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Ili

Coordenadores:
WALTER BORZANI
WILLIBALDO SCHM IOELI,
URGEL DEALMEIOA LIMA
EUGCNIO AQUARONE

BIOTECNOLOGIA
INDUSTRIAL
VOLUME 1
FUNDAMENTOS

•I EDITORA
~ BLUCHER 5
O
anos www.blucher.com.br
O 2001 \Va11er lkrani
WilbO.lclo S<luni<lcll
Urge! de 1\1nlf:idJ Lin~
Eugi:tlio Aquarooc

l'" rci1nprcssào - 2008


É proibitlá á repr()du~iic tott1! 011 P'"'Cial
/JOY q11aisq1te1' r11eios
seni á11tl)ri:(1Çti() cscrifa d<t t•tlitom
EDITORA BLUCllER
Run PedrosoAlvnrcnga.. 124)- 4° andar
04531·012 - São P.-iulo. SP - Brasil
F:ll<: (li) 3079-2707
T<I.: (11)307S·S366
c-1n:1il: cditor3@bh1chcr.con1.br
site: \V\V\v.blue-hcr.con1.br
ISBN 978·85·212.0278-l

FICl-I;-\ CATALOGllÁFICA

Oor-1.;ini, \\12llcr
Biotttnologia. indiKtrial / \\lalt« 8017.ani · outros ('()(lrdcnadottt.: \\lllliba.k!o
Sctunidcll, Urgtl de Al1nc.MU Lima., Eugênio Aq~rooc •• Slo Paulo: Dluchcr, 2001.
Bibliog:r2fi3.
ISB1'' 978-SS-212-0278-3

1. Biol«nologin 2. Oiotccnolosi2 ind11."Stri2I J, ~ficrobiologi2 industrinl 4, 11.tkroor-


s:ini.Sl'IW>S bio1cc1M>l6gicos 1. BonAni. \Vah« li. Sch1nidcll. \\lillílxlldo Ili. Lin~.
Urgcl de Al1nc-idli IV. Aqunronc. E\J~nio
05·0906 CDD-606.6

indices p.1rn c.-itá!ogo sistemático:


1. Oio1C(nologia Industrial: Engenharia qufrnics 606.6
V

f~tc ronjtmto de quatro voltul,es, rcu1'1idos sob o título amplo de 13101-EC-


NOLOCIA INDUSTRIAL. é o result.ldo do 1r.1b.1lho de um grupo de profís:-.1on.'li.,
com \•istJ\ .\ .ltuJ.lizaç-ão da rok>ção OIOTFCNOLC'XIA, cuja publiCJ(Jo foi in1ci.lda
cm 1975 • t<nnanada em 1983.
A t\perit:'fKi.I acumulada e ol~ muit.i~ mud.mç.i~ ocorridas nestes últ1m&. v1ntl"
anos., ao t.ido d.i indiscuti,'el e cn."'<\.---nte 1mportânc:i3 d.is aplicações da BIOTEC-
NOLOGIA em di,·ersos seto~ de produçlo de bens. e sen.riços. j\1stific01m pll"n.J-
m<"ntc ·'~im pensam os Coorden.1dof\"'. e o Editor desta "º"ª
Colcç.lo l'5t.1
primeir.1 att1.1liz.1çào, principalmente pelo f.lto de se destinar ao ensino cm cun,o~
de g<>duoç3o.
N~:,o prin1ciro objetivo, ''cstJ Aprescntaç.lo, é tomar co11hccintcnto do <1uc,
hoje. se <·nlcndc por BIOTECNOLOGIA. e do que vem a ser BIOTECNOl,OGI A
INDUSTRIAL.
A dc1narc-ac;Jo nítida doc.1mpodc Jtu~ç3o de.- qualquer ramo doconh('('in\t-nto
é S("mpre tare(.a muito dificil, para não di1~r impossí,·el.
T.lnto i)to é \'crdade que, com a.Yl.l (rt_>rqt~. tratados relati\'~ a um dado
setor do conhecimento atacam diR."1:.lmente o l"\.lme de uma série de tçm.J ... ~m
tentar t'boçdr, preliminarmente, um ql1.1dro que. em largos traç~, indique «t
obj(11\'o::, e a~ .1plicdções do que \'ai ser estud.ido.
T.ll m.1ncir.1 de agir, princlpalmt'11tc ('m rur~ de gr,1dt1açâo, n3o no:i, p.an..'CC
acon-.clhjvel. Julgan1os importante, 110 infci<' dos cstt1dos, a apre)(!11t;iç-'o de um
p.111or;in10 que dê? .1os alu11os, un\<l id ~ i l.'I, ai11d,1 que n3o bem deíi11id11, d.l(I Ul'lc~
objetivo-: e :iplicaçõe:,.
N.1o n o~ parece que seja imprl"SoCindí\'el tr.11l5Crever, aqui, toei.is as propo~t;i~
de "deíiniç.lo" do que se de''ª entender por Biotecnologia. t-\lgumas del.1... "l'l'Jt)
"'uÍiC'ientC'!'t r-11'.J que stja possi,•el alcançar no~ objeti,·o.
lnirlJ.f\'mos com a proposta que o Pror. Antonio Paes de Can•Jlho, l'm '!oCU
tl'abalho 1nhtulJdo ..PJtentes par01 3 8eOh.'alOlog1a", apresentou, em de1t'ml>ro d~
1993. em rcunl.M> reali.ud.a na Acadt•m1.\ 8rJ.,1h:ira de CiCncias:

.. C11ttt11f..,.~ por Bioli'C'l10Jog;n o C'o111u11to tf(' t011J1tcintt11los, téc11icn.; t '"t't,1'.fP"".


de INr't' científica ou prátic'1, q11<' 11tr1111lt' a 11t1Ji:aç1io dt serf!$ f!it'f.'.l:t CiJ11to J"'''''
i11ti~r1111tl' (' irt;tw do processo de produfdO 11ufustri11I dt• bens e $é'Tt.1iços".
VI

OOfficeofT~- A'-"0.-'Ullent. por,.ua ,.~•definiu" Bt~ui como


"""~º:

J>or o ut-ro lado, a Union lnl"·rnntionalc dê Chinlie J>ure et Applíqu~. concei·


t uou l}iot·ccnologia con\o:

..Aplica('do da Bioqufn1ic:íl, da BWICJjtt.1, 1/a 1\11ctobidlogia t da E11~'frtlrar'a Ql4ftt1im


OI~ PIVC"-'05 t produtos iudustraa1 .. ''"''"'"Jq~ produtos l'flalit"O!' a ~li,ft, (IK18Ü1
t asr~11ltura) t ao mrio an1'1m1tt•

fin.llmentc, o Conselho Nocion.11 de Obcnvol\'imento CientifK'O e T«no1ógko


(CNPq), l'm seu J>rograma N.lcio1\ill dC' Biotocnologia.• ''di:-finiu" Biotecnologia noS
:,.eguintr~ tennos:

·•A utiliznçifo de sisfl'111as ct•l11lal't'!i /Mrn obt<·ttçifo de produtos ou dt'St'Utl(J/V11ue11to


rti• 11roc1-s..;o:; industriais".

A~ poucas tentativas dedefiniç.\oaqui tra~ritas mostrolnl, n1tidament(>, qt1e


ol Bioternologi.a tem por b.bé \'J:r1<~ ramos do conhecimcnto que poderi.1m ser
c1.,,,.,foc•d<><> de FUNOA.\IENTAIS (como. por exemplo, 8ioquim1u, F"iologi•.
Gmchc.>, Microbiologia. \'irolog••· Bot.lnic•. Loologia, E<ologi.J) •o l•do de outros
quo poderiam ser •grupddos >oi>• donom1nação genérica de E;'\;GEl\liARJAS (prin·
~~\lmenlc a Engenharia Quimtc.l).
TrJt•l·Sl', portaJtto, de u1n c.101po de tr.:ibalho tipic.tmlhitc multid1-.ciplinclr, o
que tornil "b::i.olutamente iinprc::i.cindí\'CI i'I C'Ícti\•a colabor,1ç3o de profissio11ais
,)tu.lntes cn1 diferentes se tore~ do conhccin1c11to.
l)est.1quc--sc, porén'I, qut:" c~ Jtivldnde n1ultidisciplit1.ar n.\o deve S('r cn1c11-
did;i como r~ultante de uma sh11plc:-.. jt1...taposi(ào de profissionai:-.., c.id.1 um deles
oon1 i:-uJ forn1ac;Jo esp«iali.t.ad.> e prcocup.1do apenas com ~u.l .irc.1 específica.
fmporta que seja, de ÍollO, \101 lr,1b,1lho de \•ários profiSSiOnJi~ éÍCll\'oln\CntC
integrado:,., de modo que c.1dJ um dcJ..,....., tenha conhecimento, obvi.imente nJ.o
.iprofund.ido, dos prindpK>s e da""t t«n1c.11s dos campos de atuaçdo d~ dcmai.:..
A,...,m. a~~ para citar um ~ll.cmplo, C.t..O um microbiok>g.isl.l p.irtinpe de um
~rupo que estuda a o~Jo de um d.Jdo processo. é d~,·el que tenh..l alguns
ro1lhecimentos, mesmo que ~uperfid.li~. a ~peito das estratégias empregadas para
i.'I 1nodelagem matemática. Vitt•\'t'ts.l, o e-.pecialista em modelagenl deve efetuar
unl c... !orço ~dicional par.1 comprt:-cndt'r i.'IS características do ~istenlJ microbiano
c1n l~ludo, íl (inl de incorpor.t-l.1:, rio n1odclo. S<>mente desta ÍOl'lll.l i.'I .1tividade
1nulli<lisciplinar eíe1iv.1n1entc e>.:ii,lirá e podcr.i sc-r n1ais eficiente.
..., t \'ftdadc pc>< - - '!"" • Bioeocnok>gia -6 f"'' """ ....... Ctlrl'<1J..r.d•
.a!Utrk"f\tt' pnontária hi ft!ltn-amet •k f'OUC'O trmpo. tunbém e \·ttdade-, pc.')rt1utro,
q<k" r~ ~ \"fm .eldo utilizdd('. na produção d .. \ •n<" ~.
pnnopalmente alimento- de-.dea DY n'mOl.I ~llgüidade. Ba.ta, n<-.tc p.>rtíru·
larl 1011..-r t\'Íen."nci,a ao preparo de beb1ctJ, tcrmentadas a partir de ~~.i1~ na
8.Jb1lónta e no Egito (o.000 a ~ riro >no< a.C.), ~ produç.lo de p.lo, uhl,,ando
t••rmcnto-., no Egito (4.000 ano-. a.e. 1.. ,\ produç.lo de vinhos na Grécia (2.000 a.C.).
1\ Biôt\.'Cnologia encontrJ ml1it.1 ....1plic.1çõcs importantes 1las ~gu in te\ .1rc.1s
Je ati\'itl.1lll':
• Asricultur.1
• J>l-cu.iria
• S..1údt"
• J>n.'""A.!n·aç.lo do meio ambicnll'
• lndW.tria
Sua ... .lplic.ições na indústria cc.ln.. t1tu1,~m o objeti,·o primordiJI da Biotcc·
nol~ía lndu•trial. A Fig. I, adaptad.1 de um artigo publicado pl'IO Prol. R.imer
fonJ'>, é un1a bool rcprcscnt.1ç.io gr.líic.1 tt.1 •·JQCJli.1..1ç.lo'" d.1 Biotecnolt,,;1.1 lndu'·
tri.11e de -,ua interação com outr~ ra111<~ (itl co11hccimcnto.

BK>lOGlA QUÍMICA

ENGENHARIA

ENGENHARIA
OUIMICA

Flaura 1 ~~t~o esquemat a :b


Cir'Y'lf"fltO.
VIII

Convém,. finalmente, ressaltar que, co1noocorre em outros campos de trabalho,


as á.reas de apUcação da Biotecnologia, a1ltcriormente apontadas, não são "ga\retas"
estanques. Há entre elas, frcqüc1ltementc, fortes interações. Apenas para citar um
exenlplo, considere-se o caso de uma dada vacina, desenvolvida na área da Saúde.
Na etapa fina) de prodt1ção dessa vacjt'la cm larga escala surgirão, muito provavel-
n\ente, problemas de cunho tectlológ·ico e de enge1lharia que poderão tomar impres-
cindível a efetiva participação da Biotcolologia industrial na busc;i das soluções
mais adequadas.
A presente Coleção oonsra de quatro volumes. No primeiro- FUNDAMEN-
TOS - re\1nem-se, como o próprio nonle claranlente indica,, temas fundamenta.is
indispensáveis ao estudo de processos biotecnológicos. O segundo-ENGENHA-
RJA BIOQUÍMICA - focali1..a os pri1lcipais problenlas de engenharia envolvidos
naqueles processos, ao lado de asstLntos correlatos de âmbito ma.is geral, mas im-
portantes na produção em larga esca.la. Os dois úJtinlOS volumes - PROCfSSOS
FERMENTATIVOS E ENZIMATICOS e BIOTECNOLOGIA NA PRODUÇAO DE
ALIMENTOS- foram dedicados à descrição e discuss.;i.o de processos biotecno-
lógicos de importância industrial.
Todos os temas foram tratados partilldo-se do pressuposto de que a obra se
destina, prinlordialmente, a cursos de graduação. A bibliografia indicada no finaJ
de cada capítulo poderá servir como ponto de partida par~1 os que pretenderenl um
exanle mais aprofundado de um ou outro tópico.
Os Coordenadores, o Editor e, scgurament·e , também os Atttores, agradecem
todas as sugestões relativas à estrutura da Coleção ou de qttalqi.ter de suas partes,
bem como a identificação de falhas ou incorreções, infelizmente sempre possíveis,
que lhes sejam encaminhadas pelo leitor.

Literatura Recomendada
1) Anciães, \V. & Cassiolato, J.E. Biotecnologia: seus impactos no setor industrial.
CNPq, Brasília, 1985.
2) Haehn, H. Bio.químjc.:a de 1.:as fenn entaciones. Aguilar $.A. de F.diciones, ~4adri,
1956.
3) Jonas, R. C BF - Scientôfic Annual Report (pp. 35-46). Alemanha, 1990.
4) PatS de Can1alho, A. P:.lentes pa.ra 3 BioJe<nologia. Apresent~ldO à Academia
6r.1silcira de Cit-ncias em 6.12-1993.
IX

,, , ..... ....,. . i
.. 1 ~ -- 1

Cuando la colccción "Biotec1lologia", editada por los proícsotCS Et1gênio


Aquaronc, Walter Borza.ni y Urgel de Almeida Lima, apareció cn 1975, catLSÓ t in
l\ondo intpacto entre los biotecnólogos Jatinoamcrica1tos. Se trató de la primera
obra sobre cl tema escrita y publicada en nt1estra regiór1 y reprcsentó una
co1ttribt1ciór1 especialmente valios..1 ai est\1dio y enseiía1t1.a de CS.'l puj~'\nte disciplina.
"Biotcc1tologia" constó originalmente de trcs volúntenes: Tecnologia das
Fer1,,er1tações, Tópicos de Micrvbiolt>gia Industrial y Engenharia 8ioquí111ica, a los ct1ales
se stintó c1t 1981 Corrosão ;\1icrobiol6gica y lucgo Ali111ettlos e Bebidas 11rod11zidos por
Fer1t1entação en 1983. Ahora, pasados ya 1nás de \1Cinte anos, los mismos editores,
coin la participación dei profesor \.VillibaldoScl\n\idell, nos brindam la oportunidad
de apreciar y disfrutar la nueva colección "Biotecnologia Industrial" como una
st1cesora natt1r;il de "Biotecnologia". EI contenido de la nt1e\'ª obra há s ido
totalmente renovado y actualiz..ido en concordancia com los notablcs avances
experimentados porei conocin1ie:ntoen í.'Sta área en las últin1asdécada.s, inclt1ycndo
las modernas técnicas de la ingeniería genética}' cl tisode microorganisn\OS rccon\·
binantes en bioprocesos.
La nue\'a colección está dividida e11 ctultro volúmenes que abé.'lrcan los mas
variados tópicos relacionados com la biotecnologí~' indtlStrial: Fu11da111entos, l11ge11ieria
Bioq11b11ica, Procesos Fcrr11e11tat;vos y Euzi111áticos }' Biolt"Cnofogfa en la Produccci6n de
Ali111entos. En total son 74 capítulos escritos por distinguidos especialistas brasileros,
conteniendo información actualizada acctca tanto de los aspeçtos básicos co1no de
los aplicados de la utilización de células microbianas y no nlicrobianas para
finalidades productivas.
EI Voh.imen 1, Funda111t11tos, entrega tul completo panoraola dei estado dei
conocinliento en microbio1ogfa, genética, bioqu.Ínlica y e:nzimologfa finalizando1

com tln panorama de las aplicacioncs indtistriales de la biotecnologia, abriendo así


el can1ino a los próximos volúmcncs. En el Volumen 2, l11ge,1ierfa 8ioq11f111ica, se
exponen los principalcs aspectos rclacionadoscon1 la cuantificaci61l de los procesos
microbianos y enzimáticos y cl discno y operación de los eqtlipos de proceso
reqt1eridos en una instalación industrial. El Volumen 3, Proct'SCS Feru1e.11tali"l)()S y
Euzi111átiCO'S, presenta y discute la aplicación de los microorganisnlos a la producción
de una amplia gama de metabolitos }' enzimas de interés práctico, el tlSO de enzimas
como biocatali1..adorcs industriales y la aplicación de los procesos microbianos a
di\ ersos sectores industriales y a la descontaminación de eílt1entes líqt1idos y
1

residuossólidos. Finalmente, el \'olumcn 4, Biotec11ologfa en la Prod11cci611 de Alin1entos,


X

detalla la aplicación de la biotealología a una anlplia variedad de iildustrias de csc


importante sector.
Por su estructu.ra )' contenjdo, y por ln indiscutible alttoridad de sus editores
y autores, cstoy cierto que Biotecnologia Industrial está destinada a constituirse en
tula obra i1lSl1Stituíble para la enseilanz.;1- universitaria de pré y post-grado,así c<>mo
ta11lbié1l en una "raliosa fuente de consulta para el biotecn61ogo en la industria.

Fer1lando Accvedo
Profesor
Escuela de lngeniería Bioqu.ín\ica
Universidad Católic-a de Valparaiso
Valparaíso, Chile
XI

A n.1 Cl01r.1 Cucrrin i Schenberg Lu i~ Eduardo C ~1 t i crrcz


1'rofi'S$Cra Doutor11 l'nJfi'$$Cr Titular
Uni\'('r'Sid<1de de São Paulo U1ti\·trSidt1dl' d(' S.~o P.1ulo
lns1itt1to dt Ciê·nciJS 6io1né<tic.ls Escol,1 Supetior de Agricullur.l. ''Luii
A\'. Prof. i,.ineu 1>restes, 137-1 de Queiroz"
05508-900, São r,,ulo, SP, Brai.il Caix.1 Postal 9
13418-900, Piracic.1ba, S I~ 6r,l.sil
Bay.1rdo 8 aptista Torres
Prftjeswr Doutor !\1ariJ. Ligi.1 C. C<in.,al hal
Universidade de S..'io l'aulC) Pr<>fi'Si<Ora Oo11t11rn
Instituto de Química Uni\'C'rSidadt de S.-lo P;;itilo
Av. J>rof. Lineu Prestes, 748 Instituto de Ciências Biomédicas
05508·900, S.i.o P<ittlo, SP. 6r,1sil Av. Prof. Li1\\'u fr('St\"S, 1374
05505·900. S.'io 1>,11.1!0, S I~ Hrasil
Flávio Alterth un1
Profi'i<.~r Titular Otto jcsu Crocomo
lJniversidade de S.io Paulo l'rofi'$SJ.)r Titular
Instituto de Ciências Bion1édic,1s Univi.'rsidadi.' di.' 530 Paulo
,-\v. Prof. L.ineu Pl\"Sles, 1374 Esçola Superior de Agricultura "Luiz
05~·900, S..lo Paulo, SP, Hr<lSil de Queiroz"
Caixil Post.:il 9
Jo3o Lúcio d e Azevedo 13418-900, Piracic.1ba., sr, Bra::.il
Profi"S$1Jr Ti111/11r
Un.i\·ersid;ide de S.io P.1uh> Waller 8orz<ini
Escola Superior de Agricultura "Luiz Projt»tJr Plt'110
d<' Queiroz" CC'•'lln:> Univel'$it.irio do Institu to
C1ix,1 1>os1.11 9 Nlau.i de Tecnologia
13"1 lS.900, Piracicaba, SP. 6r,uil Esrol<i d<" E1lgcnh.:1ria Ntauá
Dep.1rt,1n1ento d e Engenhari,l. Quimic.1
Lui z Car-l os Ua.sso e de Ali1n('ntos
Preft$$tJr D<>11tor Pr,1ç,1 ~lau,i, 1
Uni\•ersid.1de d e $.lo P.1ulo 09580-900, São Cat.'tano do Sul. sr,
Escola Superior de A gricultur,1 NLuiz Brnsil
de Qucil'\)7."
C,1ixa Post.11 9
)3418·900, Pir.'lcicaba, SP, Brasil
XIII

, ELEMENTOS OE MICROBIOLOGIA -···········..·····-····............................ 1


li lntroduç>o .\ ~lkrol>K>log,. .......................------- 1
1.2 \lorfolog:~ e tsrrutura - - - - - - - - · - - -..-..... .S
1l 'utoç.ão ~ - ---·---·-- -13
14 \l,•.osde<ultura ____ ··-·----·--···-.......... _ lb
1.S Cn......nmento mkrobi.lno ......................._ .... 20
1.6 Controle dos microrg.1ni ..nu.>~ JX'l.1 .1ç.\o d~ agente, fis.Jcos ..................... 27
1.7 C<-lfltrole pela ação de •'Sl"l\lt." ~1ufn,ico<o ....................................................... 29
Dibliogr3fia .......................................................................................................... :l2
2 TtCNICAS BÁSICAS EM MICROBIOLOGIA................................................... 33
2.1 St.•surança no laboralóri('I ,................................................................................. 13
2.2 1>n.-pam de meios de culll1r.l .... ............................................. 1-1
2.3 lt.'cnica5> de assepsia .. ................................................................. 19
2.4 lll!>.trumentos do microl>i<>log1 ...1.-. --- ---·..-···········---·.... .. .fl
2S \ktodos de inoculaç>o .........._____ • • 42
2& Cullur.is puras·---· ·------·--·- .lf>
2.7 \1c1Kl!>dccultur• trond~dttncuN(Jop.lra anattób~ . 47
2.R \1l"todos utilizadoei. partJ qU.lnhfK.lr ~ m~mos ·--·-- ~
2.CJ Color.)Ç"lo de microrg:.tnL..ml-... .......----.....................................,_ .. ~
Referências bibliogr,1fic.1~ ........................... . .. ........... ,_ ~
l .citura eotnplement<tr ....... ... . ... .................................... . ...... - 60

3 ELEMENTOS DE GENtTICA DE MICRORGANISMOS............................. 61


3.1 h'trôdu~âo ............................................................................................................ 63
32 Mut•.ç3o .......................... ........................................................................... 64
3.:i Rt.wn,binaç-3o t>m n1kmrgan1...n\&il ....................................................... . . 74
3.4 Ht'rança extracromos:ioó1ui<-' em mi~,\J\1Smos ................. --...- ... 104
3.~ C~idet.llÇ'ÕeS f'inai~- .. -·-...- ..................... - 1oq
Rer..~bibOOgr.ifl(.l, ----···-·-- .. 110

4 ELEMENTOS DE ENGENHARIA GE NÉTICA. --·-----·--- lll


41 lntrod~Jo............... ......................................_ lll
-l 2 En.11m.as de restrição:-.,~ tt.'ltt'1Urol1o mol'l'C'Ulan.--s que cortam a moll'Cul.1
dé ONA t>m poritos eo;:pec:íf1"~ .............................................. . . ... 116
4.3 \'cton.'S gcnétic06:: a~ môll~uJ.,., de ON>\ q~1e ''cfcul.am .1 pmp.1,g.içJo
dos fr,lg11,~ltOS de ONA de 1n1crcl!M' ............................................................ 120
XIV 1
44 Construção da mok'CUl.l de O'A l'\"COffibinante-: diJerente> e<io1raté-gi.ls •. 126
4.5 Expressão da 1nfonna(.\o .t;CfWtica he-te-róloga ..................... ............•........ 133
4.6 l.i.olamento d o gene clont'ldo ...................................................................... 137
4.7 Transformaç3o gen~tic,, d,, célula \'iv3: di(en"'lltt'S si..tcm,,.,
hospedei.ros do ONA f\.'C01nbi1\a1\t\' .............................................................. 143
4.8 Questões de seguranç,l e pr<'~n,1'ç3o an1bicntal ......................................... 146
Reíerincias bibliogr.ific.1 .................................................................................. 148
Leitura recomendJda ....................................................................................... 150

S ELEMENTOS DE ENZIMOLOGIA ....................................._ - · - - .... 151


5.1 lnttOdU(JO....... . ····-··-··-···-··-······-·--·-··..··-·- .. 151
5.2 Estrulura das.,,,.,.,... ··-··-··-··-··-·······-·····- - - - - - - .. 155
5.3 Ação catalític-.ti db t.'1\l.1m.t.., -·-·-··-··-··-··-··-··-··-·- - · - - · - · - - - 16-l
5.4 Inibição da att,·idadt" t.'1\7tmJtK.l .•..- ............................ ·-··--·-·--·········· 165
5.5 Regulação da ah' 1d.>dc- en11mtlhca .............................................. - ••....•...... 166
S.6 lnOuência do mc1ó -.obre ;i •lli\'id.,de enzimática ........................................ 168
5.7 Co.fatores e cocn1im.1' ................................................................................... 171
5.8 f\1cd ida da ativ1dJdc c1,1imoi11c.l .................................................................... 17.t
5.9 Clas.siíic.1ção e non1cnclil lurl'l .......................................................................... l75
Leituras conlplenlt>11t.1r\.'l- ................................................................................ 176

6 CAMINHOS METABÓLICOS... ........................................................... .. ... 177


6.1 lntroduç3o....... .._ .................................._ ·- ·- - - _ .... 177
6.? Processos d.e obk"f'IÇ.lo de t•nergia -··-·-·······-··-··-··-·-·--·-·-·--·- 178
61 Biossín~.-······· ·-··-··-·-··-···-··-··-·- - - · - - - - · - · 193
Reler<ncias bd>LoogrJfoc•' ···-·-··-··-··-·--·-·-·-··-·-·-·--196
7 CINÉTICA DE REAÇÕES ENZIMÁTICAS...................... - .•- ......._ .............. 197
7.1 Lntroduçào..................... .. ........................................................................... 197
7.2 ~iedida de velocidade ..................................................................................... 198
7.3 lnftuéncia dat- roncl•ntr.lÇ~ da Ct\Zilna e do subslrJto
Lei de Micllaclii:o e fvl ~1\tCn ............................................................................... 199
7..a Influência da pn:'~nç.1 de un\ inibidor .......................................................... 207
7.5 Influência da teml"'r,,tur.l ....................................................... ....................... 213
7.6 lnfluênci.1 do PH ....... , ........................................ -.............................. 215
7.7 Coment..irios finai~ ... ............................... -·- ._ .... ........ 216
216

8 TERMODINÃMICA DE REAÇÕES ENZIMÁTICAS. --·-·- ... 217


8.1 Jnt:roduçâo-··-···-··-··- .............-......-··-··········-··· ...._._,, .............. 217
8.2 Principios da tcnnôd1n..1m•t"a ............................................... -. ·-............... 219
8.3 ~ nJ,·cis de éncrg1.i l1vr"C.' .............................................................................. 234
8.-1 Energética dm l>ll!ltcmai. .1bcrtC1S ..................................................................... 247
LiterattLrtl recomcndad1l .................................................................................. 247
9 PROCESSO BIOTECNOLÓGICO INDUSTRIAL G ENÉRICO ................... 249

10 ALGUMAS APLICAÇÕES INDUSTRIAIS ......................................................... 2.53


'.,.... .....
,. ,, .._.......................... ..
XV

1 ENCENHARIA BIOQUiMICA: UMA APLICAÇÃO SUi GENERIS


DA ENCENHARIA QUÍMICA.- --------·---·--·· 1
Literatura recomendada . ··----·---···---·--·-----·---· .3
l MICRORCANISMOS E MEIOS OE CULTURA PARA UTILIZAÇÃO
INDUSTRIAL. ..............•_..................... ..................·-························· ..................... 5
2. 1 Introdução .............................................................................................................. 5
2.2 Fontes de microrganbmos de intl'n.~~ ............................................................. 7
2.3 C<lr,l(k'TÍStiC'AS de$e~iveis de microrg.'lnis1nos e n1e ioS de a 1ltur.1
p.:ir.1 aplicação industrial ................................................................................... 10
2.4 Cons;deraçõcs fino Is ........................................................................................ 18
Referências bibliog.r.if'icas •.•...... ........ ...........................................- .............. 18
3 ESTERILIZAÇÃO 00 EQUIPAMENTO. ·············-···-·····-··············· .19
).1 lnlroduçâ<>.-.-----···--···· ···-···--·---·--···--·····----··---- 19
32 Tomunologia e modo d< •lu.>Ç.io ·--·--·------·---···----- 20
).) Esl<nliU(ão po< •ge>l<> li>- ·--·--------·--·-- 25
34 Es~•desinfea;ãopo<~<nldqWO\kQs---·--·--------- ... 33
R~ bilbiognlfl«'S ··--···-·- ·-·····-···---···· . 38
4 ESTERILIZAÇÃO OE MEIOS OE FERMENTAÇÃO POR
AQUECIMENTO COM VAPOR.............................................................................. 39
4. 1 ln1.roduç5o ............................................................................................................ 39
4.2 0\-scrição sumárit'I dos proc('~ de cstcriliza.;Jo por calor úmldo ........... 40
4.3 Cinc.'iti<:i> da destruição térmlcll de microrganismos ....................................... 45
44 IÀ.~truiç.io de ntitrtcntes do 1utio como con.seqtlência da esttl'ili1,n.;:iio .... Sl
4.5 Considerações gerais a respeito do eAleulo do tempo de estcriUzaçAo ...... 53
46 Cálculo do tempo de estl'filiz..çlo por processo descontínuo ......... ... ..56
4; Cüculodo tempo de tsttrili%o)(Jo por proccssorontínuo .•. . 60
1..ttcr.atura recomendada ---·----·------- . 62
5 ESTERILIZAÇÃO DE AR._ ·------·----·-·---·-- 63
S.I lnlroduçà<>.----···---· ---·---·------·--···- .63
S.2 AttOSS6is mkrob"1nos .. ..............__..........- ...---·-..···--·· . 64
5.3 Amostr<ldores ........·-···-·..··- ......................-···-············......_ .. 6S
S.4 ri.tétodos par.a a esteriJiz.lçlo do ar .....................................................-..... ... 75
5.5 COJ\Slderações finais ...... .................................................................................. 90
Rcfcrênci<'S bilio.gráfk.l'> .................................................................................... 90
XVI

6 CINfllCA DE PROCESSOS FERMENTATIVOS.·--·-----·--·-- 93


6.1 1'11roduç.io.-..·-···-· ·-·······-·---·--········-·····- 93
6.2 P.arlmetros de ferment"""Jo. .......................................-·····-············· .9S
6.3 Cá.lculo das \'ek>cidades ............................................................................... 101
6.4 A curva de crescimento mkrobl;ulO ....................._........................................ 103
6.S Classificação dos p~ fcrnlent.ltlvos ................................................... 1rn
6.6 lníluência d a conce1ltra~Ao do substrato sobre a "elocidade
cspccflica decrescinletltO ................................................................................ 110
Ap("lldice ............................................................................................................ 114
Referências bibBográlica~ ...................................................... "........................ 121

7 MODELAGE.M MATEMÁTICA E SIMULAÇÃO DE PROCESSOS


FERMENTATIVOS.·-·--. -·-------·- -· 123
1.1 1'11roduçJo.__._.__. --·-----·--------- 123
7.2 Fonnula(-Jodosmo<Wloo matcm.itl005deprocesscl0 f<mwnl.>ll\06 . -124
7.3 AJu<~ de f"'<3nltuoo do modelo /onnulado -·---·---·-····--··, ••. -- 148
7.4 A\•aliação do modek> m.lkmáhco. .. ....................- ..........-... . 164
7.5 Simul..l(ãode processos fermcnt.1bvos .......................................................... 1n
R('íctênci.as bibliogr.tficas ................................................................................ 174

8 BIORREATORES E PROCESSOS FERM ENTATIVOS.................................. 179


8.1 h\ll'Odução.......................................................................................................... 179
8.2 Classifiação dos biorreaton.">S ......................................................................... 180
8.3 Formas de co.nduç3o de un' p~ íennentati\'O............................. .. .. 185
8.4 E.'empkis de com~r.a(lo de desc:mpc!ôho de biorreatores ........._ 189
RefC":n_Ticias 1:>ib1iográ.fica~ ··--·--···-···--···-···- .•. 190

9 FERMENTAÇÃO DESCONTINUA _ -·--···--·---·--·--·---· 193


9.1 Ftrma\toÇ.iodeoconrinw ·-···--·--·---·-----·------ _ 193
9.2 lnócuJo ....--···-..········-········ ·-···············--·--···-···-··· 19"
9.3 ~losto ···-···..·················-···-·-·-·..·--················- ...- .......- ................................ l96
9.4 Classificação ..................................................................................................... 199
9.5 Número d e domas ............................................................................................ 200
Referências bibli<>gr.lt'icas ................................................................................ 204

10 FERMENTAÇÃO D ESCONTINUA ALIMENTADA....................................... 20;


10.1 lntnxfuçâo .......................................................................................................... 205
10.2 Aplie11ções ........................................................._.........~......................._ ........ W
10.3 ~ ···-········-········ - ·...····-···-·····-···-···-··- .210
1()..1 \iodelos malemál"°' ····- -·----- --·--··--·-·-- 212
Rcltn"náas b.Oliogralicob ·- ----·------- 216

11 FERMENTAÇÃO SEMICONTINUA . ····--········-···-·····-···-····--- . 219


11 .1 DefmiçJo ········-···.,··········· ·····. ... ···.,·····-···-···.,·····-··········· .... - . 219
J1.2 Produti\'id.adc do processo S<'tnicontínuo .................................................. 220
11.3 Comentários finais ............................................................................................ 22:2
Referêncl.i.s bibliografi<;as ................................................................................ 222
XVII

12 FERMENTAÇÃO CONTINUA......................................................: ......................... 223


12.1 Conceitos b.isicos .............................................................................................. 223
12.2 Vantagens e desvantagens do processo oontfnuo e m relação
tio descontínuo .................................................................................................. 224
12.3 Formas de oper.1ção no sistcmt'I rontfnuo ..................................................... 225
12.4 Formaçiio de produtos no sistema contínuo ................................................. 2-12
Ref<'ri:'1lcias bibliog:rt1.fic:is ................................................................................ 245
13 FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO. ......................................................... 247
13. I lntTOdu~ào .......................................................................................................... 247
13.2 Históri:ii do processo da FSS ............................................................................ 248
13.3 Microrganismos comumente utiliz<1d os ........................................................ 250
13.4 Substr.1tos: c.1raderísticas e composição ....................................................... 250
13.5 Re<1torcs par.i fennentaç-Jo semi·sólida .........................................................254
13.6 Controles do processo ......................................................................................259
13.7 Vantagens e dl.'$vantag<'ns ............................................................................... 264
13.8 Exemplos de casos ............................................................................................ 266
Rc!erêl\cias bibliografiC'as ................................................................................ 270
14 AGITAÇÃO E AERAÇÃO EM BIORREATORES ............................................ 277
14.1 A importâOO(t da transferência de oxigénio ................................................. 277
14.2 Sisten\as para a transferéncia de oxig('fliO .................................................... 279
14.3 Concentração de oxigênio disSOl\'ido em solucões saturadas ................... 281
• . d • • . . • . ob. •• •
14.4 Trans1Crt'nc&a e ox1g"ruo e resp1raçao m1cr 1ann ..................................... ~
14.5 Transfen.1.i,cia de oxigênio en1 sistemas agitados e areados ........................308
14.6 Considerações finais ......................................................................................... 329
Referências bibliogrofiet1s ................................................................................ 329
1S VARIAÇÃO DE ESCALA. ........................................................................................333
15. 1 Introdução .......................................................................................................... 333
15.2 Crit~rios para a <1mpUação d e escala ............................................................. 336
15.3 Comp:._ra.(Ô('S entre critérios para a ampli11.ç..'o d e escala ........................... 348
15.4 Redução de escala ............................................................................................. 351
15.5 Considerações fin<1is ......................................................................................... ~--i
Refe~nclas bibliog:ra fiC'.as ................................................................................353
16 REATORES COM CÉLULAS IMOBILIZADAS. ..............................................355
16. 1 lntrodução .......................................................................................................... 355
16.2 Métodos de imobili.z.,..;ão ................................................................................. 356
16.3 Tipos de biorreatores empregados ................................................................. 360
16.4 Aspectos relativos a<> trMtSporte d e massa ................................................... 36.1
16.5 Processos que utili.z.'lm células imobilizadas ................................................366
16.6 Conclusões ......................................................................................................... 3i0
Referências bibliogr.1fteas ................................................................................ 371
17 REATORES COM ENZIMAS IM O BILIZADAS ............................................... 373
17.1 lntrodução .......................................................................................................... 373
17.2 Reatores enzimáticos ........................................................................................374
17.3 Exemplos de proct'5SOS e-nzimáticos .............................................................. 388
Rcferei,cias bib1iogrofte.is ................................................................................ 395
XVII I

18 AUTOMAÇÃO E CONTROLE DE PROCESSOS FERMENTATIVOS .... 397


18.t l.1\troduç.'io .......................................................................................................... 397
18.2 Principais instrum('ntOS p.i.ra monitomç-50 c1n li.nha de pruct.'SSOS
fern1entalivos ................................................. ...................................................398
18.3 Controle :iplkado a processos ferme1lt<.ttivos ............................................... 411
Referências bibliogr.1ficas ................................................................................423
19 OPERAÇÃO DE INSTALAÇÕES INDUSTRIAIS DE
FERMENTAÇÃO .........................................................................................................425
19. l l>rincipios ger,1is para opéração ...................................................................... 425
19.2 Condi('ÕCS gerais par.1 a execução de um proc;esso fermentativo ............. 426
19.3 Operação d~ u1na indtístria ............................................................................. 429
19.4 Opcr.:iç3o de u n1 processo fern1entalivo asséptico ...................................... 434
19.5 Exemplo de opéra(ào de i11dústria. de ferm("nt.-.çâo .................................... 435
Bibliogr<lfia ........................................................................................................ 439
20 CONSTRUÇÃO DE EQUIPAMENTOS DE FERMENTAÇÃO...................441
20.I lni-r·oduçJo .......................................................................................................... 441
20.2 Carncterísticas ~'istc.ls de ~tores paro cuJtivo d e b3Ct~rias ou
células nnin1ais .................................................................................................. 442

20.3 Construção d o fermentador ............................................................................ 448


20.4 Cultivo de ~lulas anUriais .............................................................................. 468
20.5 Obtenção e manutenção das oondiçõcs de t'Stcrilidade e
biossegura11ça .................................................................................................... 470
20.6 Válvulas e purgadores de vapor ..................................................................... 480
20.7 Outros tipos de reatores ................................................................................... 485
Bibliografia ........................................................................................................ 489
21 PURIFICAÇÃO DE PRODUTOS BIOTECNOLÓGICOS............................ .493
21 .1 lntrodução .......................................................................................................... 493
21.2 ClnssifiCilÇ"Jo ...................................................................................................... 494
21.3 Rompimento de c~lulas microbianas ............................................................. 501
21.4 Precipititção ....................................................................................................... 405
21.5 Ultra.filtração ..................................................................................................... 507
21.6 Extração em sistemas de duas fases .1quosas ............................................... 507
21.7 Cromatografi11 ................................................................................................... 5 10
2 1.8 Tr,1tamen1os íinais ............................................................................................ 514
21.9 Rotil\as analíti<QS .............................................................................................. 515
21.10 O processo integrado de purificaç.lo ............................................................. 518
Refcrl'!nc-iM bibliogni.fic.lS ................................................................................ 521
22 ASPECTOS ECONÔMICOS ................................................................................... 523
22.1 lnt:rodt•~o .......................................................................................................... 523
22.2 Considerações sobre as diferenças variáveis e suas n!la.;ões
exlstei,tcs ~m todo o estudo econónl.ico ........................................................ 523
22.3 Análise de viabilidade econômica ................................................................. 528
22..4 Aspectos econó nlicos d e pro«'SSOS fel'1ue ntatjvos ...................................... 530
22.5 M~todos de avaliação dé inn>stimento ......................................................... 535
Referências bibliográíic-.'ls .................... .'........................................................... 541
XIX

VOLUME 3

1 PRODUÇÃO DE ETANOL........ ....••• •••···•·····················-················"···..··············· 1


1l Importância ·-···---··· _.,_ -··--.........- .............................. _ _ 1
12 v...deobtenção . - - - - - - -·--···--···---·----- - - -2
1.3 \Coltfri,t$...primas., composiç"6 t> ron.wn·.ação ·----·----·------ - 3
14 ~dos ,,,,.;.. ·--- -----·---------·--- 7
1.5 Fcnnrotação alco61k.l ............ - ····--···---·---·····--···- 11
1.6 F~totcs que afetam a krmmt.t(.lo .............................................................- IS
1.7 Có1T\'Ç3ôdos mostos ................. .... . . . ............................................ ..... 20
1.8 l'n.iparo do in6culo ........................................................................................... 20
1.9 V"l'iílc.'l{.So prátic.1 da pureza J;i.,. fcrn1entaçóes ............................................ 23
1.10 Si~tc1nas de fermC"11t;lçJlo ................................................................................... 24
1. 1l Fcmcn1.1ção a.lcoóli<'CI ro111(1lua ....................................................................... 25
1. 12 Sal3S de íennen1ação ..... ..................................................................................... 28
1.13 Rtcipll~ntcs de ferrnentaç.ão ... .. ........................................- .............................. 29
1.14 Orestilação _............................................._ _.......-·····-·······-.... ·--··-.. . 29
1 IS R.wi<~O---···---···--· ·---··········-·-·-······--······•···- •• 33
1.16 Pr•tiea d.a rctifk-oa(lo indus1m1 _ --···----·--.......- ......- ....- 3"
J 17 ~r.it4lçâododanol ----·---·----- 36
8ibltog:rafu ·--·---· _,.__,._..__________ 39
2 PRODUÇÃO DE ÁCIDOS......... - -·······---···.............................._ 45
2.1 lntroduç.10......................... ···-·•· ............................................................ ... 45
2.2 Ácido citrico ..........................................................................................,......... 45
2.3 Ácido it.acônico ................................................................................................... 50
2.4 Ácido ghteôniro e ghtrono·&-1,lctona ............................................................... 53
2.5 Ácido tático .......................................................................................................... 56
2.6 Oxogluconatos .................................................................................................... 58
Bibliografia ......................................................................................................... 58
3 PRODUÇÃO DE SOLVENTES.. _ .......... _.,............................ _... 61
3.1 lnlrodução............................. - - - ·····--···---·.................... 61
lc2 Fttment.lção are1ono-but.1nólic..t - ..·----·---·------- 62
)..} l'ffmenuçlo bulanol·i>OprOp<nc>I - - · - --·---·--- - 75
) " Fennenb('lo 3C't'klna-eunol -----------·------ - .. n
B•blK>gJalia ___................. - ·····--···-..···--..····--··- . 78
4 PRODUÇÃO DE VITAMINAS . • ....................-................................... 81
4l lntrod\l("Jo......................... .. ............................-.............................. .... 61
42 Ci.1nocobalamina ............................................................................................. 81
4.3 Rlbofi<lvin.1 ......................................................................................................... 85
4A Ácido <1$Córbico ................................................................................................... 88
XX

