsqueda de alternativas que permitan
la producción de biomasa y bioactivos, de forma rápi-
da, económica y confiable, y de esta manera brindar
solución a los problemas que presenta la producción
convencional. Una de esas alternativas es el cultivo
sumergido, que posee notables ventajas frente a los
sistemas convencionales, entre las cuales se distin-
guen el control y seguimiento de las condiciones de
cultivo (temperatura, pH, agitación, concentración
de nutrientes, esterilidad), disminución del tiempo
para la obtención de biomasa y bioactivos (9-14 días),
y la reducción de costos de obtención, separación y
purificación de los metabolitos de interés (Lee et al.,
2004); por estas razones el sistema ha tomado auge
para la obtención de biomasa micelial y sus produc-
tos, permitiendo la producción en gran escala por
medio de biorreactores, procesos de escalamiento
y optimización de procesos.
Una preocupación constante para la utiliza-
ción de cultivos sumergidos, principalmente en los
países del Tercer Mundo, es el alto costo de los pro-
cesos en gran escala. Un punto clave para comenzar
a subsanar este problema es formular y reformular
nuevos medios de cultivo en vez de utilizar medios
ya publicados por otros autores, los cuales se han
convertido en la primera elección. Es el caso de la
producción de biomasa a partir de hongos medicina-
les, en la cual las fuentes de carbono más utilizadas
son glucosa, maltosa, galactosa y lactosa (Cui et al.,
2006; Hsieh et al., 2006; Lee et al., 2004), que incre-
mentan los costos de obtención de biomasa micelial
y de bioactivos.
El objetivo en el presente trabajo fue evaluar
la incidencia de diferentes fuentes de carbono (FC)
no convencionales de bajo costo, en la producción
de biomasa micelial y exopolisacáridos (EPS) de G.
frondosa, bajo condiciones de cultivo sumergido.
También se buscó la implementación de un protocolo
de cultivo eficiente para la producción de biomasa
a escala de laboratorio, con medios de cultivo eco-
nómicos y de fácil adquisición.
Escuela de Ingeniería de Antioquia
MATERIALES Y MÉTODOS
Mantenimiento de la cepa y
precultivos
La cepa de Grifola frondosa fue conservada
en agar papa dextrosa (PDA) (Merck), incubada a
26 °C por 10 días y almacenada a 4° C. Luego se
utilizaron inóculos de 1 cm de diámetro de micelio
y agar para preparar los medios de precultivo (g/l):
sacarosa, 60; KH2PO4, 2,97; peptona (Merck), 6,58;
MgSO4.7H2O (Merck), 1; licor de maíz (Sigma), 15
(Cui et al., 2006); con un pH de 5,5 ± 0,1 e incubados
a 100 r. p. m., 7 días a 26 °C.
Preparación del medio de cultivo y
condiciones de cultivo
Se inocularon matraces de 250 ml (volumen
de trabajo: 60 ml) con 2,0 ml de precultivo de G.
frondosa. Los medios evaluados fueron (g/l): medio
de sales (MS): KH2PO4 (Merck), 2,97; MgSO4.7H2O
(Merck), 1; y medio básico (MB): MS más peptona,
6,48 y licor de maíz, 15 (Cui et al., 2006); ambos me-
dios suplementados con 30 g/l de una de las fuentes
de carbono FC1, FC2, FC3, FC4, FC5 o FC7.
Condiciones operativas de cultivo
Las condiciones de cultivo para todos los