4.5 Obtenção de outras vitamin<1s p<tr fermentação ............................................ 92


Bibliografia .......................................................................................................... 97
5 PRODUÇÃO DE ANTIBIÓTICOS ........................................................................ 101
5.1 lntrodu('ilo .......................................................................................................... 101
5.2 Antibióticos P.,lactâmi<OS ................................................................................. lC/l
Bibliografia ........................................................................................................ 122
6 PRODUÇÃO DE POLISSACARÍDEOS. ............................................................. 125
6.1 1ntroduç.ão .......................................................................................................... 125
6.2 J\gcntes de viscosidade ................................................................................... 127
6.3 PoliSS<lcarídcos gclcificanles ........................................................................... 134
6.4 Polissacarídeos com <1plicnções cspedíicas ................................................... 138
6.5 Pesquisa e desenvolvimento tm polí.ssaca.rfdeos microbianos .................. 147
6ibliogr;i fit1 . , ...................................................................................................... 149
7 PRODUÇÃO DE AMINOÁCIDOS...................................................................... 155
7.1 lnt:rodução ......................................... ,..............................................., ................ 155
7.2 Usos comerciais dos 3mino.icidos .................................................................. 156
7.3 Métodos de produção ...................................................................................... l 57
7.4 Ccp3S JXl.nl a produção direta de amioo..'icidos ............................................ 1S9
7.S Controle do proct"$$() ........................................................................................ 162
7.6 Recuperi!çâo de produto .................................................................................. 163
7.7 Produçlio de aminoácidos ............................................................................... 164
Bibliografia ........................................................................................................ 176
8 PRODUÇÃO DE ESTERÓIDES •........................................................................... 179
S. 1 Introdução .......................................................................................................... 179
8.2 O nlundo di!s transfonn<içõrs ......................................................................... 180
8.3 Transformações microbianas de gter6ides e es.t('róis ................................. 182
8.4 Tecnologia d<i biotrans!on'nação .................................................................... 189
8.5 f\1odelos microbianos do metabolismo de m..'\mífcros ................................ 195
8.6 PcrS-p<.'Ctiv3s futuras ......................................................................................... 196
Bibliografia ........................................................................................................ 1'17
9 PRODUÇÃO D E MICRORGANISMOS. ............................................................ 199
9. l Introdução e breve h.istórico ........................................................................... 199
9.2 Princfpios do crescimento microbiano .......................................................... 201
9.3 Produção de mi(f'()rg3n.isrnos e substriltos usados ...................................... 202
9.4 Estudo de casos de produção de microrganismos .......................................206
9.S t\1icrorganisnlos visando outros produtos .................................................... 213
Bibliografia ........................................................................................................ 214
10 PRODUÇÃO DE POLIÉSTERES BACTERIANOS......................................... 219
10. 1 lntroduçi'.\o .......................................................................................................... 2 19
J 0.2 Poli h id rox:ialcanoatos (PHAs) ....... ,................................................................ 222
10.3 ~ietabolisrno de PiiA:-> ..................................................................................... 228
10.4 Produ~~ode PHB e PJHS-co-JHV ................................................................. 238
10.S Extração/purificação de PHB ou P3H6<o-3HV ......................................... 242
10.6 Perspectivas !uturils para PHAs ..................................................................... 243
8ibliogra!it1 ................ ,....................................................................................... 245
11 PRODUÇÃO DE BIOINSETICIDAS................................................................--249
l 1.1 lntrod uç-Jo .................. ,................. ,............., ................. ,..................................... 249
11.2 Produc;.iio comercial .......................................................................................... 252
11.3l'tOCesso fcnncntntivo ...................................................................................... 253
ll ..a
ScpnraÇ\o de toxinas ........................................................................................ 264
11.5Ensa.io<' formu lação ......................................................................................... 268
Comerci.alizac;Ao e aplicação ........................................................................... 1JIJ
11.6
11.7Princip.1is .1v.1nços e limit<'l('ÕeS ...................................................................... 272
Bibliografia ........................................................................................................ 274
12 PRODUÇÃO DE INOCULANTES AGRÍCOLAS............................................. 279
12. I lntnxlu~o .......................................................................................................... 279
12.2 lnoculo,ntts p.1ra a fixação biológka de nitrogênio (F6N) em
leguminosas ....................................................................................................... 279
12.3 Pl'()C'tSSO de produção de inocul.1ntes para f BN e n1 leguminosas ............ 280
12.4 Inoculantes mirorriz.icos .................................................................................. 300
125 J>roduçAo e uso de i11oculantes à base de ftuigos «tomiootrizicos ........... 301
12.6 Consider-ações finais .......................................................................,................. 303
Bibliogr.lfi<l ............................................ ,........................ ,........ ,......................... 303
13 PRODUÇÃO DE VACINAS .................................................................................... .307
13. 1 lnlnxluç3o .......................................................................................................... 3<J7
13.2 liist6rico .............................................................................................................'JIJ7
13.3 1ipos de in1unidade conferidos por vacil\l\S ................................................. 308
13.4 Principais tipos de vaciJ1zis .............................................................................. 310
13.S A fermentaçao na produç-3o d e vacU,as ........................................................ 311
13.6 A produção d<' va<íno,s oomo proc:esso tmitário .......................................... 313
13.7 As vaciJuis b.,ct<'ri3n3S - c:lassifiC<1çào <' pl'Oô.'SOIS de produç.50 ............... 314
13.8 V~ji1as virais ..................................................................................................... 338
Bibliog:ra.faa ........................................................................................................ 346
14 PRODUÇÃO DE ENZIMAS MICROBIANAS ................................................. 351
14.1 lntrodução .......................................................................................................... 351
14.2 l>rodução industriJI de en.tirnas ..................................................................... 354
Bibliografia ................................................... ,.................................................... 362
1S PRODUÇÃO DE ENZIMAS INDUSTRIAIS DE ORIGEM ANIMAL ..... 363
15. l fnl.rod uçâo .......................................................................................................... 363
15.2 ranc:l'('<lti.n.a ........................................................................................................ 363
15.3 Pepsina ............................................................................................................... 364
15.4 Renina (co.1lho) ..................................................................................................364
15.S Catalase ..............................................................................................................365
Bibliografia ........................................................................................................ 366
16 PRODUÇÃO DE ENZIMAS INDUSTRIAIS DE ORIGEM VEGETAL.... 367
16.1 Pcl ptlÍM ......... .............................................. .. .. . .... .. .. ....... .. . .... .. .. . ...... ....... .. ..... .... 367
16.2 Produ('ào de páp<'ínll ....................................................................................... 367
16.3 BromC'líM ........ """'" .......................................................................................... 371
16.4 Ficin<1 .................................................................................................................. 373
16.5 Malte ................................................................................................................... 374
Bibliogra!ia ........................................................................................................ 376
X.XII

17 PURIFICAÇÃO DE ENZIMAS -------·---·--------m


l;. l lntn:ldução .....-. ··-·····---···-·····-·• 377
17.2 Extr~Jo ................. ........................................................__ . 37'J
l7.3 Purificação bascJda n.1 i.olubllld.,de .................................................. . ....... 381
l7.4 P\irificação base;ida n.1 c.1rg.1 .......................................................................... 382
l 7.S l\iri.fi~.l<;Jo bas.e.1da no ta1n,1nho .................................................................... 384
17.6 l'\.lrific.1ção baM'tida 1lll .1ílnldadc ................................................................... 386
17.7 Concentração ..................................................................................................... 387
6ibbog.rotfia ........... ............... ............................................................,•......... 389
18 IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS. ...................................................... .391
!&1 Introdução..._____.. ......- .......- ...--...---····--···-···· . 391
18.2 ~tétodo!. dt itnobih.zaçJo ------·----· ----- 391
18 3 Tipos de suporte ---------·-- .)9J
18 4 Ek:&to6 eaUS<ldos peLl 1mob1l~.io--------·----·------ 394
18.5 Cond"'"<> -·---·-- --··---····-··---..·--···--- <02
Bibliografia....... .......... ····························---· .... 403
19 ALGUMAS APLICAÇÕES DE ENZIMAS......................................................405
19.1 Introdução .......................................................................................................... 405
19.2 E1lZi1"<lS e1n medicamento-i e.~ ,,njli!4.-s clínk<tS ............................................. 407
19.3 Enz.i.nlas t 1u detergente» ................................................................................. 408
19.4 Na indU.stri<1 têxtil, em eurtumcll e''•' produção de anhbiólico................. 410
19.5 Súllt"SC enzimática de ili.pArt.l1"c e in.!>uli.n:a ................................................. 4 11
19.7 Usos diversos ......................................................................................... 411
SobUografia .................... •. ···············-············ .412
20 MODIFICAÇÃO DE FÉCULA POR FERMENTAÇÃO·--·· -113
20.I lntroduç.M>-- ---·---·----· -113
20 2 Produtos (ennent.ado,. .li p.11rt1r d~ m.1~""""primas .imil.itt.b 414
20.3 Produtos t'ttment.l<lOl!i a p.lrt1r d.l f«ul.a ··--·---·····-·· 415
20.4 t\matéria·pnma -tfttul.1. ............................. 416
20..5 1\ tc.'â\Ologi.1 p.ara produçlo d.l f«ul.i fermentada....................... . 417
20.6 A prod~àocomer<i.11 de íécul.\ fermentada ou polvilho azedo .............. ~ l9
20.7 A pesquisa ........................................................................................,.............. 426
20.8 A romcrcinli1,.ação do polvilho i\1.cdo no Brasil ........................................... 434
20.9 A caractcriz<1\âO e a quitlld(td~ do polvilho azedo .............,........................ 435
20. lO O,; produtos de polvilho .i ..ooo no Ur.1stl ('"'"América L..1tina ................. 4..U
20. ti No\'06 prOdutos ................. , ... . . .................................... .... .... ..... 452
20.12 O mercado de pol\ alho azedo 1\d Bt.lSil e na .~mêôca Lahna, ...... -.457
6ibl1ografi.a .....-. ....--..···-··..·--·... .. ."60
21 APLICAÇÕES DA BIOTECNOLOGIA NA PRODUÇÃO DE
PAPEL E CELULOSE ·-- - - ···--···---·----·-- "6S
21. l Introdução---·---·---· -·-------·--· 465
2l 2 ~1.ldeira - cotn).'JQ>lÇ"O qu1m1c.a e ultra-e.trutw-.1 .....-............. - 466
2l.3 81odeg.radaçãoda made1rJ ~ ~"' compont'Tltes ........................,.•_, 468
21.4 Proc('SSllm('nto d.1 made1r,1 na lndUstria de papel e celul<>M' ... ............... 471
2l.S Aplic.1ções da b1otcc-nologi.1 nJ índú3tri.i papeleira .................................... 473
81bliogra íiol .... .. ................., ................... ......................................................... ,, •• 483
XXlll

22 LIXIVIAÇÃ O BACTERIANA OE MINÉRIOS . ..................................................485


22.1 l1ltroduçâo .......................................................................................................... 485
22.2 As b.i<térias do proce;so .................................................................................. 488
22.3 <>smincrais lbdviáveis ..................................................................................... 493
22.4 Desenvolvimento experimental da 1.ixi"iaç!io bacteriana ........................... 504
22.S A bioidl'Qmetalúrgica no Brasil ....................................................................... 508
Bibli<>g.t.líin ........................................................................................................ 510
23 TRATAMENTO BIOLÓGICO OE EFLUENTES. .............................................. 513
23.1 lntroduçdo .......................................................................................................... 513
23.2 J\borda.gem dos probll?m;.'IS de resíduos industri3is .................................... 514
23.3 Pl"()('.('SS(')S biológicos de tr.1tamento de te$fduos .......................................... 518
23.4 Tratamento biológico ;.lCtóbio ......................................................................... 521
23.5 Trat<'11nento biológico auntróbio ..................................................................... 536
23.6 Lagoos ................................................................................................................ 542
8ibliografi" ........................................................................................................ 546
24 PROCESSOS COM C~LULAS ANIMAIS ......................................................... 547
24.1 lnt:roduç.lio .......................................................................................................... 547
24.2 A.s c~lulas ........................................................................................................... 54S
24.3 Condiçõt>S básic3s de culli\'o .......................................................................... 552
24.4 ca..
lx>li<mo e<lu•u ..........................................................................................556
24.5 Biorttt1tores ........................................................................................................ 560
24.6 l>rodut~ ............................................................................................................. 570
Bibliografia ........................................................................................................579
25 CONTROLE OE CONTAMINAÇÕES MICROBIANAS EM
PROCESSOS FERMENTATIVOS .......................................................................... 583
25.1 Lntroduçdo .......................................................................................................... 583
25.2 [)('si1úctantes qufnlicos ....................................................................................585
25.3 Antibiótiros ....................................................................................................... 587
Bibliogr.1fia ........................................................................................................593
xxv

CUNIF••iíO
VOLUME 4

1 GENERALIDADES SOBRE BEBIDAS ALCOÓLICAS..................................... 1


l. l lntroduç.âo .............................................................................................................. 1
1.2 Legislação brasiJeir-a ............................................................................................. 2
1.3 Cervejas ................................................. ,., .............................................................. 4
1..a Vinhos ..................................................................................................................... S
1.5 ~bid<1s por mish•ril ........................................................................................... 12
1.6 Bebidas destiladas .............................................................................................. 1-1
1.7 Bebidas á lcool-ácidas ......................................................................................... 18
Sibliog:l'i"lfia .......................................................................................................... 19
2 TECNOLOGIA DO VINH0 ....................................................................................... 21
2.1 Definições de v i1\hO e de enologia ................................................................... 21
2.2 Composição do vinho ........................................................................................ 22
2.3 Uvas para \tinho .................................................................................................. 30
2.4 Composição física e química da uv,l m<1dttra ................................................. 31
2.5 Vindima ................................................................................................................ 34
2.6 Correções do mosto ............................................................................................ 35
2.7 Microbiologia do vis\ho ..................................................................................... 39
2.8 F<rment>ÇÕCS ....................................................................................................... 43
2.9 Vinificllç!O ........................................................ ................................................... 47
2.10 ClarifiC<'l('àodc \'inJlO ......................................................................................... 60
2.11 Conscrva(âo ........................................................................................................ 63
2. 12 Envclhtcimcnto de vinhos ................................................................................ 63
2. 13 Altera('<)es. no vinho ............................................................................................65
Bibliografia .......................................................................................................... 67
3 TECNOLOGIA DA SIDRA. .......................................................................................69
3.1 C>efinições de sidra ............................................................................................. 69
3.2 Maçãs para sidr.1 .................................................................................................69
3.3 Fennent.1ção ........................................................................................................ 74
3.4 Tecnologia ............................................................................................................ 76
3.S Fennenta('Jo alcoólic:a ........................................................................................ 83
3.6 Est<l.biliZJ('~O e cstocagcm ................................................................................. 84
3.7 Clarific~o .......................................................................................................... 85
3.8 Filtr..ç5o ................................................................................................................ 86
3.9 Altt'r(IÇÕC:S na sidra ............................................................................................. 86
3.10 Características físicas<' químkns do produto final -sidra ......................... 88
Bibliog:r.1 fia ............................. ............................................................................. 90
XXVI

4 CERVEJA .......................................................................................................................... 91
4.1 lntroduçlío ............................................................................................................ 91
4.2 Lcgishlção brasileira ........................................................................................... 93
4.3 ~1atérias·prin\AS .................................................................................................. 'YJ
4.4 Leveduras e bact~ri3S ....................................................................................... 1'1i
4.5 Pl'OCX'SS<:1nlen10 ................................................................................................... 112
4.6 Clt.i.1lidade da <X'n·cja ....................................................................................... 130
4.7 Tipos de cerveja ................................................................................................. 138
nibliografia ........................................................................................................ 143
5 AGUARDENTES .......................................................................................................... 145
5.1 lntroduç.10 .......................................................................................................... 145
5.2 Clru;siiic.ição d as bebidas alcoóli~s e das agu,1rdentes .............................. 146
5.3 l)efinição ............................................................................................................ 147
5.4 Bebidas (ermeto-d.(':StilAdas e destilo-retificadas .......................................... 147
5.5 Aguarde1\ tCd e cana-de-açucar ....................................................................... 163
5.6 Outrasagua.rdentcs .......................................................................................... 179
5.i Padrões d e identidade ..................................................................................... 179
6ibliografit1 ........................................................................................................ 180
6 VINAGRES..................................................................................................................... 183
6.1 Introdução e hi.stóriro ...................................................................................... 183
6.2 Padroni1..aç.'io e legislaçâo ................................................................................ 184
6.3 icrminologi3 vifl.ll81'eir,1 .................................................................................. 186
6.4 f\1titérias-primas ................................................................................................ 187
6.5 (>.1jcrorganisn1os ................................................................................................ 188
6.6 Rendimento e produti\•idade ...............................~ .......................................... 190
6.7 Fatores qtie afetam a qualid:tde do vinagre .................................................. 191
6.8 Bioquimida d<' fcr1ne111ilÇ"ão acétic.1 ............................................................... 191
6.9 Pr<>CCSS-OS de fabricação .................................................................................... 193
6.10 Compa.rtiçâo t"'llll'C pJ'OCE'S.<;OS .......................................................................... 200
6. 11 npos de vinagn._"S .............................................................................................. 200
6.12 Tr.1ta1ntnto fin;;i l ................................................................................................ 201
6.13 En,·elhecinlento ................................................................................................ 202
6.1-1 Mattriais resis1entes ao ácido acéti<O ............................................................ 202
6.15 Alter.1ções c def('itos ........................................................................................ 200
6.16 Usos e aplicações .............................................................................................. 2Q.l
6. l7 Resumo ............................................................................................................... 206
Bibliogr.1fia ........................................................................................................ 207
7 L EITES FERMENTADOS .........................................................................................209
7.1 lA"g-iSl3('JO .......................................................................................................... 209
7.2 Caractcristi('M de leites fermentados ............................................................ 2 l2
7.3 Too1olog:ia de produ('ào de ;:ilguos leites fernle ntados ............................... 212
Bibliografia ........................................................................................................ 223
8 Q U EIJ OS. ....................................................................................................................... 225
8.1 lnt·rodução .......................................................................................................... 225
8.2 Composição e valor nutricio1,.,.1...................................................................... 226
8.3 Cltissifi('<'('.\o ...................................................................................................... 226
8.4 Matéria-prima e ingredientes ......................................................................... 228
XXVll

$.5 Processo d<' fnbricação d e queijos .................................................................. 234


8.6 Os dif(•rentes tipos de queijo ........................................................................... 24.S
8.7 Uhrafiltra('ão no processo d<' fabricação de queijos .................................... 247
Blbl.iografia ........................................................................................................ 251
9 MANTEIGAS ................................................................................................................. 255
9.1 Legislação .......................................................................................................... 255
9.2 FabriQ'lçJo .......................................................................................................... 257
9.3 Etapas do processo descontf11uo de produ('JO ............................................. 257
9.4 l>rocesso rontínuo de produção ...................................................................... 264
9.5 Embalagem ........................................................................................................ 26-1
9.6 Armaz('i1.-imento ............................................................................................... 265
9.7 Rendimento ll'l.flnteiguei.ro ............................................................................... 265
9.8 ()efeitos da ma.zlttiga ....................................................................................... 266
9.10 Manteig.1 de ga1Taí.1 ......................................................................................... 266
Uibliog.rafin ........................................................................................................ 267
10 FERMENTAÇÃO LÁTICA DE HORTALIÇAS E AZEITONAS ................... 269
10. l h1tn.xtuçào .......................................................................................................... 269
10.2 Produt0$ íermcnt.1dos ...................................................................................... 270
10.3 Microbiologia da fermentação ........................................................................ 2n
10.4 O processo de fcnnC1lt:iç11o láti«i ................................................................... 277
10.5 J\Uitonas ........................................................................................................... 293
Bibliografia ........................................................................................................ 302
11 PESCADO FERMENTAD0 ..................................................................................... 305
11 .1 lntrodu(';\Q .......................................................................................................... 305
11.2 Pescado como matéria·prin1.1 ......................................................................... 306
11.3 J>roccsso de ferment;)Çâo do pescado ............................................................ 311
Bibliogr.1.fia ........................................................................................................ 337
12 CACAU . ........................................................................................................................... 347
12.1 [ntrodução .......................................................................................................... 347
12.2 Estudo ('mpírico para a obt('nçâo do c.1cau comercial ................................ 348
12.3 Estudo quimico e microbiológiro dn OOte1\~0 do «icau comercial .......... 351
12.4 C<lratt\'óstic-as ideais das amêndoas de c.1c,1u após o processamento ..... 356
12.5 Classific.1çJo do cacau (d<'termina('!io de qunUdade) .................................. 358
12.6 Composição quín1ica do cacau ....................................................................... 360
12.7 ~1anufatur,1 ........................................................................................................ 36l
Bíbliografia ........................................................................................................ 363
13 PÃO .............................................................................................................................36.5
13.1 t<listórico ............................................................................................................. 365
13.2 Mo.ig<'m do trigo .............................................................................................. 366
13.3 Potencial de panifica('lo da farinh" de trigo ................................................ '367
13.4 Características e funções dos ingredientes ................................................... 36$
13.5 Processamento do pão ..................................................................................... 381
Bibliografia ........................................................................................................ 386
XX.VIII

14 APLICAÇÕES DE ENZIMAS NA TECNOLOGIA DE ALIMENTOS. ..387


14 1 lntrodU(lo ........... _. . -·······--·····-············· 387
1'2 Uiõdeenzimasemp.'-1'1.if.c".t(lo ...................................................... 388
14 3 Uso de enzimas na modific•(•\o do ~n1ido .................................................. 393
14.4 Uso de enzimas na indti.!ttria de sucos de frutas .......................................... 398
14.5 Uso de C1\Zimns 1\.'l rnodlfl<:;)(JO de proteínas .............................................. 403
14.6 Uso de enzimas n.i indtí~tri., de l,''ltlcfnios .................................................... 405
14.7 Uso de enzimas em bt>bidi'15 l11coóliclls .......................................................... 409
14.8 Aplicações diversa~ de enLlm.1-; ................................................................... 4 l4
Bibliografia .............. ··········································-··..--··· .... 418
15 PROTEINAS DE ORIGEM MICROBIANA.--·----···---···· 421
1S. I Jntrod uçâo--------· ·--···---·------- 421
152 BactM.>s----·---· -------·---- - - <22
IS.3 fungos-----· -···---·-----··---- 422
15.4 le\·ieduras --..·---................. ..•.•- .......- ..........._.,.......................... ..422
1S.5 .\1.atérias-primas ·····-···· . ................................................... .. 425
15.6 l,,.t\·ed1.1ras ~s de dcstil.1ri.1s de jl(OOI ....................................................... 425
15.7 F,1briC<'(ào de ll.,,·cdur.u M..~.ns de destilarias de .61rool ............................... 430
15.8 Biomassa algal ................................................................................................... 439
Bibliografia ........................................................................................................ 443
16 PRODUÇÃO DE LIPÍDEOS POR MICRORGANISMOS........................... 447
16. l lnl:rod1.1(ão............................... ................................................................. .. 447
16.2 8.lctéria.$. fungos e le\·cdur.u.. ................................ 449
16.3 Matórias-prim.ls ·····-· - - ·····--···---···---···- - - _ 453
16.• Su....,.,... _____ ----···------ --- <S3
l6S '.'i:uhlentes ·------- --------- 455
16.6 5q»raçlo dos 1;pldeoo ---···----·---···- 456
16.7 Algas····-----·--- ...• - - - · · · · ·······-·······---·········-·--···-···· .. <57
16..8 Extração da gordura.......... .................................- ........................ - ·- .. 461
Bibliografia ..................... ............................................................................. 463
17 ALIMENTOS ORIENTAIS ....................................................................................... 46S
17.1 lntrodu('ào .......................................................................................................... 465
17.2 P.listória das fennent.1ç~ d~ <'lhn('ntos ..................................................... 466
17.3 1'.ticrobiolog.ia e bioqur1nlca ............................................................................. 466
17.4 Vak>~ nutriti\·os................. .............................................................. 467
17.5 Classificação dos aliment08 fermentados ·-............................... - - 468
17.6 Missõ ..-------···---- - ·------·----... ;169
t 7.7 Moiro d< soja (Shoyu) ----·------------ 476
17.8 Nat6 --- ---------- ~
Bibliograíia ............... ·-------·----·- "88
18 CONSERVAÇÃO DE FORRAGENS: SILAGEM•.•·-·····-·······-·······- 491
18.1 lntrod~o.................. .............. .................................................................. 491
18.2 Tttnolog&a da en!>ilagcm .................................................................................. 492
18.3 Bioquimic.a da silag('m ..................................................................................... ·l93
XXIX

18.4 Micl'()biologi,n d a siL1gem ................................................................................ 495


18.5 Si.lag<'m pr(--..secada ........................................................................................... 499
18.6 J>rodução de silagenl de grãos ........................................................................ 500
18.7 Ad.itivos n<i silagem ...........................................................................................501
18.8 ProblentaS comuns na ensilagem e causas prov~veis ................................. 503
18.9 Mct"s p.'l.ra prodUÇ'llo de uma silagem estável ............................................. 503
Uibliografia ........................................................................................................ 504

19 CHÁ ............................................................................................................................. 507


19.I lntrodução .......................................................................................................... 507
19.2 Ctdtivo, produ('.i\o e consumo ......................................................................... 507
19.3 Compos;ição ....................................................................................................... 510
19.4 Scoefi('ia n1e nto do chá ..................................................................................... 513
19.5 Qualidade do chá .............................................................................................. 517
19.7 Nornenclat·ura ................................................................................................... 518
19.7 Class. ifitt1ç50 ...................................................................................................... 518
19.8 Outros process.1n\entos .................................................................................... 519
19.9 Su«dân..'OS do d>JI ............................................................................................ 521
l~ibl iografia ......................................................................................................... 522
ELEMENTOS
DE MICROBIOLOGIA
Flávio Alterthumm

1.1 - lntroduçào à Microbiologia


A partir da descoberta e início dos estudos dos microrganismos, fico\1
claro que a divisão dos seres vivos ent dois reinos, aninlais e plantas, era insu-
ficiente. O zoólogo E.H. Haeckcl, c1n 1866, s ugeriu a criação d'2' un\ terceiro
reino, denominado Protista, englobando as bactérias, algas, fungos e proto-
zoários. Essa classificação nlostrot1·sc satisfatória até qlte estt1dos mais avan-
çados sobre u1tra-cstrl1tl1ra celtilar dcnlo1tstraram duas categorias de células:
as procarióticas e as eucarióticas. Nas eucarióticas o núcleo é limitado pela
membrana nuclear e apresenta no seu interior vários cromossomas. Assim,
em 1969, R.H. \tVittaker propôs a expansão da classificação proposta por
Haeckcl, baseado 1l~O só na orga1lizaçâo celular nlas ta1nbé1tl 1la forma de
obter energia e alimento: Reino Plantae, Reino Anima lia, Reino Fungi, Rei·
no ProtiSt(l (microalgas e protozoários) e Reino Monera (bactérias e ciano·
bactérias) (Fig. 1.1).
Esti.adando as sinlifaridades e difere1lças do RNA ribossõmico, C. Woese
propôs, c1n 1979, uma nova classificação para os SC'res vivos: Do1nfnio ou Su-
pra·reino Arquibactérias (incluindo bactérias metanogênicas, bactérias term6-
tilas, bactérias acidófilas e bactérias halófilas), Domínio ou Stipra-reino
Eubactéria (incluindo as demais bactérias e cia1lobactérias) e Domínio ou Su-
pra·reino Euc.'lrioto (incluindo plantas, animais, fungos, protozoários e algas)
fig. 1.2).
(ll(~f'IOfO!;; '"°'~""°"
J
"'°""""'°"'""' prin(iPOl"""to
doos • ll'~>OJ

Fiaun 1. 1 - Oi$tnbJiç\odois~m<XemtMOS. óeacoo:locomaproposiade ~r. (íft\lraadaflta·


da 00 livro Mclobto.bgy. ConccptJoid App6c4>011s de Mth.'ld J.PelaM Jr.. E.C.S. Chan e Noel R. Kntt, 199"3.)
Por 1\ão aprescl\tarem uma es1rull1ra celular, os vírus n<lo st\o co1tsidera-
.ko, M:res vivos e portanto não se enqul'ldra1n nas classificações acima. São •tor-
i.ados basicamente por uma porç-Jo de m.lleriaJ genético, DNA ou RNA.. nunca
... dois simultaneamente, en,·ol,ridos por proteína. Alguns \•frus, rom estrutura
.ti~ romplen.. têm sob~posto ã camadôl protéica um en\'Oltório lipoprotéico.
"lo.\'Írus, qua.ndo fora das células, não ~suem atividade metabólica própri.,
port.1nto não sintctil.1m protoplasma nem crescem. SJo sintetizados pcla.s
~tlulas hospedeiros, nas ql1ais penctrJ1n, pois assumem o co1nando do n'et\1-
bolisn10. O aumento do número de vírus nao ocorre pelo proce!tsô de d ivisão
,X\mo nos organismos celulares, mas sin1 feito pela replica(âO virai.

CARACTERISTICA PROCARIÔTICAS EIJCARIÔTICAS

i\icmbr11na nurlcolr Auscn1c r~11c·ntc

NucJéolo Au11en1e Prt•M.'nlt'

Numtt0df' Um \f.A1i qt.H" um

'"""""'°"''
Rcikulo
Au~1t Pr~1e
endoplasm.~tico

;\parelho dl' Co()lgi

r..t1tocõnd ri~
l Auwn1t

Al.l"'-"nlC'
Prl~"l'n".>

Pt(""l'ntC'

Li~.as AUl'C"nlC' Ptt~te

HJSIOIUS aS$0C'i.adu ao
('fOl'ftOSSOfna
AuSC'nl('º ,.,.,,..,.
Kib0$$0m11s

1Cloropl.astos
PMC'dC' ttfula.r C'Om
-Í-
705
Au!ltnh'

~nt('º
+ 805
P~nl(' t'm

Au~nlC'
plant11s

mU(O(On'lpJ.\.O

Transportit dit dttrons ~titmbr•n.t ~hlOCIÔndfW.'

FAgocit~ Aui('nl\' Às \'f'7C'• p~te


P1nocltose AuioC'nh.' Â,. V\'ltt pn.'M:n;__j
• li~ ("XCC'ÇÓt'i
Os vírus são classificados de acordo com o ác-ido J\ltCléico, composição
química e morfologia. Enlbora sejam objetos de estudo da microbiologia, não
serão abordados neste capítuJo introdutório.
O sistema (ormal de organização, classificação e nomenclatura dos seres
vivos é chanlado de taxonoinia. A organização está b(lseada em sete J\íveis
descendc1ltcs, sendo o reino o mais amplo e maior, e a espécie o mais específi-
co e Jnenor. Os denlais níveis são, em ordem decrescc1\t{': d ivisão, classe, or-
dem, famíJia e gênero.
A classificação é o arranjo dos organismos em grupos, de preferê1\cia
obedecendo às relações evolutivas. A nomencJati1ra é o processo de dar no-
mes às espécies cxist{'ntes. É binominal, sendo o nome cientifico uma combi-
nação do no1ne g{'nérico (gênero) seguido da espécie. O no1ne do gênero é
iniciado con\ letra 1naiúscula, mas o da espécie não, e ambos os 1\omcs são es-
critos cm itálico ou grifado. Exemplos:

Saccha ronl)'Ces cerevisiae Escherichia coli


~ el;:lt<>t
.......~ ·~

SaccJraron1yces cert.-visiac E.scltericllia coli


gf<Wo ~... JMero tipfci9

O microscópio foi e ainda é, em muitos casos, o equipan\ento laboratorial


mais utilizado no estudo dos microrganismos. Há duas categorias principais
de nlicroscópios empregados: óptico e eletrônico. Eles diferem na forma pela
qual se dá a ampliação e visualização do objeto. Na microscopia óptic(I \lm
sistema de lent<tS 1nanipula um feixe de luz q\1e atravessa o objeto e chega ao
olho do obS(!rvador; na nlicroscopia eletrônica a Ju.z ~ substituída por um fei ~
xe de cl~trons, e as lentes por um sistema de ca1npo magnético. A nlicroscopia
óptica comum aumenta até 2.000 \•eze-s e tem variações como a microscopia de
fase, de campo escuro e de fluorescência. A microscopia eletrônic:i permite
um aumento de cerca de 400.000 vezes e apresenta variações como a de trans-
missão e a de varredura.
A Fig. 1.3 apresenta algi.ms exemplos comparativos de tamanho de n\i ~
crorganismos, vírus e a tabela de equivalência das unidades empregadas na
microbiologia.
Neste capítulo abordaremos sonlente aspectos gerais relativos a bacté ~
rias e (t1ngos.
limito de t~oluçbo
do micrOK4pio 61ico

limõlc de r-kiçOO do
miuoK~io elelr6flico

100""'

.,._ C6!ulo cpilc!iol

1o"""
,.._. Hcmócio

J~stipfco,
l pm

VfrllJ

Micr0k6pio
··~
(100 Ju Ptoecínos

de vorrcduro
1 nm
(10 Ã)
JAMin.o6(õdos
O. 1 nrn J Álomos
(1 Á}

Fl'Jura 1.J - LtMes de ~dos ~épiosc e possiblidades de~ de e~ bactérias. ..<rvs.


~ei':omos.

1.2 - Morfologia e estrutura


1.2.1 - Bactérias
Quando observadas ao microscópio, a m<lior parte das bactérias a pre·
senta·se e m uma das três formas: esféricas,. ci1í1\dricas ou es piraladas. As bac·
térias de forma esférica denominam·se cocos e as cilíndric:is,. bacilos. Nas e-s..
piraladas, qi.1ando o corpo é rígido e apresenta várias espirais, recebem o
nome de espirilos e q uando o corpo é rígido, porém e1n forma de vlrg-u la ou
meia espira l$ recebe m a designação de vibriões (Fig. l .4).
Coco>

Bacilos
Cocobocilos

Vibriõo

Espiroqueto
Espirilo

Os cocos, ao se dividirem, podem dar origc1n a agrupa1ne1\tos caracte-


rísticos. Se agrupados em pares, são chamados diplococos; c1n cadeias, são
chamados estreptococos e em cachos, cstaíilococos. Os cocos qlle pcrn\anecen\
isolados São chamados de micrococos (Fig. 1.5).
Os bacilos que ao se dividirem permanecem em cadeias são chamados
de estrcptobacilos.
A morfologia iodividu;:il e os agrupamentos podem ser n1elhor obser-
vados qua11do as bactérias apresentam-se coradas. O método n1ais usual de
coloraç:io é o de Gran1, que permite a divisão em dois grandes grltpos:
gram-positivas e gr;:in1-11egativas.
Caracteristicamente, as células bacteria1"1as são pequenas. O diân1etro
das esféricas varia de 0,5 a 4,0 ~LO\, e1\q1.1anto que o comprinlento das cilíndri-
cas ("aramente ultrapassa 19,0 µn\. Recenteme1lte foi descoberta uma bactéria
macroscópic.l (0,5 iun de compriolento) habitando o iJlterior de peixes que vi-
vem a ct?nteuas de metros de profundidade nos oceanos.
Quanto à estrutura, a célula bactcriaua apresenta as características dos
seres p rocarióticos (Fig. 1.6).
Olplocooos

Estreptooocos

' .
Télrade

Sarein.a

Estafik>coco
< (

A célula é delimitada pela n1tn1braun citoplasnuftica, de composição lipo-


protéica e de importância vital. Além de regular as trocas com o meio a1nbiente,
a membrana executa várias funções que, nas células eucarióticas, dependem
de estruturas especiais : processos respiratórios (mitocôndrias), fotossíntese
(cloroplastos), sustentação de ribossomas (retículo), orientação da d ivisão nu·
clear (fuso) e biossíntese de estruturas de superffcie.
Externamente à membrana,. as bactérias p ossucnl un\a parede celular
rígida, q\1e garante a forma da célula e a protege contra a diferença de p res-
são osmótica entre o meio i1\ tcr1\0 e o ambie1\te (a p ressão dentro d'1 célula
pode ser vinte vezes 1naior do que fora). A parede é constituída de um arca-
bouço básico, denominado mucopeptídeo ou peptideoglicano, formado de
cadeias de polissac;:arídeos (unidades a lternantes de N-acetilglicosamina e
de ácido N-acetilmu râmico) unidas entre si por meio de cadeias peptídicas.
A esse arcabouço podem se unir proteínas, polissacarídeos e, no caS-O de
bact·é rias gram-negativas, uma fração bastante significa tiva de lipopolissa-
carídeos.
Algumas bactérias apresentam exter1\amcnte à parede uma camada mu-
cosa que, quando definida, é chamada de cáps11la. Esta te1n natureza polipepti-
dica ou polissacarídica e, em certos casos, ~ muito abundante, podendo então
ter inlportãncia industrial, como Sltcede com as dextra nas.
No citoplasma, além do material cm solltção (sais minera is, aminoáci-
dos, pequenas moléculas, proteínas, açtícares), encontranl•S-C partSculasF
tais como: ribossomos, constituídos de RNA e proteína, OJ\dc ocorre a sfn-
tese prot~ica; g rfi.1\ulos de material de reser\•a - amido, g licogénio, lipfdeos
ou fosfatos.
O material nuclear ("uclOOidt) é constitl1ído por l•m filamento duplo de
ONA (um cromossoma), não associado a proteínas e preso a uma invaginação
da membrana citoplasmática (mcsossoma). Ainda no citoplasma podemos en-
contrar pfasn1ídeos, pedaços de DNA circl1lares menores que o cromossoma.
Eles codificam informaçõ~ qt1e, c1nbora importantes para a célula, não são es-
senciais <)u indispensáveis.
A.lgu_m as bactérias móveis apréSt?ntam flagelos - filamentos longos
conslituídos de proteína contrátil e fixados a uma estrutt1ra basal loc(lliiada
na membrana citoplasmática.
Entre outras estruturas d ispensá,1eis, alg-u mas bactérias apre-sc1\tam /fnr·
brias ou JJili, que servem para aderência às superfícies, permitindo a f<>rmaçào
de biofilmes. Há que se destacar a existência de u1n tipo nlais longo de fímbria
- a fímbria sexual - que serve de ponte entre duas células por ocasião da
transferência de material genético de t1nla bactéria macho (f' } para t1n\a bact·é -
ria fêmea (F).
Menção especial deve ser fei ta a uma estruttira particular apresentada
apenas por certos grupos de bacté ri(ls, o esporo. Representa uma fase na
vida de certas bactérias qi1e se transformam em esporos, por motivos a inda
imperfeitamente conhecidos. Co1\sistc 1luma célula diferente da forma ve·
getativa norma l: tamanho menor, materia l rll1clear e citoplasma condensa·
dos, baixo teor de água, maior quantidade de cálcio e presença de ácido
dipicolíi\ico. Alénl da membrana citoplasmática, o esporo é ell,•olvido por
várias camadas. que lhe confere \1m revestimento bastante espesso. O as-
pecto importa nte dos esporos bacterianos é sua considerável resis têtlcia
aos agentes externos, p rincipalmente à ten\peratura; alguns esporos resis·
tem a te1nperaturas superiores a too~c dt1ra1\te ' 'árias horas. A<> contrá rio
do que sucede com os esporos de outros organis1nos, não são formas de re-
produção, pois cada bactéria se transforma e1n um esporo e este, encon-
trando eventualmente co1\dições favoráveis, germina, produzindo ape1las
uma bactéria (Fig:. 1.7).
A reprodução JlaS bact6rias é feita, na grande maioria dos casos, pelo
processo da d ivisão binária simples, na qual \tma célula, a tingindo u1n deter-
minado tamanho, d ivide-se ao meio, dando d\tas células-filhas iguais.
--- V
'~"°-·
N

1.2.2 - Fungos
Os fu1lgos são seres eucarióticos, heterotróficos, que 1lão siri.tetizam clo-
rofila, porta1lto r1ão fazen1 fotossíntese, não ar1nazenam arnido como 1naterial
de reserva e sim glicogê11io e não tên1 celulose na parede celular, com exceção
de alguns f\1ngos aquáticos. São ubíqltos, podendo ser encontrados no ar,
solo, água, ' 'egetais e animais.
Do ponto de vista morfológico, é co11,1enicrlte distingui-los em leveduras
e bolores. Essa distinção não tem valor taxo1lô1nico, pois a1r1bas as formas po-
dem ser encontradas nltm mesmo grupo de fungos.
As leveduras são geralmente unicelulares, de forma esférica, elíptica
ou filamentosa. O tan1anho varia de 1 a 5 µm de diâmetro a 5-30 µm de com·
primento.

o ,..., ,
""'.., .,,,ti
9 .Jt• '
_p-
- ..- --- -- -- -- () ~

Figura 1.8 - fom'laS de apresentaçlodaskvtô.Jras(esquerda) e bolotes(dll'tlta).


~t -.... li

Os bolores sJo conslituídos por células mullinucleadas (cenócitos). que


formam 1ubos chamados /rifas; ao conjunto de hifa.s dá·se o nome de m1cll10.
As hifJS podem ser contínuas Oll septadas (Fig. 1.8).
A c~ lul u((u\gica (leveduras e bolores), tcn\ ,,,t,11brana citoplasnufticn lip<>-
prot~ica, cují'I fu1\çào p rincipí'll é regular í'I S trocas com o oleio í'lnlbie1,te. Pos·
sui \tnln parede celular rígida, que confe 1·c resistência às p ressõC'S osnlólicns e
mecânicas. Sua natureza é polissacaridica cni nlaior proporçJo, contendo tí'ln\·
bém proteínas e lipídeos. No cito11Jas111n c 1,contra m·se. além dos co1npo1lcntes
usuais em M>luç3o, vacúolos, mitocô1ldrias, relículo endoplas mático, ribosso·
mas, m3tertal de r~nia (gordur3s e carboidratos). O núclro. tipicamente eu·
cariótico. contém nuc·l éolo, \•ários cromos.>0mas e his tonas en\rOl\1idos por
uma membr.lna nuclear (Fig. 1.9).