ensayos fueron: pH inicial del medio 5,5 ± 0,01,
agitación constante a 100 r. p. m. (agitador orbital
Alvel), temperatura de (26 ± 1) °C por 10 días de
incubación a 1.700 luxes.
Determinación de biomasa
La determinación de biomasa micelial se lle-
vó a cabo por el método del peso seco; la biomasa
total obtenida de cada matraz fue filtrada y lavada
con abundante agua desionizada y, finalmente,
llevada a un horno de secado a 105 °C, hasta peso
constante.
139
 Producción de biomasa y exopolisacáridos de Grifola frondosa bajo cultivo sumergido...
Cuantificación de exopolisacáridos
En la determinación de EPS, se removió el
micelio por filtración y al líquido se le adicionó eta-
nol al 95% (v/v) a 4 ºC para precipitar los EPS (Tang
y Zhong, 2002), con una posterior centrifugación a
2.400 r. p. m. durante 15 minutos. Los componentes
insolubles fueron suspendidos en hidróxido de sodio
(Merck), NaOH 1M a 60 °C durante 1 hora, y el sobre-
nadante fue cuantificado por el método fenol-ácido
sulfúrico (FAS) (Dubois et al., 1956).
Análisis de resultados
Con base en la literatura consultada y experi-
mentaciones previas realizadas en el laboratorio, el
diseño propuesto fue un modelo factorial con dos
factores: fuente de carbono (FC1, FC2, FC3, FC4, FC5 y
FC7) y medio (MB y MS), con una hipótesis planteada:
ambos factores tienen efecto sobre la producción
de biomasa y exopolisacáridos de G. frondosa en
condiciones de cultivo sumergido. Se realizaron las
pruebas de ajuste al modelo (normalidad, homoce-
dasticidad e independencia).
Tabla 1. Análisis de varianza (ANOVA) para biomasa
Suma de
Fuente de variación Grados de libertad
cuadrados
Efectos principales
A: Fuente de carbono 169,534
B: Medio 549,713
Interacciones AB 138,234
Residuos 47,9597
Total (corregidos) 905,441
140
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
• Producción de biomasa
El análisis de varianza (tabla 1) mostró que
tanto el medio como la fuente de carbono influyen
en la producción de biomasa micelial (p < 0,001).
Además se muestra una interacción significa­ti­­­
va entre los factores fuente de carbono y medio
(p < 0,001).
En los resultados (figuras 1 y 2) se puede
observar que el medio MB fue el mejor para la pro-
ducción de biomasa, ya que en todos los casos se
obtuvo una producción de biomasa igual o superior
a 19,21 g/l, y el promedio general fue de 20,56 g/l.
En el medio MS la producción, en todos los casos,
fue inferior a 16,62 g/l y el promedio general fue de
12,74 g/l; de aquí se tiene que existen diferencias
significativas entre ambos factores cuando se evalúa
la producción de biomasa micelial. Ahora, cuando
se observa la respuesta del hongo en los medios
suplementados con diferentes fuentes de carbono,
puede verse que en el medio MB la fuente de carbo-
no resultó ser no significativa, con un valor máximo
Cuadrado medio Fo Valor P
5 33,9069 16,97 0,0000
1 549,713 275,09 0,0000
5 27,6468 13,84 0,0000
24 1,99832
35
Revista EIA
 Figura 1. Interacción medio-fuente de carbono Figura 3. Interacción medio-fuente de carbono
para biomasa (g/l) para EPS (g/l)