ANIMAL E PROTozoAAIO

fiaurii l ,t ~esen~ao ~ c:b 'AA euunota e w.~ pnnop.11$ ~a.s~ra ~ dolM'o


'lt(:fobiobO" M #'IO'OIÍ!JCbOrtdtGeran:I J- T~. ~rdctl l\íunke e Chnsttt L Case. 199S).

Os fungos aquáticos apresentam Jlngrlos para sua locomoç.lo e poucos


fungos pos.suem dpsula.
Os Npor0$ fúngicos têm uma importãncia toda especial. pois além de se·
rema íorm.-i mais íteqüeote de reproduçJo, s.Jo os principais " eículos de di.s~
se minaç~\o. ~ esporos podem te r origem rtS!'>CXt1ddí'l ou sexl1ada. 1\ nlancir.l
pela qual se (orma m e se dispõem , constiltli e lcme1\to importante na idc1ltifi·
cação, partict1lar1nc1, te nos bolores. Os tipos fundamentais podcn' ser vis t1a li·
udos na Fig. 1.10.
12 ~de~

.. .
••

I - ,;,o- o -

n
I
- - - ·-
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I
I ·=-
I
---
l'JSOIOO-

~·1 """""...

Cotride.os. Células isoladas ou em cadeias, local izadas na extremidade de


uma hifa, o conidióforo, freqüentemente se originando de uma célula especia1,
o esterigntn; êl'n outros casos, origirHl Jll-SC por brota 1ncr1;to do conidióforo.
Espornngiosporos. Es po ros localizados oo interior de u1n saco deno1nina·
do esporâ1lgio, fornlado na extremidade de unla hifa.
Arlroco11idcos. Resi1ltam sinlplesnle1lte da frag nle1ltaç-ão de u.n ta hiía.
Cla111idoconfdt'OS. Fornlados pot un'la célitla qualquer do micélio, c11'l tor-
no da qual se de-se1lvolve uma pa rede espessa. São mais resistentes que os ou·
tros tipos de espo ros.
Na reprod u{ào sexuada, os espo ros Slo formados pe la união de duas cé·
lt1las e fusão de seus nllclcos scgilida de d ivisão, o que produz tun nl1ntero
variável de células. Há, tan1l>ém, vários tipos conforme segue.
Ascosporos. Os esporos formados, e m nún1e ro de oito, fica nl contidos no
interior de um saco, ou asco, íornlado pela parede resulta nte da fi1sào das
duas céltllas i1liciais.
Dos-poros. For1nados pela fiLsão de uma célulJ 1nasculina pequcJ'ta com
uma céluJa fe n"linina grande.
Basidiosporos. Esporos formados na extre n1idade de células especiais
chan1adas basídios. Caracterizam os cogumelos.
Z1gosporos. Conseqüentes da fusJo de duas células idênticas.
Semelhante aos bolores, as levedur.lS podem se reproduzir assexu.ld.1 ou
~'(uadamentc. No primeiro caso, o processo mais comum é o brotamento, do
qu.ll rcsutt.tm c~ lul as·fi lhas inicialmente menores que a célula·1nãc. Alguma)
lt>vcdurJs reproduzem-se por divis.1o binária, como as bact~ria s.
A rcprodt1çl\o sexuada se faz pela íornlaçJo de ascosporos, isto~. esporo~
~:antidos 1\0 interior de um asco.

1.3 - Nutrição microbiana

1.3.1 Considerações gerais


&sicamcnte as necessidades nutr1tt\'olS dos microrganismos s.\o .1.) m~
m.is qul" a.s de todos os seres \'Í\'OS, que, p.ira renovarem seu protoplJ~m.., e
l"'crcercm suas atividades, exjgem fontt's de energia e fontes de mJtcritll plás-
tico. Nos seres superiores, todaviJ, encontramos apenas dois tipos nutritivos:
n) os \1egetais são fot()Ssi11tlticos, isto é, obtêm energia da luz solar, e a11to--
t16ficos, 1\t1trindo-se exclusivamente de subslôncias inorgâ1ticns;
b) os a1limais são quinriolróficos, obtendo citcrgia às custas de rcA('t)('S
químicas e /14·1erotr6fitos, por exigirem fontes orgânicas de carbono.
Entre os nticrorganismos, principalmente as bactérias, há uma \'aritdadc
de t1pos intermediários entre os dois tipos mencionados.

1.3.2 Fontes de """'li>'


As algds e algumas bactérias s.\o fotossintéticds. Nas primeiratt o pig-
mento principiJI é a clorofila, como na.:t pldnt.1s; durante o processo J águ\I é
utili1;'ldn como doadora de elétrons, com de)prcndimento de oxigênio. ES!>C
proecsso é importantíssimo e cerca de 50,-., do oxigênio atmosférico prové1n
dele. Nas bactérias, o pig1ncnto fotossintético 1\Jo é a clorofil., vegetal; nl'lo há
produçno de oxigênio, pois a ág·ua n~o ~ utiliz01da como fonte de elétrons. Uac-.
tcri4ls que utiliza1n compostos inorgS1\ÍCOS (H,S, por exemplo) para esse fim
,Jo chamadas de litolr6jicas; as orgn,,otr6flN1$ s.ão as que exigem doadores or·
~.!nicos de elétrons.

~ fungos e a grande maioria dtto, bKtérias são quimiotr6ficos. obtendo


t"'l'1etgi41 ;\~ cust.as de reações químit'.is, onde substr.ltos adequados ~o oxida-
Jos:. Os microrganismos litotróficos O'.ll:idam compostos inorgãnit'OS, €!'nquanto
-tue os orgJnotróficos oxidam compo~t0:, orgdnicos. No primeiro grupo en·
cont-rJm~ somente bõlctérias, alguma<t de considerável importância. Como
t>xemplo, as bactérias do género Th1oltacitlu:; são capazes de oxidar enxofre
prodt1zlndo ácido sulfúrico. 5.\o, por i~~o1 utilizadris na lixiviaçâo de mctaii;
l'lu min ~ r ios pobres, como de cobre ou de urllnio, onde o proc::csso qu,mico
usual seria pouco C<'onômico. No segundo grupo encontramos os fungos,.
além de u 1n gra1\dc 1\ú1ncro de bactérias.

1.3.3 - f ontes de material plástico


Para a renO\'ação da matéria v iv a~ os ele1nentos qua11titativamente mais
in,porta r1tcs são o carbo1,o, o J,idrogênio$ o oxigênio, o nitrogênio, o enxofre e
o fósforo.
Fontes de carbono. Para os microrga1,isn1os autotróficos a ú11ica fon te de
carbono é o CO; ot1 o íon bicarbon<'l tO, a partir dos q ua is co11seguem sinteti·
zar todos os con1postos orgânicos de que necessitan1. Fungos e a maioria
das bactérias são ltett•rotróficos, exigindo fontes orgânicas de carbono; des-
tas, as 1t1ais co111u11s são os carboidratos, partictdarme11te D-glicose; anti-
noácidos, ácidos monocarboxílicos, lipideos, álcoois e n1eso10 polfn1cros
como amido e celu lose podem tan1bén\ ser utilizados. Na realidade, qua l·
quer composto orgânico natt1ral e 1nuitos sintéticos podem ser utilizados
por algun1 nticrorganismo. Essa versatilidade é de uma extraordiná ria im-
portância, pcrn1itindo o en1prego de n1icrorganisn1os nunta extensa série
de tra11sfor1naçõcs úteis para o hontem. Na n1aior parte das vezes, o O\CSJllO
con1pt)Sto é usado para obter e11crgia e esqueletos de carbo110. Aléo1 disso,
os 1nicrorganismos heterotróficos são també1t1 capazes de fixar CO: (1nu itos
o exigem em quantidades maiores), embora 11âo como fon te ,J11ica de ca rbo-
no. Os elementos químicos oxigênio e h idrogênio gera lmente fazem parte
dos co1npostos orgânicos.
Fouft'$ de nitrogt?nio. Quanto à ne<:essidade de nitrogênio l1á, en1 Ji11has
gerais, três categorias de microrga1\iSn\OS. 1\lgumas bactérias retiran1 o nitro-
gê11io dire t<'l1nente da atmosfera e o co11vcrtc1t\ a nitrogê1\iO orgânico. Essa "fi-
xação" de 11itrogênio é exercida por bac t ~ ria s dos gêneros Az<>tobacter,
Clostridiu,,, e !~hizobi11111 . Elas executam o processo em simbiose com p lantas
legun\i1\osas. Estudos re<:cntcs tên' den,011strado que, alé''' desses, Ot1tros mi-
crorganisn\OS são capazê"s de fixar d irctantcl\te o nitrogê11io atn1osférico: algu-
1nas a lgas azu l esverdeadas e bactérias dos gé11eros Achrü111obncter, 'f\íotardia,
Pse11do1n<>nas e Aerobacter. Nova1ncntc tc1)\0S aqui u 1t1 pr0<:esso de co11siderá -
vel importância ~onôm i ca. Tais n\icrorga11isn\os podcn\ co1\tribuir de maneira
sig1,iíicativa na fertilidade e produtividade do solo. Nun\erosos fu11gos, a lgas
e a quase totalidade das bactérias utilizan1 conlpostos i1\orgâ11icos de 11itrogê-
1\io, en' cspe<:ial sais de antônio e ocasio1\alo1e1\te nitratos (raramente nitritos).
Fungos e algu1,1as bacté rias exigen' ío1\tes orgá11icas de nitrogênio, represen-
tadas por un1 número ' 'ariável de a o1iJ1oãcidos. ()e un\ 1nodo geral, a adição
de a11,i11oâcidos ou hidrolisados de proteinas fa\1orece o crescio1c11to da maio·
ria dos 111icrorganisn1os heterotróíicos.
fons inorgâuicos essenciais. Além de carbono e nitrogênio, os 111icrorganis·
mos exigen1 uma série de Ot1tros elementos, sob a fo rn1a de con1postos i11orgâ·
~--- IS

n1cos. >\lguns s.lo necessários em quanhdadts aptcciá,•eis - n1acro11111r;.e111t$ -


enquanto que, de outros_. bastam traço;; - 1'1kro1111lrir1rltS. Dentre os primeiros
remos o /Mfan.>, sob a forma de fosfatos, importante no metabolismo energéti·
co e na síntese de ácidos nucléicos: o 111.tofre, necessário por fazer parte de
olminodcidos como cistina e cisteína e parn a síntese de vitaminas conio bioti·
ni\ e tin1nh\ri; o pottfssio, ativador \.1C cnzin\ris e regulador da pressl\o osn\c\tica;
o 111ng11filo, ativ.1dor de enzimas extr:icelularcs e fato r importante na esporula·
ç3o; o ferro, necessário para a síntese dos citocronlos e de certos pignlento:,. O
papel dos n\icronut.rientt>s não é ti'lo bt'm conhecido. dadas as dificuldades de
~u e:ittudo. Tem-se, toda,·ia, demonstrado. em casos especificos, il necei,,i,ida·
de de elementos como cobre, cobalto, 1inco. manganês, sódio, boro e muitos
outros..
FotortS dr crNCimento. Denominam-se Íoltorcs de crescimento os compos-
tos orgJnlco~ indispensá,•eis a um dcterman.ldo microrganismo, mas que ele
n3o consegue sintetizar. Tais fatore:,, portanto, de\·em estar presentes no meio
p,1r.- qtac o n1icrorganismo po!->S<l cr{'S(er. ~luitos. désscs fatores são vi ta1n ino1~.
~m especial do con\plexo B; outras vc1.cs sJo llntinodcidos, nucleotfdcos e áci·
dos graxo:;. As necessidades dos nlicrorg.'lnisntOS, 1\e-sse particular, s.,o varia·
dfssln'lílS.
Un'l dos QSf)(.!CIOS importantes d("<iiori;,n in di~pcnsab ilidade result11 do fa to de
que, qu.n1\dO u1n 1nicrorganismo t>xige un\ determinado fator, seu cttscimcnto
ser~ limit.1do pt>la quantidade do fator presente no meio. Dentro de ccrtoi, linli·
tcs, o crescimento será proporcion.tl ao teor do composto limitante. JS).() pern'li·
tt .J ebbor.l(~ de um método de dowgem de certos compostos, baseado na
medida do cresctmento microbiano. Ess.l ~ .1 b..lse da dosagem microtuol~ico de
uma série de substâncias, principalmente aminoácidos e \·itaminas.
,
1.3.4 "4:ua
A águ;i nõo constiltli um nutriente, nt\lb é absoluta1ncntc indi s pcns~vc l
pnr,, o crescin1cnto dos mic;rorganisn'lOS. Seu papel é n\(1ltiplo. Con1 cxccçAo
dos protozoários, capazes de englobar portícuh.\S sólidas, os microrganis n1os
se nutren1 pcl;i passagem de substâncias c1n ~oloçJo através da membran:.i ci·
toplasmátic.-.. A água é o soJ,rente univeri,,al. Alén1 disso, a água exerce (unç.\o
primord10\1 na regulaçJo da p ressJo o:tn1ót1ca e, pelo seu eJe\•ado calor espt.'Cf·
fico,"" regul~lo térmica. A maior parte dos microrganismos, quilndo n:io es·
porulados, morre rapidamente pela desscc.Jç.lo.

1.lS Ox~ almOSfénco


Como n i.igtra, o oxigênio atmosférico n.lo é um nutriente e ft1nciona npe·
nas conlo receptor final de hidrog\'nio nos processos de respiração aeróbica.
Os n1icrorganisnlos tên1 comportamc11t~ diferentes 1l<l presença de 0 1 livre:
n1icrorgrinisn1os aeróbios exigem a presença de oxigê1\io livre; alguns, todolvia,
o exigem em pequena quantidade, nAo tolerando as pressões normais de O:
atmosférico; sJo os microatrófilos; microrganismos a1L4er6bíos nJo toleram a
pre~nça de oxigênio livre, morrendo rapidamente nessas condições; micror~
gJnismos /ncultat;vos tan to podem crescer na. presença con10 na au~ncia de
oxig~nio livre.

Entre as bactérias, enco11tr.1mos os três tipos de comporta111entos. Os


f\1ngos sno acróbi0$ ou factr ltativos, raran1cntc a11aeróbios.

1.4 - Meios de cultura


1.4. I - Considerações geraJS
Nas condições artificiai~ do lllboratório o crescimento de m1crorganis--
mos é conseguido pela semeadura dos mesmos em meios de cultur.a, cu;a
romposiç.lo de\'e atender aos princípios e~postos no item anterior. Dada a
\1.'ltil'dade de tipos nutritivos, é fáci1 compr~nder que não há um meio de cul·
turJ unlversal. Muitas vezes, o que é exigido por um determinodo microrga-
nismo inibe tota1mcnte o crescimento de outros; é o que sucede ro1n a m;,t~ria
org~11ica 11ecessária ao crescin1ento de gcr1ncs heterotrófiros que, 110 1nnioria
do3 vc1,C's, ittibc totalmente a prolif<.'ra('ÃO de autotróficos. Assiln, p4'rrt co1npor
um meio ndcquado, é necessário conlleccr a fisio logia dos microrganis1n& c1n
C3ludo. Lembramos que cada microrg~ni~mo duplicado ou multiplicl1do deve
possuir todos os componentes da célul.- origina1. Para se ter uma idéi..l ripro,i-
mada da composição química de uma bactéria, por exemplo a E$tl1er;cJ1i11 coli,
,·rj.l a Tab. 12. Os números apresent.JdO> >lo \'<~lidos para essa bact'1ri.l, quando
cult1v.id.i nas condições estabe1ecid01s; eh.o:; No são \'.ilidos para oult'Q) m~ror­
ganism0> (outras bactérias ou fungos), mh set\'em de referencial.

1.4.2 Composição dos meios de rultura


6a3icamente existen\ dois grandes grupos de meios de cultura: os meios
sinttticos e os meios con1pltxos. Chnnlnm·sc meios sintéticos àqueles cujo rom·
posiç-~o química é q\1alit::i.tivo e qua11til1.1tivan1cnte conhecida. Co113idere·se,
por exemplo, o seguinte meio: NI r,CI, 1.0g; K,HPOv I.Og; MgSO,. 71 1,0, 0,2g;
FcSO,. 711,0, 0,0lg; CaCI,, 0,02g; MnCI,. 4H,O, 0,002g; NaMoO,. 2H,0, O.OOlg;
água q.>.p., 1 L.
Temos aqui um meio que se cnquadrO' na definição de sintético. T.-am-
bém est.i de acordo com os principios gerais. já expostos, no que tange a fonte
de n1trogên10 e íons inorgãnicos; n3o contém1 entretanto, uma fonte de colrbo--
no nem ronte de energia.
Isso ~ueede porque o meio foi planejado para a cultura de germes fotoli·
totróficos: só contém material inorg~nico; a fonte de carbono é o CO, (prove-
nicnt<! do ar) e a fonte de energia ~a luz solar. Para que os n1icrorganismos
cresçJ1n nesse meio, eles devem ser incubndos e m presença de luz e C'm condi-
ções de oC"robiose.
Tabela 1.2 - ~~dl<&il~

i\fass.a ~iassa/ciélu l a Nlímcrodc Oifercnl('S


Macromolé<ula$ «<•
... {%)
X J()'""g '""'
mof«ular
mol«ula$/
céh1l.l
tipos de
n1olé<ulas
-
Pr<.>teína 55,0 155,0 4,0>ilO' 2.36().000 1.05-0
RNA (lota!) 20,5 59))
23rRNA Jl,0 1,0 >ilO' 18.700 1
16rRNA 16,0 S>itO' 18.700 1
SrRN;\ 1,0 l,9 oo:IO' 18.700 1
trtinsfe~ncia 8,6 2,5 KlO' 205.000 60
mcn:Hlg('iro 2A 1.380 400
1,0 )(10"
DNA J,I
Lípide 9,1 26,0
9,0
2,5 xio•
705
2,13
22.000.000 ,.1

Lipopolis.s.1carfd('o 3,4 10,0 1.200.000 1


4346
~1urocomplexo 2.5 7,0 1 1
(90-l)n
Cliçog~nio 2.5 7)) 4.360 1
1,0 x i O'
Tot.ll de
96, 1 273,0
m<1cromoltcuJ.ls
>-
i\fitcrl.ll em solu(IO: 2,9 8,0
Subunjd.ldcs. 7))
vilamina!l, rnetabólitO<S 1))
tons orgânicos 1,0 3,0
~

1
t-.iass.a seca • tot.tl 100)) 284))

~fasS.> de um11 bactéria: 9,5 x 10·0 S


Conteúdo aquoso: 6,7 x !()°'-'g
M:issn se<:.> de um11 bactéria: 2,8-1 x 10· 1 's
• Há quatro classes de f0$!olipídcos, c.1da uma d('lilseon1 con1pos~ \'ar!á\'els de ácidos graxos.

Se a esse meio de ct1ltura adicio1t<lrmos 0,5 g de glicose, ele continuaria a


ser enquadrado na definiç.ão de sintético, mas, contendo agora uma fonte or·
gânjca de energia e carbono (glicose), permitirá o crescin1ento de quin1iorga·
notróficos como, por exemplo, Esclierichia coJ;, habitante normal do i11testino
dos mamíferos. Trata-se de u1n organismo de excepcionais capacidades de
sf1ltese, pois, a partir da glicose e dos sais minerais do meio, co11segue fabricar
todos os componentes do protoplasma. Se quisermos, conttldo, CtLltivar uma
bactéria con1 características nutritivas semelhantes à E.coli, o bacilo tífico (Snt-
111011ella typJ11), será Jlecessário, a lém da glicose, adicionar o aminoácido tripto·
fano; S.typl1i não consegtte .sintetizar triptofano, que, para ela, como definimos
anteriormente, é um fato r de crescimento. Ot1tros anli11oácidos pode1n ser iil·
cluídos, perolitindo o crescimento de u m número cada vez n1aior de n1icror·
ganismos. O meio, contudo, a inda será considerado como sinté tico, pois sua
composição é semp re bem definida.
Se quisermos cultivar 1nicl'orga11ismos mais exigentes nesse meio, pode-
mos enriqt1e<:ê-lo com substâ11cias capazes de fornece r uma ,,a riedade grande
de vitan1inas e aminoácidos como, por exe1nplo, extrato de leveduras. Nesse
n1omento o meio passot1 a ser complexo, pois conté1n unl prod uto cuja com-
posição química não é perfeita mente definida, o extrato de leved ul'as. Na prá·
tica, a maior parte dos meios utilizados é do tipo complexo e as mais variadas
substâncias pode1n ser t1tilizadas na sua composição: peptonas, extrato de car-
ne, extra tos de órgãos animais como figado, coração, extra tos de vegeta is
con10 soja, a l'roz, ot1 outras como sangue, soro, etc.

1.4.3 - Estado fisico dos meios de cultura


0$ meios de cultura podem ser constituídos simplesn1ente po r solt1ções
de 11utrie11tes. Gera lmente os microrganismos têm maior facilidade de iniciar
o set1 crescimento 11esse tipo de meio, principalmente se o seu número é, de
início, peqtleno. Quando, toda,•ia, existe mais de um tipo de microrganismo
no material semeado, o crescin1ento final será co11stitufdo de uma mistura
destes, o que impede qtie se tirem conclusões a respeito da 11atureza e da ati-
vidade de cada um. Para que as características de um microrganismo possam
ser reconhecidas ou para que a sua a tividade possa ser devidamente aprovei-
tada, ele deve se encontl'ar em "cultura pura", isto é, não deve ser mjstu rado a
outros.
Para que se possa separá-los num material Oll nt1ma cultura líquida, há
necessidade de semeá-los na supe rfície de u m meio s6lido. Nesse caso, se o
material foi adequadamente diluído e o espalha mento ben\ feito, cada 1nicror-
ga1\ isn10 estará separado de seu \•izi1l ho e, multip lic<1ndo-se, formará un1a co-
lô1\ia de orga11isn,os iguais a ele, visível macroscopicamente e facilmente
transferí\reJ pai'a 11ovo meio, de onde crescerão em cultura pura.
Os nleios sólidos são preparados adicionando-se um agente solidifica-
dor às sol\1ções de n\1trientes. O agente n1ais usado é o ágar, polissac<1rídeo ex-
traído de a lgas, que fu nde a lOOºC, mas somente solidifica de novo ao redor
de 45"C. A ad ição de 1,5 a 2o/o de ágar ao meio de cultura líqt1ido é st1ficicntc
para a solidificação deles. Sendo un1 polissacarfdeo e, pol'tanto, de na tureza
o rgânica, o ágar poderá inibir o c rescimento de certos microrganismos a uto-
tróficos. Nesses casos, usa-se como solidiíicador a sílica-gel.

1.4.4 - Meios seletivos e diferenciais


Meios Sêletivos são aqueles cujas características impedem o cl'escime11to
de certos n1icrorganisn1os, pern1ilindo a pe nas o crescimento de outros. O
\

meio descrito 1\0 ite 1n 1.4.2., por exe mplo,~ seletivo pata foto litottóficos.
~luitas vezéS a seletividade do meio depende da adição de algum composto
inibidor dos indesejáveis. Assi1n, por exen\plo, corar1;tes básicos inibem o cres-
cimento de bactérias g ram positivas, enquanto que a azida sódica inibe as
g_ranl-negativ as.
ti.1eios diferenciais são aqueles que conferem características especiais às
colônias que, en\ condições 1\ormais, serian\ idê1"lticas. Assim, n1icrorganismos
íermentadores de lactose, semeados em meio contendo l ac to~ e um indica-
dor, dão colônias de cor d iferente das dos não ferme11tadores, pois, crescendo,
fermentanl a lactose, origin<:indo ácido lático, que faz ""irar" o i1\dicador.

1.4.5 - Conservação dos mi<'.rorganismos


Isolado um microrganismo em cultu ra pura, é 1n ister conservá·lo no la-
boratório para estudo ou \ISO futuro. Várias são as técnicas empregadas para
tal fim, conforn1e a 1laturcza do org(lnismo em qt1estão. A técnica mais co-
mun\ consiste em sentear e nl meio sólido distribuído em tubos e, periodica-
me1\te, transf{'rí-lo para novo n\eio. O tenlpo decorrido de unta transferência
para outra dependerá da resistência do microrganis1no. É converl iente que o
met(lbolismo microbiano seja reduzido tanto quanto possível, pois, 1\12-ssas
rondições, ele permanecerá viável por tempo mais prolongado. Para se co1\SC·
guir ta l 1•es ult.ldo, llá vários rC«1..1rsos que serão aplic'1dos, de acordo com o
tipo de microrganis1t)O en\ q uestão. Uma das técnicas 1nais s intples consiste
em se conservar as culturas à temperatura de geladeira; há germes que per-
manecem viáveis d urante meses. Outra técnica consiste em se recobrir a cultu-
ra com tinta camada de óleo nlineral estéril, reduzindo dessa íorma o
suprinlento de oxigênio e, conS<'qiienten\ente, o mctabolisnlO microbiano. To·
dos esses processos, todavia, e1\volven\ u1n trabalho intenso e constante, prin-
cipahnente quando o número de orga1\ismos na coleção é grande. A lém disso,
muita atenção é nêee.$Sária nas transferências, para evit<ir tuna co11ta1ninação.
Ot1tro problen1a importante decorre do fato de que, com o correr do tcinp-0,
muitos microrga1lisn\os pode1n sofrer n1t1tações e, com isto, terem suas carac-
terísticas a lteradas. Para se co11tor11ar <.>sscs i11convenientes, recorre-se ao p ro-
cesSo da liofiliwçíJo, que já exige urn ~uipamcn to espe<ial. t\1esse processo,
micro rganismos são suspensos em um meio adequado (leite ou albunlina, por
exemplo), colocados em uma ampola e rapidamente congelados no n\íninlo a
-30"C. Em seguida, proccd~sc à SC<'Jge111 do n1aterial por 11ma s ublimação da
água e, após isso, as ampolas sâo fech<\das ltermctican,ente. O material pode
ser con.scr\':tdo à temperat11ra ambiente. Outra técnica utilizada é a conserva-
ção em te nlperatura de nitrogênio líquido (-179'1C). Ernprcgal\do as duas (Lili·
mas técnicas - liofilização e nitrogênio líquido - os micro rganis1nos podc1ll
ser gt.1ardados durante 1n uito tempo, a té n1esmo anos, senl que haja nec:essida ·
de de renovação e sem a lterações em suas propriedades. Um método simples
de consen•ar fungos, é a través de seus esporos. Este-s são misturados à areia,
solo o u s ílica, previamente esterilizados.
ffá Instituições especialiadas que identificam, anna:z:enam e \fendem
bactéri<'IS, fungos e vírus. A mai.~ conhecida é a American Type Cl1lture Col·
le<:tion - ATCC.

1.5 - Crescimento microbiano


1.5.1 - Considerações gerais
Considera·se como crescimento, e1n sistemas bjoló.gicos, o aumento de
ma:,:,a resuJ1ante de um acréscimo ordenado de todos os componentes de
protoplasma. Assim., au.m entos de t~m•nho decorrentes de (enõmenos como
absorçlo de ~gua ou acúmulo dt!' material de resen·a não podem 5e'r conside-
rados como crescimento. Em microbiologia,. embora seja possí,·el e-t.tudar o
crescimento individual, geralmente o que se mede é o crescimen10 de uma
pOpl1laçJo, expri.mindo-se quer em term~ da n1assa total,. quer em funç:lo do
111ít;u•rode indivfduos.

1.5.2 - Medida de crescimento


O crescimento de un\a popula~l\o mlcrobinna em meio líquido pode ser
detcrn1inndo de várias formas.
a) Dflertninação do peso S«O ou ún1ido. A medida do peso úmido ó bastan·
te falha, dando apenas uma idéia g:ro~scira da massa microbiana presente.
Pre(ere-se, por isso, a detennínaç3o do peso seco, que sendo corretamente
e);ttulada, ronstitui o processo b.isK'O de medida de massa, sen.·indo romo ~
ferência na padronização de outros métodos. Uma amostra da suspefbão mi-
crobianó'l é centrifugada, o sobrenadante desprezado e o sedimento «lular
l.tvado algumas vezes com água destilada ou solução salina. Apó~ a última
ccntrifug.tc;3o, o sedimento é colocado em um vidro de relógio previamente
tar.tdo e, em seguida, secado em cstuf.l íll~ peso constante. Hã, contudo, «rtas
lintit11<;õE.>s inerentes a essa t~cnica . Sâo necessárias amostras relnti\'llffiénte
grondcs para que as medidas tcnhn1t1 signi(icado. Isso s ignifica que n!'.\o ~ pos-
sf\'cl acon1panhar o crescimênto de uma população microbiana desde as suas
fases iniciais,. sendo necessário espcrllr que a massa atinja um nível crítico. A
lavagent das células a11tes da SC<Cagem pode levar a perdas de material e, além
disso, componentes celular-(>$ solúveis podem ser retirados. O prc>chSO n3o
pode ser aplicado quando o meio de cultura contém partículas sólid.is tm su.s ·
pen$.I<>.
b) 1Ntern1111ação químia de con1po11~11trs c~l11laus. É posSÍ\'el calc-ular a
mass.ot microbiana pela dosagem de certos componentes celular<."s, como pro-
teína e ácidos nucl~icos. Esses métodos podem St:!r muito sensívei> e, portan-
to, llplíc~vejs a amostras pequenas. Seu inconveniente maior reside no foto
de ser a composição química das c~ l u l as microbianas, principalmente bact6-
rias, altrinlente variável de acordo co1ll as condições de crescimento: compo·
.. 1çào do meio de cultura. idade da cultur.l e ,·elocidade de crcscinlento. Para
w.tn.i dada ~rie de condi(ôes. todavia. tais método._ ~o bastante sensí,·eis e
rreciM>S.
e) 'furl1i1li1uetria. Consiste na medida da tt1rva<;âo de u ma suspensão mi-
crobi.;ina. Pt>dc·se medir a nbsorbâ 1\cia élll u m espectrofotômt'.!tro ou a capaci-
J.Jde de di-.persão da luz C'n\ un11\eÍE.'lc'.'>rnetro. V('rlíirou•sc- que i.l tuJ'\':t(.lO está
'"elacion.ld.l (Om a ma:i.~ de microrg.1n1~mos prffente. O proce"»O é extrema-
mente :iimpll'S, permitindo que se obtenham rcsult.1dos e constru.Jm curva~
;;-.1r.1 lelJml"'ntc ao dcse1\\'0l\'imento do processo. f l;t, contudo. f:.tore~ que in-
tl'ríeren1 conl a p re<isi\o dt) n\étodo, p ril\Cipali1\Cllle o tamaoho di1S células e
.. ua composição química. Jlé1n da presenç.1 de m\lterial particuladt> no n1eio
Je cultl1r.ii. P.ira obter bon-. resultado-., é portanto nt""'C\'s.._~rio con ..truir cur\'a&
Jt" calibr,1(~'º· com ba~ cm determin.lÇÔl"S de ~ Sl'<'O, para c.lda conjunto
Jt.> condiç-ões cxpcrimcn1,11:,.
O 1ltin1..:ro d e org:inis1nos presentes nun1a SU:!opcnsão ta 111bén1 pode ser
Jt.>têrn1inndo. ha,•endo pelr.1 iSS<> dois m~todc>s princip,1is.
1. Co11tasrn1do111ír1tt'ro total dr i11d1rfd1ttlS~ sem le\ olr em cont.1 M" E.'Slâo \'i-
"' ~ ou morro,. A técnica mdiS <:omum t.-sta em coloc.lr diluições conhecidas
d.i suspen!>:.o cn1 cJmar.ls de cont,1gcn1 e. !iOb o 1n icro~cópio , <'Ont.1r diret.l•
mí'n te o nún1cro de partículas prc:!'Cl'llCS 1'lu Jl\ dctcro'li11ado \'Olumc. O tatr,,
tecnica co1l~iste enl e!!ipall1ar-se un1n qua11tidade <'<>nhí'cida dJ !!oUSpcnsão
numa áre.1 determinad.J de uma lâmina, corá-la e, ~m seguida, co11t.1r o nú-
mero de mlcrorganismo31 presente., cm ,·ári~ <"ampos do micro'<6pio. Sa·
ti~ ndo-se a .irca do c.1mpo. calcula·s<.' o ntímero n,\ s1.1~pcnsão . Ex1-.rcm ainda
Jparell1(l:, rlctrônicos que co11t,'\m nuton1aticamentc o 11ti1nero de p~rtículas
Je un1a Su!!ipCnsão.
2. C(lulO,\rl'111 dt 111irrors,aui.sl11M rid1yi5. É o m~lodo mais ulili7.1do para
'("lntagem de bactérias e Jc, eduras, e nc~ caso são ít-1l.1s dilui(ÕC'S .1dequadas
J.1 suspcn~''º· semeando-M! .1líquotas na ~uperfícic de meios sólido~ . Após um
rcríodo de h\Cu ba<;âo, cont.1-se as c-0lôni.1s qt1e crcsccr.1111. Se o csp.1lh.1mento
toi bem Ít.. ilo e homogêneo, cada cúlõniJ corresponde a uma bactéria. Leva1\•
Jo-sc e-m 001\lcl a diluiç.io feita, calcula·M! o número de bactérias ou lc\'t..)(iuras
\ 1\·as prt"S<'nlcs na SU>pl'n!!Jo original. Dada a ~..1bilidade dr duJ.s <:élulas
t1carcm mtuto próxima .. no momento do espalhamento, a colôni.1 formada
...~rá a sobreposição de duds. Em "ista dessa pos~ i bil idadé, o 1t1étodo é apro·
rriadamcl'ltC Chá!'nado de contagen1 de unidadeJor11111d()ta dl! colónia~.

l .S.3 Crescrnen1o eicponencial


Qt1ando se acompanh.1 o crescimcnlo de microrg.1nism0> cm meio líqui·
do, durt1ntc c1 espaço de tempo em qut ,, quantidade ele l'\ utrientcs é superior
,\s neccssidcldcs destes e nind,1 ni\o se .1cun1ttlot1 un1J qu,1ntidad c significativa
Jc substât\Cias tóxicas. \'erifica·se qui.• t1 crescimento, na maioria dos (asos. é
expone1\cial, is to é, o alLmento de número ou massa se faz segundo uma pro·
g ressão geométrica.
Tratando-se de microrganismos como bacté rias, certas alg(ls unicelula-
res e algumas leveduras que se multiplicani por d ivisão binária, temos

N =N, .2• , (1-1)

onde N é o n(1n1ero de microrganismos ao fim de 11 divisões (ou gerações) e t'l0


é o nún\cro inicial.
Empregando os logaritmos dos números, temos

logN =logN, +11 1og2 (1-2)

O número de gerações será:

=1ogN- logN, (1-3)


11
log2
A velocidade exponencial de crescimento, R, é expressa pelo n(Ln1ero de
gerações na unidade de tempo:

R • -"- . 1ogN -logN 0 (1-4)


t -t 0 log2( t -t 0 )
A reciproca de Ré o tempo de geração:

C=2_=t-t, (1·5)
R 11
Tais equações, etltretanto, somente se aplicam a microrganismos que se di\•i-
dem bi1tari am~\te e em 001\diçôies que garantam 100% de viabilidade. Assim sen·
do, ~ mais conveniente aplicar-se uma equação mais geral, onde se leva em
001\Sidcraçào a variação da massa X d~ protoplasma, em função do tempo:

~ •µX (1·~
dl
lsso significa qtle a velocidade de crescimento é proporcional à concen·
tração de mjcrorganismos nt1n\ instante dado. A fração pela qual a população
c r~e na unidade de tempo é dada porµ, que representa a velocidade t--Sptcfjica
de creSt:i1'11~t1to,
1 dX (1 ·7)
1•=x · d 1
A integração da exprcssâo (1·6) leva a

111 -X =µt (1-8)


x,
ou

ln X =/11 X 0 + ~tt (1-9)

Transfor1nando para logar itmos decimais,

(1-10)
logX • logX 0 + ~·t
2,3
Projetando-se num gráfico os \•atores do log X contra o tempo, obtém-se
uma reta, característica do crescimento exponencial.
1.5.4 - Fases do crescimento microbia1lo
~óbvio que, numa cultura descont(nua,. as condições não permanecenl
ideais por muito tenlpo. Logo a quantidade de nutrientes con\eça a diminuir e
produtos do metabolismo microbia1\0 vão se acumulando cada ''ez mais.
Essas modificações têm uma considerável influência sobre o crescimento dos
microrganismos. Construind<rsc u1n gráfico global do crescimento microbia-
no em cultura descontínua em nleio lfquido, obser,•a-Sê que a curva represen-
tativa desse crescimento apresenta várias fases (Fig.1.11).

Fase
estaeioll6ria

,..,, ..
Rgvn 1.11 - Fases da curva de ~to micrQOOno,

a) Fase de "lagN. lnicialmcnte há um período em que contagens não re-


velam aumento de número. Determinações de massa, todavia, geralmente
demonstram que há um aumc1lto, reflexo de um aumento no tamanho dos in-
divíduos. Essa fase só ocorre quando os microrganismos semeados provêm de
uma cultura velha, não mais em crescimento exponencial. É a conseq\iência
de uma necessidade de renovação dos microrganismos que, em culttlras ve-
lhas, já perderam certos sistemas enzimáticos por esgotamento do substrato;
ou estâo deficientes e1n ácidos 1lucléicos e Ol1tros componentes importantes do
p rotoplasma. Ao serem colocados em novo 1neio de cultura, antes de inicia.renl
st1a multjplicação, passam por essa fase de renovação; aumentando de ta ma·
nho em co1lseq\1ência da síntese de material novo. É claro que nlicrorganis·
1nos crescendo cxponencialme1ll'e, semeados enl meio idêntico, não apresen-
ta1n fase de lag; aprcsentá·la·ão, todavia, se o novo meio fo r mais pobre que o
origina1. A semeadura de microrganismos, mesmo velhos, e m meio mais rico
que o original; leva na maior parte das vezes a uma st1pressão ou redução da
fase de lag.
b) Fase de cresci111e'1to expo"e11cial (fase log). Nessa fase, realizam-se as
co1ldições descritas e1n 1.5.3. Os 1nicrorganis1nos se encontram na plenitude
de suas capacidades, nt1m nleio cujo st1prinlento de nt1trientes ~superio r às
necessidades do organismo semeado. A velocidade de crescimento dX/dt é
uma função da massa X e a velocidade específica µ é constante. Essa é, senl
dúvida alguma, a fase mais importa nte do crescimento microbia1lo, (orne·
cendo dados fundamen tais para os estudos de fisiologia, de cinética, para os
quais a \1elocidade específica é lllll parámetro de 1náxima importância. Nessa
fase é possível estudar a influência de tima série de fatores, a nalisando as
modificações in trodttzidas na curva de crescimento e ila composição do
meio de cultura (consumo de substrato, aparecimento de produtos do me ta~
bolismo etc.).
e) Fase estacio,,ária. Ao fim de u.nl certo tempo, \•ariável com a natureza
do microrganismo e condições de ct1ltura, a \relocidadc de crescimento vai di-
minuindo até a tingir a fase em que o númel"O de novos indi\1Ídl1os é igual ao
número de indivíduos que morre. Em termos de n1ass.a pode lla\rer, durante
um certo tempo, um ligeiro aumento. Essa é a fase estacionária, cuja dt1ração
varia consideravel1ncnl'e. As causas dessa parada de crescimento podem ser o
acúmulo de n1atabólitos tóxicos, o esgotamento de nutrientes e o esgotamento
de O,.
A influf!ncia do acúmulo de metabólitos tóxicos é particularmente cvi·
dc1l tc e1n 1neios conte1\do carboidratos fermentáveis; o acúnlulo de ácidos
orgâ1licos rapida1nente inibe o crescimento. O tamponamento do meio per-
mite t1m rendimento maior.
O esgotamento ocorre num certo momento em que a qt1antidade de
nutrietltes torna·sc insuficie1lte para a população microbiana existente; o
crescimcrlto cessa. Nem se1npre, todavia, esse é o motivo principal; a nelttra-
lização de produtos tóxicos, a acração ou ambos, podem promover unl
novo surto de crescimento, mostrando que ainda havia ttma quant idade su·
ficiente de alimento.
0 esgotamento de Ô 1 é u1n (ator importante apenas para Olicrorga·
1liSOlOS aeróbios ou facultati\ros. Nu1na cultura estacionária (senl agita·
~ ztut- 1S

( l O), a di(uslo de oxigênio nJo se Í•l. suflcíentemente depreisa para su-


pr1r as necessidade daqueles localizados nas camadas mais proft1nd3s do
meio.
d) fase de declínie>. Depois de u1n certo tenlpo. o número de org.,nlsnl0$
que 1tlc>rrc torna·sc progressiva1llCntc s upe rior .ao dos qtLe surge1n. Eventual-
mente o cu ltura se esterili1..a. A durnç3o dcssn f,1se é, também, extrClllíllllcnlc
,.,,rlávcl.

l.S.S CulliYo contônvo


O que foi descrito re(cre·se a um <"rtS<imento em cultura descontínua,
n.1 qual o meio de cultura não~ reno\•ado. Nesse tipo de cultura é Í.i<"il obser·
'.1r que, a f)4'rlir do momento em que o mcao é inoculado, as condi(l>cs rome--
~am a \'.lriar de forma progressi\•a. Emborot muitos est\1dos po»am ser
&e'\ ados a efeito com pleno êxito n('Ssa.s condiçãt!s. seria ideal estudar o cresci·
mento microbiano de maneir.l tal que todos os pJr.lmetros se mantives::i.em
con'>tllntcs. Isso se tornou possível com o proccSSô de cultur.1 continua, cn\
que novo meio de cultt1ra é adicionado cons tantemente ao sistcnla, do qual se
retira un' volu1l\C correspo11dcn1c. Unl csquC'ma do quimiostato encontra·SC
n• Fig. 1.12.

--
Ih-·--·-
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,., º""rll
'
'.