Figura 2. Promedio general de biomasa (g/l) de Figura 4. Promedio general de EPS (g/l) de
G. frondosa medios MB-MS G. frondosa para cada fuente de carbono

Tabla 2. Análisis de varianza (ANOVA) para EPS

Suma de
Fuente de variación Grados de libertad Cuadrado medio Fo Valor P
cuadrados
Efectos principales
A: Fuente de carbono 5 24,9948 440,83 0,0000
B: Medio 124, 752 1 0,910752 16,06 0,0005

Interacciones AB 35,8981 5 7,17962 126,63 0,0000

Residuos 1,36078 24 0,0566992

Total (corregidos) 163,144 35

Escuela de Ingeniería de Antioquia

141
 Producción de biomasa y exopolisacáridos de Grifola frondosa bajo cultivo sumergido...
de (21,10 ± 0,82) g/l cuando fue suplementado con
FC4; contrario a lo que sucede en el medio MS donde
suplementar con diferentes FC produce diferencias
bastante apreciables (figura 1). Es así como la mejor
fuente de carbono para suplementar el medio MS es
FC2, donde se produce (16,62 ± 0,82) g/l mientras
que con la fuente de carbono FC7 sólo se produce
(4,60 ± 0,82) g/l.
• Producción de exopolisacáridos
El análisis de varianza (tabla 2) mostró que
tanto el medio de cultivo como la fuente de carbono
influyen en la producción de EPS (p < 0,001). Ade-
más muestra una interacción significativa entre los
factores fuente de carbono y medio (p < 0,001).
En los anteriores resultados (figuras 3 y 4) se
puede observar que el mejor medio para la produc-
ción de EPS es MB, excepto cuando se suplementa con
la fuente de carbono FC7. Ahora, cuando se observa
la producción de EPS en ambos medios (MS y MB),
el factor fuente de carbono resulta ser significativo,
presentándose los mayores niveles con la fuente de
carbono FC4; suplementado MB con esta fuente de
carbono alcanza un valor de (6,53 ± 0,14) g/l; con un
promedio general de 5,85 g/l.
• Productividad y análisis
económico
Cuando se trabaja con hongos, es necesario
establecer un medio de cultivo adecuado que per-
mita garantizar su mantenimiento y supervivencia.
En general, los medios de cultivo utilizados son quí-
micamente definidos, con cantidades conocidas de
compuestos altamente purificados. Estos se diseñan
con el fin de proporcionar la energía y los elementos
necesarios para el crecimiento celular; por lo gene-
ral, se requiere el uso de macronutrientes (fuentes de
carbono, nitrógeno, fósforo, potasio, azufre y magne-
sio), micronutrientes (hierro, manganeso, cinc, cobre
y molibdeno), factores de crecimiento (hormonas
y vitaminas) y demás elementos específicos (sales
142
con efecto tampón, antioxidantes y quelantes). Todo
esto para lograr la mayor producción de biomasa o
bioactivos (Lee et al., 2004; Xu et al., 2003; Cho et al.,
2002; Bae et al., 2000). En la producción industrial
es más útil y económico recurrir a medios complejos
o de composición indefinida, donde las principales
fuentes de nutrientes son cereales y subproductos
derivados de la agroindustria, de animales y de mi-
croorganismos (Jaime, 2004).
Estudiar el efecto de la fuente de carbono en
la producción de biomasa y bioactivos es un aspecto
de relevante importancia, sin embargo, también se
hace necesario desarrollar trabajos que busquen la
disminución de costos en los medios de cultivo y el
aumento en la producción de biomasa y metaboli-
tos activos. Para el cultivo sumergido las fuentes de
carbono que más se han estudiado son la glucosa,
lactosa, sucrosa y maltosa (Carvajal y Rendón, 2004;
Lee et al., 2003; Wagner et al., 2003); también se
ha reportado el uso de celulosa, almidón; metanol,
etanol; acido oléico, acido palmitoleico, aceite de
oliva, aceite de soya y aceite de girasol (Yang et al.,
2000; Schisler y Volkoff, 1977), siendo todos estos
compuestos de alto costo y difícil adquisición para
nuestro país.
En este estudio se utilizaron seis tipos de fuente
de carbono para suplementar los medios MS y MB
tomando como variables de respuesta la producción
de biomasa y exopolisacáridos. Las fuentes de car-
bono utilizadas corresponden a mezclas complejas
de cereales (trigo, avena, arroz), las cuales atienden
los requerimientos básicos para el crecimiento del
hongo, como es la fuente de carbono, vitaminas y
elementos traza.
Cui et al. (2006), en su trabajo de optimización,
utilizaron medio MB suplementado con glucosa y
obtuvieron 22,50 g/l de biomasa y 1,32 g/l de EPS;
aunque en nuestra investigación la producción