O estudo do cultivo contínuo de 1n icrorganismos íaz parte dos objctlvos


doCopltulo 12 do Volume 2.
l .S.6 - Fatores que influem no creS<:imento
a) Te111perat11ra. P<ira todos os nlicrorganismos existem três tempcratt1ras
cardeais: (a) tcmpcr<itura 1n[nima, abaixo da qual não há crescinlento; (b) tem·
peratura máxima, acima da qual não há crescimento e (e) temperatura ótima,
onde o crescin1ento é máximo. Oeve·se salientar que, para outras atividades
microbianas, existem também temperaturas ótimas, que não coincidem neces-
sariamente com a temperatura ótima de crescimento. De acordo com essa tem-
peratura, os microrganis1nos pode1n ser classiíicados em t~s grandes grupos:
termófilos, cujo ótin10 se localiza em torno de 60°C;
criólilos, cujo ótimo se localiza em torno de lOºC; e
mesófilos, cujo ótimo está entre 20 e 40°C.
Para nlicrorganismos parasitas de animais de sangue quente, o ótimo,
em geral, localiia-se ao redor de 37ºC, enquanto que, para os habitantes do
solo, cereais etc., o ótimo se situa entre 20 e 30ºC.
b) pH. Como a temperatura, existe sempre um valor de pH ótimo e pH
máximo e mínimo. A maioria dos 1nicrorganis1nos tem seu ótimo em torno da
1\cutralid<idc. Muitos processos fermentativos, entretanto, são executados por
n1icrorganisn1os, que se desenvolvem melhor em valores de pH ácido em tor·
no de 5. Raros s..'o capazes de desen\rolver stul atividade cm limites extre1nos.
Exceção notável é o Thiobacill11s tlliooxidaus, que transforma enxofre en1 ácido
sulf\írico, proliferando ben1 em tomo de pH t e, no outro extrenlo, o Vibrio
'º'""'ª'agente causador da cólera asiática, que se desenvolve em pH 10.
e) Oxigê11io. O efeito da variação na quantidade disponível de oxigênio
se faz sentir no crescimento de microrganismos aeróbios, para os quais é in-
dispensável, e no de facultativos que podem crescer também na ausência de
O ?. No primeiro caso, o efeito se traduz no maior ou menor rendimento da
cultura, enquanto que no segundo, al~m da diferença no rendimento, há dife·
renças se11síveis na velocidade do crescimento e 11os produtos da at-ividade do
microrganismo. Isso por várias razões. Em priineiro lug<ir, o metabolis1no ae.
róbio é muito mais eficiente, fornecendo 11ma quantidade 1nuito maior de
energia, que ten\ con\o conseqiiência um cresci1nento 1nais rápido. Em scgu.n·
do lug<ir, a ·via aeróbia tem geralmente como produtos íinais do inet<ibolismo
CQ? e ágtLa_, enquanto que a via anaeróbia, fermentativa, tem como prodtttOS
finais uma série enorme: de produtos orgânicos que variam de acordo com o
microrganismo empregado e que, na maioria das vezes, são de natureia a ini·
bir o crescimento microbi<)nO. Assim sendo, quando se deseja obter grandes
1nassas de microrganismos, o proc~ usual consiste em se promover uma
<ier<içâo vigorosa da C\tltura, qlter por borbull,nn1cnto de Jr, quer por agita·
ção, ou ambos si1nuJta11eamente. Co1no já foi mc1\cionado 1\0 i11ício, tais 1n~to·
dos só inflt1encian1 o crescimento de aeróbios 0\1 fact1ltativos.
d) i'l.Xitnçào. Uma das con seqü~l\cias da agitação é promover uma m ~ l ho r
.1er.1ção do meio, f<t,1orecendo o crcsci111c1\ lo de aeróbios e facultativos. Além
dis.~. cntretJnto, a agitação promove uma homog<:1\eizaçâo dos nutrientes no
meio de ctdtura e unta d ispersão dos produtos ntetabólicos, o que também fa-
\·orece o crcsci1ncnto de 1naneira apreciável, inclusive de nl iCl'organis n\os
.i.naeróbios.

1.6 - Controle dos microrganismos pela ação dos agentes


físicos

1.6.1 - Considerações gerais


Oenomi1la·se esft•rili:nção o processo pelo qual são n1ortos. inativados ir-
reve rsiv<:htu~ nteou retirados todos os orga11isn1os de uot ntaterial ou suspen·
são. i11clusive as íorntas esporttladas. Gel'ali11c1l te os processos empregados
par.1 esse f-inl são processos fisic-os, por seren' n1~1is eficientes e. com alg un1as
v:ceções, 1n enos d is pe11diosos que os químicos.

1.6.2 - Temperatura
De todos os processos empregados para ntatar 1nicrorg;;inisn1os, o calor
é, seo1 dúvid~l algt1n1a, o ntais eficiente e econôntico. Pode ser emp regado de
duas maneiras: seco e úmido. O cal<>r seco age pron\ove1\do un1a oxidação
'lti-olenta de con'lponentes do protoplasnla. Sua cíiciênci.:1 é comparativamente
baix,1, pois não te1n ntuit.t c,,pacidade de penetração. r\lém d isso, 11ào é todo
tipo de n1ate rial que pode ser s ub1ne tido às t('ntpt:ra turas 11eccss;;irias par,t es-
rerilizaçt\o pe lo calor seco (160 a ISOºC du rar'lte u1n tcntpo n1ínin10 de unia ou
duas ltor;;is). Emprega-se para vidraria_, óleos ou pós; ne n1 todo material me tá·
lico pode ser esterilizado a seco; certos i1lstrunlentos delicados poden' perder
o corte ou a t~nlpt:ra. O processo da f1a111bager11, utilizado nos labor<itórios de
microbiologia par(! esteriliz.ar a lç3s e fios de p latina, consis te em passar-Sê o
material dire tanitnte na clta nla do bico de Btutsen.
O calor \Ín1ido é muito mais eficiente. .i.\ge prOnlovendo a dcs11aturaçâo
de proteínas e d iSS<>ltlÇà<) de lipíd(.•<)S, o que ta nlbé-11\ co11t1·ibui pa ra intensifi·
caro prioteito efeito. Te1ll alta c.apacidadc de penetração e pod ~ ser titilizado
~ l'cl unta grande variedade de n1ateriais, inclusi\'C biológicos. 1\ tc1nperatura
de 60ºC. durante tuna 11ora, ~suficiente para matar as íotnlas ' 'egetativas de
:odos os n1icrorgal\is nlos, cxcctua1\do ·st: os ter1nófilos, natura ln1ente. A tOOºC
as fo rntas vegetativas 111orrcnl en1 po\1cos minutos; se n1antida essa tentpera~
tura d ur.-.1, te 15 n\inutos, n1orre ta n1b6rn a 1naioria dos esporos. Há, contudo,
esporos, pri11cipa hl1C"ntc de saprófitas, que podeni resistir ao aque,-cimento a
tOO;C durante várias hor(ls, s uportando mesmo te1npe raturas t1m pouco 1ttais
.i.ltJs. 1>ara matar qualquer tipo de n1icrorga1-.isn\o, i1lclusive todos os tipos de
esporos, c1nprega·sc vapor d 'água aquecido a 120ºC, sob uma pressão de uma
atmosfera acima da norJnal, durante 20 minutos. O aparelho utilizado para
esse fim é a autcx:laue, que consiste num recipiente de paredes resistentes onde
se coloca o material. O vapor poderá ser produzido pelo aquecimento da âgua
contida na própria autoclave ou ser introduzido por tubulação adequada.
Para que o processo seja eficiente, é indispensável que se evite mistura de ar
ao vapor e que o material esteja acondicionado e distribuído de forma conve-
niente.
A pnsteurizaçho coi'lsiste no aqi1C<"i1ne1\tO a 62ºC por 30 mi1\utos, seguido
de um resfriamento brusco. Não é um processo de esterilização, tendo sido
inicialmente empregado para destruir os 1nicrorga1\ismos patog~n i cos presen-
tes no leite. Além disso, utiliza-se esse método para interromper certos pro-
cessos microbiológicos industriais qua1\do estes atingem u1n certo ponto. É o
qlte sucede na fabricação da cerveja, por exemplo.
De um niodo geral, os microrganismos são mais resistentes ao frio do
que ao calor. Com algumas exceções, a temperatura de geladeira (4ºC) pode
ser c-mpregada para a conservação de culturas. Temperaturas inferiores a OºC
podem ser letais para microrga1\ismos. O co1\gelamento lento promove a for-
n'lação de c-ristais de gelo, que perfuram a membrana e a parede celular. A al-
ternância de congelamento e descongelamento é tim processo bastante eficien-
te para lesar e matar microrganismos. O congelamento br\lSCO a temperaturas
inferiores a -30ºC não leva à formação de cristais, e os microrganismos geral-
1nente sobrevi\•Cm durante mllito tenipo nessas condições prii\c-ipahlientc- se o
processo é seguido de um dessecame1\to a vácuo. ~ é a técnica da liofiliza-
çào, empregada para a conservação de microrganismos e de material biológi-
co em geral.

1.6.3 - Radiações
De- interesse prático pela sua atividade letal sobre microrganismos sãos
as radiações ultravioleta (UV) e as radiaçôêS chamadas io,,i.ututes.
As radiações UV, principalmente as de comprimento de onda entre 240 e
280 nn11 são absonridas pelas pttrinas e pirimidinas dos ácidos nucléicos, pro.-
vocando mutações. An~is aromáticos de aminoácidos também absorvem radia-
ções, levando à inativação de enzinia.s. Ambos os efeitos podc-m levar a célula à
morte. N(l prátic.-., empregam-se lâmpadas de merçúrio como fonte de radia-
ções UV. O seu emprego em lugares públicos, salas de operação, berçários, en-
fermarias e salas asséptiças, tem sido bem sucedido. Os restdta.dos demonstram
que há uma redução apreciável da conta1ninações e das infeções cruzadas. Pre-
caução indispensável é evit.1r a incidência direta da luz ultravioleta sobre as
~soas. pois ela produz, conforme o tcn\po de exposição, queimaduras graves
e lesões severas da córnea.
As radiações ionizantes exercem atividade de forma diferc1\te, pois ati.1\·
ge1n os átomos e são incomparavelmente mais eficientes. Enqi1anto que, para
w matar uma ~lula de Eschni<"J1UJ t0l1 Slo necessários ter
quat1ta, no caso dos
r.110:. UV, apenas 1 quantum é suficiente quando se trata de radiações ioniz.-.n·
h Seringas, agulhas e 0\1tros materiais descartáveis têm sido esterili.tados
por esse processo.
1.6.4 - Filtração
A passagenl de soluções ou gases a tr;iv~s de filtros de poros suficiente-
mente pequenos que retêm microrganismos pode ser empregada 1la rcmoçJlo
Jt> bact~rias e fungos, deixando entretanto passar a maioria dos vírus.
As \'eJas porosas de porcelana foram muito usadas no passado e atual·
mente sJo empregadas membranas filtrantes de nitTQcelulose e acet.1to de ct-
ulose para esse fim.
A filtração tem como principais aplicações a esterilizaç3o de soluções
ttrmossensíveis e na entrada de salas ou ambientes onde qualquer microrg<.l·
~ismo do ar é indesejável. Muito comum é a esterilização do nr que é borbu·
hado cm nleios de cultura, sendo bastante empregados filtros de IA de vidro.

1.6.5 - Vibrações sônicas


Sons audlvcis tém uma freqliência que nào ultrapassa 2,4 kl lz; entre 9,0 e
~,o kl lz, as freqüências são supersõnlc:is e acima de 200,0 kHz, ultra-sônicas.
\i'u itos microrganismos são sensíveis a víbrações ultra.sônicas, sendo destruí·
dos por li.se e extra,•asamento do conteúdo celular. Uma das explicações para o
f.110 ba.sel.t-.se no fenômeno da a\ritaç.lo: os gases dissolvidos em líquidos sub-
metidos a tais \•íbrações saem de soluç.lo sob a forma de microbolhas e estas,
\ tolentamente agitadas, chocam-se contr.l as paredes microbianas. rompen-
dQoo'1.S. O empn.--go da sonicaçJio par;i" ruptur.i de microrganismos tem sido útil,
por permitir a obtenção de frações independentemente de um triltamcnto quf-
mico ou t~rmico e isentas de partículas inert·e s. como a alumina.

1.7 - Cont.role pela ação de agentes químicos


1.7.1 - Considerações gerais
Classicamente, os agentes químicos empregados para matar ou inativar
microrganismos são classificados em dois grandes grupos: desinfetantes e
agentes quU:nioter.tpicos.
C>t'Jinfttont~. São substâncias que agem diretamente sobre estruturas
microbianas, causando a morte do microrganismo. Não matam necessaría·
mente todos microrganismos. Devem diminuir o nUmero, de tal forma que 0$
indesejáveis não representam mais um risco para o processo. As principais
estrt1tur:is e moléculas alvo são a membrana citoplasmática, scnslvcl aos
.tgcntcs capazes de dissolver os lipídco:t que a compõem, e as proteínas cnii·
1náticns ou estruturais. Os mecanis1nos de nçi\o são. os mais dive rsos, C01llO
oxidantes,. desnaturantes, alquilantes, etc. Pelo fato de agirenl sobre estrutu·
ras e moléculas comuns a todas as células, quer de nlicrorga1\ismos, quer de
seres superiores, os desinfetantes são tóxicos gerais, não possui1\do cspccifici·
dade para este ou aquele microrganisnlo, 1\ão podendo ser introduzidos nos
organismos superiores. É claro que 1\em todos os microrganimos são igual·
mente sensíveis, mas o que sucede,. em geral, é que quando um microrganis·
mo é 1nais resistente, ele o é a tod()S os desinfetantes indiscrinlinadanlente. ~o
que acontece, por exe1llplo, conl Pseudo111ottas aerugiuosa. Certos desinfetantes,
tendo u.n\a ação nlenos tóxica, podem ser ltsados na s11ptrJfcie de tecidos vi·
vos. Nesse caso particular, toma1n o 1\ome de a11ti~pticos.
Agtttlts q11i111ioterápicos. São substârlcias que interférem, na grande maio-
ria dos casos, em determinadas vias 111ctab6licas, isto é, a ação dos agentes qui·
Jllioterápicos se restringe às céltdas de nlicrorga1lismos que possue1n a via
metabólica sensível. Assim, por exemplo, a sulfanilamida age competindo
c<>nl o ácido p-aminobenzóico, que é um metabólito essencial para a sh\t~
do ácido lólico. Células ou nlicrorga1lismos i1lcapazes de sinteti~ar ácido fóli-
co são resistentes àquele agente. Os agentes quimioterápicos podem ser sinlé-
licos, como é o caso das sulfas, ou naturais, conlo os al\tibióticos, sendo então
produzidos por mic-rorganis1tlOS; é o e-aso da penicilina, e$treptomicina, tetra-
cic1ina,. etc.
Tanto para os desinfetantes como para os quinlioterápicos, há a possibi·
lidade do agc1lte ser 111icrobicida, dctcrn\inando a morte do 111itrorga11is111(), ou
rnicrobiostático, apenas iinpedindo sua proliferação. Em mllitos casos, essa dis-
tinção é pouco nftida e a. mes1na subst.fincia, depcnd('ndo da. dose ê do tempo de
contato em que foram empregados, poderá agir de uma ou de outra forma.
Deve-se ressaltar que, enl te<:nologia i1\dustrial, o termo desinfetante é
utiJizado para designar qualquer agente quí111ico e111pregado 11u111 processo ,,,;cro·
biol6gico para inibir ou 111atar '"icrorga11is111os co111a111ina11tes i111lesejáveis. Tanto
podem ser utilizados agentes do primeiro grupo (desinfetantes) como do SC·
gtLndo (ql1imioterâpicos).

1.7.2 - Determinação da potência dos desinfetantes


O p rocesso empregado obrigatoriamente é a determinação do chamado
coeficiet1te fett6lico. Consiste na comparação, em coildiçõcs padronizadas, da
ativid:'lde de um desinleta1ltc qualqu('r co1n a atividade do fenol, considerado
como padrão. A relação entre o inverso da dilltição de desinfcta1\te que mata
o 1nicrorganismo enlpregado (Snln1ouella typl1i, l'se1ldo111011as acrugiuosa ou
Staphylococc11s aure11s) em um determinado tempo e o inverso da dilui\âO de
fenol ql1e mata o mesmo microrganismo, nas mesmas condições e no mesmo
tempo, con.stitui o coeficiente fc1\ólico. Apesar de tal determinação ser obriga·
tória por lei, o coeficiente fenólico é um índice extrenla1nentc precário da a ti-
vidade de um desinlctante, a não ser que e le seja, também; de natureza
fenólica. Isso porque desinfetantes diferentes, tendo mecanismos de ação dife·
rfltt·e s, serão afetados de forma di,•erSJ pelas condições dt'! uso. 1\ssim, ten'
grande influênc;ia na a tividade dos desinfe tantes o fator de diluição. Verifi·
cou·St'! ser válida a eqttac;ão
C" ·l ;; K
onde C é a concentração, to tt?mpo," o coeficiente de diluição e K uma cons·
tantt'!. Dcsinletantes como o fenol e derivados têm u = 1. Isso significa que,
sendo diluído à rnetadt?, o ten1po necessário para se obter o rneso10 efeito será
o dobro. Já o bicloreto de mercú rio tem 11 = 6. Sc1,do d iluído à n1etade, o tem·
po de aç!\o au1ne1\tará sessenta e qltatro ve~es. Por esse n1otivo, atualn\e1,te se
prefere (lvaliar a a tividade dos desinfetan tes con\ provas realizadas nas cortdi·
('Õt-"S de llSO.
Outros fatores infloem consideravelmente na a tividade dos desinfet<1n·
fes: temperatura, pH, p re~nça de sais e, principalmente, presença de proteí·
nas estr.-anl\as. Certos agentes, cxtre1namente ati\'OS "iu vilro··, perden' qu<lse
totaht,cnte S \1a <ltividade, qt1ando e m prest'!r'lça de n1ateriaJ orgânico c:ontendo
proteína, em virtude de sua grande afinidade por e la. É o que sucede, por
exemplo, con1 os con\postos de mercú rio.

1.7.3 - Principais grupos


Não há un'a classificação única aceita, de tal forrna que apresent<lre·
mos os <lgentes químicos e 1n grupos que tenhan1 em cOn\um as funções quí·
micas (álcoois, aldeídos, e tc.), ou e l<!mentos quínlicos (halog&nios, rnetais
pesados, etc.), ot1 mecanismos de ação (agc1, tes oxidantes, (!gentes de super·
ficie, etc.). Cabe lembrar ainda que cada 11m dos compostos cit<ldos abaixo
pode ter seu emprego como esterilizan te, desinfetante, a1,tisséptico ou até
conserv<lnte, devendo no entanto sercn' cons\d tados livros especializados
quar\IO à concen traç~o, tempo de conta to e n1odo de emprego.
Álcoois: etilico, isopropílico, propiler\oglicol, etilenogJic:ol.
1\ldeídos: fórmico (formol), gl\1tárico.
Fenóis: fenol, cresol, timo), clorocrcsol, cloroxilenol.
Ácidos orgânicos: acético, lactico, bcnzóico, capróico.
Halogênios: iodo, cloro, ácido J\ipoclo1·oso. cloraminas, hipoclorito.
f\1etais pesados: sais de mercúrio, prata, cobre, 7,inco.
Agentes oxidantes: água oxigenada, per1na1lganato de potássio.
Agentes de superfície: cloreto de benz3lcônio, cloreto de benzetônio,
cloreto de cetil-piridineo, c;lorohexidina.
Cases: óxjdo de etileno, óxido de propileno, Beta·propil-lactona, dióxido
de cloro, ozona.
Bibliografia
NEOHARDT, F.C.: JNCRAHA~i, J.l.; SCHAECHTER, M. Physlology oi the b.acteri.al
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, ,
TECNICAS BASICAS
EM MICROBIOLOGIA
M . Ligia C. Carvalhal

2.1 - Seguranc;a no laboratório


Em nlictobioJogio. 1robolhor bem significo (robofhor <;om segurança.

Qualquer estudante ou profb;sional qu(' u til iza nl icrorg.:inisnlos ll <> seu


-3:.--alht) d eve cst.,1· consciente d e q ue está n1anu S('.'l1l d o otg,1nisn1os vive,ls; en·
=~ ~ tes poden1 cst,'\1' incluidos org.i.nisn10$ patt)gênicos ou pote ncialnlénte
:-J.:l1~ên i cos. U1r1 bon1 profissional deve conhecer, pl)rta11to. as normas de se·
~...tr.~ nça <1uc nt)rtéia1l1 o trJbalho en1 on1 labor;itório, antes n\esn10 do inicio
.;"· \lt1,1lquer atividadé prática. List<lrnos ilqui algun1as regras inlportantes n o
t"'\t'r(icio d o tr;iba1ho Cnl labt)ratl>rio d e b iotecnologia.
1) Ao c 1l ti'ar rio l<1borató rio col()('<1r livr<>S, c.lsaco e OtLt ros objetos dé u so
~ :-(l.-1 1 enl local a prop1·i.ldo. ntinc;i sobre a banc.1da de t1'.lbillho.
2) Enquanto no laboratório, \•estir se1nprC' u nl a\·ental. abc..ll<>ado o u (e·
. ._ ~.1d<> de fornla" cobrir a 1l"t,1ior pa rte do corpo. Nào s..."irdo l,1borat6 rio con1 o
-~.:o-m<>.

3) 1:echar portas e janc..las dur<1ntc o tr.1balho en1 labora tório de nlic ro-
: c-l<tg ia. para e,·i ta r conta n1i n;içõcs <',rigi na(las pelas correntes d e :'Ir.
4) Limpar é dcsinfctJr a bil1\cada antes e ;ipó:; o Séu t1so. 1\ s p.11·cdes e o
.:-h,\o do lal>orat6rio ta111bé n1 dcvcn1 éSlar sc n,pre be111 lin1po:>.
5) L:ivar as 111ãos con1 s,1b,\o 0\1 deterge11tc, antes e depois de execu tar o
::J.l'Jlho.
6) Nolo coloc<lr n ad.l na boca. ~ão co1ncr. beber ou íun1ar dc:ntro d o lí.'lbo-
..J~Qrio. l' í'l ra pipc1,1 r, usar pipet.1dores de borracha ou ,1uton'lâticos.
7) Prender os cabelos, quando longos, para evitar o contato com a cJla1na
do bico de gás.
8) Descartar todo o n1ateriaJ contaminado cm local apropriado e seguro.
Tr.ltando-se de pipetas,. lâminas, etc., dcixá·las 1nergulhadas em solução de-
sinfeta1lte apropriada por tempo determinado, antes de ser efetuada a Java·
genl e esterilização dos mesmos.
9) Evitar a produção de aerossóis que possam conter n1icrorganismos vi·
vos, pois estes podem ser fontes potenciais de co11tamiJlação e de infecção.
J-\ erossóis são partículas, líquidas ou sólidas medindo apenas a lgu11s nlicrõ-
metros,. que permanecen1, em (unção do seu d iminuto tan1anho, suspe11sas no
ar, podendo ser inaladas pelas pessoas que estão no local. 1>ara evitar os riscos
origi1lados peln for1naçâo de aerossóis, o procedinlento rcco1nendado é o uso
de câmaras espé<:iais para a prática com Lnicrorganismos (Vo1.2, Cap.5).
10) f\1antcr scn1pre a atenção no trabalho q1te está sendo executado, a
fim de evitar acidentes.
11) Ao carregar tubos 110 laboratório, nunca colocá-los 110 bolso mas sin1
acondicioná-los em estantes. O mesmo deve ser feito com placas e outros 1na-
l<?riais, que devem ser transportados e1n ba11dejas apropriadas.
12) Após a quebra de qualquer recipiente contendo microrganismos, co-
brir imediatamente o local com toalhas de pap<?t saturadas com solução desin-
fetante. Deixar at\1ar durante pelo 1ncnos 15 min.
13) A manipulação de (ungos deve ser rápida e eficiente, para evit.lr a
contaminação do antbiente co1n esporos.

2.2 - Preparo de meios de cultura


Chamamos de meio de cultura o <onjun(O de nucrientes necessórios poro que ocor-
ro o mulciplicaçõo ou monvcenção dos mic101ganismos.

Um n1eio de ctiltura pode ser utilizado para o crescimento (multiplica-


ção), para a manutenção ou nles1110 para o transporte de n1icrorganismos.
Quando utilizados para o crescime1\to, devem conter todos os nutrientes ne-
cessários, para que sejan\ sintetizadas as novas estruturas celulares. Toda·
via, antc-s de serem semeados, os meios de C\1ltura devem ser esterilizados,
ou seja, devem estar isentos de qualquer organismo vivo. Os inétodos utili-
zados para a esterilização dos meios de cultura \•aria111 confor1ne as caracte-
rísticas do próprio meio (Ver Cap.1, item 1.6.).
O que é um inócufo? O que é inocular? O que é uma cultura?

Para cuJtivar \tm n1icrorgnnismo como a Escllericltia coli, por exenlplo, re-
corremos a um meio de cultura esterilizado (ise1\to de formas vivas) e adicio·
namos a ele uma pequena quantidade de material contc11do c~lulas vivas
.:ot~1,1 bactéria: ,1 este tnate rial, d.,n,os o ''ºº'e de iuõculc> e à :idiç.'1<> d<> inclculc>
ntl'io csléril cha1nan1os tie i11c>c11/a('rlc> {<l$ instrun1cnt<>S titilizados e procedi·
-~ri tos en\'Ol\'idos com a inoculaç,\<) st~r.\o dcscl'itos postel'it)l'1l1entc). 1\pós ;i
- '(ufaçào, o n1eio de c11lturt1 é incubado (acondicionado) por ten1po delCt'Jlli·
- ·..:it), sob co11diçôcs a pl'Opriadas de oxigcoJçâo. ten1peratura, ~ te. J>ara que as
~..iiçôes de incubação f,\\•or~J111 o crescimento d<1 microrganisn10 inocitla·
o 111icrobiologista d~\·e conhecl'r prc,·ia1l,l'1, lc .,s c.1rJctcrísticas fisiológi·
., . <lo oticrorganisn10 estuc.iado. Durante a incubação ocorre a n1ultiplic.1ç.\o
• n1i<rorg,1nisrno da11dt) origen1 a un1.1 cull11ra.

De OGordo com o tstodo fisico, os meio$ de culturo têm usos específicos e devem
ser acondicionados de fotmo apropriado.

Os nlcit)S de cultura podenl ser líquidl)S, sólidos ou sen1i-sólidos. Os n1c·


... s.ólidos diícrcn\ dos meios líquidos pel<) seu dSpl'cto gl'l.1ti11oso, devido à
':'"'t'"-l'llÇ<l de :ígar (unl poliss,1c.1l'ideo cxtr;.1ídl>d e a lgas) ou de gelati1,,1. O .igar
. --:1,,is usac.io qul" J gl'latina, pois, alt>n1de1\âo ser (it.1c.,do pclJ gr:indc n1aio·
- l ,ios microrga11isn1os, não é liquefeito cn1 tcn1pcr<ituras norn1ahnl'nte i1s,l·
_ , p.1r,1 o c1·cscin,cnto dtlS n1icrorganisn,os (c111 torno de 30 a 35º C). 1\ gelati·
.. • <10 ct>ntrário, pode liquef,,ZCl'•SC pela ação de gelatinas('"S produiidas por
-:.:rt)rganisn1os ou 1r1esn10 quando subn1ctida ,, ,.,...,,,per.lturas en1 torno dP
. :. ( .Variando a con<e1ltr,1çAo de ága r no n1eio de cult111\1, poden1os obtel' 1..1111
-l-':~) sáliá<> (13 J 30g/ l.) (qt1a11do a placa é i1l\'Cl'tidJ 1lJ:O ocorre derra1namen·
l)\.I $t'111i-$6lido (2 .1 IOg/ L). 1\lguns nleios de c\.iltura sólidos não co1,tê1n
.:.lr tlu gelatina. Un1 exen1plo é o 111cio de Dors.et contcndtl <>vo, n1eio usado
:-Jr,1 a n1(lnutenç.~o de 1\ilycobacteriu111fubtrculot:itl.Os 1neios de cultura líquidos
...., "1enl ser acôndicionado:;. en1 tubos ou fr.lSCt)S côn1 ta1npas plásticas ou metáli·
~.i ' . de rosc.l, de encaixe, ou de algodão envol,·ido en1 g.1ze (Fig. 2.1 .).

(>) (b) (C) (d) (e)

:=.sura 2.1 - Tubo$COt"lv.lnost~Ç~u..,.::.i• • :>e~ensa;o_(o)wn;)tlcrcp..istco:{c)l.Kl'Ç<ide(e«a e:


, <:!e ~~ (eJ W'n:>-lo de 4"goc:ijo "'C"d~:x;
Os nlcios s61id0$,. ao contrário dos líquidos, podem s~r acondicionado:.
em tubos ou írascos na posiçJo ho rizontal ou inclinõ'lda, ou C'm placO'ls de PC'lri
de ~·idro ou de pl.isti<:o do tipo de-scartâveis ou reutili:Zá~·eis (Fig. 2.2.). O meio
líquido pode )('r esterilizado dentro de um tubo ou de um fra>Co. O mesmo
não ocotrc com o meio sólido quando e1n placa. Para se obter unla pl<'lca com
meio de culluril sólido, este deve ser previamente este rilizado c1n (rasco (lpro·
priado C', n seguir, ql1ando a indn líquido (tc1npcratura enl torno de 50ºC), der·
ramado dentro de uma plac>'I esterilizada. J-\ O se prepar.1r tubos ou frascos
com meios de cultura do tipo sólido e inclinado. estes poderlo ser esteriliza·
dos dentro do tubo a ser utilii.ado e, após esterilizaçJ:o, inclinido até o seu
resfriamento.

1 (d)

(a) (b) (C) C•l


F~ l.2 - MtloeleClh.n s6tido~cni:-(.a}ta.Oodt .... ~-'f*il~ (b) 1UX>d!ip" ~
~ - ~ ~ (e> MIO ot . . . . . . irdnldo: (d) pf.k.a. "9\. (e) e'1e. 1ICJCI o:m .lglt lf'ldNtcb

Tipos de meios de C4ll<u10: bosol. ~ en1iq41ec;menro. ie-te-tWo. dife1enciol. sjntético


ou quimicomtnte definido, complexo e de transporte.
Os nlcios de cultura dcvcnl ser utilizados de acordo com os objetivos do
experimento. A composiçdo química (qualidade e quantidade de nutrientes)
de um meio de cultura pode \•o.riar em um.a ordem de grandeu quilse iníinit.i.
Ao culti,•armos uma bactéri3 quimiolitolróíica (\rer Cap. t, i tem 1.3). por
exemplo, podcinos recorrer ~ um meio de cultura contendo SÍlnp l ~men tc
uma soJuc;!\o de S(liS inorgíinicos lendo o CO, conlo fonte de carbono. Jd un1t1
bactéri<'l quimiorganotrófíca, co1no n E. coli, 11cccssita da prcscnçil de unl s ubs·
trato orgânico como fonte de energia e carbono. \\otuitos microrganismos s.lo
capazes de crt"><'er e mul1iplicar em um meio de cultura basal (Tab. 2.1.). Ou·
tros,. mais e."<igentes, só crescer:to se,. ao meio b-'SJil,. forem acrescentados ou·
tros nutrierltcs. Chamamos de nleio de eur-iqurriruruto o meio basal acrescido
de Otltros 11u1rlentcs. Os 1ncios dt' enriquccii11cn10 são usados quando queré·
mos pron1over o crescin1ento de un1 determinado mic-rorganis11\o e/ot.1 iilibir
•crescimento de outros. l'or exen,plo, consideremos uma amos tra de Í0ZCS de
mn individuo com S\1speita de unla doença causada por $nl111onella typ/Ji. Nes--
SI anloStr:i, a l6nl de possíveis células dl'SSa bactéria, existe um grande núme-
ro de outros inicrorganismos que formam a n1icrobiota intestinal. !rata-se
~i n1 de um inócul<> contendo apenas atgurnas c6lulas de t.1nl deternl inado
c:Ucrorganis n10 que queremos isolar e, por outro lado, unl gral'1de n(1mero de
outros Olicrorganisnios indesejáveis. O caldo de selenito, cuja Ct)n\posi,ão é
.iprese1\tada na Tab. 2.1., inibe o crescin1e1lto de niuitas bacté rias entéricas (il'l ·
duindo á E.coli), poré1n nâo inibe o crescinle1\ IO de $.tyµJti. Ao inocularmos
um,, amostra das fezes nesse meio de cultura, após irlcuba,ão por ten,po ade-
GU(ldo a proporção de células de S. typ/Ji ser.i favorecida, a po1lto de conse-
guir1t1os detectar a sua p resença mais facilmente. O 1neio de sclellito, a lénl de
~r tun meio de e1lriquecinlellto, é tan\bên1 \JOl 1n eio seletivo, pois pértnitc o
aescimênlo preferencial de a lguns nlicrorganismos e1n detri1n ento de outros.
O nleio ~1ac Conkey (iab. 2. 1.) é unl exen1plo de n1eio de cult-ura s.clcti-
"º e ao mcs rno tenlpo diferencial. M{'iO de cullura diferencial, como<> próprio
nome indica, é aquele quê pernlite diíêrenciar tlll\a c-spécie de outra pe lo as-
pecto macrosc;ópico de seu crcsciménto, ou seja, pol' di ferenças no 3specto das
colõ1lias como cor, textura, halo de he n1ólise, e tc. No meio fl.·lac Conkey, por
e:\emplo, bactérias entéricas, capazes de fermentar a lactose. orig inan\ colõnias
'-·ern1élhas, devido aos prodttlos ácidos que a ltcran1 o indicador presente 1\0
meio; espécies que não fê r1ncut:int a lactose originan1 colônias incolores. No
meio ágar sangue$ microrganismos p rod utores de hemolisina podem ser sepa·
rados de espécies não prod utoras desta enziina, pela presença de \1m ha lo de
hen16lisc ao redor da colônia onde a eniima produzida lisot1 as henlâcias de
carneiro contidas no nlcio.
Algttns 1neios de cultura contên\ s ubs tâncias como peptona ou extrclto
de levedura, cuja compos ição qo in1ica não pode ser definida quantitati,ran\en·
te. Existem, em 1nicrobiologia, situa,ôes onde há necessidade de tcr1nos unl
meio de ct1ltura com con1posiçâo quínt ica absolutan\ente conhecid(l, até mes-
mo e nl rela,ão aos micront1trientes. Esses 1neios de composição definida são
chamados 1neios sinlét;cos ou q11i111icar,,t'11te definidos e dev{'m ser preparados a
partir das s ubst<.í' ncias puras. Usan\os u1n nleio definido quando querc-nlos,
por exemplo, estudar os outrientcs esse1lciais para o crescime11to d~ u1n deter-
minado nlicrorganismo. Os meios de cultura, qua1\do 1tão são quimicameut~
conl1ecidos, são cha1nados de co111plexos.
Os n1eios de transpo rte são aqueles utilizados pa ra o armazenamento e
manutc11,ão l'en1por.iria de determinado mate rial (por exemplo, um "s,vab"),
que será pos teriornlente exan1inado e pesquisado para a presc1lça de deternli 4

nado n1icrorganis olo. 1-\ principal fu11çâo desse tipo de meio é manter a viabi-
lidade dos possíveis microrganismos presentes, ai1\da q t1e 11ão favoreça a s ua
multiplica,ão, o qt1e muitas \rezes não ê aconsêlhável, considerando os p rodu·
tos 1netabólicos tóxicos que se acun\t1lam no meio.
38 T~WW"MI-~

~1EIOS OE CULTURA ' CO/\tl'OSIÇÀO QUfMICA 00 ~1EIO (g:/I)


1
,Wt>i'Ot b.1.SQi.S:
Águ.s de ptptóná Pcpton.1 (produto soh1vel resullante da hidrólise de
protein.1s), 10; cloreto de sódio, S.

C.ildo nutrient(' Pcptona, 10; cloreto de sódio, S; extr11.10 de c-.irne, 10.

Ágar 1\utriente Caldo nutriente solidificado com ág.:1r, l~.

Agar Sabouraud ghrose PeptOnõt, 10; dextrosc, 40; .igar, 15.


A1eios de t"11ri']u«i111e11t.,:
Ágars.angue Ág.ir nutric:nte acrc.scido de sangu(' dl"$fibrin.1do ou
citr.1t01do, 50 ;i JOOmL/L de meio.

Caldo sel('nito P('plona, 5; rnanitol, 4; fosfato díbásleo de s6dio, 10;


.sel('nito de sódio (NaHSeO.). 4.

AfrÍ()i $c!letlvo1:
Ág:ir d1."()i.:icol;,it()citr;1to Exteato de c11.rne e p<:ptona, 10; citrato d..- sódio, 10;
citrato férrico de :imõnio, I; d1.'0i.:icol;1to de sódio, 5;
vermelho neutro, 0,()2; .igar, 15.

Caldo Mac Con.key Peptona, 20; li\ctosc, 10; cloreto d..- sódio, 5; tauroco·
111.10 de sódio, 5; vermelho neutro, 0,03.
/vl(i0$ dife-r.·nrUlis:
Agar Mac Conice)' Caldo ~fac Conkc)' .1crescido de ágtir, 15.

Ag.1r olmid() Amido, 10; e:xtr.lto de (:llrnc, 3; ptpton;,15; <ig.,r, 15.

A1rio Je tr.in.sportt:
Asar glicerol Cllrerol. S; ~~xtr:ito de levedura, 2; fosfato dibásiro
de potássio, l;<ig.,r, 15.

Os meios de cultura devem ser preparados e esceri/izod<>s seguindo pr0<edJmentos


b6sicos.

A rnaior parte dos 1neios de cultura estão disponíveis comercialmente na


forma de pó. Para meios líquidos o pó é simplcsnlcntc pesado e dissolvido em
água destilada ou deionizada. Quando se trata de meios sólidos (por excmplo 1

ágar nutriente), após pesagem e dissolução em ágt1a~ o meio deve ser aquecido
até a total diSS<>luçJo do ágar. Uma vez aco1ldicionados em frascos apropria·
dos e esterilizados por autoclavação (Cap. 1, item 1.3.) São subseqüentc1nc1ltc
1

esíriados a nproxio\adanlente 45<r-C e derramados em placas previame11te esteri·


'*""'-°"..... 39

J:;uJdt>. C.1kul.l•SC aprox.ima.damt."'fll(' 20 a 25 ml de meio para plaC,\S de 9JJ cm


..!lt J1,\metro. A~ pl.1cas não dC\·cm ser mt•>.id.Js ncn\ remo,·idas,. at~ que o nleio
.n..~·.l totalm~1\tc :,01idiíic.1do. AlgtunJ;o: ti.Xnic.is de ~tneadt1r.1 exigcnl que o
~rfic i c cio meio sólido esteja i~enta de líquido. Uma maneira de prcvt1lir n
C'Jf'Clri\Ç•'º cio n1eio ~ derr,1n\í.Í·lo no placa cofn t('m pcra t u r~1 en1 torno de 50ºC
<.ulicicntc p.ir.1 que não occ)rra a s~li<l i lic.1ç.\o rinl{'S d e con1pletar a c;in1ndo),
Qu.1ndo pcrn1õ1ncccre1n gotas n.;i superfície.• do meio, estas poderfio ser climinn·
..:J: .. n1nntcndo·'-'IS ro1tl a tan1pa lig('it.11ll cntc ,1bcrta dent-ro de i1nla estuÍJ n 37<>C
N ..-n\ un1J c.in1ara de !luxo lamii1<lr. Algu11s n1eios conte11do nutricnt('S 1cr;1no·
A""é'l> n3o podc1n ser ~terili.zados por 01utoclavaçAo. Utiliza-se p.ira tanto o ~i~­
>rm• de fillr.>ç3o (Fig. 2.3).

ltJ F.-o ~a<'o n.t F4'0 eDCllllldC>


• ..,.. a funl

2.J - Técnicas de assepsia


As ttcn1cos de assepsia impedem o contominoçâo de inscrumencos e meios de cul·
turo antes e duronre o seu m onusejo.

A':!- t('(nic•s de ass<-psia ~n\rOI\ em o~ procedimentos responso\\'t>ls pela


irterili7açlo de instrumentos a serem utill1.ldos (por exemplo, quancto .. ub·
":'1-~lí'm<b .l .1lç.1 e fio de inoculaç.\o à quc1mJ pelo calor da cham.l do bico dt·
ôunsen - Fig. 2. 4.i e 2.4() e os proct"d1ment~ rt"sponsã,·eis pela manutí'nç3o
J.1 con<tíçJo de t.~tcrilidade. ou :.cja. pelo in,plodimcnto do con.1.1to do' m;1te·
~.1i.. co1n objetos ou superficies nJo e ... 1 ~re-i .. conto os dedos. a :.upcrfícic d.1
:.tnc.Jdn, etc. Dc~~a. forma. fr~lS<'O' e .. t('rih,.1dos. va1.ios ou n3o, dc\'cn1 ~cr
m.:1ntidos ~cn1p re fechados, S<'lldo ;lbl'rto' p~: l o n1enor tempo nec:cs.;.,.irio p.irJ
J sua utililaç.\o. Pa r<i ~v i ta r " conta111innç3o d~ un1 n1atcrial (s~j a este ul'n
(a) Flambal a alça até o rubto. (b} Encostar 1evemet1to a alça na colônia lsola<la.
Tampar a plaea em seguida.

(e) 1iror. OOtl"I o dedo mínimo. a tampa do (d) lncx;ular a amostra oom movimentos de
MX>. Flambar a boca do tubo. ziguezague sobre a $Uperfteie dO áS>ar inolinac:lo.

(•) Flambar a boca do tubo antes de fech81. (f) Flambar a alça ou o tio imediatamente
apósOU$0.
~o estéril ou um frasco contendo uma c-ult\1ra p\1ra,, por exemplo), a borda
•tubo deve ser rapidamente passada na chama do bico de Bunsen imediata-
9t'Ote após a S\La abertura e antes de ser fechado (Figs.2.4c e 2.4e). Essa prá-
IKa evita que eventuais orga.n ismos vivos, presentes nes~ região, caiam
*"'tro do frasco, contaminando o meio 0\1 a cultura. Esse procedimento
ctt.ama-sejla,,1bage111· (Cap.l, ítem 1.6.2) e deve ser utilizado durante a reti-
sada de amostras, inoculações ou semeaduras em meios estéreis contidos
cm tubos ou frascos. Lembramos aqui a necessidade de adotar um sistema
wguro para que a tampa 1lão íique exposta à contaminação, por exemplo,
llllWndo a deixamos erradamente sobre a bancada. Para ta1\to, aco1lsclha-se
uso do dedo mínimo para segurar a tampa do tubo durante todo o tempo
• manusc;o (Fig. 2.4c, d e e).
Poro eviror o contaminação de um meio de cultura sólido, contido em placa. exis-
tem técnicos de assepsia apropriados.
Para tanto, a tampa da placa deve ser mantida sobre a bancada com a
kirda para cima, o 1nais próxima possível da chama do bico de Bunscn,
ftt<iUanto a placa contendo o meio de Cltltura ~ segura c:om a mão esquerda
wnbén\ perto da c:hama (Fig. 2.4b). Como alternativa, pode ser utilizado o
rocedimento descrito na Fig. 2.8, onde a ta1npa é aberta sem a separação total
da base da plac:a.

2.4 - lntrumentos do microbiologista


Poro inocular ou repicar os microrgonism()S recorremos o instrumentos especiais.
As técnic:as que envolvem a tra1lsíer~ncia de microrganismos de um lo·
cal para outro utilizam os seguintes instrumentos (fig. 2.5): alça e fio (agullla)
M platina ou de 11íq11el-cron10 e pipetas Paste11r e s.orológic.a. Esses i1lstru1ne1\tos
são encontrados atualme1\te na íorma reciclável ou na forma esteriJiz.ada e
dtscartável com gotas de ' 'Olunles pré-detern\inados (no caso da alça e das pi-
pttas Paste\1r). Palitos longos de madeir.-a também podem ser utilizados desde
ue devidamente esterilizados em forno ou <llttoclavc. 1\ alça e o íio devem
....- esterilizados imediatamente antes e após o seu uso. Para isso, as partes
.-etálic:as devem permanecer na cllanla do bic:o de Bunse1l até atingir o rubro
Figs.2.4a e 2.4(). /\ntes do c:ontato c:om a cultura, a fim de impedir a destrlti-
lo dos microrganismos, a alça O\I o íio devem ser esíriados en' superfície
irsléril (Sltper(ície interna do tubo ou da placa) ou no ambiente, desde que
rrabalhando em câmara de fluxo de ar) .

• Atrn(do! A fta,,1b.tg,.,,1 nlo 4i:w HT adotada qunttdQ (1$ lfquidw utili;ados tt111 07rncterlstiots
inJlan1'1.1tis!
(e)
(d)
(o) (b)