de EPS fue superada sustancialmente (6,53 g/l), la
producción de biomasa no fue superada (21,10 g/l);
sin embargo, una comparación en términos econó-
micos muestra que el medio MB suplementado con
Revista EIA
cualquiera de las fuentes de carbono (FC1-7) es más
económico que el propuesto por Cui et al. (2006).
Además, aunque los resultados obtenidos con el
medio MS no son satisfactorios para la producción
de biomasa (12,74 g/l), en términos de eficiencia se
superan en forma notable los resultados publicados
antes (tabla 3).
Tabla 3. Costo de un litro de medio de cultivo para la
producción de biomasa micelial de G. frondosa
Medio Medio Cui Medio MB Medio MS
et al. (2006) suplementado suplementado
Resultado con FC
Precio en pesos 18.455 15.185
colombianos ($)
Biomasa 22,5 21,1
producida (g/l)
La productividad alcanzada con el medio
MB suplementado con la fuente de carbono FC4 fue
0,70 g de biomasa/g de FC4, mientras que en MS es
de 0,42 g de biomasa/g de FC; sin embargo, en tér-
minos de eficiencia, es evidente que MS es el medio
para ser suplementado, ya que los costos de un litro
de medio para la producción de biomasa y EPS son
mucho menores que los reportados actualmente.
Producir 1 g de biomasa en MS tiene un costo de
Col $51,49; en medio MB, 1 g de biomasa tiene un
costo de Col $738,57. El medio optimizado por Cui
et al. (2006) tiene una productividad de 0,49 g de
biomasa/ g de glucosa, sin embargo, producir cada
gramo tiene un costo de Col $820. Además, el valor
de EPS alcanzado en este trabajo en medio MS
suplementado con FC4 fue de 5,16 g/l, superando
lo obtenido con el medio optimizado de Cui et al.
(2006) y acercándose a los valores reportados por
Lee et al. (2003 y 2004).
La siguiente etapa de investigación estará en-
caminada a encontrar a qué concentraciones de las
fuentes de carbono analizadas se verá favorecida la
producción de biomasa, EPS y otros metabolitos de
Escuela de Ingeniería de Antioquia
interés (intrapolisacáridos y triterpenos), los cuales
también poseen actividad biológica.
CONCLUSIONES
El desarrollo del trabajo logró establecer un
protocolo para la producción de biomasa y EPS del
hongo medicinal Grifola frondosa en cultivo sumer-
gido, el cual cumple con el propósito general del
trabajo: disminuir costos de producción.
Luego de evaluar cada uno de los medios y de
las fuentes de carbono, se tiene que usando el medio
con FC
MB suplementado con la fuente de carbono FC4, con
656
las condiciones operativas trabajadas, se obtienen
12,74 producciones óptimas de biomasa y de EPS a partir
del cultivo sumergido de Grifola frondosa, reduciendo
el costo del medio en un 17,72%, valor que puede
llegar a ser muy apreciable cuando se piensa en llevar
el proceso a una escala piloto o industrial.
No obstante, es de anotar que, aunque el me-
dio MS no presentó altos valores en la producción
de biomasa micelial comparado con los reportes
actuales o comparado con el medio MB, se puede
concluir que cultivando el hongo en el medio MS
suplementado con la fuente de carbono FC4 se consi-
gue el objetivo de disminuir los costos de producción
de biomasa y EPS de manera ostensible, ya que se
reduce el precio del medio de Col $18.455 a Col
$656, lo que representa una reducción del 96,45%.
Estos resultados abren una nueva puerta para
el desarrollo de productos a partir de Grifola frondosa,
ya que si el proceso es escalado en planta piloto o
industrial, se podrían abastecer las necesidades de
la industria nacional, generando alimentos, fitote-
rapéuticos y cosméticos funcionales de bajo costo
para el tratamiento o prevención de enfermedades
de alto costo; y en un futuro se podrían alcanzar los
mercados internacionales con productos de alto
valor agregado con costos razonablemente com-
petitivos.
143
 Producción de biomasa y exopolisacáridos de Grifola frondosa bajo cultivo sumergido...
AGRADECIMIENTOS
Esta investigación fue realizada gracias al
apoyo científico, logístico y financiero de los grupos
de Biotecnología y Biotecnología Vegetal, Sede de
Investigación Universitaria (SIU), Universidad de
Antioquia. Expresamos nuestros agradecimientos por
el apoyo científico e instrumental que nos brindó el
Grupo de Sustancias Bioactivas, Sede de Investiga-
ción Universitaria, Universidad de Antioquia.
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