..._ ...........--aomo...
~~~Me~ {•)~dcplat>N.. de~<tO'l"IOCU dt ~ (b)lo
FltW'll.S
de~(<) ...... '-'.r.(d)_ .. .._..(... -~(fl
~ fO'd6ea. (~ ppeudor mtdJ KO<Om ~de pliMlcO.

2.5 - Métodos de inoculação


Pr0<-edttM11tos pato ;noculoçõo com llqu1dos contendo microrion1smos.

Quando uma alça estéril é mergulhada em uma suspensão cont('ndo mi·


crorgJnismos e a seguir retirada do meio, (orma·se na al~a umrt película li·
q\lida circular, contc1\dO um dctcr1ninrido nún\ero de microrgc1nisntos. Essa
''alçndo" ó chanlada de inóculo; o ta1t1a11lto deste inócu.l o vai depender de dois
rator(.'S pcr(citan\ente coi1trolávcis: concc11traç.lo de células na suspcnsAo (ver
itc1n 2.8.) e d iâmetro da alça (normolmcntc comportam volumes que variom
de 0,005 a 0,01 mL). O fio de platinó'l também pode ser um instrumento pata
inocular suspensões, uma vez que um pequeno volume de líquido (ica 01deri·
do .io metal. A pipeta Pasteur e a pipet01 sorológica podem Soet' usadas par'
inocul.1r \'Olumes variáveis con(orme .l s ua calibragem~ desde que acopladas a
si.stemas pipetadores ou peras de borracha qve gilrantam a quranç.i no tr•·
b•lho (fig. 2.5.).

2.5. I - lnóculos líquidos em metOS líquidos


A p<'lrtir de uma suspensão conte1ldo microrganismos, podemos inocu·
lor n'cios líquidos, mergulhando nestes uma "alc;ada" contendo os 1t,lcrorgn-
19Smos. Da mcs{nn forma, esse tipo de inoculação pode ser feito co1n pipetas
tof016gicas ou do tipo Pasteur, simplesmente gotejando o inócu1o lentamen·
• no meio líquido a ser inoculado. lmediatamente após a inoculação (Fig.
:.-&e,f), as alças e os fios devem ser novanlente íla1nbados até o r\1bro, para
prevenir a contaminação do i1ldivfduo ou do ambiente de trabalho. Conl
tetJ.tl fi1lalidade, as pipetas dcve1n ser inlcdiatamcntc inlersas enl sol\tÇão
~infcta1\te.

2.5.2 - lnóculoo sólidoo em meioo líquidos

A alça e o fio de platina podem ser \1Sados para retirar pcquen;;is qua1\·
tidades de 1naterial sólido, por exemplo, microrga1\i.Sn\os provenientes de
llll\a colônia cm meio de cultura sólido (Fig. 2.4b.). Para tanto, basta tocar a
.lç:.l ou o fio no material; a quantidade de material ou o número de microrga·
~mos retidos na superfície da alça ou do fio não é mensurável e, conse·
i.tentemcnte, este método de inoct1laçâo só poderá ser usado quando este
Nrâmetro não for importante. A alça ou o fio co1\tcndo os microrganismos
mergulhados no meio líquido e lentanlente agitados para a libcraç~o do
"'6culo.

2.5.3 - Uquidoo ou sólidoo em meioo sólidoo


Meios s61idos podem ser inoculados de muitas maneiras. dependtrtdo do objetivo
específico. Ustomos o seguir algumas técnicos mais comuns e seus respectivos ob·
jetjvos.

2.5.3.1 - Semeadura para obtenção de <:o&Onia.s isoladas ou semeadura em estrias


Essa técnica é usada qua1ldo o inóculo (líqt1ido ou sólido) contém di·
rentes microrganisnlos ou muitos n\icrorganisnlos de uma mesma espécie
~ deseja1nos obter colônias bem separadas. Nessa técnica o inócuto é pro·
gres.sivamcntc espalhado, de for1na a promO\'Cr a separação das cé lulas na
superfí<:ie do meio sólido. A Fig. 2.6. 1nostra, esquenlaticamente, a seqüên·
aa de procedimentos a seren\ seguidos para a obtenção de colônias isola-
CW.s: como mostra a Fig. 2.6, durante a se1\leadt1ra em estrias a alça deve ser
-.intida na posição correi<\, a fim de evitar rasuras 1\0 ágar. Entre cada es·
fria, A, B ou C, a alça deve ser flambada para elinlinar os microrganismos
wmanescentes 1\a mcsnla. Como o 1n~todo parte do princípio de que cada
Ulula origina tuna colô1\ia, após incubaç~o por tempo determinado, o es·
wço onde as c~lulas tiverem sido suficienteme1\te separadas umas das ou-
a.s apresentará colônias isoladas. Cada colônia isolada corresponde a uma
ultura pura.
44 T~~.,n~

1
1

~
1. Recirando o~
coma alça
llÍlllll..,.
"°"°'º
llidO
lllli~me

-- -=--
;f3 2.
>:;r--•
- -

~ 3.

;f3 '·
Figur~ l.6 - T~clesemeadul'aemestnasparaaobcençk>decolõnias~.A~dertrodoqwdro11'1ô$­
vaa~c()tl'$~ ~ dur;v'f.e a ~a. l)Coma alça n?tira·sc oin6wbc» ~. '2) lllC)(l)br«itn a
~ ccwendo os muorgarwnos a ~ do ágM etn estnli (Ot't\ tnc:Mmentos em ZltVt~. c()tlÍOt'n'IC <:$QV'C•
m.1 emA 3} R.epet.- o pnxtdf'ncn:o scgvirdo esquema em 8. 1) ~opnxecltneM> ~ esqJefl'la em C.

2.S.3.2 - Semeadura em ptQlundidade e supetficie


Esse nl.étodo é usado quando queremos crescer microrganismos simulta·
neamcnte, cnl condições de semi·anaerobiOSê e em acrobiosc. Para isso, 1.LSa·
n1os o ,11eio sólido i11clit1ado e,,r tubo (Fig. 2.2.). Espetamos o fio de platina con·
tendo o inóculo na base do meio de c\Lltura sólido, retirando-o em seguida e
passando lentamente em zigt1e-zaguc pela superfície do mesmo meio (Fig.
2.4d). Oe-ssa forma, o in6culo fica distribuído na base (condição de anaerobio·
se) e 1\a superfície do meio (condição de aerobiose).

2.5.3.3 - Semeactvra com espaflatnento cm supcrliôe


Também chamada de sc1nead1Lra para c:ontagent de colônias, esta técni·
ca consiste no espalhamento de um inóculo contido e1n 1un pequeno volunte
(norntalme11te entre 0,05eO,1 mL) sobre a superfície de tun nleio de cultura só·
.Jo cm placa. Para garantir o espalh.lmento de colônias isoladas par., a conta·
p.-m, o inóculo de,•e ser pre\'iamente diluído e espalhado com uma alçtl de
Origalski (ba.st.\o de vidro em forma de L) com movimentos lt'.'vcs e homogê·
""(Fig. 2.7.).

~ CO"l'I ~ et'l'I __,."com llc;a de ~ ~....,... dm mim"""""


ltt.l~dC>Jp'. .a.o..crarnlo.... ~do~"' ~~~""Mho­
.........'*"°'
2.S.3.4 Semead<ra em amada
Es~1
técnica tem como objetivo il obtcnç3o de um crescimento abundan·
til· ~1n todil a
~upcrffcic do meio de cultur,1 sólido rontído cm placa, crlcnmcycr
iJU outro (r,1sco. Para tanto, pode ser utilizado um inóculo liquido ou sólido
ctmtendo um nlímero grande de c~lulas. A semeadura pode ser feita por der·
r.1ma1ncnto de determinado volunlc e poste rior espalhamc1\to. Parl'I o espa·
lNmcnto podem ser usados diferentes h1botrun1entos. como "sivab" (pedaço
'11\pactado de algodão preso na ponta de um palito de madeira ou de metal),
11 de Origalski, alça de platina ou mesmo por combinação dos instrumentos
F\emplo: primeira inocutaçAo com o .. sv.•.tb.. contendo o inóculo e t-:tpalha-
<t"nto subscqilente com alça de plat1n.t).
2.S3.S ~ por -
Com o mesmo objetivo da técnica descrita no item 2.5.3.2, esta té<ni.-
• ~ usada pllr.1 obten(âo de crescimento enl condições de acrobiOb-C (s u-
f"'.'ríícic do n1eio) e anaerobiose (proíondidade do m eio) cm 1nelo de cul·
tura sólido con tido em placa de Pctri. Pllra tanto, o inóculo é sc1nc11do cm
46 ,.,... _ _ t~

meio sólido estéril fundido, em tubo (aproximadamente 20ml - tempera·


lura em torno de ..JO°'C). Imediatamente após a adição do inóculo, o meio é
derramado em placa já esterilllada, até cobrir homogeneamente todo o
(undo da mesma. Após esfrirt 1ncn to, a placa é incubi'!da por te1npo e tem·
perat\1rn adeq uados. O c rescime1\tO das colônias pode ser observado en\
tod a n profundidade do nlcio confor1ne as características acróbiris e anae·
r óbi as do microrganisn\o semeado {Fig. 2.8.).

2.6 - Culturas puras


A partir de umo mfS(UfO dt orao111smos podemtn prepo1or (u/ruros puros. cksde
que utilizemos récni<os odequodos
Para obtermos culturas pur.is de uma determinada espttle ou linha·
gem a partir de uma mistura de organismos. temos que usar procedimentos
que envo1\'em técnicas de i~lamr11to. O exemplo a seguir descre\re e ilustra a
-ttilua~Ao presente pí>lo isolamento de E. coli. a partir de uma amostra de água
de esgoto (nor1nalmente o esgoto possui uma variedade de microrga1lismos
cn t ~r i cos e n3o c1\téricos).
un1a alçad a da águo de esgoto é sentcoda en\ est rias na
l ni cial nten t~
supcrífcie de uma p laca contc1tdo i\gar Mac Conkey (ver Fig. 2.6. ite m 1

2.5.3.1 .). A seguir a p laca é incubad1l por 18-24 horas a 37ºC. As placas de·
vem ser incubadas na (orma invertida, para que as gotas de águ.l geradas
durante a incubação não pinguem :.obre o meio de cultura, prejudicando o
isolamento. Ourante a incubaçJo, a.:. células que estão separadas e que (orem
capa7tt de crescer nesse meio de cultura originarão colônias individuais.
Após 2~ horas em ãgar Mac Conkey. células de E.coli dão origem a colõnías
J'<'dondas, ' 'ermelhas, com apro"imadamente 2-Jmm de diâmetro; 1odavia1
nl"n\ todas as colônias com esta apa..Vncia serão obrigatoriamente de E:.roli. O
próxhno passo é escolher a1gumos dessas colônias para exame mais detalha·
do. Co1no E. coli é bastante con\u1n 1\esse tipo de material, é provável que ai·
gumos destas colô1lias perte1tçan' o bactérias do gênero E. coll. Antes de
eder:. identificação, é necess.irio ctrlificar-se que cada colônia seleciona-
.&. ronlém «lulas de uma mesma ~pécie de organismo. Existe sempre ri pos-
91it',JidJde de uma determinada colônia, mesmo bem separada, poder conter
lul.lb de d\1as espécies diferentes; isto pode acontecer se.. durante a bemea-
cfur.l cnl e~trias, duas células de espécies diferentes permanecernnl muito j\ln-
ll~ n1.1 superíícic do meio. J>nra resolver esse problenll.l, cadn colônio ~
IUhcultivado ôtl repicada; subc11ltivar ou repicar é unl procedimc1ltO ntrav~s do
.pulas relulas de uma cultura pur:. O\I de un11.1 colônia são transferidos pora
mn novo 1neio estéril. Para subcultivar uma colônia basta tocar leveme1ltC
ma al(a a superfície da colônia, de forma a obter a adesão de uma quanti-
4.1..ft mínima de organismos. Esse pectu('no inóculo é então semeado "º"ª-
~te em um n0\'0 meio de ~gar t\·t ac Conkey. Algumas bactérias form1om
'ónia~ muito pequenas e, nesses casos, a «picagem toma-se mais f.icil se for
6r1ui com um fio de platina; o inóculo é enl.lo carregado para o nO\'O meio e
i:t espalhado em estrias com uma alça. Cada placa inoculada com uma
911nples colônia ~ então incubada. Se C.Jdn colônia \'ermclha repicada repre-
wnta uma única espécie, teremos, npós incubaç:\o dessas placas, várias cult\I·
<1:11 purJs. Um1.1 delas poderá ser de E. coli. Outros repiques poderão ser feito~
Cl.'m o objeti vo de aumentar a probabilidade de tcr1nos de fato culturas p\lras.
C.d;i c-ulturJ pura dc\•erá então ser exonlinada pelos procedimentos adequa·
6....., pora a identificação dos microrganis1nos.

2. 7 - Meios de cultura e condições de incubação para


anaeróbios
Poto qut" ocotro o mult1plKoç& dos m.c1orion'smos on«16biot os mtfos 1noculo-
dos dcw:m ser incubados em cond,ções oJHoptto®s.

2.7. I - Incubação anaeróbia em jarras


Microrganismos a1laeróbios devcnl ser mnntidos em ausência de oxigê-
Essa condiçl'lo pode ser alcançada conl o uso de jarras de nntré'robloSé'. U1n
IUD.
pode jarra de anaerobiose muito \1tili13dt1 tlllUllnlente é uma jarr.i de p lásti-
l cilíndrica, conl uma tampa firmc1nC'ntc fixada. Após enc.hi1ne1lto dl'I jl'lrra
"11\ as placa~ inoculadas (Fig. 2.9.), adiciona-M! água aos pncotes contendo
MJ.~tlnci3i químicas. Imediatamente após n adi(ào da água, esses S4\o jogados
:"l'ltro da jarra, que é imediatamente tampada por rosqueamento. As subst1n·
OJ ... químteas liberam hidrog~io que-.. na pr(.-sença do catalisador, romb1n.t
~mo º"igênlo dentro da jarra. Como nes.tt ca.so não se estabelece umtl ~itua·
' de \•oi.cuo, as placas podem permanecer na posiçJo in\'ertida.. evitando as-
a condens.JçJo de água na superffcle do meio. A maioria da.> jarras de
~.aerobiose cont~m um indicador redolC, que indica o estado de anaerobiose
..-ntro da ;arra. Em jarras de metal es~<.> indicador~ colocado em pequt1lOS vi-
dros c1n unl braço lateral da jarra, enqt10•1lto cm jarras de plástico existe tim
f"-daço de algodão embebido no indicndor visível pelo lado externo.
Catafis.adot de palédio

PlaeM inoculadas na
posiçOO in~rtkSa

Figun 2.9 - Jarra pano OJllNo de~ at\lO'ÓbiOS.

2.7.2 - Meios de cultura para anaeróbios


AJgu1lS microrganis1nos a1\acróbios p<>dem c:rescer em meios de cultura
apropriados, como ~ o caso do méio de Robertson (carne de coração picada
(IOg/ L), peptona (IOg/ L), doreto de sódio (Sg/ L) e um agente redutor, por
exemplo, c:isteína ou tioglicolato); o meio é esterilizado por autoclavação e
nlantido em frascos com tampa de rosca.

2.7.3 - Câmaras para o trabalho com anaeróbios


A \ltilização de câmaras para o trabalho com microrganismos anaeróbios
pernlite que amostras de culturas sejam rétiradas em condições controladas
de au~1\c-i a de oxig4!nio, temperatura, umidade e C02. A manipulação das
a1nostras no interior da câmara é feita con1 o a\ocilio de lu\laS fixadas no pai·
nel frontal.

2.8 - Métodos utilizados para quantificar os microrganismos


Existem vários métodos o serem utilizodO$ quondo queremos sobet o núme10 de
microrganismos em uma cultura ou suspensão.

2.8.1 - Técnicas de diluição


O nú1l1ero de inicrorganismos em uma população pode variar dentro de
uma ampla escala. Como conseqüência, muitas vezes torna-se impossivcl a
quantificação de uma populaçiio de n1icrorganismos, tanto por contagem d ire·
l i tmcâma ras, como por semeadt1ra em meio de cultura sólido (métodos des-
crilos posteriormente). Para reduzir o número de Jtl icrorganimos em uma
amostra, usanlos as ttknicas de dil\1ição. Estas consistem em p ipetar \lma fra-
9í0 da amostra enl tt1bo co1t tendo outro líquido (diluente), gera lmente água
destilada estéril ou solução salina isotônica (NaCI, 8,Sg/ L) esterilizadas. O
dlculo do fator de diluição~ feito dividindo o volume ini<:ial da amostra pelo
olume total, após mistura da mesma com o dil\1entc.
Assim,

Volt1Ule da aJnostra
Fator de diluição= - - - - - - - - - - - - - -
Volume total (amostra+ dilt1ente)

Exemplo: 1,0 nlL de uma cultt1ra de bactérias é pipetado ent 9,0 Jnl de
tolução salina(NaCI, 8,Sg/L). O fator de diluição, neste <:aso, pode ser identi-
ficado por 1:10, 1/10 ou 10·•. Se 1,0 mL da d iluição lff' for p ipetado em outro
tubo conte1tdo 9,0 ml de solução salina, o novo fator de d iluição a partir da
.amostra inicial será 1:100 ou 1 / 100 ou 10·2 (Fig. 2.12a).

2.8.2 - Contagem do número total de células (vivas e mortas)


O •lúmero tota l de c~lulas é usualmente determinado por contagem em
câmaras calibradas observadas com microscópio, ot1 por "contadores'' (Coul-
trr counter), onde os organismos são contados eletronicamente. As contagens
~ ciinlaras são ntenos precisas_. porém mais s i1nples e mais baratas que as
contagens eletrônicas. Ü\1tros métodos, como a contagent e1n esfregaços cora-
dos e turbidiinctria, também podem ser utilizados para a obtenção do número
total de microrganisntos. Ressaltamos que os ntétodos de contagem do núnle-
ro total de células envolvem a contagenl de céltilas vivas e mortas. Em anlOS·
traS líquidas, essas contage1ts são expressas em número de células / 1nl.

2.8 .2.1 - amaras d• contagem


Para a co1ttagem em câmaras, os organismos patogênicos ou mól'eis de-
vem ser previamente mortos pelo calor ou por ação de ttma solução contendo
kirmalina (solução contendo formo! O,So/o em volumc).
Uma das fontes de erro desse tipo de contagem es tá relacionada co1n a
.-lesão dos microrganismos à pipeta, de vidro ou de plástico, ou à st1a agluti-
nação ent líquidos ácidos. Essas d ificuldades podenl ser resolvidas, suspen-
dendo os orga1tismos em solução salina contendo traços de um detergente
.aniônico (por exemplo, o Teepol) tamponado cont Na~HP0 1 a pH 7,5. Para
~·itar a contamirlação da suspensão por outros microrganismos não descjá-
Yeis, adiciona-se formalina. Recomenda-se a lavagem da cân1ara imediata-
mente após o uso, para evitar a secagcm do nlaterial no \ 1 idro e posterior
m.terferência com novas contagens. A Fig. 2.10 apresenta um esquema de
uma câmara de contagenl tipica.
--- -- 0.-

O.t~

(a)

(C)

Fl.gurA 2. 1O lkN dm,ar.\ de con~ lipg. (~) V!St.11 bteral: (~ tu'N UmN ~de \'ldfo ~
com~~W'IU;lldeO.lmmabao!odorWtfdasbterM.AplUJA:)tm;:i<entralf:~cbon"ibrOJIM~~
porl.l'NI c.Md.ldc ele Qda '-k>. (b)'Asta supencw: 1'111 ~ deudlmctaclt dai pWfotrN ~..-~~um cp.11·
d-adc>~em<400~qwó'ados.adaU"ndc 1• .,~. lkN~~Set~e~
tobrt•bonkl~dldtn.n.:pwaets"oCO'ILICO . . . . . . ,~ôM'ser~•epdaleYetndlltP*tu·
pctfl:.e ~~ wndopd$i0~ (f"""' dpOd!dGMO. 8cr.!tnain ÔOICltf. &owc:htlo4:>0'oidMcodo-
,..._ dt PU S- ~ Ed jCfln \Wey & Sons. 4 • cd 1997 l

A utilizaç3.o de uma c.imara com os padrões apresentados~ Fig. 2.10


deve ser fei ta ronJorme os procedimentos: uma pipeta Pasteur contendo um
pequeno \'Olume da suspcn~o de nlicrorganismos (coluna de lfquido com
nAo 1nals que 10 mm) é colocada como indicado na Fig. 2.10b. A ponta dn pi~
petJ deve se apoiar na platalor111a ccntrl"I e o lado da pipeta encostar na la 1ní~
1tula. Com 1.\ pipeta nessa posiçõo o líquido~ automaticamente conduzido por
capilaridade par.1 dentro do espaço coberto pela lamh1ula e parte do espnço
da p lataforma; é inlportantc que o líquido não extravase. Algumt'ls ve1cs ~ tle--
ce:i.sdrio bater levemente na ponta dri pipeta para que o Liquido comece t'l sair.
Após 30 minutos de repouso, a contagem pode ser feita em microscópio. O
c~lculo do nümero total de partículas pode ser obtido em células/unidade de
\'Olume. Um exemplo prático: Cilda pequeno quadrado do quadricut.11do medt>
1/400 mm·. Como a distãnda entre a gridee a lamínula é 1/ 10 mm, o \'Olumc.>
do líquido em cada quadrado pequeno é 1/4.000 mm', isto é, 1/4.000.000 mL.
Suponhamos, por exemplo, que após contagem de 400 quadrados pequenos
íorl'n\ contJdas 500 células; isto daria uma média de 500:400 • 1,25 células
/quadr41do pequeno, ou seja, 1~25 célula:. por t / 4.000.000 mL. A amostrn con-
ti1lha cntlio 1,25 x 4.000.000 células/ 1nL, ou seja, 5x10* céluJos/o\L. A m&lin
de várias contagens representa o resultado. Se a amostra~ por estar 1nuito con·
centrada, for diJuída a1ltes de ser examinada, o fator de dil\1ição deve ser ron·
siderado no resultado (inal. Assim, se foi feita a diluição de 1/10, a co1ltage1n
deve ser multiplicada por 10.
2.8. 1.2 - Contagem em C.OOlter - counter
O Coulter - counter é composto por duas cân1aras, um sistema de de·
tecção de partículas e un1 analisador (Fig. 2.11). Para Sêrem contadas, as partí-
culas (ou células, no caso) devem ser suspensas em um fluido cond\1tor q\1e
passa de uma cân\ara para outra através de uma abert"llia nlinúscida por onde
passa tambénl uma corrente elétrica. Cada vez que u.nla bact~ria, ou qualquer
outra partícula passa pe lo orifício, insta1\taneame1\tC muda a resistência do
sistema. Essa mudança é detectada e medida por elêtrodos contidos nas duas
câmaras. A grandeza da alteração da tens..'io elétrica é proporcional ao \•oi time
da partícula. Esse instrumento permite contar rapidamente um grande núme-
ro de partíc1.1las d iminuindo o e rro de contagenl.

'
~ _ Bac::1ltr1a
• ., cilfnclrlca

f"11ur\l l, I 1 - Coc.lter •c:iounter. Passagem de IXN. ~contendomcrotganisrl'losolÍ'llh:OS ~dooofi·


oe> que scp.n as dlR.s ~A.$~ com setas ~t.ll't'las k'lh.lide fot~

2.8. 1.3. Contagem em esfregaç0< c0tados


Neste m..~todo, uma gota de suspensão de volume conhecido (1.Lst1al·
mente 0,01ml) é espalhada sobre uma área de 1cm2 1la superfície de uma lâ·
mina de vidro. A seguir a gota é secada, fixada e corada. A contagem é feita
.ao microscópio. O ntín\cro total de organismos em 0,01 ml.. é o nún1ero de or-
ganismos em cada campo observado, dividido pela á rea do campo em cm 1 .
Como é esperado, os organismos não se distribuem homogeneamente na gota,
per1nane<:cndo mais concentrados no centro do que nas bordas. Por esta ra·
z.ão, a contagem deve ser feita em toda a área da gota para a obtenção de um
' 'alor médio.
2.8.1. 4 - Método da wrbidime<tia. Comparaç.lo '"5ual com tubos de tuM1ão padrão
O número total de microrganismos em \1ma amostra pode ser estimado
por turbidinletria. Nesse método, a turvação de uma st1spensão de mic-rorga·
nismos é co1nparada com tubos contendo concentrações cres<:entes de sulfato
de bário (Tab. 2.2. - Escala de Mac Farland); a turvação dos tubos varia de
transparente (tubo 1) a translúcido, o lt1rvo .-iti1lgindo o opaco (tubo 10). J>ar(I
um dctern'linado nlicrorganismo (geralmente bact~rias ou leveduras), a turva·
ção apr~1\tada en\ um ttibo corresponde à turvação de uma suspensão com
um número conhecido de células. A aolostra deve ser obsen1ada em tubos de
dimensões iguais ao tubo contendo a suspensão padrão. A turvação da amos·
tra é comparada visualnlente com a de um determinado tubo da série padrão
e o cálculo da concentração de céllllas na anlostra é feito a partir de uma tal>e·
la que acompanha o conjunto de tubos padrões.

Tabeb 2.l - Pr~dl.C$Gta ele Ml<.f.vl.Wl(Tab& v.lduzicb eadapWa dofwo: 1-haobiology. A lcbo·
ftH>f'/l/qltJdde~ '1.1 td. ~~~Publ.CoMp.. W .. 1996.).

Cloreto de bário 1Ácido t ulfúriro Valor aproximado d11


Tubo l ()g/l,. ! % em \•Olum~ ron~t1trt1(àO de b11ct~rlas
(nll,.) (ml) (milh ões/1nl)

1 0, 1 9.9 JOO

. 2 0,2 9.8
i 600
-
3 0.3 1 9,7 900
~

• º" 9,4 1
1
1200

s o.s 9,5 1500


·-
6 0,6 1 9.< 1800
7 0,7 9.3 2100

8 T 0,8
. 9.2 2400
-
9 o.9 9,1 2700
10 1,0 •.o 3-000

2.8.2 - Contagem do número de micro<ganismos vivos


A contagem de viáveis mede a concentração de células v ivas. Tod<'lvia, o
seu significado está condicionado ao conceito do que é vivo em microbiologia.
A defi1liçâo nlais aceita para o trabalho conl microrganismos é a de viabilidade
corno o poder de forn1ar colónias 111acroscópicas en1111eio de cu/lura sólido ou de tornar
:4'N um mtio dt n1ltura líquido. As l1m1t~ões desta definiç-ão de\'em ser consi-
r.1das, na medida que existem s11uaçôe':t cm que sabidamente est~ ororren-
'° multiplica(!O ~ lular com produ(30 de microcolõnias muitas ve;es n:io
...ivcis a olho nu. É o caso, por exen1plo, de microcolônias forniadas por al-
untl\s bnctl1rl3s como o Streptococc11s sp, quando cultivados cm dctcr1ninr1dos
it>iOs de cultur<'I.
A 1n.-.ioria dos métodos que estin1an1o11úmero de células viávci:t cnvol-
t.'m o lnoculaç~o de amostras (gertilmentc diluídas) em meios sólidos. Após
llCUb.1(30, o número de células no in6cl1lo pode ser estimado pel.1 contagem
b colônias que se formam na superfície ou no interior do meio de cultura.
ar.i Unto, admite.se que cada colbni... foi originada em uma simples célula; o
mero de células que dão origem ' uma colônia depende, em partt-, do meio
cultur• utiliudo., das condições dt- 1ncubaçAo e das c-aracteristica;s de cada
'rt"<'ie. Por isso, o termo célula foi substiluido por Unid.adf For"iadora df Co/6-
" (UfC).
O núme10 de vi6veis pode ser esrimodo após a coniogem de colôníos em melo s61i-
do ou pela medido do tutvoçõo do melo ffquido ,

2 8.2.1 C.OOiagem de colôroas após °'pall>amento do "'6wlo na superlkoe do meoo


de C\lltura
Esse método é bast.inte utiliz.ido p.1r.1 ;i conta.gem de bactéri.1s e leve·
uras. Um in6culo de aproximadamente 0,05-0,lml é espalhado nól superfí-
de um meio sólido esléril, como descrito na Fig. 2.7. Após incuból(.lo. o
umero de células \•iâ,•eis é estimado con>iderando: 1) Número de co16n•a>
;t; FC<). 2)Volume do inôculo usado. 3) Diluiçlo utilizada (se houve).
\ ...!tim, bol' :;uspeitamos que uma amostra contém muitas células - em torno
tO"células/mL - ela pode ser dil\1ída muitas vezes (geralmente são íeitAs
lu1ções decimais (l /10, l /100/, etc.) e o lnóculo de cada diluição espalhodo
..nbre uma placa separadamente. Com ccrte1.a, pelo menos un1a das dilui~ões
mr1ttoecrá u1n n\ímero contável de col01tlos. A Fig. 2.12a apresenta u 1n cxcni-
lo de utili1aç1lo dessa técnica: con1 u1nr1 pipeta estéril,. transferir 1 n1L da
U!tpen~~o para 11m frasco contendo 9,0 1nL de soluç3o sa.Jina est~ ril (prlnleiro
r.t...co) . ._lomogcneizar a mistura. Tr.,nsfcrir, com uma no\•a pipeta$ 1 mL do
1meiro fr,1sco para o segundo Ít.lS<'O. Repetir a operaç-Jo até alcançar o nll·
rode dilu1(ões necessário para a s.emcadura em meio sólido. P1pe1ar, a
rt1r de c.\da diluição, 0~1 ml cm meio de cultura sólido e espalhar com a
•de Origalski (Fig. 2.7.). Após mcubaçAo das placas. a contagem d•s col6-
•'- de\·erá ser feila considerando-se que o número de colônias est•tistica-
~nt\.' válido é de 30 a 300 para uma placa de 9 cm de diâmetro. O fator de
lui~Ao e o volume do inóculo devem M"r considerados para o cálculo do re·
!>-Oltado final. A placa que apresentar colônias devidamente Séparodas é(':,·
·•lhidl.'I porl.'I l.'I contagem. A Fig. 2.12n oprc:,enta um caso con1 três plocas
Kmcadas com diluições crescente:,.
1mL

Oml

10-1

1
O.tml
9mL

,...,
1
O, 1nt.
-
e
e
Turbidimettia

(&) (b)

2.8.2.2 - Contagem de colõoias após demmamento do me<> ioocl.iado em placa.


Método do ·Poor Plate·
Neste método o i1\6culo líquido é n\ist1.1rado conto ágar fundido (45&C)
contido em um tubo ou frasco, que então é derramado no interior da parte ba-
sal de uma placa de Petri estéril (ver item 2.5.3.5 - Fig.2.8). Após solidificaçlo
do meio e incub<1ção da placa por tempo adequado, as colô1\ias crescerão so-
bre e dentro do ágar? tornando possível a contagem do 1\ú1ncro total de colô-
nias viáveis como no ntétodo anterior.
2.8.2.3 - Contagem de colónias após inoC\Jlaçâo com gotaS. Método "M,les e Misra·
Nesse método a estimativa do 1lún,cro de células vivas é obtida a partir
da contagcn1 de colônias originadas pelas células contidas nas gotas. lnicial-
mc1\te a amostra é diluída e tima gota de volume conhecido, proveniente de
cada diluição, é pipetada em local predetermi1lado na supcrffcie seca do meio
de cultura sólido. As placas são nlantidas enl repO\lSO até secagem das gotas
e, a segt1ir, invertidas e incubadas em fe mperatura adequada até o crescin1en·
to visível das colônias. As gotas que contêm um número grande de c~ lul as
apresentarão crescimento, porém, pela proximidade das células, estas não ori-
gi1larão colô1lias suficientemente isoladas, impedindo assim a sua contagem.
Qi1alquer gota contendo nlenos de 15 células vivas dará origenl a \Lm número
de colônias contáveis. Nesse método o tempo de incubação é crítico, uma vez
que as colônias podem se fundir rapida1nc1\tc, inviabiliza1\do a co1ltagem.
Considerando, como nos demais métodos, que cada célula originou uma colô-
nia, a contagenl do número total de viáveis na amostra pode ser feita consi-
derando: 1. Número de colônias 2. Volun\e da gota 3. fator de diluição. A
mesma p ipeta pode ser usada para todas as diluiç~s, desde que o início seja
a partir da maior diluição (Fig. 2.13.).


."·

f.C'n ou
2.13 - Método dlpa "Milcs t Mii:sta.º, "4 gotas ~de dbções l'l'lel'IOfeS ~cresci·
""C'ltO,potê:'i\No~colõniiisisoladlsCQmQasaprcsenudunugous~tsdt~~.

2.8.2.4 - Contagem de colônias após r.itraçõo


Esse método é utilizado para amostras com lima baixa concentração de
microrganismos. Por exemplo, a ági1a de um rio limpo. Após passagem de de-
terminado volume (100ml) por membranas filtrantes (Fig. 2.3.) com poros de
V,2µ1n de diâmetro, os filtros co1n os 1nicrorganisnlos retidos são colocados na
~upcrficie de meios de cultura sólidos apropriados e incubados em tempera-
tura adequada. Ourante a incubação, os nutric1\tes contidos no nleio de cultu-
ra difundem através da n\embrana e, sobre ela, formam-se colônias a partir
das células retidas no filtro. A contagem do número de células vivas~ feita a
partir das colônias crescidas na membrana e o volume da a1nostra filtrada.
2.8.2.S - Dct~rmiMção do ntXnero de viáveis após inoculação em meio líquido.
Método do NúmefO Mais Prcmvel (N.M.P.)
Nesse método, a cultura ou suspensão co1\te1ldo os microrganismos é di-
luída várias vetes, como nos métodos de sc1neadura em meio de cuJtura sólido.
A seguir, incxula.se em uma série de 3, 5 ou 10 tubos um volume conilccido de
e.ada d iluição. Após a incubação, anota-se o número de tubos que aprcsent.1m
turvação (crescimento) ou não para cada diluição inoculada. Os meios inocula-
dos a partir de suspensões concentradas devem apresentar turvação em todos
os tubos. Os ineios inoculados a partir de diluições maiores não apresentarão
crescimento, ou seja, não estarão turvos. O método das dilujções seriadas tem
como princípio que os meios, que permanecem claros (sem crescimento ' 'isível
a olho n\1) mesmo após incubação, estão isentos de qualquer organismo vi''º·
Os tubos contendo meios inoculados com diluições intermediárias apresenta·
rão tl.1rvação c1n ape1las alg\lns tl.tbos e em ot1tros Jlão. A proporção de tubos
turvos e não tun1os em cada dilt1ição inoculada está relacionada com o número
de organismos vivos na s uspe1lsão não diluída e é considerado o Número Mais
Provável (N.M.P.) de organismos. O cálculo é obtido a partir dos resultados ob-
tidos na prática recorrendo-se a tabelas adequadas(•.Jt.
2.8.2.6 - Determinação do número de viãvei.s após S'loculação em meio de cultul'a
'6Ldo. Método do Nvme<o M•ÕS P~I Alternativo (N.M.PA)!'>
Esse método é uma adaptação do nlétodo anterior, usado para estimar o
NMP de microrganismos em meio líquido. Nesse método alterna tivo os tubos
contendo meio Líquido são substituídos por espaços predeterminados na super-
fície de um nleio de cultura sólido. A partir de d iluições da suspensão original,
gotas de volt1me co1ll\e<ido (geraln\ent'e de 5 a 10 µL) são pipetadas 1\0S espaços
deli1nitados na superfície do meio, confornlê modelo mostrado na Fig. 2. 14.
Após secagem das gotas, o Oleio é i1lcubado cm co1\dições adequadas,
até o aparecime1lto de coló1\ias visíveis. Nesse 1nétodo, diferente do método
das gotas, as colônias não são contadas mas o que é considerado é o número
de espaços inoculados a partir de cada diluição que aprese1lte qualquer tipo
de cresciment~. A partir dos resultados, escolhe-se 3 dill.1ições para o cálculo
do núntero mais prová,,eJ de n\jcrorganismos viáveis 1la amostra. Como no
método anterior, O cálculo é obtido a partir dos result21dos experimenta is, re-
correndc>-se a tabelas adequadas.•n

Figura l . 14 - ~dc)f\ü'nen) MM ~AJ:ematl;M)(NM,PA) Modelo u:lzadop.vaa nx>Oçlodo 11*>


$JÕliÓO. 0$ ~ Csp.lÇO$ p'CIOC(fldos poc rVncros~ os locarsa semn i'loo..lados ap.lJ'f.lrde (l)da~seriada.°'
Esse nl6todo não pode S<'I' utilizado Ct)n1 organismos incapazes de cres·
a?I' em n1eio sólido. Cctalnlc11te tem sido utili;r,ado para b~1ctérias e leveduras.
O crescinlento de coll>nias de fo rnta não isolada elll cada espaço, ao contrá rio
J-0> outros métodos, não interfere 1\0 resultado da contagem.

2.8.3 - Métodos utilizados para medir a biomassa microbiana


2,8.3. 1 - Detenninação da ma.S$Cl de material celvla.r
As célul.1s pr0\'('11ientes de uma cultur,1 poden1 ser qu;;1ntificadas pol' pe·
;;ag~m dirtta. Tod:ivi<1? as estimativas obtidas con't n1edidas da 1i1assa (lí> n1ate.
riJI celular tímido 11Jo são pre<'is.as, devido às dificuldades encontradas n,1
J.\<tli.lção correta da quantidade de água intracelular, ou n1esn10 da água l'Cti·
Ja na superfície das células . As n1edidas da Olassa de nlat6ria celular Séea tt!m
iido n1a is freqüente n1ente adotadas, p<>is elas fornecem dados mais precisos e
propotciooais à quantidade de biomassa. P.1r,l St" detern'tinar a n1assa de n'taté·
ria seca de un1a população n1icrobi.:ina, as células dcvenl ser iniciahnénte se·
p.ir.ldas do n1eio dt" cultura. Essa separação segue basic,1n1ente dois padrões:
no pri111eiro a$ células são filtrad.'ls, o filtro co11tC'ndo as célul.:is é l.:ivado e a
seguir $4.?cado. No segundo, quando a fi ltraç.\o não é utilizada, <1$ células po·
dt"nl ser sep;;1radas do n1cio dé cultura por centrifugac;ão, ren1ovendo·se o
0·11?iO de cultura pc)r decant,1çJ.0$ aspiração ou pipetagl'nt. 1-\ s células s.."it) lava·
Jas e ressuspensas con1 águ.1 ou dilul'nte adequado. A suspensão contendo as
('t'lul,1s é en1:to colocada en1 cube tas previan1ente pesad.:is. Dependendo das
características do n1ateriat a se<age1ll podl' ser rc-alizada tm fo rno a IOSº C ou
tnl tempe ra turas n1ais baixas (80 ou .io~c) én1 condições de vácuo. Dado oca-
r3tí'r higroS<"ópico d:i maioria das célt1las microbianas, antes de cada pesagen1
.is cubetas deven1 ser esfriad,1s í'm dcsséeador à tí>n1pérat11ra ambiente''". As
mt."<lidas de 1nassa do co1\tl'údo celular seco tên1 sido bastante en1pregadas
para avaliar <'rêscin1énto de bactérias$ leveduras e ltLngos fi l,11nentosos.
2.8,3.2 Tvrt>iáimetria <om cspec:trofQ(ômetro
t\o lo1lgo dos últi1nos a nos foran1 desenvolvidos muitos insi-run1entos
para medir a tt1rvação de u1na Sllspens.-lo co11tC'ndo n1icrorg.:inisn1os.
Entre essC's, o cspéetr<>fott>metro é un1 instrumento capa;r, de medir a
~u a11 tidadc de- luz que é abS(>rvida ot1 transmitida qt1ando a trJ\'ess,1 un1a
.ln1(1Stra contida en1 un1 recipiente. t\•luitas rnoléculas, bi()Jogic.:io1cntc in1por·
t,1ntes, absorven1 tipos cspe<'\ficos de energia de rad iaç.'io (luz e n1 difere11tes
con1prin1entos de onda). En1 n1icr<)bit)!ogia, quando utilizamos o espectrofotô·
metro, \1n1 feixe de luz atravessa a Su$pensão que ctn1 t~m ()$ n1icrorganismos
1ger.1ln1C'nle bactérias 011 levedura~). Quanto n1aior o ntin1ero de microrga·
nis111os. n1aior será a dispersão d,1 luz. O resultado será que un'ta 111cno1·
quan tid~1d e de lui atravess.lrá .1 ,llllt)Stra . 1\ Fig. 2.12 .:iptesenta u1\l n1odelt)
s.i n1plific;ido de \1111 e-spcctroíotún1ctro. f\1()rmaln1cnte as an1<)Stras Si'\o coloca-
das em tubos ou cubetas de t.11nanl10 e 1nate riais apropriados. A maior parte
dos espectrofotôn\etros n\ede a quantidade de lllZ transmitida (transmitância)
e a quantidade de luz absorvida (absorbãncia)'~•.

2.8.3.3 - Dosagem de componentes celulares


A dos:igc1n de qualqlter \tm dos principais componentes cellllares pode
fornecer \1n1a avaliação da massa 1nicrobian:i. Entre os componentes mais frc·
qüentemente dosados estão o t1itrogê11io e a proteína celulares. Para dosar o ni·
trogênio celular, um dos métodos mais utilizados tenl sido o de Kjeldah1 1•-'1•
Nesse nlétodo o nitrogênio contido na ma t~ ri a orgânica é convertido a sulfato
de amônio por d igestão com H~,. na rresença de un\ catalisador. Entre Oll•
tros, o método colorimétrico de lo\·v ry' ·" tem sido freqüentemente utilizado
para dosar o conteúdo protéico da bionlassa microbiana. Muitas vez.es a con·
centração de nitrogênio ou proteína não é proporcio1\al ao conte(1do citoplas·
mático (por exemplo, quando uma fração considerável do nitrogênio celular
forma uma estrutura p:irticular da célula, coino a cápsula de a lg-u mas espécies
de Bnccilli1s composta por ácido polig lutâmico). Nesses casos, outros compô•
nentes celulares poden\ ser dosados con\o o ONA ou o 1~NA<•-'>,
2.8.3.4 - Medidas de compostos resultantes ela ativ-dade metabóliç,a
Qua1\do as células estão em crescimento, a n1assa de material celular
seco aumenta, enquanto a quantidad~ de nutrie1ltes dispo1\ívcis no meio de
cultura din\inui. Essa é a razão pela qt1al, ml1itas vezes, para estimar a bio·
massa, recorremos a métodos que avaliam o desaparC<"ime1\to do substrato no
1ncio de ét1ltura. Os métodos existentes para a dosagem dos diferentes subs·
tratos e, conseqüenteme1ttc, st1a titilização pelos 1nicrorganismos, varian1 con1
o tipo de sttbstrato a ser analisado. A análise de açúcares, por exemfJo, é bas-
tante s imples, podendo ser fe ita por métodos colorimétricos11 ot1 por
HPLC1!->(Cronlatografia líquida de a lta pressão). O consumo de O t também
pode ser usado con\o parân1etro para estimar a biomassa. Assim como o desa·
parecimento de substratos do 1neio de cultt1ra, substâ 1\cias enco1\ tradas 1\0
oteio, originadas da atividade metabólica dos microrganismos, podem ser do-
sadas e utilizadas como parâmetro proporcional à biomassa celtilar. Medidas
da prod\.tção de CO: ou de ácidos orgânicos eliminados no meio de cultura
são hoje faci lmente obtidas com a.nalisadorcs at1tomatizados<"1•
2.8.3.S - Volume de material celular após centnfvgação
Esse ntétodo co11sistc na ce11trifugação de uma antostra de suspensão ce·
lular em tubo de centrífuga especialmente caJibrado. A centrifugação deve ser
realizada em condições que promovam o empacotame11to dos microrganis·
mos, sem provocar ruptt1ra ou lise celular. O volu1ne de células compactadas
após a centriftigação é obtido por leitura na escala existente no próprio t\lbo.
Os tubos calibrados são do tipo llemal'ócritos, usados em rotina de laboratórios
de hematologia. Esse método tem ' 'antagens sobre o método da filtração, so·
bretudo qua11do a cultura apresenta problemas para ser filtrada•'>.
2.9 - Coloração de microrganismos
2.9.1 - l'rcparoção de esfregaços e fixação pelo calor
Para que uma amostra seja cor.Jda, geralmente as células são previa·
mente mortas e fixadas. Os esfrega~s devem ser feitos sobre uma lâminai
J• vidro. Conforme esquema na Fig. 2.15, descreveremos a seqüência dos
proced imentos a serem executados na preparação de u1n csfregaço: (a) Co·
0(';1r sobre u ma lãnlinn de vidro limpn e seca uma gota de água . (b) Emulsí·
in.1r, na gota,. os microrganismos aderidos na alc;a, provenientes de cultur'-'
ttm meio sólido. Se o inóculo for uma suspensão, não há necessidade de co·
.:ar pre••iamenlc a gola de água. (e) e (d) Espalhar o inoculo na gota, de
-~neira a formar uma película finai sobre a lâmina. (e) ~i~ar secar em tem-
f"'ratura ambiente. Não secar diretamente na chama, para não modificar a
morfologia dos 1nicrorgal'1ismos. (f) Fixar o ma te rial, passando rap)danlc1,tc
.1 131nina 3 vezes sobre a cllama do bico de Bunscn. Dcixnr esfriar antes dn
olorac;ão.
Esse é o método mais simples para a preparação e fi).ação do esfregac;o.
pós coloração, ele poderá ~r examinado em microscópio óplico.

(Q

2.9.2 - ColoraçJo de Gram


Essa colorac;Ao é utilizada par.t separar as bactérias cm dois grandes
crupos: bactérias gram·positi,1as e bactérias gram-ncga1ivas. As etapas da
olorac;ão de gram encontram-se de:,critas na legenda da Fig. 2. 16.
~ .......- ~

,,..--,,
~ -' ....
..'-
(•) (b) (e) (d)

• ,.
'
" (~
'
(g)

Fl1u"' 1.16 ElapaS dl coloraç.k> de gqm. (l) Sobre um tsfr~o ítlCldo dcrram.v o c~o ~ do ienc..w
(Mar 1 ~)-(b)E$CO!'l'tl"a~de~dt!oacnclll'll. (c)Cobft'a lltronacomuma~~CleiOdo
e ~de pcUwo (L.up). (d) Ot$.corar .a ~l)l'1Çao, vtrttndo~ sobre a L\rNn..1 um ~l'llt como o
$llOl 9S.•. Wc ~<li coloraçãoé~. 1,m11 ~1 que: o tw.ot ~ laviV a. llmn& IPC"ll$ Plt'I cxtr"" o'°'.,_
<f.lt.., ~<ta~·(•) LMtonfrcpçoemJe,A COl"l'efU_ Nts.Sa mpa as «U.ts~ntpllYll pei-.
defiOO(ll)l'ltq ~~.er'IQUlf'tO.t\Vrlfl-po&lt'-'M~JoattJ(f'Cll(iOUIN~A l"ften-
çlodot01 ......~de~ -ltJ=ll- (f)~. _.... odc:pp.oo:rncdeo::irvdc l'\ainfidl.lidol)
c.,._ JO~ (&'I LMt a ~O)l'l'l ~~ (h)*-«m~ de litl'Ostftl'""S*. pnnloNnW>
. , .O et6'«0- ~ 1 ~ tf'ftftlOOKÓpO«Wft ~ dt l'l'llel'Slo(~de 1 0X>W111K).

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TtR. E \Y.~ \VOOO. \V.; KRl.EC, N.R. ET PHILLIPS, C.B
NfS.
~f.i_nu.il of ~1t'lhodJ for Ct'nc-r-.11 Bac-
'° ;
lc-riology. AtftHK.tn Sodd)· foir ~1acrob~y \\'...,,gton. 1981.

Leitura complementar
10 \'IRY, 0 .11.; ROSEBKOUCH. N.J.; 1AN, A.L. E'r IV\Nl)AL, R.J, "Pro1cln n\t.-~urc-·
l'l\t'nt \\•llh Ih\' Folln phenol rc.igen t~. J.Uiol. Ch~n1 ., vol.193, p .265, l951.
STUKUS. P.E. lnvesti311iting f\.ticroblolog)' - A L~bor:.tory f\1<1nu<1 I for Gcncr•I ~~i­
crobiolog)'· Saunders College Publishing. EUA, 1997.
MILES, A.A. ET MISRA, $.$. ·Th~ esthn:.tion of thc ba<t(!ricid:1! põ'"er of th(' blood ~. J.
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ti06EN, H.J. ET 50'-iASEGARAN, P. "Comp.irison of lhe pou.r, sprcad ô'lnd dr<>p plate
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1982.
ELEMENTOS
,
DE GENETICA
DE MICRORGANISMOS
João Lúcio de Azevedo

3.1 - Introdução
A Genética é tuna das mais recentes áreas das Ciências BiológicJs que,
de uma nla1\eira bem geral, pode ser definida conto o estudo da tra nsmissão
de caracterís ticas de (IScendentes para descéndentes. Essas características cha-
madas de hereditárias, são transmitidas de modo ordenado em todos os seres
nvos. A Genética procura também explicar como ocorre a e1tormc ''ariabilida·
dt que pode ser observada entre e dentro das espécies.
Sendo o material genético, na grande n1aioria dos seres vivos,. constitui-
.:lo pelo ácido desoxirribont1cléico, ou DNA, a Ge11ética possuí stias rcgr.lS
.aplicáveis tanto a plantas e a1l in1ais st1pcriores co1no aos microrganismos. É
!"90 ONA que estão as informações genéticas ne<:essárias pa ra a mantitenção e
~revivência das espécies. As leis fundamenta is da Genética foram descritas
:-ela printeira ' 'CZ, na segunda metade do séctilo passado, e1n ervilhas. E1r1bo·
!'a com a redescoberta dessas leis cm 1900, e as plantas e ani1nais sere1n am·
~amente tisados em pesquisas gc1\éticas, a introdução de microrganismos
Jet1 um"º''º inlpulso à ci~ncia da hereditariedade. Foi a penas em 1941 qt1e
~gos foram efetivamente introduzidos enl estudos genéticos, segt1indo·se
~ctérias e vírus, a lém de algas e protozoários.

Essa introdução foi tln\ marco de<:isivo para o dcsc1\volviincnto da Cc·


~tica, uma \ rez que nticrorganismos possuem qualidades quase que ideais
p.ira esse tipo de estudo. Eles apresenta rn, de modo geral, um ciclo vital rápi·
.ia, permitindo o estudo da transmissão de C.lractcrísticas l\ered itárias em cur·
período de tempo; sendo seres microscópicos, eles podem ser ctiltivados
m grande nljmero; requerendo pouco espaço e porta1\tO con1 economia, propi·
ando que cnractersíticas raras possam ser detectadas em grandes popttlações;
st'ndo nlenos complexos que pla1ltas e aninlais superiores enl suas exjgê1lcias
nutricionais e de cultivo, eles tornam mais fácil a elucidaç.ão dos mecanismos
da h.erança, principalmente em seus aspectos 1nolccularcs. Além disso, uma
grande mtiioria dos microrganismos a presenta apenas um ou uma série única
de cronlossomos, que são as estruturas que contê1n ti 1r1aior parte do 1naterial
genético, o DNA. E1n outras palavras, os microrganisnlos são em geral haplói·
des, eol co1l traposição a otganismos superiores que, geralmente. possuem
duas séries de cromossomos ho1nólogos, 01..1 seja, são diplóides. Em seres ha·
plóidcs as características hereditárias manifestam-se de modo mtiis direto,
não sendo mascaradas por outros g·e nes homólogos. Foi devido a essas e ou·
tras vantagens que os microrganisnlos, especialmente a partir da segunda me·
tade do século XX, foram empregados cada vez. mais freqücntc1nc1\te em
Genética. Além disso tudo, a \t tiliz.aç~o e importância cada vez maior desses
seres microscópicos em processos i1ldustriais e de valor eco1lômico nas áreas
de saúde, agropecuária, energética, de alimentos e proteção ambiental, fez
com que o interesse sobre a Genética e Melhoramento Genético de Microrga·
nismos fosse incrementado. Coino já ntencionado, a investigação genética ba·
scia-se na ''ariabilidade existente entre e dentro das espécies.
Se todos indivíd\1os de uma nlesma espécie fossem exatamente iguais,
não haveria possibilidade de estudos ge1léticos. Essa variaç3o te1n como íoitte
a mutação, que consiste em modificações dos genes; ou seja, do n1aterial gené-
tico, que são transmitidos de pais para filhos. Entretanto. só o processo de
mutação nilo explica toda a variabilidade encontrada nos seres vi,•os. Diferen·
tes características lleredit.itias geradas pela mutação podem ser combinadas
por meio de um segundo processo, o da recombinação. Esse é respo1lsá,,e1
pela junção de distintas características genéticas em u.nl único indivíduo.
Assinl, nlutação e recombinação constituem as 1nolas 1nestras da variabilida·
de em todos os seres vivos, incl\1indo os microrga1lisnlos.
Na Genética microbiana são fundamentalmente est\1dados os me-canis·
mos de mutação e recombi1tação que ocorrc1n nesses seres . ~u emprego per·
lllite tan1bém que a variabilidade existente possa ser direcionada para a
obtenção de linhagens, raças, variedades ou estirpes lllicrobianas 1nelhoradas
geneticamente. No presente capítulo a Genética microbiana, especialmente de
fungos e bactérias vai ser abordada, primeiramente sob o ponto de vista de
seus mutantes. sua obtenção, caracterização e usos. Em seguida os principais
sistemas de recombinaç.ão genética ser:io a presentados. Fínalmente outros as·
pectos ge1t~ticos de importâ1lcia em microtganismos serão mencionados.

3.2 - Mutação
3.2.1 - Mutações espontâneas e induzidas. Agentes mutagênicos
Qualquer alteração no material genético que seja capai de ser transmitida
aos desoondentes, constitui uma mutaç-ão. Existem vários tipos de mutações.
""""" 65

guns desses i-ipos stio a lterações grosseiras, causando pcrd<ls ou adições de


çandes segrnentos cromossônlicos Otl ail'lda i1lvcrsôc-s ou translocações do
--.iatcrial gcr\ético. Outros tipos de mutações altcran\ o número de cromosso-
"'lOS. Finalmente um últin10 tipo de mutação menos drástico é a n1utação gêni-
.::a ou de ponto. Nesse caso ocorrem substituições ou ainda adições ou perda
« um ou poucos nucleotfdcos no ONA. A Fig. 3.1 apresenta os di(cl'C1\tes ti·
ros de mutações q1.1e ocorrem em seres vivos.
Qu<'llquer que seja o tipo de mutação, esse é um evento raro, que aconte-
« com diferentes freqüéncias c1n diferentes genes,. mas que pode ser considc·
·.1do para cada gene como ocorrendo e n1 média \ 1n1a vez por un1 milhão de
Ji\'isões celulares. As mutações ditas espontâneas s.'lo causndas por erros
ura1lte a duplicação do ONA, devido aos d i (ere1lt~ estados tautom~ricos
ue existenl nos nucleotídeos que formam os genes. Podem ser causadas tam·
:iem por agcntes mutagênicos não controláveis, como raios cósmicos e outros
como produtos quínlicos qt1e entram em contacto com células vivas. A (re·
-tüência de nlt1tação es pontânea pode ser aun1entada em dezenas,. ccntenns ou
milhares de vezes, se fore1n propositadamente utilizados os chan1ados agcn-
.itS mutagênico.s. Nesse caso ocorrenl mutações induzidas, que se somam às
~pontâ1leas. 1\s radiações ionizantes como os raios gama, a luz ultravioleta,
certos cornpostos químicos, incluindo os agcnte-.s alquilantes como o dietil·
'-ulfato (OES), nletanossulfo11ô.\to de etila (EtvfS) e nitrosogt1anidina (NTG),
.agentes desaminadores como o ácido nitroso (HNO :) e hidroxilamina (HA),
.a.nálogos de bases 1litrogenadas conlo a 2-anlinopttrina (2·AP) e S·bromo·
deoxiutidinn (S·BdU), ou ainda agentes intercala11t('S como os cora.ntes de acri-
d1na, são todos mutagênicos. Eles são c1npregados pelos geneticistas e melho-
nstas para aumentar a variabilidade gent1tica e proporcionar, assin1, a escolha
Je mutantes aproprindos. Revisões sobre mutaç.ã o e agentes nlutagênicos são
~un,erosas e podem fornecer aos interessados n1ais detalhes sobre o assttnto
1, 2, 3, 4). De qunlqucr 1nodo, tanto mutantes espontdneos como induzidos
ocorrenl cm g<>ral ao acaso, de 1,,1 modo que o gc1leticista tem que recorrer ao
uso de técnicas para selecionar os 1nutantes q ue a ele interessam. Re<:entemen-
re técnicas especic1is tem s ido descritas para produzir mutantes com alterações
d~(inidas no material gcn~tico. Essas técnicas, conhecidas pela designação de
mutações sitiodirigidas". \•êm permitindo transforn1ar a indtLÇJo de 11luh1n·
tts de un1 processo c1npírico em um processo dirigido, en1bora haja11l a inda
muitas li1nitações em seu uso. Técnie<}S de 1nutaçôcs sitiodirigidas fazem par-
te das tecnologias do DNA reco1nbinante, conhecidas também como Engenha·
ria Genética. Essas técnicas serão discutidas no capitulo 4 dessa publicaçJo.
~o presente c-apíttllo serão descritos os principais tipos de mut,,ntes utilizados
tn\ microrga1\is1nos, seu isolamento e caracteriiação. Deve-se taml>é1n ter <>m
mente que, ao co11trário de plantas e anin1ais superiores, mutantes de microrga·
nisn1os são visualizados nào como um indivíduo mutante rnas, em geral,
como uma colônia crcsce11do cm um determinado nleio sólido. Utilizando-se
semeaduras e diluições apropriadas, todas as células de uma colónia
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crobiana constituem clones. Um clone é unl conjunto de células ou i1ldiví-


s originados de uma única célula, por multiplicação vegetativa.,, sendo to-
geneticamente iguais, portanto. Assim, a utilização de colônias ou clones
genética de microrganismos permite que macroscopicamente possam ser
tinguidos mutantes, sem a necessidade do uso de nlicroscópio, como será
to ent seguida.

3.2.2 - Prinàpais tipos de mutantes utilizados em genética


de microrganismos
A lista de tipos de mutantes que podenl ser utilizados é muito grande.
Alguns são mais conlumcnte empregados para certas espécies bactcria1\aS,
eutros nlais utilizados enl fungos filamentosos e outros em leveduras; algas
ou protozoários ou rnesmo vírus. Tudo depende das características inererltes
• cada espécie estudada e das finalidades da pesquisa. Entreta1tto, existem
certos tipos de ntt1tantcs que são empregados com grande íreqü~1tçia, i1tdc·
pendentc1ncnte da espécie microbiana estudada. Eles serão descritos a segt1ir.
3.2.2.1 - MU'lantes aoxotróficos
Muitos mi<:rorganismos, especialmente bactérias e fu1lgos, podezn se d0-
senvolver cm um meio de cultivo sólido constituído apen<is por sais minerais
~uma fo1lte de carbono ou, ainda, cont u1n ota poucos a1ninoácidos, vitaminas
ou outros conlpone1ltes de 1\att1reza conhecida adicionados ao meio. Esse ~o
meio de cultivo chamado de "definido "ou "mínimo" em oposição a 1neios ri·
cose col'nplexos que possuem enl sua co1nposiçào pcptona, caseína, extrato de
1tved1.1ras, soluções de ácidos nucléicos, de vitaminas etc. U1n meio desse tipo
~ cha1nado de "meio contpleto". Uma espécie ou linhagent microbia1la, que
originalmente cresce tanto em nteio mhtimo como em meio con1pleto, pode
apresentar ntuta1ttes que só formant colô1tias cm meio completo e não em
meio ntínimo. Tais ntuta1ttes s.'io chamados de auxotrôficos, e1n oposição à li-
nhagem origi1tal Otl selvagem que é chamad(l de prototr6fica. Pode assiin ser
bOlada uma gr(lnde variedade de ntutantes auxotróficos, inçapazes de crescer
em nteio n1fJ\i1no. Esses mutantes perderam a capacidade de s intetizar algum
componente do Dleio conlplcto que não existe no meio mínimo.
O que ocorreu foi uma muf(lçào em um gene que é necessário para a
produção de tlm a1llinoácido, vitamina ou con1ponente dos ácidos n\1cléicos.
Assim, se JO meio mínimo for adicionado, por cxc1nplo, a vita.1nina riboflavi·
n.a, un1 mutante auxotrófico que perdeu a capacidade de produ-iir a vitamina,
''ªi poder crescer novamente nesse nleio míni1no conl riboflavina. Como são
vinte os aminoácidos essc1tciais, muitas as vitaminas e di,rersas as puri1las e
pirimidinas normalmente sintetizadas por u1n nticrorganismo prototrófico,
pode-se comprc1tdcr que o número de tipos de mutantes a\1xotróficos possf·
,·eis e1n uma única linh(l,gem bacteriana ou de fungo ~ bastante grande. Existe
uma nonle1tclat1.1ra tod;:i especial para esses mutantes, que são designados
p rincipahncntc a pós as 1\or1nas definidas cn\ 1969 (5) por J letras, em geral a~
iniciais do componente que n3o pode ser sintetizado pelo mutante. Assim., um
mutante que é incapaz. de ~intetizar riboflavina é chamado de rib, outro inca·
pat de sintetizar o aminokido lisina é d~ignado de lys e assim por diantt.
Como s.\o \ 1.lrios genes envolvidos na síntese de um determinado componente
essencial, às 3 letras pode-se seguir uma letra maiúscula que define o gene ou
locus nluta 1\ te (lysA, lys6, lysC, por excnlplo). Se vários mu tantes parn um
mes1r10 gene s3o conhecido~. eles ainda lcvom números opós a letra (/ysA 1,
lysA2, lysA3 etc.).

3.2.2. 2 Mwr<es que nlo...,.,,, Cl!rtaS brtts do cait>ono ou ~


De n\aneira semelhante aos mutantt'S auxotróficos para vitaminas, puri·
nas, pi rimidinas ou amino;\cidos, há mutantes q ue não são capazes de crescer
cm meio míni1no no qual apenas uma dctcr1ninada íontc de carbono ou nitro-
gênio íoi adicionada. Ê comum em fungos e bactérias, por exemplo, a e.xist.:n·
eia de mut.lntes incapazes de utilizar lactose" como única fonte de carbono.
Esses muto.ntes são chamados de lactose negati\•os (lac·). Outros não crescem
se a galac1o:,.c fo r a única fonte de carbono (mutantes gal-) e rt:.:.im por dianl('.
Mut<'lnte:. hn também ql1C l1sam an\ônia 0\1 1\itrito como fo1l te de nitrogênio,
mas são incapnzes de tisar nitra to. Todos css<ls muta.ntcs sAo bastante usados
em genétic.1 mícrobiana.

3.22.3 Mutantes-•ag<ntes•-es
Se uma populaçJo de células de linhagem microbiana é colocada em
p rese n ç\l ~dc um agente inibidor e sendo CS.S\l população originariamente scn·
sf\•cl ao agente, son\e1l tc mutantes resistc1\tes poderâo se 1nultiplicar e for·
mar colônias cm presença do mesmo. En\ bactérias_, mutantes resistentes a
antibióticos, quimioterápicos e sais de met.li)o pesados Wo muito empreg;J·
dos. t-.1utantes resistentes .110 antibiótico estreptomidna Slo representado.,
por slrR, O,!, resistentes~ ampicilina são chamados de ampR e assim por dian·
te. Em (u1tgos. mutantes resistentes a cor,1ntcs, fu ngicida:. e otitros agenl(>..
são tanlb~nl basta nte c1nprcgados e1tl gc n ~ t ica. Inibidores nl"io são apena~
antibiótico~, fungicidas ou outras drogas químicas. Agentes físicos e bíológi·
cos também impedem o crescimento de microrganismos e pode ocorrer rõi\·
téncia aos mesmos. ~ o c•so de mutantes resistentes à luz ultra\•ioleta., alta4
temperatur.t:t, vírus, etc.

3.2.2.4 - Mutantes moifológKos


S.lo aqueles que apresentam modífic.1çõcs na coloraçJo, tamanho ou for·
mato da colõnia, em comparaçJo com o tipo original ou sel\•agem. Em bactéria4
e fungos eles são comuns, como no caso de mutantes albinos. Também muito
empregados sAo os mutantes com tamanho de colônia menor que o norm31.
como os "pctite"' de levedura~ ou compactos de fungos íilamentosos que, em
geral, aprescnt"m deficiências respiratórias. Mutantes con1 bordos de colônlti"'
....... ..
alterados são freqüentemente empregados, como os 1nutantes rugosos de bac-
ttrias, em oposiçAo ao tipo liso capsulado. Em fungos, onde existe uma maior
romplcx.idadc de estruturas distintas oonlo conídios e corpos de frutificação,
utantes morfo16g:icos são mais frcqüente1ncntc encontrados, como por exem-
~ os aconidiais ou os que apresentam alterações em estruturas reprodutivas.
3.2.2.5 - Mutante$ para produção de su~ liberadas pelas cél<.las
Em bactérias e fungos, muitos prodt1tos são liberados pelas células no
meio de cultivo. Bactérias do gênero Bacillus, Strepto,,1yces e hulgos como o Pe-
JCilliun1, liberam antibióticos de importância ec::o1\ômica. Outros liberam áci-
dos orgânicos, vitan1inas, enzimas e muitos outros produtos de grande valor
totec::nológico. Assim, a busca e o isolamento de mutantes con1 maior produ-
.;.Jo de antibióticos, vitaminas, enzimas e outros produtos f'1z parte de progr'1-
as de melhoramc1lto gc11~tico. Foi por meio do uso desses mutantes que se
con~g:uiram aumentos consideráveis na produção do antibiótico penicilina
por Pe11icilli11111 cl1rysoge1111111. Tan\bém cm certos casos é i1nporta1\te a obtenção
de mutantes com diminuição ou mesmo perda de produtos ÍndeSt?jáveis.
Com a fi1\aJidadc de estudos básicos_, a obtenção de mutantes incapazes de
produzir substâncias de valor econômico pode lançar no,•as lllZes sobre os
meca.nisn\os de produção, rcgulaç.lo e liberação das mesmas pelas c~Julas.

3.2.2.6 - Mutantes para vin.ilênôa e patoger*:idade


Muitos microrganismos causam doenças em seres humanos, animais e
plantas, inclusive atacando outros microrganismos. Mutantes com eficiências
'ariáveis ou mesmo incapazes de causar doenças podem ser obtidos. Essas al-
teraçõéS estão ligadas em geral à produção de antígenos específicos, toxinas,
a.pacidade de aderência aos tecidos etc. No controle biológico de inse-
tos-pragas por exemplo, procura-se obter microrgn1lis1nos cada vez mais efi-
cazes e1n causar morte de: seus hospedeiros.

3.2.2.7 - Mutante-s mais senslveis a agent~ inibidor"eS


Assim com existe1n nlutantcs rcsistc1ltes, o inverso também é verdadei-
ro. Se \LO\ microrganismo desenvolve-se bem entre 28ºC e 3r'C, podem ser
conseguidos mutante:s que são sensíveis à temperatur.-a, isto é, só podem cres·
ttr até 25ºC, sendo injbidos por tcmpctatt1ras mais elevadas Esses nlt1tantes
em geral estão relacio1,ados com os auxotróficos já citados. Nesse caso pode
ocorrer mut<lçào em um gene que produi uma enzima termolábil, que em
temperaturas mais elevadas não funcio11a, impedindo assim a síntese de um
produto essencial para o desenvolvimento do microrganisnlo. Enl temperatu·
ras mais baixas, entretanto, ela pode atuar e o microrganismo desenvolve se 4

normalmente. Mutantes mais sensíveis à llLZ ultraviolet(l são bastante co·


muns. J)or meio deles foram descobertos os principais m~an i smos gen~ticos
de reparo que as c~Julas possuem para evitar os efeitos danosos da luz ultra 4

,·ioleta solar.
3.2.2.8 - ileve•'SÕeS
Assi1n COlllO tim nlic rorga1\ isn10 pode muta r p a ra a 11xotrofia, resistência
a antibióticos, ca rJcteristicas morfológicas e outras. e le pode ta mbém sofrt r
reversão dessa nlutaçào, \'Oltando ao tipo normal ou S{'l\'agcn1. Essa nlutação
re ve r:;a o u rcvel'S<'\o é c hamada de ve rdJdeira, q uando rep a ra exatame nte o
defeito C(l\1sado pela p r i1llC'ira n1u t(lçào. Ela p<>de ser tambén1 supressora
q ua11do ocor re em outro local do genom(I, podendo ser no 1nesmt) g('nc onde
esta va localiz;:ida ;;i p ri1n eira n1utaçào, 111as não no n1esn10 local da primeira
al ter(lçào (r eversãc> in.tragêr1ic.1) o t1 e n1 outro gene (reversão intcrgênica). A
re versão, cspe<ialn1ente a volta da a uxotrofia para a prototrofia, é muito e1n·
pregada para a detecção e determinação da cficil'ncia de tllll agente mtitagêni·
co. l'elo n(Ín1ero de reversões obtidas após o tratamento com um suposto
agente n\utagênico, em con1pa ração com un1 co ntrole, pode·se concluir se ele
é realmer\te mutagênico, e nesse caso, s ua eficácia eo1 causar mutações pode
ser cstinlada ( para maiores dctalht>s cons ultar 1, 2, 4).

3.2.2.9 - Outros tipos de mutantes


1-\ lista dós tipos de n\u tantes empregados en\ gen ~tica 1n jcrobiana é pra ti·
can\ente infindável. En1bora os principais já tenham s ido n1éncionados, podc..ge
acreScénta r a essa lista os n1t1tantes que apt('S('ntanl alter,1ções 11a locomoção
em n1icro rganisn'os q ue a prC"Sent.1111 flagelos e o utros meios de m<>tilidad <!-. Ou·
trc.)S m utantes tC01 con,portan1e11to a lterado, ou S<'ja$ apresentam quimiotaxia,
fo totaxia ou o utros tipos de (!tração o u repulsão por agentes quh11icos o t 1 íisi·
cos que os d istil'suem do tipo r1o l'n1al ou selvage1n . 1\1utantes com loctnll<>Çtio
o u co1n porta n1ento alterado são comume11tc usados cm bactérias e en1 p ro to---
zoários. ~v1 u ta ntcs co1n alter<lÇâo 11(1 síntese de DN.I\, na SÍllt~e ê 1n ecanis nlos
(IC ação dos diferentes tipos de RN"\ s das célolas, 1nut,1ntes p(lra a lteraçi>c.-'S em
características de valor con1ercial$ como por exc1n plo (ixaç3o de nitrogênjo en1
bactérias e m\1itos outros tén1 sido enl pregados com fi nalidades (lC(ldêmicas ou
aplicJd <.'ls. Tanlbénl nos \•lrus$ pro tozoários e algas, l1á outros tipos de n1uta ntes
empregados. E1n a lgas clorofi ladas$ po r exemplo, n1t1tantes ptlra fo tossíntese
são co11hecidos. Para vírus existe unla gan1a de n1utante-s estudados em seus
hos pedeiros cspeciíicos. J>ela cons tatação da existência de n1uitos tipos de n1u 4

tant·e s em 1nicrorganism<>S, fi c..1 clato q ue eles apresentan1 variabilidade genétl·


ca n3o só c-11tre espécies mas entre linhagens. ;\ cxisté11cia dess.' \'ariabilid(lde
possibilito u um maio r co1\hccin1e1, to da Genética Micro biana e pe rn1itiu u1ll
1t1aior dcS<"nvolvin1ento da Genética conlo u111 todo.

3.2.3 - Isolamento e caracterização de mutantes microbianos


Os n1ut,1ntes s<lo os instrument<>S que o geueticistJ ten1 cm m~os parJ rea 4

lizar pesq uisas sobre a hcrcdit.1 riedade. Não é portanto por acaso que foram e
contiiluan' a ser desenvolvidos 111étodos r~'ipidos e c(icazes 1\0 isolanlClllO de
n1utantes. Esses n1étodos são b(l$tantê d ivers-0s, dependendo do tipo de mu·
-
""""" 71

tante que se quer isolar e do microrgc1nismo utilizado. Em geral, par.1 se con-


seguir unln n1.iior frt·qliência de mutantes, empregam-se agentes mutag\inicos
anlt"S de se iniciar o isoln1l\COto propri:in\ente dito. A luz ultrnvio1eta, pcln su:i
(:.e:ilidade de utilizaç-Ao e disponibilidade em pr.1ticamcnte qualquer laborató-
rio de ~ticrobiologia ou Genétic.a. é o agente mutagênico mais utili:t.."ldo.
Entretanto ou1ros mut,1gCnicos, como o E~1S ot1 f\'TC. são t.imbém muito em.-
prc-gados. r•Jra O isolnn\CntO de 1nulclnfCS í.'IUXOtr6fiCOS um proe:esso óbvio é
trotar u1na população n\icrobiann con1 um agl!nle n1t1tagênico, em seguida se-
mear células em um meio completo para q\1t> crcsç-a1n rolónill~ isolad;.is e de-
pois transferi-las, um• • uma, para meío minimo. As que nJo C'restt'rem nesse
meio serJo .1uxotr6fiCJ>. Essa transferência pode ser feita de uma s6 \'CZ, uti-
lizando -~c u1n veludo que (uncionA como um c"rintbo (6). Tendo s ido desen-
volvida para bactêrins,lcvcduras c.-. con\ a lgu1nas n1odi(ic11(t>cs,para fungos
filamentosos (Fig. 3.2), ainda assim o processo~ trabalhoso.
~létodos foram então criados pdra selecion.1r mutantH o1uxotrófico-. an·
tcs da scmc.1dura das c~ lu l.1s em meio compl~to. Un1 deles, u~do para b.1cté-
rins senSÍ\'Cis à penicilinn, cons iste cm coloc11r a popuh1(AO tipós tratJn1cnto
com mut~gênico em 1neio n1íi1in10 líquido, contcudo c-ssc ;.,ntibiótico, por urn
a:rto pl'ríodo de tC>mpo. Nesse meio .lS célula~ prototr6fic.ls irão mul1ipli-
car-se e, nC>>C momento, ser.io mortJS pelo antibiótico. As ;iu%otróficas nJo se
dividen1 no meio minin10 e são preservadas. Um.1 ccntrl(ug'1Ç•\C? ~ cntJo re.1li·
zada p:iril precipitar ilS ~ l ulas . O sobrt•nadanlc contendo o nutibióticcl é então
retirado e as células ~30 rt"ssuspcr1didas em solução salina e semeadas em
mcio completo. Uma por(30 r-azo.i\·cl dessas «lulas darlo origem .- colõnias
auxotr6íic.l>, como poder.S ser const.1t.1do por tr.1nsferência das mesma .. p.1ra
meio míni1no. Em fungos as téc1licas de- cnrique<imento de auxotróficO> ~Jo
(citas tambén1 eo1 meio mh1imo líquido. onde <'Onfdios, que s.lo íorola~ <lc ré•
~istência. "-Obr~·i,·enl a 01l1as tempcr.1turas ou c111 presença d~ certos produtos
químicos. Como au.xotróftcos não germinam n~ meio, ele> >lo pres<>n·ados,.
enquanto os prototró(icm_. irão morrer quando submetidos a tcmperatt1ras ai·
1~1s ou a detcrn1inado:, produtos. Tanlbén' filtr;içJo pode scpar.1r célulao11 sen1
gernlinar das gcrnlinitd.is, permitindo u1n enriquccin1ento de n1utantt"s na po·
pulação que passou p<'IO filtro (7). 1\ <ar.act('ri.,açAo de muta1\tL'S auxotróficos
pode >er (e1t.1 adicionJindo--se ao mf!K> mínimo fontes de \·i1.1minas, amino.íci-
dos e conlponcntcs dos ácidos nucléi<os. De acordo com o cre~imento ou nlo
nés~s 01cios, o muta11te ~ caractcrizndo para sua deficiência nutricio1lal. M.1is
detalhe:, sobre o isola1neuto e car11ctcriza<âo d(• 111ut"ntes a11!l.otr6ficos poden1
ser e-ncontrados em r~·i~ e manuais sobre o ~ssunto (8, 9, 10, 11, 12, 13). O
1-Wl.lmento de mutantes r(~istentt'S J agcnt<.-S inibidores ~, em geral, bol~t.inte
3implifica<lo, pois b;i~tJ colocar a popul.lçâo ~cnsível ao inibidor em prC>Cn{a
<lc c<nlccnlrnçôcs :lproprittd:is do nléSnlO. Evidc11tcnlentc.-, só n1t1tantc~ n:sis·
tentes poderão se dcsenvol\'er e for1nar colónias 1\t?SSC meio. É 3ssi1n que nlu•
lantes re>Í"lcntes a antíbtóticos, fungicidas e oulros produlO> que imJ>'."<lem o
crescimento de microrganismos pod~m ser isolados. Um processo allem.iti\'O
•\ ' I •
~ ~
,, 1 · Cilindro
2 • Elástloo
3 · Veludo
4 • Placa de Petri
- 1-- ' s • "'ielo de QJl!ura oom
colônias na superlfcle

o
Colõnia resistente
--f.0~~80
i 0o ' ºJ'
sem nunca ter
entrado em contato
com o antibiótico • oo

Placa de Petri oom meio Pl<K:a sem Placaoom
de cultura sem antibiótico antibiótico antibiótico
no ({uai estão crescendo bactérias

/Réplica\
- ô Coloola reSlstente
ºººº
9o00°o
º8$º
t-.teiosem Meio com Placa sem
antibiótico antibiólico antibiótico

Bactérias isofadas na
posição oorrespondente
ao crescimento da cotõnia
na placa oom antibl"ót/lco
Placa com

~
J

Réphca ®---
antfbiótioo
8actérias is.oladas na
posição correspondente a
uma ou mais oolõnias na
placa oom antibiótico
Placa sem Pl&ea sem
antibiótfoo antibiótico

©
Figura l.2 · A té<nia ~ rópflQ para transferência de bactéri.l:s. A)A 1r'3nSl'crênoa de e~ da pb(a para o vefudO.
8) /.pie~~ dl tkOO no ~o <!e ~t°"s resisttnt<$ a um antibóico !TIO$~. inc1vstve. qw a mut.lçãô
p.lm te-.;;.16noo ocorre pr~te ao comato com a drop..
- 73

é usado em casos com resistência poligênica1 isto é, ql1an do ' 'ários genes estão
envol\1 idos, cada L1m conferi ndo tima peqL1ena resistência. Nesses casos, utili-
za-se a placa gradien te (Fig. 3.3), q ue faz com ql1e t1m meio de cultura apre-
sent·e um g radiente de concen tr.içõcs de zero até tim lim ite máxin10.

Colónia$ resistentes

o • ••
••
M
éij ••
• •
a) Ptac.a vista de lado
• • •
• •
Gradiente
+
b) Placa vista de cima

Figura l.l ~ gradiicntc para o ~o de tnuWICCS 1'C$1Stontes a certos. antbót>cos.

Dessa maneira linhagens com gcr1es cro1nossõ1n icos para alta resistên-
cia a penicilinas, cloranfenicol, tetraciclinas e outros antibió ticos p Llderam ser
isoladas (para unia revisão ' 'er 14). O isola111cnto de rnutantes morfológicos é
feito por inspeção v ist1a l, r1ão existindo pratican1ente L1nla'n'ta11e ira de se fazer
urn enriqt1ecin1e11to pré,do. O importante no caso é ter en1 r"11ente qt1c altera-
ções do ambiente poden1 tan1bém alterar a morfologia de colônias n1icrobia-
nas. Assim, o isolamento tcn1 qt1e ser feito ein cond ições bem controladas. Há
necessidade de ' 'ários repiques de colônias corn rnorfologia a lterada para ' 'e-
rificar se a característica é realmente ge11ética e 11ão devido a 1nod ifica\õeS no
ambiente.
Mutantes para maior ou 1nenor produ\ão de SLtbstâncias e li mi11adas das
células microbianas, para o 1neio de culti, 10, são tan1bém isolados em meios
que permitam essa disti11ção. Para o isolamel'1to de mutantes com produção
alterada d e unl a1ltibiótico, por exen1plo, colô11ias podem ser dese1lvolvidas
e m meio sólido e depois colocadas em presença de tim n1icrorganismo sc11sí-
vel. Evidentemente esse microrga1lismo não poderá c rescer ao redor de colô-
nias produtoras e qL1anto n1aior o l1a lo de irtib ição for1nado ao redor da
colô1lia, maior deve ter sido a prodL1ção de a11tibiót ico pela 1ncsnla. De igt1a l
forrna, o isolamento de un1 microrg.i11is11lo con1 n1ais a lta ou mais baixa pro·
dL1ção de u nia c1lzi1na do qt1c a li1lhagem orig inal, pode ser feita em meio
apropriado. Para a n1ilases pode·sc Ltsar n1cio co1n am ido e ,,erificar a prese1l·
ça de halos e set1 diân1etro, usa 11do·se t1n1a solução de iodo q L1e , rai colo rir de
azul as regiões do meio com a mido e pe rnlitir o a pa recinlento de ha lo claro ao
redor de colô1\ ias que produzira1n a milase. l.,rocessos semelhantes são fei tos
para o isolamento de mutantes com prod \1ção alterada de cch.1Jases, lipases,
quitinases e n\uitas outras erlzinlas e produtos. Embo ra o método seja sen\i·
quantita tivo, e le permite uma seleção das colônias mais pronlissoras, que d0-
verão então .ser submetidas a ensaios mais acurados. Foi por meio dessa
nletodologia q ue li1\l\age11s mutantes de valor industrial (oran\ obtidas pa r<'I a
prod ução de antibióticos, enzimas, ácidos orgânicos, entre outros. Mutantes
para locomoção alterada sll.o isolados cm 1neios senli-sólidos; mutantes pa ra
patogenicidade são isolados em p resença de seus llospcdeiros; reversôes de
mutantes a \1xotr6ficos para prototróficos podenl ser isolados semeando -se
grande qua1\tidade de células en1 rneio mínimo, onde só células con\ n\utações
reversas poderão crescer. Eníim,. os processos para o isolamento de nt\1tantes
são variados e essa é u1na área bastante criativa, e sen\pre en\ expa1\Sào den-
tro da ge11étic.;i microbiana.

3.2.4 - A natureza da variação microbiana


Seja quJI for o tipo de nl uta1l te a Sér isolado e a fi nalidade para o qua l
ele vai ser utilizado, dcve·se S('mpre ter em mente que a ntt1taçâo ocorre ao
acaso, não sendó induzida de n1aneira d irigida, seja pelo agente rnutagênico
utilizado, seja pelo agente selecionador. É certo q ue determinados agentes
mutagênicos podenl, de nlaneira nluito limitada, favorecer o isolantento de a i·
gtLns n1utantes quando se tem idéia da composição de bases nitrogenadas no
gene ou genes a serem mutados. Se o gene for rico c1tl guanina e citosina, por
e>a~mpl o, o uso de mu tagênico cujo n1odo de ação é preferencial para essas ba -
ses, pode levar a \1n1a maior facilidade no isolamento de mutantes nesses gc·
nes. Tambént fica evidente que a nova tecnologia do DN1\ reco1nbinan1e,
pri1tcipahne1\ te ili mutação sitiodirigida, a síntese de genes e a introdução de
segmentos específicos de DNA, produzc111 céltilas 1nicrobianas com caracte-
rísticas genéticas deter1ninadas.
t inte ressante salientar l<l1nbén1 que, enlbora muitas vezes fiqtLe a inl·
pressão de qt1e os nlicrorganis1nos sej:iin induzidos a nl11tar enl prese1\ça de
unl i1l ibidor, como um antibiótico por exemplo, a maioria dos experimentos
demonstra que o agente inibidor a penas seleciona 1nutantes resistentes que
ocorreram a ntes do contato conl o mesnto. Vá rios traba lhos (6, 15,16) demons·
Iram q ue não ocorre u1na adaptJçào tipo lamarquista do microrga1'lis1no ao
agente inibidor, 1nas sim tun sisten'a de mutação ao (lCaso, seguidJ de seleção
pelo agente em questão.

3.3 - Recombinação em microrganismos


Existindo m\1tantes apropriados em dife rentes cClulas o u indivíd\1os,
(:les pode m ser contbinados dê distintas maneiras nos descendentes. O n1e-
c,\1\ iSLno que permite conl qt1e ess.as co1tl bi1\ações sejam prodt1zidas ~o de
recombinação. A reco1r1binação é pra tica mente essencia1 para que uma espé·
cie possa existir como tal e prod\1zir descendentes que sejan\ capazes de so·
breviver às variações do ambiente. Dessa maneira difere1\ tes mecanismos de
recombinação existem em n\icrorganismos e mesmo dentro de uma mesma es-
pécie podem ocorrer d uas O la mais formas de recombinação. Mecanismos se-
xuais de reco1nbinação são conhecidos há a lgum tempo em microrganis1nos
eucarióticos, isto é, co1n núcleo típico, conlo os (~1ngos, a lgas e protozoários.
Entretanto, rneSnlO nesses microrganisn'tos outros sistemas de recombinação
começaram a ser descritos a parti r dos a1\osSO do século passado. Em bactéri-
as tanto o mecanismo ~xua l de recombinação como p rocessos alte rnativos de
recombinação só co1neçara m a ser descobe rtos a p(lrtir de 1944, ou sej(l, apro-
ximadamc1\tc 60 anos a trás. Os sistemas de reconlbinação e1n nlicrorganismos
e suas pote1\cialidades p(lra a Genética e Melhorame1\to Ccl'1ético serão a se-
guir descritos.

3.3.1 - Recombinação em bactérias


Um dos fatores responsá\reis pela i1ltrodução das bactt'i rias cm estudos
genéticos, somente (l partir dos a1'tOS 40 do século XX, (o i o desco1lhe<:imento
dos mecanismos de recombinação ou troca de material genético entre esses
nlicrorganismos. Foi cm 1944 que Aver)' e colaboradores (17) mostraram que
u1n processo não (or·mal de reconlbinação ocorria enl bactérias, a trans(orn\a-
ção bacteriana. Dois anos mais tarde, Lederberg e Tat\lll'I ( 18) demonstraran\
pela primeira vez a existê1lcia de 1.un processo sexual em bactérias, designado
de conj1.tgação bacteria1\a. Em 1952, Zinder e Lederberg (19) tlemonstra ra m a
existência d e um terceiro processo de recombiilação em bactérias, chamado
por eles de transdução. Todos esses processos, cn\bora cvidc-nciados a partir
de linhagens m\itantes e1n laboratório, devem também ocorrer com certa fre-
qüência na natureza e é por 1neio deles que as bactérias podem troe-ar material
genético, surgindo assim linhagens com novas conlbinações de ge1'tes. 1\lém
dessc-s processos, que podem ser considerados de certa (orm(l naturais, mais rc·
ce1lteme1\tC foram descritos mecanisnlos de rC<'ombinação por meio de mani-
pulação do ONA enl laboratório. Essas novas tecnologias permite m troca de
n1aterial gené tico entre espécies e gêneros bacterianos d iferentes, conlo tam-
bé nl propiciam a introdução de C(lracterísticas genéticas de O\ttros reiJ\os,
co1no de pla1\tas e animais supe riores em bactérias e vice-versa.
3.3.1.1 - A conjugação bacteriana
O primeiro expe rimento qt1e revelo\l (l existência de \tnl mecanismo se·
xual de recombinação em bactérias foi feito em Esc.lierichia coli. Duas Jin11agens
com deficiências n1.1tricionais, 0\1 seja~ n\uta1\ tcs auxotróficos, foram mistu ra-
das c1n um mesnlO tubo de e1lsaio e desta mistura S\trgiram rccombina1ltes
que cresceram em \1m meio mínimo, sem os req1.1isitos nutricionais necessários
para o desenvolvimento das linhagens.originais. A freqüência de cél\tlas rc-
conlbina1lt'es era bem maior que a esperada, se somente mutação reversa de
auxotrofia pa ra prot'o trofia estivesse ocorrendo. Um expe rimento conhecido
76 ..,._•......-:.•-o•• •
como do lubo em U, mostrou que havia necessidade de um íntimo contato en·
trc as células das duas linhagens origjnai.s para que recombinantes prototrófi·
cos oporecessem (Fig. 3.4).

Linh:lgom Linhage
tte~: ..U'"; llr blo-; mel


Meio minimc>
(l\Ao há cr-esdmento)

..
~1tlo mínimo
(Cro&cimttlto 61 1eootnbltlan1os)

Firural.4 .. ~~re<~tfl'lbla~por~com~es~ddoeintes
~.a.a WllN!<le fftQnni(tre-). ltooN(IN~), T..)nW'I.) (ba ), 8lobnl (blo-) e MeOO!'W'll{mec -) ~ un
tubotmU.

O próximo passo foi demon3tr.lr que ex~tiam tipos de reações SCl(uais


ou "'S4'xos" diferentes em bact~ri.J.s. Haycs em 1952 (20) ttalizou crul.lml'ntos
r«lprO<'os, empreg.indo duas linho1gens com deficiências nutricion;ais distin-
l.l5 e uma delas sendo resistente ;ao ant1biótico estreptomicina. Foi venílc•do
que ttrombinantes só apareciam em mrto com estreptomicina qu.lndo uma li-
nhagem determinada era resistente a esse antibiótico. Isso levou à conclusão
de qtre haviam céltllas doadoras de material genético e ~lu las rt.-ceptor.ts des-
~c tnateri31 qtlC J\CCCSSitavam permAnec~r vivas no meio conl csLreptomic-ina,
para que a conjugação produ7iss~ rC'COnlbinantes. As células doador:.s íor.\1n
ch.lnli,das de F'+ O\I " masculinas" e ris reccp,oras, der. ou "fc1ni11ínr1s". Aos
poucos o processo foi sendo elucidado. Verificou-se Jogo a seguir que cél\1las
doadoras era1n d ife rentes das receptoras, por conter a lém do cromosson10 llltl
elemento cxtracromossômico adiciollnl, d~ignado d~ plasmídeo F (de fertili·
dade). Por outro lado, células receptoras não continham o plasmídeo F. Mais
tarde foi também visto que o plasmídeo F, possJveln\C1llC de origem virai,
possuia tama1ll\O bem menor que o cromosson10 bacteria110, 1nas era capaz de
conter gel\~ suficientes para S\1a duplicaç._l\o autônorna, isto é, independente
da do cron1ossomo da cél\lla, alé-1n de possuir genes para sua transferéncia de
unl:.l célula para outra. Entre esses genes existiam aqueles carregando infor·
mações genéticas pnra a síntese de fímbrias ou pilli sexuais, qttc per1n itiam
com que o contato e11tre célt1las doadoras e rcccptorJs ocorresse e que o mate-
rial genético passasse de uma célul(I para outra. Foi vcriíic<'ldO, também, que
pela co1\jugação bacteriana apenns o plasmídco F pode ser transferido após
sua duplicação na célllla doadora (Fig. 3.5).

e"""""""°


Plasmídlo

f igural.5 .. ~embiaétias. T~do~f.a)~dil<~<loodol'a(f+)<OO'la<&l.l


r«~ (f.). il pR-nera (O((endo uomosson'IO e plasmidieo<em poMO de origem (onl). e a~ só <Or'n o
O'QmOS$QITIC). b)F~de ponte de <OfM:~e<Me em~dos fios do ONAdo ~ F. nopõl'ltoonT.
e) lnnS{crênO;J de um dos f~ do DNl\do ~ d.l célula doador'a para a tt<epiora. 4) ~de c.adet.li <om·
plcmcnll)t'C$ do ONA.no ~.e) Tbmino<b eot\IJ!:~ ~ ó..0s<a.«li F+ (tl'IOC!k.ado de Souza ll•I).
Nesse caso, a célula receptora feminina não recebe genes cromossônl.i·
cos, n\<lS apc11as muda de sexo. Por outro lado, a célula doadora pode tambént
1\l.udar de seu estado F+ pa ra f .• se perder o plnsmídio. Isso ocorre quando ele
se duplica n1ais lcnta1nente que a célula que o alberga, ou quando a bactéria é
tratada por certos agentes como corantes de acridina. Esses corantes são cha-
mados de "curagênicos", pois o processo de perda de plasmídeo é designado
de "cura". Mas nem sempre pela conjugação bacteriana só passa o plasnlfdeo
F de u1na célula para outra. Esse p lasmJdeo tem a propriedade de poder i1lse-
rir-se no cromosso1no da célula doadora. Nesse caso, ele pode transferir parte
do cromossomo ou todo o cromo$$0n10 para a célula receptora (Fig. 3.6).
Hr.

o :t
'•--~) :g
,_

~-
F-
~
/
o

Figun 3.6 - ~b.Kten.w.C8'.lsH!r. T~docrornossornodedliluHír~céll.ksF-. Os


gencs, o c b ~~mata6~.1'1o6fQQode~(IO).

As células que tem o pJasmideo ligado ao cromossomo bacteriano s.io


chamadas de Hfr (de High Frequency of l~econ\bination) e são elas que trans-
ferem genes cromos.sôniicos de bactérias doadoras para receptoras, como
ocorreu 110 experimento original da descoberta do processo de conjugação en1
E. coli. Ainda outra variação do mecanismo pode ocorrer. O plasmídeo F, insc·
rido em células H(r, l'Cn\ a capacidade de poder volta r ao seu estado autôno-
mo. Nesse caso, rara1nénte e le pode levar algum gene cromossô1nico quando
se desliga do mesmo. Plasn1ídeos carregando um ou mais genes do cromosso-
1no são chamados de f' (F linlla ou f . primo). Quando eles passam de uma cé-
lula para outra, carregam gene ou genes cromossômicos para a bactéria
receptora. Esse p rocesso é chan1ado de sexodução (Fig. 3.7).
- = ::!- -@
li
-
0tP0n1ãno& 1··-
j oom F E-11
doF ,

F 03
ã· R~n:~ Cf't"
WJ
@ ~ Permul8
desigual (F )

ESTÁGIOS DA CONJUGAÇÃO - De um modo geral, em uma conjuga·


ç.\o bacteriana os seguintes estágios podem ser distinguidos. a) FornlaçAo de
p.'lres específicos: ocorre entre célula> doadorô\S e receptoras, mas raramente
tJnlbém entre d uas célulns doadoras. A íorm aç~o de pares não é exatamente
ao acaso, mas envol,•e um p rõô!SSO de quimiotaxia, onde há atrpçâo dll célula
masculin.l pela feminina. b) Formação de cone"Jo celul.ir: feit.l através do pi·
l11s scx\lal (plural pilli). e) tvlobil lz..-.ção e transferência do cronlossomo ou do
plasmídoo F ou F': apenas uma fita de DNA, seja do cromossomo ota do pias·
mídeo, é tr.insferida. No C.lSO de transferCncia do cromossomo ele quMe sem·
prc só é en' parte transferido; a quebr;"i da ponte citoplasmática entre as d uns
céluJas é comum durante o processo. d) integração do material genético na
célula receptora: há parcó'lmento de regiões hom61ogil~ da fit.i de ONA pro·
vcniente da céltalas doadora e cro1nossC>nlo da c~ ltl1 a receptora. PeJo mecanis·
mo de pennutaç.\o ou "'crossing--0\•er"' vai ha\'er então a formação de
recombin.1ntes que podem ser isolad~ em meios apropriados.
1

A AMPLITUDE DO PROCESSO DE CONJUGAÇÃO ENTRE 13AC·


lÍRIAS - A"m de ocorrer em E. coli t outras enteroba<térias, a conjugação já
íoi descrita em mtaitos outros g(!neros como Vibriol Pst11domo11ns, Rlli:obiunr e
inrJusive em gl!ntros de ba('térhts g ram·positivns COJllO Slre11tor11yces1 Bacillus,
Strq>t««cus, et<". Existem pequenas \•ariações no mecanismo de arordo roma
esp&ie, 1nas .1s características gcr,1is d a conj trgaçjo perrnanecem as n1e-smas.
Cruzamentos intert'specífiros são âs \'l.'1-es possfveís entre gêneros aparenta·
dos, como Escliericlua e Sh1ge.lla. PS<udon10,,as poss uem plasmídeos designados
de J>. Alguns deJes são ditos p hls n1 ídeos promíscuos, pois podc1u ser transfe·
ridos para gêneros bastante distintos. A descoberta dos plasmfdeos J'> foi de
grande valor para a construção de vetores em Engenharia Genética (Ver Capí-
tulo 4). Enl estrcptomicctos a conjugaçcâo te1n facetas próprias. Existem 3 ti-
pos de linhagens quanto ao sexo: NF {fertilidade normal), UF (ultrafertilida-
de) é 1F (fertilidade ii1icial). Em Strepton1yces coelicolor o plasmídeo é chamado
de SCPl e atua OOD\O fator sexual e produtor de substâncias difusíveis. LinJ1a-
gc1\S NF t~m plasnlídeo integrado ao cromossomo, as IF tém plasnlideo autô·
non10 e as UF stio de-sprovidas de plasmideo nlas, ao co1\trário do que ocorre
cm E.scliericJ1ia, cruzamentos UF x UF s.'io férteis, embora em baixas freqlii!1\ci-
as. A descoberta de um segundo plasmídeo envolvido na conjugação dessas
bactérias pode explicar a fertilidade de células sent plasinídco SCPt.
UTILIZAÇÃO DO PROCESSO DE CONJUGAÇÃO BACTERI ANA - A
descoberta do n1ecanismo de recombinação por conjugaçào em bactérias foi
de grande titilidade, sob vários aspectos. Para estudos genéticos de espécies
bacterianas, ela pern1itiu o ntapeamc1lto de genes nos cromossonlOS e a cons-
trução de niapas genéticos. J>cr1nitiu tambén\ que fossem realizados estudos
sobre don\inância e recessividade de genes e1n célt1las haplóides, pela cons·
truç~o de zigotos parciais Olt merozig:otos com genes llomólogos na mesma
célula. Foi assim possível o estudo de con1plemcntação entre genes mutantes.
Mais importante.ainda, ela abriu cantinho para que a regulação génica, princi-
palnlente em bactérias e depois en1 outros seres vivos, fosse compreendida
(22). Pode-se n1esn\o dizer qlte a co1\jugaç3o bacteriana foi imprescindível
para o 1\otavcl desenvolvimento da Biologia !\1olectLlar e da Engenharia Gené-
tica nas últimas décadas. Finalmente ela permitit1, em esp&ies de valor e<:o-
nômico, que se fizesse un1 n1ell1ora1ne1\to genético agrupando genes de
interesse, em linhagens de in1portância agrícola ou i11dustrial.
3.3.1.2 - Transfonnoç.io em bactérias
O mecanismo de transformação foi o primeiro a ser evidenciado conlo
causando recombinação ent bactérias, a11tcs n1esmo do processo de conjuga-
ção acin1a descrito. Ele foi observado pela primeira vez 1\a lnglatcrr:.. Criffi th,
e1n 1928 (23), injetou em camundongos unia n\istura de duas linhagens da
bactéria então chamada Diplococcus p11e11r11011ine ou P11eu,,1ococc11s, hoje co11he--
cida como Slreptoeocc11s p11eun1011iae. Unia das linl1age11s usadas era virulenta,
mas tinha sido n\orta por aquecimento. A outra era viva e avirulenta. Os ca·
nt\lndongos injetados com a mistura 1norreram e deles foram isoladas bactérias
virulerttas. O fenônleno foi chamado de transformação, rnas não foi bem con1-
preend.i do na época. Só c1n 1944 Avery, MacLeod e McCarl)' (17) desvendaram
o nlecanismo. Eles, por meio de exaustivos testes, oonseguira1n demonstrar que
era um con1ponente quín1ioo das células virulentas, o ácido desox.irribonucl~i­
co ou DNA, o respons.ível pela transformação das células avirtilentas em vi-
rulentas. Foi denionstrado dessa maneira não só \1m sistema de recombinação
en1 bactérias mas tan1bén1 que o ONA era o material genético das rnesmas, o
1

que depois foi generali?.ado para praticanlente todos os seres vivos. O proces-
so de transforntação, ao contrário do qt1e ocorre na conjugação bacteriana,
nlo r:equer um contato ~tre duas células. nem tipos de reação sexu3l di.st1n·
tos. É a.ssim um mecanismo alternativo do sexo, mas que, da mesma forma
que a conjugaç3o, produz recombinantes. Tendo sido descrito em S. p1'tlirt1(JllÍ·
•t, vcriíicou·sc logo em seguidn que outras bactérias tamMm eram capa~es de
,erern tra1\SÍOrmadas para as mais diversas características e não apenas para
virulênci:.i. Atunlinc1l te pode-se dizer que qualquer gênero Ot1espécie baclcri·
.lna, dependendo dns condições de cultivo e certos con\poncntes qufnlicos
adicionados no meio, podem sofrer transfor1naçõo. Também pode ser trans·
formada qualquer característica gen~tica bactcria1la, seja auxotroíin, n\orfolo·
gia de colõnia, resistência a agentes inibidores, etc.
AS FASES DA TRANSFORMAÇÃO BACTERIAt'IA - Assim romo
ocon-e na conjugação, a transformaç.lo pode ser di,ridida em etapas ou fases.
'.':a natur-ei;a, antecedendo ao processo propriamente dito, de,•e ocorrer lise de
células de tal modo que seu DNA fica livre no meio. Em laboratório e~i~tem
diferentes métodos para extração do DNA das células que vão doar esse .icido
nucl~ico, qt1c sJo chamadas de doadoras, parJ as células qt1e ''30 receber o
ONA,. ditas receptoras. O material gcn~tico .issim extraido é chamado de
ON1\ exógeno.Esse DNA deve ter ta1nanho rclotivamente grande pnrn que o
tra1lsfornltiçào seja eficiente e deve estar cn\ seu estado de fi l'a dupla. ·r11nlbC:n1
é 11cccs.sdrio que as células receptorJs estejam ein um estado de aplidt\o para
receber o DNA. Esse estado,. chanlado de NC'ompetência", depende de diferes\·
tes fatores: existência de receptores espec(ficos para o DNA, fase de crcsC"i·
mcnto bacteriano, que por sua ' 'C7 produz modificações na membr.ina e
modific11~ no meio de cultura, que podem propiciar aumento ou diminui·
ç3o da competência. Atualmente, det·e rminadas técnicas como a eletroporolçlo
(abertura de poros da membr-ana por forças el,tricas), ou a utiliução de pr~
toplastos (célul.ls ~m parede) podem aumentar a freqüência de transforma...
çao. F.ltores genéticos também est3o envolvidos, tendo sido inclusive iSOIJdris
linhugen~ cot11 -~ isto é, constituídas por célt1I;•) não competentes e pot'l.lnto in·
capazes de sofrer tr.1nsformaç3o. Umn vci existindo ONA nativo, ou de íit.l
dt1pla disponível, <:existindo (élulas con1pctentcs, o contacto célulll co11lpC·
tente·DNA pode ocorrer. As fases que se desenrolam durante a transforn1oç1lo
são 11s scguintt'S: a) Entrada do DNA c.xógcno nn célula receptora - en1born
ele prC(iSC estar enl seu estado nativo de dupla hélice, com algumas exce~e~
a~nas umn fita do DNA penet·ra na «lula re«ptora. O processo de entrada é
bastJnte complexo e seus detalhes n.Jo são bem conhecidos. b) lncorpor<'~~o
do DNA exógeno no cromossomo da célula receptora: o DNA que penetrou
na celulil receptora vai se parear com a regi3o homóloga do crom~o da
mesma. O mecanismo de permutaç-Jo ou · crossing'"°"er' ocorre como na ron 4

jugaçâo. c) FormaçJo de recombinantes: nas próximas duplicações do DNA o


segmento que foi incorporado ao cromo!)son10 vai também sofrer duplicaç.lo.
Carregnndo tnn ou mais genes distintos Cnl relação aos da célula receptora,
pode ha,1cr modificação en' uma ou mais (tir:.icterístic"s genéticas de relulos
dcS<cndcntcs (Fig. 3.8).
li5e d<)
célula

Fragmenios
livres de ONA
Figura l .8 .. T~l»aen.lN.A, 8e( s.lo~dacék.ia.doadora, sendoque o, bec slo~homólo­
gos na célill re<:cplora. O gene 8 wt>Muiv o &C'\C I> "- dlt.la reccp«n.

A UTILIZAÇAO 00 MECANISMO OE TRANSFORMAÇÃO - Além da


e1\tr."lda de DNA cromossônlico nas células receptoras por transformação, po-
de-se também introduzir e lementos t?xtracromossômicos como plasmídios.
Tendo duplicação independente da do cron1osson10 bacteriano, esses pJasn1í-
deos podem permanecer nas células receptoras e Cn\ seus descendentes, intro-
duzi1\do 11ovas cJracterísticas genéticas nas mes1nas. Se esses plas1nídios
possuírem gen~ provenientes de outras espécies bacterianas ou n1esn10 de ou-
tros organisn1os, con10 plantas, animais ou da própria espécie huma11a, u1na
bactéria assim tra11sformada poderá produzir novas substâncias. ~dessa ma-
neira que certos hormônios, como insulina, somatostati11a e o de crescimento
humanos.ão hoje produzidos por bact~ rias como a E. coJ;. Nesse caso os plasmí-
deos f\lncionam como vetores de genes exógenos. Ess..-.. tccnologin de Enge11ha-
ria Genética propiciou grandes ª''a11ços biotecnológicos_, permitindo a
construção de linhagens bacterianas e de outros microrganismos transfor;nla-
dos, co1\Stituindo-sc em ' 'erdadeiras fábricas de fármacos e outros p rodutos.
A transformação é também um ótin10 sistema ge11ético para o estudo da
genética bacteriana. Por meio de transforn1ação pode-se combi11ar genes de
difere1\tes Ji1\l\agêns em l11na n1csma, fazer 1napeamento genético e construir
mapas genéticos bastante detalhados de regiões do genomJ das esptkies estu·
dadas. Por cxcnlplo, se11do os segmentos de ONA que entram dentro das célu-
las da ordem de 200 a 500 vezes menores que o cromossomo, dificihnente dois
genes d istintos dos existe11tes nas c~l ulas receptoras vão ser incorporados enl
conjunto. Quando isso ocorre (co-transformação) está demo11strada a grande
proximidade desses genes 110 cromossomo bacteriano.
A descoberta de transformação em outros microrganismos, como fungos
filamentosos e levedttras e a utilização em larga escala do mecanismo na Tec-
nologia do DNA reco1nbinante, faze1n con\ que esse sistema de recombi11ação
seja de g rande importância para estt1dos genéticos e parJ a ma1\ipulação de
bactérias e outros n1icrorga11ismos.
3.3. 1.3 - Transdoção
Além da transforn1ação, tim outro mecanisino de a lternativa do sexo de-
signado de tra.nsdução foi descrito cm 1952 na bactéria Saltt1onella typhitt1ttriu111.
llloco-"bl~ - ... • • .. •>
Ele pode M'f consider-ado um refin;imento do processo de transformaçJo. Na
transduç3o. bact,rias são também modlí1cada.s em suas caractcristic.is genéti·
cas por um DNA "'indo de outTas bactérias.. Entretanto. nesse caso o DNA é
carregado por vírus que atacam bactér'ias. os chamados bacteriófagos ou abrc-
vil\damente, fagos. Esses fagos Íl\ÍCCtan\ uma determinada bactéria, lisan1 a
mesma e pode1n ter um segnlento do ONA bncteriano substituindo seu pró-o
prio DNA, ou niesn10 ter alguns ge1lCS da bactéria incorporados ao seu geno-
ma. Assiin, quando infectar unia no"n bactéria, e le vái c.irregar esse motcrial
para ll célula hospedeira, desencadeando ri trt\1\sduçAo.
OS TIPOS DE TRfü\JSDUÇÃO - Exi~tcm basicamente trl.'S tipos distin~
tos de transdu(ào: generalizada. esp«ífic.i ou restrita e transduçào abortiv.i.
Cada um deles vai ser ,·isto em seguida.
TRANSDUÇÀO GENERALIZADA - Se um lago lisa uma célula ..,lv•·
gem e depolS vai infectar células mutant~. dentre elas aparettm alguma.s
contendo genes das células lisadas. Em geral. cada célula é modificada apenas
para um,1 c.iracterística genética. I~ ocorre porque, como j.i menc;i onado,
qurindo um fago ataca uma bactérin e mata a mesma, algumas par"tfculas virais
das ccn1cnas ou milhares que são Jibcr<1dns. por ttm erro de incorpor.ic;1'o, pos·
sucn\ um pcdnço do DNA do cromosson\O boctcriano em lugar do ONA do
próprio fogo (Fig. 3.9).

- Novat palticulas
Ot vlrus

ONAdo
VÍN$
-·0,.. ,.,
J~e su ltar\\ llSSim de uma célula lisndn un\ ou poucos fagos que contên\ no
interior de su<'I cc.pa protéica DNA de bact~riri. Isso não impede que eSS<l fago
alterado infecte um nova célula e injete o ONA dentro da mesma. 1\í, cvidcn·
temente nào vai ha,•er lise, mesmo que a célula receptora seja sensível ao fago.
O DNA no interior da bactéria vai se comportar como na transformaçio, isto
é. \•ai haver um pareamento entre esse )Cgment'o adicionado à céluli, com o
cor~pondcnte homólogo do cromossomo bacleriano, •crossing-O\'Cr..e apa·
recimento de recombinantes. Nesse tipo de transdução, qualquer gene bac-le-
riano pode ser carttg.ido da célula doadora p.1ra a receptora e por i))() ela f
chamadll de tr.lnsdu~o genE>ralizada. Con\o s.\o muitos os fagos que infect.tm
diferentes t."Spé<ies de bactérias. o processo é- de ocorrência ampla. tendo sido
dct·ectado cm diferentes géneros de bJct~rins. tanto gram·posit·i vas conlO
grnm-ncgativas.
TRANSDUÇÃO ESPEC(FICA OU RESTRITA - Morse, Lederberg e Le·
derberg (24), procurando novos virus que poderiam servir de vetores para
eíetuar a transdução, verificaram que um determinado íago cha.mado de
lambda (}~)era capaz disso, mas que a grande maioria das bactérias que sofria1n
transdução só o fazia1n para un1 gene, o que condicio1\ava ou não a utilização
~e galactose como única fonte de carbono (gal). Esse fago é do tipo lisogê1\ico,
isto é, pode ser incorporado no cromossomo bacteria1lo. NeSSt!' caso ele não
lisa a c~lula mas se multiplica juntantcntc com o cromossonto da mcsn1a, pro-
tegendo-a do ataque por fagos relacionados. Um fago i1tcorporado ao cron1os-
somo está em um estado designado de profago. Entreta_nto, cspo11taneamente
ou induzido por luz ultravioleta, ele pode sair desse estado, liberando-se do
('romosson\o bactcria1\o. O DNA do fago agora livre se 1nultiplica e <'entenas
de partículas virajs con\ capa protéic:a sâo fo rmadas e liberadas lisando a c~lu­
la. Uma pequena fração dos lagos liberados, quando saem do cromossomo,
carregam co1lsigo parte do cro1nossomo, à semelhança do que ocorre co1n o
plasmídeo F quando se modifica em F' (ver conjugação). Como o local de liga-
ção do fago no cromosson10 bacteriano é sen1pre próxin10 ao gene gol, é ele
que vai ser incorporado ao fago. Raramc1\te outro gene, o da deficiência nutri-
cional para biotina (bio), que está um pouco mais distante do que gal no local
de incorporação do fago, é também transferido. Quando esse íago, carregando
o gene gal+, p~r exemplo, vni infectar un\a bact~ri a gnl-, ele pode se incorpo-
rar ao cromossonlo dessa bactéria que vai ficar conl dois genes gal, unl selva·
gcn\ e outro nlutante. Forma-se assim um heterogenoto que pode novanlente
liberar o fago co1n o gene gale nesse caso metade das partículas virais que re-
sullam da lise da célula l'ai carregar esse gene, dando lisados chamados de
Hl-1 (High Frequency of Transduction). A Fig. 3.10 mostra os principais pas-
sos que ocorrem na transdução restrita.
TRANSDUÇÃO 1\BORTJVA - Em certos casos de transdução, o nlateriaJ
genético da bactéria doador,1 ('arregado pelo fago vetor penetra na bactéria re-
ceptora mas, por raZôes não bem clucidndas, não é i1\tegtndo ao cron\osso1no
bacteriano e, não tendo duplicação autônonla, também não se duplica dentro
dela. Exemplificando para o ct1so de u1n ge1le selvagcn\ para \tma auxotrofia,
tr.1nsduzido para uma célula receptora que possui essa auxotrofia, o que vai
ocorrer é que o gc1\e il\troduzido propic-ia a síntese da substá11cia em fa lta.
Entret.1nto,. q\1ando a bactéria se divide em um meio mínimo, apenas uma das
células filhas irá ter o seg1l\ento e só ela poderá dividir-se novanlente. Assim,
en1 lugar de unl crescimento em escala geom~trica, vai ocorrer um crescimen·
to em escala a ritmética. For1nam·sc então en\ ttm n1eio sólido colônias nti1títs-
culas, caractcristicas da lransduc;ão aborliva. A transferência das células de
uma dessas colônias para um novo 1neio tllí1,inlo dá co1no resultado apenas
uma colônia 1niilt'1stula, que é resultante da célula que tem o segmento trans-
duzido (Fig. 3.1 l). En1 geral o número de tra1\Sduçõl"S abortivas, co1nparado
con1 <>de transduções gc1,eri1lizadas, é 20 a 30 vezes maior. Isso indica qlte a
probabilidade de u1n segmento transduzido ser incorporado ao cromossomo
da célula receptora ~ pequena, en\ comparação co1n a probabilidade de sua
ll5o i1,cotpo1•ação.
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..
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lntegraçêo ~
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Normalmente

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l Ror•me•te

q (")
...

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1
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l q.
1
p-:.::::::::~
Oiplóid'e i>arcial
(~~il'l$hM!iJ _ _ _ e) Sei. normal entta na célula
~ - i.dg e). nwltiplieam·se dando o
~ llsado HFT oom 50% de i.dg e 50% de ).

b) Aooombinaç.\o entregar e ga1•.


reSdlado oé-Jula.:s 93f+ estáveis
a) Perda de i.dg por e-xeiS~,
re$u1Ulnd'O oéh.ll<IS gal- ff:tâveis,
pois i.dg ~õnomo não se duplica
(1 em l.000 divisões)

Figura 3.1 O - Atr~ res1nt.1 em~~ coma~ do gene 00 vtilrl~d.l ~ose <OtnO fonte<k
carbono (gd).
a) Só células oom segnienlo tranS<klVdo b) <Atl\ilas sem fragmento podem sofrçr
sào capazes de se dividir. algumas divisões antes de o JlfQdvto diluir•$0,

( ' ) (" .' )


I \' / \
(. :' ) ( .)
( ) ( ' )
-=- / \2 / \ I \
) ( '-'--'-~ ) ( _,_. ) {"- ) (- •)
( ) ( '
\ 2•1 • 3 I I \ -
I etc.
(- ) (·- ·)
1c:=:::i 1C:=:=') I \
I \ 3••·• {--- .) 1-~-)
Aumento em pt09"essào aritmétic<l

- - - C<omouom<>
- PedaQO ttpnsduzklo
• • • Produto formado pelo PQcl;)ÇO tranSduZiOo

Flgur,1 J.1 1 - T~~em~M.ls. a) Seapenasacélk~recebe ofragmemo transõ.aidon3o.-i·


COl'j)Ol"adoaocromos.wmosofre~.\Q.o~odo~ro<kcék.tuocorreem~~at'ltmétiUete·
SI.Ai~...,... uMa t'l'ICfocoi6rla em me.o sólido. b) X-~ céllks q.ie njQ rct;tbctn o (~o~ tarr'lbérn so-
frem """1 ou pouQS dJpl~õe$. dtY"do à e»st~ de m.)teNI ~ ~ microc:olõtv.a v;ti set ~ poucol'NIOI"
do qve no QI~ 3rtenor.

OS ESTÁGIOS DA TRANSOUÇÀO - A transduç.lo pode sor dividida


nos seguintes estágios: a) Forn\ação das parlículas virais transdutor(ls e seu
transporte: o processo nos três tipos de transd\1ção é feito pel(l incorpora(ão
de p(lrte do ONA bacteriano a<> do fago (transdução espe<iíica ou restrita), ou
por s ubstituição do ONA do fago por segmc1\to de ONA bacteria1\0 (transdu-
çõcs generalizada e abortiva). b) Entrada e destino do ONJ-\ dentro da bact~ria
receptora: a e1ltrad:i ~(c i ta por injeção do ONA contido na capa protéica virai
p(lra o interior da célula r~t?p tora. Se o (r.,gment'o for incorporado ao genoma
da receptora por "crossing over", ocorre a lrJ1lsdução por substituição como
no caso da transdtu;ão generalizada. Co1no o DNA do fago é circular (ver Fig.
3.10), uma pern\\1ta ou "crossing-over'' entre dois DN1-\s circulares resulta em
incorpor:içã.o do ONA qt1e foi introduzido pelo fago, sem s ubstituição. Se o
DNA não for incorporado e fic:ir livre na célula, ocorre a transdução abortiva.
USOS DA TRANSOUÇÃO - Como acontece no e.a so da conjugaç.ã o e
transformação, a tr.'lnsdução pode tambén'\ ser usada coino um sistema gc1\éti-
co p(tra mapeanlento de genes bacterianos ao longo do cro1nossomo. Uma
co-trar'\SdtlÇ<lo, isto é, duas características f-reqüente1nente sendo tra1lsdttzidas
em conjunto, revela ligação dos genes envolvidos. Estudos de complementação
gênica també1n sâo realizados via traosduçlio. Bacteriõf;;igos e outros virus po-
dem t<\mbém ser usados, à scn1clhal\ÇJ dos plasntideos, conto vetores cnt
Engenharia Genética. Aliás, plasmídeos e fagos tênt muito em comum, supon 4

do se que a origem dos plasmideos seja virai.


4

3.3. I .4 - Transposição do material genético e tecnologia do DNA recombinante


Os três sistemas de recombinação descritos aci11ta lllio s~o artefatos de
laboratório e devent ocorrer na natureza, permitindo t-roca de ntaterial gcnéli·
coem bactérias. A eles podem ser adicioJtados 1nais dois s istco\as. o primeiro
também natur.:il e o segttndo constituindo·se muito 1nais en\ u.n\a nlanipula 4

ção genética en1 laboratório do que um sistema natural de troca de DNA entre
células.
TRANSPOSONS - O genon1a dos seres vJv0$ sempr e foi considt.~r/Jdó
romo formado por seqüências bastante estáveis, so1lte11te ntodificad.:is por n1u 4

taçiio. Embora existissem exen1plos de que o material gcn~tico poderia sofrer


trJ11sposições de um local para outro do genoma, con10 em milho (25) e n1esmo
em fungos (26), esses casos eran1 co1lsider,1dos como exceções. Foi prêeiso que o
procésso de trc'l1\sposiy_'o fosse elucidado do ponto de vista molecular em bact~
rias, para que ele pudesse ser aceito deíinitivanlente pelos geneticistas. Hoje sa 4

be-se que o mecanismo de t-ransposiçâo é ger,ll e se constitui enl um pr«csso


que au_n,enta a variabilidade nos seres vivos, sendo de grande importância para
a e,rolução; reg\~lação gênjca e d iferenciação. Trt1nsposons foram pela prin1eira
vez descritos do ponto de vista molecular, quando se veriíia:>u que niutações
chamadas polares en1 sisten1as de regulação génica bacteriôlna eram çausadas
por segmentos de DNA inseridos em genes. Esses Sêgmentos ou IS (lt1~rtio11
Seg111e11ts) têm cm n1~dia 700 a 1.500 pares de nucleotídoos que codifican1 pro 4

teinas envolvidas no próprio 1nec.1nisn10 de transposição. A Tab. 3.1 apresenta


algumas propriedades de diferentes tra1\sposo11s.
T ll.bcl;s l . I ~ oracterlsl!CM <k <!-e:el'ml~ ~.os de ~(IS) ttn blaér'las.

1 T h Nútne.ro dc p.ires de N1ímcrode


Tipos o.m.in os b.lak"S dos 1erminais. prottinllS
de IS (pares de l:>.iSI.'$) j i.nver1idos rcpctid01 codiílco.das

15-1 70$ 23 1 2
IS-4 1 1428 1$ 2
15-5
15-IOR
'
1195
1329
16
22 '
3

Logo a seguir foran1 descritos outros elementos transponíveis c1n bacté-


rias, bem ntaiores que os IS carregando genes, conlo os de resisté1lcia a anti 4

bióticos entre outros. Esses genes eram flanqueados por ISs e o conjunto fo i
chamado de transposon (Til). Atualn1ente tanto 15 conlo Tn ton1am a designa·
ção geral de transposons. A Fig . 3.12 n1ostra um d~es transposons. Normal·
mente uma bactéria carrega ' 'ários tra1lSposons. A linhagem de E. coli K12
possuí pelo menos 14 t ransposons em seu cromossomo e três em set.1 plasmí·
deo F.

-9- -3(1- -30- - 11 02 - -3(1- -30- - 9-

1 1~ RI TN9
I ~ KI
ONAdo - - - ONAdo
hospe<feiro IS-1 IS·1 hospedeiro

Figuni J.12 O tt~ Tn9t-ncontrado em b.\Ctérias. c.ltl't-gando um &C-'f'lt' quic crirt rew.b'l<ia ao ~1bo6-
bCO (l()rJnfetlic:ol. Os n(aner0$ indicam ~ QIW(~ de parei dt' bases. IS 1é UTI segmento de ·~·

O MECANISMO DE TRANSPOSIÇÃO - O p rocesso so inicia pela du-


plicação do elemer,to tra1lsponível e termi1la con' sua inserção enl ot1tro loca l
do genoma. 1\ d l1plicaçào não acarreta a locomoção do transposon o riginal,
mas sinl de su(I cópia. Essa cópia vai ligar·se 30 DNA alvo em Otatro local do
cromossonlO Ot1 el~rt'\ento extr(lcromossó1nico. !\!tais detalhes sobre esse me·
canismo e sobre as enzirnas e1l\ro lvidas, podem ser e1lCOntradas Clll re, ,isões
sobre o 355\tnto (1, 27, 28). Esse sistema , logo após sua descoberta, foi cha·
nlado de " reconlbi1\ação ilegítima", pois i1\depende d as enzimas nor1na l·
rnente usadc1s para efetuar recombinação clássica através de permu ta ou
"crossing·over". No e1\tanto, logo foi visto qt1e esse é tan\ sistcn\a tão natt1ral
qt.1ando o a1lteriorntente conhecido. A transposição permite qt1e os transpo·
sons ít1ncionem conlO intcrrt1ptores em sistemas de regulaç.ão, permite qtLe
no,r;is in fo rmações genéticas sejam introduzidas cnt tuna célula e apresenta
assim um potc1'\ cial nlt1lto g r;i nde para aunlcntar a \rariabilidade e sobre-vi·
' 'ê1lcia de células. Possivclrl,entc plasmídieos designados de R, se1nelllantes
ao F, mas que carreganl genes de resistência a um ou ' 'ários agentes inibido res
de bactérias conlO antibióticos, quintioterápicos e metais pesados, íorant for·
mados por transposições de diferentes origens, selccio1\ados enl tim plasmí·
deo único. Tal plasntídeo confere às bactérias un\a vant~1gem -seleti,•a na
presença desses inibidores.
OUTROS EXEMPLOS DE TRANSPOSONS - Cerlos bacteriófagos como
o ~lu (Mt1tador), t;imbé1n Ítincionanl conlo transposons, inserindo-se em ' 'árias
regiões do cromosson'o bacteria1lo e ca11sando rnutações. Ern íungos fila nlen·
tosos e leveduras, tan,bém são relativanlentc bcn\ descritos casos de transpo·
so1,s. Enl le\•edt1ras, ' 'ariaçt">es no tipo de reação sext1al ou "mating·types" são
ocasionadas por tra1lsposições de nlaterial genético. E1l' plantas e anintais su·
periores também transposições foranl detectadas enl grande número. A desco·
berta desse sisten\a de recombinação J;inçou novas Juzes aos (~nônle1,os
ligados à alta instabilidade genética aprese1,tada por alguns microrganismos e
d ificilme1,te explicada pela genética até então. É o caso de variação de fase em
Sa/,,1011ella, tipos de reação sexual em leveduras, instabilidade rt)itótica e1n furl·
~·..-- . . . . . . 89

go.s íilam('otosos, a lguns de import[incia indus trial, capacidade de a lta rcsis·


tência a vários inibidores c1n células bacterianas (' nluitos outros. O:;
tra 1lsposons são rcsponsâ,,eis por uma verdadeira E1lgenhoria Genética i11
rivo nas c~l u las. Em alguns microrganismos que \'ivem dentro de plantas,
os cndófltos. parece existir uma certa coincidência de genes iguais ou seme--
lhantes em ambos. Se confirmados esS("s .Jchados, estaria demon~trada a pos·
sibilidade de transfcrênci~ por transposiç~o. ou mecani~mo similar. entre
genes de células de reinos diícrcntc-s. Esse processo já foi demonstrado c1n
b.ict ~ ri as que CAusiln\ tltnlor~ em plantas, como as do gênero Agrobacltri11111,
que podem ter un1 seu plasmídeo designado de Ti incorporado ao gênOn1a dn
planta. Entretanto, o existência de u1n fluxo gênico entre g\!1\Cros, familias ou
mesmo reinos distintos, pode denlonstrar que a Engenharia Genética é um si)-
tttma também natural de recombinaç3o u~do ~os seres \ ' ÍYOS, embora ocor-
r.i com frequência reduzida.
A TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE - Descrita J'<'la primei·
r\l vct cm bactérias no inicio dos anos 70, a tec-nologia do DNA reco1nbina1,.
te fo i ampliada rnpidamente para ou lros mic1·orga1l is1nos e, depois, parn
todos os seres vivos. Ela é considerada um sistema de recontbinação a rtifici-
al, por manipulaçJo do material genético de células e introdução de novas
características nas mesmas. Do ponto de ' 'ista gen~tico é um sistema de re·
combinação que aumenta a possibilid.1de de obter ' '.iriab1lidade. Do ponto
de vista biotecnológico, ela pode produ1ir linhagens de importãncia econô·
nlica. Essa tecnologia vai ser vista e1t' detalhes em outro capítulo desta 1ncs-
nto pt1blicação.

3.3.2 - Recombinação em fungos


Como acontece em bactérias, a recombinação em muit.1s espécies de fun·
gos pode ocorrer por mais de um mecanismo. Sendo microrganismos euca.r\6-
ticos, os fungos possuem núcleo típico e muitas espécies nprC"SCntam um ciclo
sexual similar ao dos a ninlais e p lantas supe riores. Entrctnnto, grande pilrtc
do ciclo ' rita l da 1l1aiorlíl dos fungos~ ltoplóide. A fase diplóidc é bastante rá-
pldn, pois assim que dois ntícleos se íundcm e dão un\ ntíclt'O d íplóide. ocorre
meiose com ' 'olta ao estado hapl6ide. Além do mais, os chamados Fungos
Imperfeitos ou Deuteromicetos não pos!tuem ou ainda nJo tem descrito seu ci-
clo sexual. Nesses fungos e mesmo em outros que possuem ciclo sexual exist·e
um sistema alternativo de sexo. denominado de ciclo p3rassexual, de-scrito
pela primeira ' ' C7. por Pontccorvo e Ropcr cm 1952 (29). Ta1nb~n1 em fungos, à
semelhança das bactórius, transforo1a,,;o por DNA pode :-ter usado como u1l'1
slstc nla de rccombina~.lo. Pa ra fo rç.1r n parassexualidadc s.;o i1sadas técnicas
eficientes como íusJo de protoplastos. Finalmente, também da mesma manei·
r., que em bactéria.s, a tecnologia do ONA recombinante pode ser usada par.1
produzir nov0$ genótipos. Esses sistemas de recombin..1ç3o em fungos serão
aprese-ntados a seguir.
J.3.2 1 Oódo~emrungos
Como mencionado, os fungos s.\o euc.-.rióticos e muitos deles têm um
processo ~>tual com fu.slo de núcleos hap16ides, produção de núcleo diplóídc e
meiose, rc~ultando nove'l1nente células haplóides. Cada espécie de fungo qt1e
possui ciclo sexual apresc1l la caractcrístic.'ls próprias nesse ciclo, 1nas o objetivo
de s ua cxis t~ncia é sempre o n1esmo, isto é, produzir recol'nbinantes. Alguns
fungos s..l\o homotáJicos, ou seja, não possuc1n tipos de rcJ.('Jo sexual dis tintos.
Nesses caso eles podem ~ autofecun<Wr e recombinantes nJo s.lo produz.idos.
Eles podem também soittr CTv1.amento com outro talo .produzi-ndo rerombi·
nantes. Outros fungos sào hett>rolâliros, com dois ou mais tipos de reação sexu·
ai ou "mating•types "di~t intos. Nesses casos só linhagens de diferentes tipos
d e reaçõo sexual é que se cruza1r1. ;-\ s Figs. 3. 13, 3. 14 e 3. 15 npresentam os ci·
cios sexunis de três diferentes e"Spécics de fungos, dois fil.atnentosos, o Aspergi/·
l11s nid11la11s (homot.ilico) e 1'lf11rospora crassa (heterotálico) e uma le\'edurJ~ a
Sauharom~t'S ctrevisiat.


- hai
. ~a
·" " '- ~-.....
b e l
g~ i:.
Meiose •

.Meios.
·~
M---:.......
Heterocárlo
(V« 119. 3.• ,,

~
. @:)

..,_
.
(..e) e
~-~ 91
1
Todas as três espécies têm sido amplamente usadas em Genética. NC$ses
fungos e em outros que possuem ciclo ~xual fica fácil estabelecer cruzamen·
tos para esludos genéticos e para programas de melhoramento genélico. Exis-
tindo mulantes, a análise genética pode ser realizada com facilidade e,
dependendo do fungo, as análises podem ser feitas a partir de esporos sexuais
ordenados cnl compa rtimento do corpo de írutiflcac;âo; como ocorre em l..Jeu-
rospora crnssa. Pode ser feita també1t1 por análise de esporos sexuais 1llJO ordc·
na dos COJllO c 111 Snccharo,,1yces c1•rt•uisia1? ot1, ainda, por esporos scxl1a is
coletados no acaso como em Asp~·rg;t/11s nid11Ja11s. A Fig. 3.16 n1ostra nlgL1ns
exemplos dessas análises genéticas.
TiPO de reação sexual A Tipo de reação sexual a

Micronidios Macnlnldios
$( •
••• ...._..... .d .
: --..on1 10S

"
Asoogõnío

Nucleo do a5<:0gõolo A
1
/
_,NUcleodo NUcleodo
o c:onldio. confdío A •••
NUcieodo
ascogOOio a J
Asl:O com núcleo
Hiía ascôgena diplóide

Perité<:io Peritéck> "'

Figura J . 14 Oocloserualno~Ntúl'osporooa.so(.Stnckbctger. 13)


F*igvra J, IS Oodo~N\cYtdlnSocâo'o""'r«1 ttrtv6«<0ft'l l ~°' ~IO'<llJ(.1 e o )~«t
d .. 12)

3.3.2 2 - O ciclo para!lexual em fl#>p


O ciclo pa r~xual íoi descrilo pela primeira vez no fungo A.. tridulons.
Graças à existência de mutantes para coloração de conídeos e mutantes auxo-
troficos, foi possivel oolncar duas linhagens de cores d e conídeos distintas e
auxotróílas ta1nbén\ d istintas crn tun meio l íquid o 1tl h\imo, com tuna pequena
qu:'lnlid adc de meio co1npleto pa r:'l pernlitir apenas o início da germinaçJo
dos conídeos. Nesse caso. ocorreram anastomoses de hifas com ~ formação de
heteroccirlos (dois núcleos genetic•mente distintos em um citoplasma co-
1num). Esses heteroc.irios podiam crescer e m meio mínimo, pois um núcleo
fornecin o qtae fa ltava para o outro. Entreta1110, conto o fungo te nt conid ios
uninucleados, os conídeos dos heteroc.'lrios e r<'lrn igu3iS aos das linhagens que
o fo rmar.1m e não podiam crescer no meio mínimo. A seme01dura de milhões
de con,deos pro,·enientes de um hcterocário em meio mínimo produziu, en--
tretanto, algumas colônias prototróficas. Essas, com surpres01, er'1m dipl ó i de~.
o que foi C01"1sta tado pe lo volume de setas conídc."Os, que e ra o do bro do d:is li·
1\ hagens originais Cj\ IC foritlara m o l\ctcrocário, pela q t1antidadc de DNA cm
seus nticleos que era tnnlb~ m o dobro da encontrJda cm conldcos haplóides e
pela possibilidad e que essas colônias tinham de formar setort"$, principalmen·
te se transferid~ para meio complc10. A análise genétic<.1 desses setores reve•
Jou scrc1n t1lguns recombina ntes l1aplóides. originando·se por t11n processo de
não disjunçfio col'n pe rda de cron1osso1nos a té o estado origi1tt\ I ha plóide ser
ating ido. Outros eram diplóidéS, ori g ii\a nd~se por permutaç3o ota "crossing·
over• mllótiro (Fig. 3.17).
• .!!!!!!!_ ,
,,
-~
oo
(b) Pennvt~ •nlr• o 9""" •o c:eMtOmeto

~
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'li

~ -- o

,,
~- o

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o ,,o o, ,,o o,
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o ,, ,ooo oo ,,o

-- ,

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...
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NPO

Ili
li
FJsw<t l . 16 ~de~~"""'~ 1• ...,,... f91'1hc.&lt"IV'p~a(Qf;<0nom~Ol'de
Neb;-wull"WIO"C • ""el90'°'~e ·~brwol ~~fpoW...d~.,.,,...~p.inOdlfl'·
l'l"INÇkl dl ~ Mltt"'" l'f"t: to«io6 1et0. n . Tipoe; de .nco\ <iO'!'I ~ orden.tdm cp.wdl)<llM ~ ~ ~
dol~(l"'lftAeB) • · $ittt!ot$~~.ao ..........deb'l'NNo~dOl 1~~0l'l"lll . r.,•
. -....... _....""'°""(PO).n!o-d1fpoas(NPO)e1-(1).oquc"""',_..,.qucv.\No<1!·
°'
lai;6H fl'ltfe genn ~ po$Ul'n ~ d>t.dli
~-~\-\\
Fusàci de hiras Fudo dt nüdt0$ NUdeo
(helerocário) no lntoriol d., hlfa diplóiclo

Coni<fto${ .... .
diplóides ••,,.

J
~
\;:V
Cofóntasd~
sefeclonadat em
placa com melo Segreg<'lnto$ ~l)lõdes
mínimo e dipk)ilJes a l)<'lrtir
do colônia diplóidc
heterozigo(a em
melo oompleio

Fliwal. 17 oooo~em~

Em ambos os case» aparccer.1m rt.-combinanlcs. o que pcrmill\1 um no,·o


processo de análise genétic41, propici.lndo um rápido mapeamento de genes
em seus respectivos cromossomos. 1\pós ~cr descrito cm A. 111dufa,,~, e le íoi
con~ 1 .i t.1d o em AsJNrgillus u;ger, Ptnlt;/Jiu111 cl1rysogen111u e muito~ outros fun-
gos imperfeitos que nào posstliílo' ciclo sexual e que, potta 1,to, 1l,lO eram fllcil·
ll)Cntc cstudí.'ldos do ponto de v i ~ la genét ico. Dentre os deutcro1l'liCctos l'SIJo
iinportõ111tes fun gos de i1l tc1·csse biotcc1\ológico utilizados na produ~At, de an-
tibiólicos, ácidos orgânicos, cnzilnn), no controle biológic:o de insetos, etc. O
ciclo põ1rassexual como a lte-rnativJ do M!XO, pct1nitiu qt1e a gellétlca e o nt('w
lltoran1ento geJ\ético fosse feito com gr.Jnde sucesso como em A. "igfr, Tricl1~
drrnut e Pt<11icillir1111. Em A . '1id11lans que possui OJntbos os ciclos sexual e para~
c;.e'.lt:ual, uma comparação entre o-. mesnlOS pode ser feita (Tab. 3.2).
..loje o ciclo já é conhecido cm dezenas de fungos (Tab. 3.3). V;.ri.tçôes
nh ..e ciclo podem ocorrer. Uma delas, descoberta em A. nigt*r é a par.tmciose
(30) ondt rec:ombinantes podem ~r oblidos sem isolamento de um diplóide
cstoivel (Fig. 3. 18). A parameio:,C jj foi descrit.1 em 8eauveria tiassitu11r ( lvlitarlri·
:i111't t1nisopliae, ambos de""'º' no contro le biológico de insetos (3 1, 32) e pode
/i.l'r ~ ·xp l icad,, conto sendo causada por d iplóidcs transitórios, tr:\nSpo:,ons ou
nlCSnto por transf<>rnlaç!io dc1\tro d:lS hifas.
1. F"u$âO nuclc.ir em cstrutur3S es~ 1. FusJo nuclc"r '"'"em qu"lqut>r
c-i,d1z11do1S n11s hifas, r,~~u hando zl~o­ pCJnto d11 h ií;a, d.indo dipló idt•!f.,
tos diplóidH.
1
2. O x.igoto lorma<io' cf~m~ro, per· 2. O d1pl61de n.\o f "'(-m~ro f' to(r(' 1
,.i~t ind o por llJ>('n.1.s un1i.\ l;l' tt1ção nu· m it~ii., dt1nd o mal1t n\icloos diplói·
<ll'o'lr. d<'$.

3. ~leios(' rom rerombin,,i;Jo m~1ót 1(ii 3.. Rttomb1n~Jo r.1r,1 por pê'rmut•·
no \'$.t.igin de quatro fiOtl ~· ' 'ólta "º Ç•'º mltótl<.11. O.:orrc h.,1plo1dl1t1ç3o
t'"t.igio hapló ldt'. r.ira por n.ào disjun(ló.

"1. O:s pl'()(h1t05 meióti<c>o- C.'lstóspa-- .i, O:s rtt0mbin.1nt'°' m1tõh~. lM.' uti·
ros) são f.1cllmentí.' '''<Mht·<idos" li:.:iid°' m.1r<<ldOrt'S :1pr(1pn.td~,
i-"Olados. emtr~e1n rorno seu,r('$ oriundos ele
collinw.. diplóick-s

1323 - fusJode~-~
Enlbo ra seja \ lm me<:Jnis mo parJSS('Xu.. I de obtcnç.lo de rccombinanl<."llo
fac:ilit11ndo hetcrocariose, que~ o primeiro pai,so da parnssexualídade, (1 fu-
são de proloplastos, pela sua importinc:ia, ''ªI ~r desc:"rita separ.,damenle do
ciclo p<1rassexual. ~1esmo em fungos que possuem ciclo ~).uai ou parasse~ual
a he tcrocnriose 11cn1 sen1prc é possí\'cl, d evido à i11con1patibilidndc <lc a11:isto·
moses ocasionada pela parede celular. A possibilidade de se produzir células
inteir.,ment<" d<.'Spro,·ida)> ou apcnaii. com re~uici<b de parede celular. ~
protoplastos (con1 total auo;:ência de p.1rede) ou (-S:ft:"roplallotOS (devido ao seu
formato esfé rico c n1 meio rico em cst.ibiliz(ldorcs osn16ticos, po<lcndo conter
ou não restos de parede) abriu a possibilidade de se (u11dir c61u1Js as 1nais
di,·ersa)>, n.ão só de fungos m.ls de pr.tticamente quaisqt•er células ' 'Í\'as. E,•i·
dentemente qu:tnto ma is distantes s.\o as células de e~p~cies fusionadJii.,
1 mais diíicil fi ca s un viabilidade e n\ultip licnção. Protoplas tos podem ser
obtidos de diferentes m41neiras, mas. de modo geral, o tratame1110 de um
fungo com enzim3.s que destroem a patede celular é o preferido. 1.sso é ft."ilo
em 1nc io com altJ conccntr.1ção d e 5,\ÍS o u l'IÇticares (est.1bili2adores osmóti·
ros), p<1r3 C\•itar o rompil'nC1\tO das células. Os d ctaJhes de o bten c;r'lo d e proto·
plastos podem S<?r encontr•dos em \'~rias publi<açóes (1, 2. 27, 33, ~. 35, 36).
Obtidos os pro topl.1stos, a fusão pode ser (eitJ por adi(:to de agentes fusog~
1\ icos :10 ntcio, con\O o polietileno glicol ou 11breviad31ne111c PEG. o u po r cor·
rentes elé-tricas, por um processo conhocido co1110 e letroíusão (Fig. 3. 19).
A$Cocl1y1a ir11perp«ta
Aspi-rgilh1s tu11strlodar11i
A5/h~rgillus flavus
Aspergillus fu111igat11s
Aspt>rgiflus nidulaus
1l spergillus 11iger
Aspergill11s oryznt
1\spergill11s rugulos11s
Aspergill11s wjat
Beauwlia bassianta
Ct·pJialospori111n acrt•111tn1 ii1111
C••pl1alosporiun1 n1ycopllyii1n1
C1Xhliobol11s sati&us
Copril1us fin1etari11s
Copri1111s lagopus
, D.vctyosteli11111 discoilttu1t1 (1t1ixco111ic(toJ
Fusari11111 oxysport11t1 (. sp. cnllistepl1i
Fu$ariu11i oxysr1cr11111 f. sp. cubt11'St'
Fusariulf1 oxysporunt (. sp. pisi
Fus.nriuni rtdolrus
A11:tarhizi11n1 anisopliae
J\1icrospor11111 gypsi11n1
Peuicilli11n1 chrysoge1111n1
Pt11icilliu111 digitat11111
Pt11icilli111ri expa11s11111
Peniciflil1111 ilalic11n1
Phycon1yct"S blflkt"Slt·anus
Phyn1atotrichu111 on111ivor11111
PhytoplitJ1ora i11/t•staus
Piric11laritJ ory:ne
I'11cci11ia gran1i11is tritici
SaccJioro,11yce$ ctrtvisiat
Scliizopl1yll11n1 cllonu1111ne
Ustilago hordt·i
Ustifago ,1111ydis
llstilago violnce"
V erticilli111,1 albo·al111 n1
Vtrticilliu111 dalitiat var. lo1tgispor11n1
_ __,..__
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...... ~--.- 97

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•liJM 1eS
Í'&'A) 19 .. fvtaode~tr'l'l"Pfo-.b-~·~d·~~f1~)
De muitos protoplas1os usados, apenas alguns sofrem fusão. É necessário
enttl o uma seleção dos prod utos de fusão , que ~ facil itada se forem usadas li·
1lhagens con\ nluta ntes apropriados, con\o auxotróficos, resistentes a drogas
etc. Em geral, heterocários são recuperados em meio 1nfnimo, utilizando-se li-
nhagens ni utantes com deficiências conlplementares. Desses produtos de fus.; o,
diplóide e recombinantes podem ser obtidos. As barreiras d(' incompa tibilida-
de, ro1npidas pelo tL.;;() de protoplastos, permitiram que h1sões pudessen\ ser
re,aliz.-idas c1\tre espécies e n\cs1no gêneros distintos de fungos. O prinieiro
exemplo be1n documentado foi a fusão de duas espécies relacionadas, o A. ni·
dulaus e o A . rugulos11s. Os produtos de ft1são pl.'rmiliram u1na compa ração en-
tre n1apas genéticos das d uas espécies, abrindo possibilidades de se estuda r
s imilaridades entre fungos, inclusive aspectos laxonônlicos dos n1es1nos via fu-
são de protoplas1os. Atualmente, são conhecidos nluitos casos de fusões de
protoplas tos en1 leveduras e fungos fila1nentosos. Alg11n1as dessas fusões pro-
d t1zira1n recon\binantcs de grande valor indus trial como em Ct'pllalosporiu11r
acrer11011i11111, produtor do antibiótico cefalosporina (35) e em leveduras para Ji1\S
enológicos (37). Os protoplas tos são tan1Mnt fun danlentais p(lra que outros
processos de rcco1n binaçâo possam ser usados em fungos, con10 a trans íorn1a-
çlío e, conscqllcnten1cntc, a Engenltaria Ct:>nética. Protoplas tos de fungos são
empregados ta1nbC1n para separaçJ.o elctroforética de cromosson1os e1n géis de
campo pulsado (38, 39).

3.3. 2. 4 - Transfonn.-ição em fungos


Uma das gra ndes dificuldades do uso de fungos em Biologia rvlole<ular
foi a incxistêl\cia de un1 sistema de entr.-ida de DNA nos mesmos via 1ransfor-
n1aç3o, co1no ocorre " º' bac t~ri a s. 1\ situação começou a ser modificada, qua n-
do célul.-is ii\capazes de utilizar inositol em N. crasso foranl capazes de íazê·lo
ao receber DNA de linhagem selvagem. Essa transíorn1ação ocorria en1 fre-
qüências muito baixas e os transformantes eranl ins t.iveis. Foi só cm 1978 que
a tran.sformaç.ã o genética foi obtida con1 freqüências maiores em S. ct•rt.'Visiae.
Un1 ano mais tarde o 1nesnlo foi conseg11ido em i' J. crassa. Hojé o processo está
bt nl estabelecido, não mais uti lizando-se 11111 DNr\ isolado, n1as sim plasmí·
doos carregc1ndo genes de ftlngos. A extração de DNA de células doadoras é o
prinleiro passo 11a tra1\SÍor1naçào. Esse DNA é colocado em vetores, c1n ger<ll
plasnl idcos, e clonado en1 células bacte rianas, por exe1nplo. O scgt1ndo passo
é a preparação das célu las receptoras. Elas têm que estar em \ Lnl estado de
co1l1petê1\cia e isso pode ser con ~g uido com certas subs t.1 ncias químicas,
con\o acetato dé lítio em leveduras ou então protoplastiz.ando as células. em
fungos fil amentosos. Protoplastos em p resença de I'EC 011 por eletroporação
são muito receptivos ao DNA exógeno. Finalmente a introduç.\o do DNA exó-
geno, e ni. geral plasmídeos com genes de fungos em células hospedeiras, pro-
duz transformação.
Há três destinos desse DNA que penetra nas células. Ele pode ser iJlle·
grado ao cron1ossoJnO do fungo em local de ho1nologia tom o g('1lo1n;.'I car-re·
gado, ele pode s ubs tituir o gene homólogo no fungo por pern\uta ou ele pod('
ser inserido em ot1tro local do genoma do fungo que não a região honlóloga a
ele. Enl qualquer dos casos está ocorrendo recombinação. Dessa maneira o
processo de transfor1nação e 1\l fungos é de grande in1portância para a realiza-
ção de pesquisas bâsicas ('aplicadas nesse Reino.
3.3.2.5 - A tecoolog'1 de ONA 'ecombinante em fungos
A transformação genética elucidada e tornada rotina em fungos, aliada à
faci lidade de prod ttção de protoplastos, tornot1 possível a apliC.Jç.lo da tc-cnolo·
gia do ONA recon\binante nos nlesn\os. Ah1almente a <:lonagem de gc1\es c1n
fu1lgos e s ua expressão é comtntlente realizJda, an1pliando sobremaneira as
possibilidades de obtenção de novos produlos inlportantes do ponto de vista
biotecnológico, tendo esses microrganis mos conlo J\ospedeiros. f t1ngos como S.
ar.wisine e A. niger, além do Pe11icilli11111, são usados há n1uito te1llpo na produ-
ção de bebidas, a limentos e fá rn1acos. Isso faz con1 qt1e seu tiso con\o vetores
1lão catise tantos problemas de ordem ética.., ambie1\tal e de rejeição conlo bacté·
rias, principaln1ente a E. coli. Detalhes do uso dessa tecnologia poden\ S('r en·
contrados c1n ;\ zcvcdo (1, 2, 27), CostJ (3), Le\,•in (40) e no capítulo sobre
Engenharia Cenétic.l nesta 1nesnla publicação. Derivados dos estt1dos sobre Bi·
oloSia Molecular St1rgira1n tJnlb~1\\ valiosas tecnologias parq a separação de
cromossomos, para estudar variabilidade gc114!tica e paro 1napean1ento cron10S·
sôn1jco, entre outras. Essas técnicas são conhecidas por s iglas conto CHEF e
OFAGE pa ra sepa raç.ã o de cromosson1os em can\pO pulsado (38, 39), l~FLP,
PC R e RAPO para n1apeamento genético e para a n1plificação de seg1t'\et1tos de
DNA e estudos de variabilidade. El;is têm pern1itido um maior conhecin1e1lto
dos fungos e de outros n\icrorga1'\isn1os do ponto de vista da sua Cenét-ica tvto-
lect1lar, faci litando os processos de melhoran1ento genético.

3 .3.3 - Recombinação em outros microrganismos


Embo ra nào tão i1t1porta 1l tes para estudos genéticos ou biote<:1\ológi·
cos, recombinação também se verifica em vírus, algas e protozoários. Resu·
midan1ente serão apresentados os principJis sisten1as de recombi1lação nos
O\CSJtlOS.

3.3.3. 1 - Re<ombinação nos vfrus


Os vírus permitiram, en1 vários casos? a e lucidJ ção de in1portantes <lS·
péctos genéticos, con10 a decifração do código genético ou ~sti n1 a ti\ras das di·
mensões dos genes. Os virus 1nais c 1tl pregados são os bacter-iófagos. Como já
visto, eles té n1 un1 papel primordial em um dos processos de recombinação
bacte ri<lna, a trans duç-ào. E1ltrcta1l to os b;icteriófagos por s i só apr('S('1l tanl um
sistema de recombinação. O processo é si1nplcs. lníectando·sc uma célula bac·
tcriana con\ duas ou mais linhagens mutantes de fagos, ocorre síntese de
ONJ-\ llO illtérior das bactt1rias, que depois de algum tC'nlpo soíre1l\ lise e libe-
ra nl partículas de fagos. Dentre essas partfculas, a lém dos tipos parentais,
apa recem reco1nbinantcs. Um dos primeiros exenlplos de reconlbinação en\
íagos fo i descobe rto por Hershey e Rotman ent 1949 (41). Eles infe<:t.lrani duas
linhagens, B é B/ 2 de E. coli co1l\ dois tipos de bacteriófagos, o primeiro con1
ge1lótipo h+r+ (lt+ tem (!finidade e a taca as duas linhagens de E. toli e r+ dá
lise normal } e o segu1tdo coni genótipo h·r· (ataca só 1.1n1a das li1\l1agens e tem
placa de lise rtipida e portanto maior que o selvagem r+}. 1-\ pareceram entre as
partículas virais que resultar.ln\ das cél\1las Lis.ldas os dois tipos parentais,
alé n\ de dois outros tipos, os recombi1\antts ll+r· e lr·r+ (Fíg. 3.20}. Expe ri·
nlentos infectando-se bactérias con1 três ti pos de fagos nlostrarani qtte re·
conlbinantes e ntre os três tipos pOdê 1n ser recuperados. Suas freqüências
sâo co1tlpatívcis com pern1uta ou "crossing over" entre e les, sempre dois a4

dois e m vá rios c iclos ou turnos ( IC rccon1binação.

'
"'
(wrva)

º
(lise tépida)
h'r'
(límpida)
(llse normal)

/
, --'
'
1' 'l h"r

O
t {lfMpid;a)
',
--- ,, (liseN)J'.lida} hfº (ll,,IJVi'I}
(i$0 normal}

na)<Otn owoil·r· ~doe lise tl.HV.l e grarde) tesdwn os ll?OS p.ar'etUS (h +1 - e'>'+'-) e os dois bpos recombn.in·
~t$(11-t r. ~ tt.r•). A~ ~pr~.:i os fenóti?OS das plaa.s<lc lscem Esdiendlio<ofr ~~ B e 8J2 ~
~tm~<le?ctn,

Os bactcri6íagos e outros vírus são tambén\ de valor na tecnologia do


DNA rccon1binante, como vetores de genes e conlo modelos para d iferentes
c-xpcrimc1ltOs genéticos. Também s ua in1port{incia aplicada ".em sendo cada
vez 1'1''U)ÍS acentuada nas áreas de sat'.lde e controle biológico de insetos-pragas
da agricultura como é o caso dos baculovirt1s que sâo patógenos de in1portân 4

eia para pragas como a Lagarta da soja. (2, 34, 42).


3.3.3.2 Re<:omt>nação em protozoános
Foi principalmente apó~ ri descoberta de tipos de reaçJo S(');\l{ll em pr
tozoários que sua genética começou a adquirir Gerta import3.ncia. No enta
to. o \'OJume de trabalhos genéticos com eles ~ muito menor do que e
bactérias e fungos. A lguns são raz.oa,1eln\e1\te bC'm estudados, principaln\cn
~1\ l rc os cili<'ldos, como espe<:ics dos gêneros Pnra11u·ci11,,r e Te1rnlty1uena. No e
t.1n10, a nào íormnçào de colõ1lias cm meio s61ido, a complexidade dos mci·
dt cultivo e conseqüentemente o dificuldade do isolamento de mutantes, lirr
tJ muito o uso de protozoários em Genética. Nos protozo~rios ciliados 1
dois tipos de núcleos, os macronücleos e os m1cronúcleos. Na reprodu(:
.assexuada há simplesmente ttm estrangulamento da célula, resultanc
d itas células filhas. Na reprodu\Ao sexuada, cxcnlplificartdo pílra êl espéc
Ttlrnl1yr11enn pyrifor111is, duas células de tipos de reação scxuíll opostos ~
conjugam pelo citóstoma. ocorre meiose nos micronúcleos,. com a íormaçJ
de quatro deles cm cada célula. dos quais três degeneram. O que restou St
Ire mitose e do.i dois micronúclcos, um dos quais migra para .i ou1r.i célula
se funde com o que lá permaneceu, resultando assim no,1antente micronl
clcos diplóidcs. O micron úclco diplóide de c.idn célula sofre d uas nlitosc:
dá qt1a tro 111ic ro 1t l~cle o s diplóldcs, d o is d os quJ is vão da r 1ttacron1\cleos (
que esta''ª na célula degenera). No final resultJ.nl células com um m icroni
cleo e um macronúcleo cada (Fig. 3.21 ).
O ciclo \ 1ital de Paramtci11m como o P. aurrlia é semelhante.. Nessa esp(
c:ic ocorre um outro tipo de recombinação, chamado de au1ognn1ia, que en
volve a penas un1a célula. H ~ 11ma d esorganiiriçAo do mC1cron(1cleo. d ivisà·
n1eió tica e depois 11titótica do nlicronúcleo, resttl tando oito deles dos quaí
sobra apenas un\ que se d ivide. Os dois m icronúcleos resultantes fu ndem·st.
dando no\•amente um micronúcleo diplóide e, nesse e-aso. homozigoto. Res
titui-se assim um s6 tipo de reaç3o sexual, pois os protozoários que saen
de uma reprodu\âO normal por conjugação s:to heterozigotos para o gen•
de reação sexual e não podcnt nla is se conjug1'\r. A autogn 1nln restabe lec•
dessa ma neir., hontozigose para o gene de rca\.lo sexua l. pernliti11do con
que a célula do protozoário Pº"'' se conjugar com célula de tipo de reação se
xua1oposta~
Os protozoários são muito apropriados para estudos genéticos de he
rança cxtracromossôm ic-a, diferenc i aç~o celular, genética do comportamentc
etc. Uma conj11gaçtlo em pro tozoários en volve transferência de unt núclcc
para u1n citoplrisma inte ira mente novo para ele e a ltamente d ifere nc iado. C
macronúcleo parece conter muitas séries cromossômicas que se organiuirr
em grupos diplóides. Um gene mutante que é carregado de um protozoáric
para outro, raramente se manifesta imediat.imente, pois no citoplasma já
existe grande quantidade do produto do gene ante riormente presente. So·
1ncnte após várias div isões celula res é que a caracte ris tica genética se inani·
festa (Fig. 3.22).
2n

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le'tll't'tOft'rWnO~do.N:i \k>~100p<M1cwu ~ ""'wrndiol~cc:uwiwno\cK ~
$otnenl('ql.Wldoo ~todo~ A for~- o ~«On'C' somente 1pc)t. ·~~ <t!Jarn. f ~os
pto!OZ°'1'0S deKer«ntn clt <&t.1s com d.os f'\Ol'Tl"l#s v3o apr~t.v ciLot ~rlldos.

3.3.3.3 - Recombonaç.lo em alg"


A exemplo dos proto7.oários, pesqui:.Js g«"nétic.JS em a1gJs são tambén\
muito menos nt1merosas que em ~ctérias e fungos.. Os princip..Jis exemplos
de cstt1d<>S gen éticos cst.'10 den tro do g rt1po das algas verdes ou clo roífcc.1s,
.se1\do a esp&-ie C,1lnt11ydo1uorrns r1~i11l1ardi a n\ais u tilizada. Ela a pre...;.cotn u 1n
sistema de rerombi.na(.\o. a con;ug.>(M'.>,. ond<' dois tipos de rta('A<> sexual de·
signndos de mt'" e mt· s..~o conhecidos. Quando duas células de tipos sexuais
opostos se encon11·nn\, pode rcsultílr fus..'o celular ou singamia, produzindo-se
um zigoto diplóide. O núcleo diplóide do mc~n10 sofre meiose. dando quatro
células h.aplóides, du-as com um 1lpo d<.' rea(J.o sexual e duas oom o tipo opos-
to. A Fig. 3.23 .1presento os passos dn conjug.1c;ão 1\('S.S.l alg<'I. ''"°im con10 há
scgrcgnção de 1:1 para o gene do tipo de ren.;110 Sêxual, outros genes cro1nos·
sômiros de alg.ls também apres<'f\t.tm o n\cs.mo cipo de M'gregação. Em
Chla1,,ydor11ona.~ podem M!r usad~ meios definidos, ou sej-1, de composiç3o
si1t1ph.:s. rvlutantcs a u xotróíicos, morfológicos e para rc-sistênci3 " drog3s ~J.o
empregados, o que fac-ilit.i a análise .genética.
....._ \ _ Células
~ haplóldes

! :::-Oº~
(!!_
,
O;:lõ;de ZlgolO

/ ~.1eiose

EB
Figurõl. J .ll - AcQl'IJvgaçAo,... alga Chb'nyWmonCI$ reK1~<f11. Céltksdos tiposck'reaç~sexualmt+ emt· SO·
frem ~ngamii. dal'\do i;m zigote> d•plóide. Por mciost. qwvo ci!tJ!is ~ ~ formadas. ~ duM mt .+ e
dulStnt·.

J\Genéticn de a lgas verdes é rica em exen\plos de l\cr,.nça citoplasn1áti·


ca. Algurnas dessas algas têm apenas u1n c1orop1asto que conténl ONA.
Assim, existem genes nucleares e extranuçleares ou extracromossônlicos que
podcnl ser estudados separadan\cntc. Genes para rcsistê1lcia a antibióticos e
para fotossíntese estão localizados, em algas verdes, no DNA dos cloroplas-
tos. Isso tor1\a as a lgas um atrativo nlaterial de estudo de genes localizados
c1n DNA do cloroplJsto.

3.4 - Herança extracromossômica em microrganismos


Já foram citados váriJs vezes J\C'Stc capítulo que e lementos extracron\OS·
sôrll icos e porta.nlt.>, C<l.$0$ de herança extracromossônlica, são d~tectados eol
microrganismos. Em a lgas e protozoários os casos sJo nluito freqüentes, tor•
nan do·OS unl material (lpropriado para esse tipo de estudo. Mas é OO\'an\ente
enl bactérias e fungos que casos de hera n ç.a extracron\ossômica adquirem
uma importância toda especial. Alguns deles vão ser citados a seguir.
3.4.1 - Plasmfdeos bacterianos
Bactérias podem conter elemcntos extrKr<>mo~micos~ designados de
pl01smídeos. Qtcs possuem c.i~cldadt:- de se dl\'ldir independt>nlcmente do
cronlossomo bacteriano e sJ.o constituídos por ONA. Embora bem menores
que os cron,osso11tos e nào SCl\do ei,:,enciais paríl a sobrevivência dos bactérias
que os alberga1n, pelo 1nenos cn1 certos meios de cullura. os p lasmídcos carrc-
gant gc1\E"S que conferem difef('nles caracterío;ticJ:, gt'n éticas aos seus hospc-
deír0$. Essas características n3o eslJo ligadas M> cromossomo bacteriano, a
nJo ser quando o plasmideo se incorpora ao mt>Smo, o que pode ocorrer com
ollguns deles. Esse ~ o caso do pl.lsmídco F já mencionado (ver item sobre
conjugação bactcri,1na) e ml-'Smo o l>Jcteriófago À envolvido na lro\nsdução C-S·
pccifica e q ue ta 1nbé-m pode ser cons iderado un' plasmídeo. J>las1nídeos que
poden\ existir no estado autônomo ou integ:r~do ao cromoSS-OnlO So\o chama·
dos de epissomos e esses est;JdOS ~o n.'"\'etSi\'ci:t, como ocorre com o plasmí·
doo Feno f.lgo )... Alguns dos prlnc1p:ai:s pl.-.smíde<r.. bacteri,lnos além do F e>.
scr.io descritos íl seguir.
3.4.1 .1 PIMmfdcos R
Plasmíd("()S R carregam gt"nes qt•e confer<."n\ resistência a diversos tipos
de inibidores.. C'Omo antibióticos. quimioterápicos. sais de metais pesados etc.
Elf."S foram pela primeira \'(>% c:,tud>1dos no Japllo, quando constatou--se tranS·
fc rência de resist~ncia múllipla a drogas entre b.1ctérias encontr.1d.ls em pa·
cicnléS com desinte ria bacteriantt. Depois disso. muitos outros c,1sos foran\
descritos em várias partes do n1undo, co1\fcrindo n esses plí.lsn,fdcos gr.11,dc
importância do ponto de vista n1édico (1-1).
Os pJasmídeos R.. à semelhanç.i dos F, podem em sua gr.1nde maioria
ser transferidos de uma célul,1 paroi outra, pois têm genes que c01rrcgam in·
íor1nações para essa transferência. Porénl, além disso, carregarn gení>S que
cond icionanl resistência a vários antibióticos, conlo pc1l icilinns, tc traciclilla.s,
c l or.1nf~nico l , e out ros, para qui1nioterápicos co1uo as sulfas e para sais de
metais pti-sados como o mercúrio, por exemplo. O mecanismo de resistência
rondicionado por e3-Sê:$ genes é diferente do da resistência rromossômica.
Em geral os gene~ para resistência, localiZJdos em pla.smídeos, c.1rr-cgam i.n·
fo rn1ações para produção de cn1.imas que i11c1tivam o antibiótico, ou nJ.o per·
mitc1n a s ua c1\trodn nas células. Ess.1s células torn.1m-se, ent,\o, resistentes a
v~ rios agentes de uo1a só \'CZ, c11usc1ndo graves problemas na tera pio de gcr·
n1es parogênicoi.. Por outro lado, esses plasmideos tê1n s ido uS11dos co1no ve-
tores de genes na tecnologia do DNA recombin.1nte. Também pla.smídeos
que carregam resistência a metai:t pesados, fungic idas e outros agroquími·
ros, têm sido relatados como de potencial impor15ncia para dt'spoluição de
ri1l1bie11tes con1 esses con1ponentcs, umô.\ vez que conscgucn1 degradá·los.
3 1 1.2 - Plastrídtos coionogêncos
CÀ""'S<'ritos pel.-. primeira \ •ez em E. co/1, de onde pro,·ém seu nome, esm
plasmidcos c.lrrcgan\ genes para produ~Jo de colicinas. Estas são sub:,t5ncio..'t
antimícroblJnas de cul'to espt."Ctro que conscguenl ntat.1r linhagens de bactériris
da ntcsnto espécie ou de ~pécies ntuito rclncio11ndos. Após sua descoberta c1n
E. coli, elas íora111 tanlbém cons tatadas c nl n\uit.'.IS o utras bactcrias, donde es·
ses plasn1ídeos receberem uma d esign a~1'o 1nais ge ra l~ de bacteriocinogC!nicos
e os agcnlcs í)ntibactcrianos. de bacteriocinos. Como no caso dos plasmidcos
R. os plasmfdcos produtores de bactcriocinas s:.o usados como vetores c1n
EngenharJa Cc:n~tica.
) 1 .1 ) - Plastrídtos de ~CQIS
Esse gênero bacteriano é rico em pla.:tmídeos. alguns de grande impor·
t,\ncia médíc.l, como os plasmidios produtores de penicilinase~ enzima que
inativa a penicilina, tornando a bactéria q\le o possui resistente a esse antibió-
tico. S.1h\.."\..osc que c::.séS plasm.ídios poden\ c.1r rcgar t<1mbém outros ge1les que
confc rcn1 r'•sistência a arsenato, a ~ni t o. 1ncrctírio. cobre, zinco, neon1 icin.-.,
eritronlicina, ,ctc. Várias cópias d esses plas1n ,clios podem existir em u111a ll\CS·
1na cólula. Co1nc) os plllsnlidios Jt eles ta 1nb~ n1 causam problemas, pois b actó·
rias re!'l<\tcntc.-s ~.lo freqüe1\temente cne<)ntrr1das e sobreviven1 ao tra t.-.nlento
conl os 1nais diversos anti1nicrobianos.

3 4.14 Outros bjlOS de "'5m<leôs


~luitos outros tipos de p1asmídeos jA (orao\ descritos,. como os que con·
ferem com~tCncia à transformação em algumas bactérias,. os que dão c01rxte-
ristic.ls de produç.lo de ácido sulfidrko e os relacionados à patogenicidade.
Podt'm ser encontradols re,•isões sobre outro~ tipos de plasmideos, além do:.
plasn1idoos ;~ mencion,1dos (21,. -1-4). S.lo de~rit~ inch.JSi\•e pl.asmideos crípti·
cos, dctcctaclos, por cxe1nplo, por proc,•ssos Cll!troloréticos, mas que nAo pr°"
duzcn1 nparentcmcnte qualquer difercil\a fcnotípicn nas células que os c<>n·
tênl. N:lo só cm bactérias n1as cm clutros seres vivos eles foram dett"Ctridos. O
pl11sn1ídco 2µ d e Jc,•OOuras é um exen1plo. Tan1bén1 o DNA n1itocondrinl bcn1
conto o cloroplastíd ico, podem ser considcrJ dos p lasn1ideos.

' ' importS1\cia dos plasmideos é inquestioná\tel para a sobre,ri,•C:-ncia e


evoluç-~o de unw espécie, principalmente aquelas que se baseiam cm um gran·
de número de indi\1iduos para resistir ~ modificól(Õl'S do meio ambiente. ~ o
(a.SO, por (""tmplo, das bactérias onde .l alt.l \".lriabilidade existente permik'
que ela~ ~re,•i \•.Jm aos mais di,·el'$0S ag.entc.'8 inibidores. Sendo extracromos-
!iÕmic-.., C>).1 v.. ri.lbilidade não substitt1i, apenas adiciona no,•as propriedtldes
à.:; célul.l"i, pC'rn1itindo sua adaptaç.\o a an1bicntcs adversos. f\-lelhor ainda,~
dc1~dl) .ser pPrdidos facilmente e tam~m rtoeuperados por rttombi1lação. esses
e lc n,ent<lS cx tr.,crorno~SÔ J't, i cos f,)rllCCClll uma cnpacidade de rápidas nuxt i fic~1·
(Ô(';!; 1\íl'l pí>l)lllnçõcs das esp<!cie que os possut·rn.
,_ 107

--
.....IYC'lt4'>C:. Oio6"0~""""'"•""

@) 8 8 @)
-- Conldio Protoperitécio

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1 1

0 8 8 8
8 8 8 8'
8 8 0 8
8 8
8 ascósporos normais
8 8
8 ascósporos. "Poky'"
fiiora l .24 Mera1"9 e~. Muurctt •poty" 6e Ntvrosporo (lt&O. Os desctndontes s.k> ~
'f.Ml~qvrbne<cuo~~).r'ldt~cmcn:cdotçiodereaçlõseac:uilouOeie·

"""""'-

3-4.2 - lieraô(a extracromossõmK'a em fungos


O reino dos fungos também é rico cm exemplos de her.tn(a extracromos--
sômica ou extranuclear, no caso, pois t~ slo microrganismos C\IC.lrióticos,
dotados de núcl(.'O típico. Um exemplo em íungos (iJamentosos e outro em le·
vedur;lS võo ser descritos a segu ir. Mais exemplos. pode1n ser encontr.1dO:!t Cnl
várias revisões. livros e t·r(lbalhos " respeito do heran(a extranuclear cm íun·
gos (1 , 10, 45, 46, 47).
3.4.2.1 - Colônias •pollf em Nevrosporo crosso
1'.1utantes "poky" possuen\ UJll cresciniento reduzido quando co1t1parado
com linhagen1 sclvage1n ou 11orn\al. Ess(' tipo de 1nutante ~ herdado sempre
que a linhagem mutante é usada como "l'nâe", isto~. fornecedora de citoplasma
e núcleo, ao contrário da linhagem "pai", que só forn ece o núcleo par.:i os des-
cc-ndentcs. U1t1a lii\hagen1 que en\ tlltl cruzan\ento fornece só o conídoo é um<'I
linhagem que funciona co1no "pai", enquanto q ue a outra que entra com hifas
para produção dos descendentes éa linhagem "mãe". A Fig. 3:24 apresenta cru-
;:a1nentos entre 1\J. cra&õa selvage1n e "poky", evidenciando herança citoplJsn1á-
t-ica. Nesse caso a organela ('Xtracro1nossôn1ica que entra com o material
genético para dar o caráter normal ou mutante é mitocôndrio. A linhagen1 usa 4

da como "mãe" é a que fornece a grande quantidade de citoplasnia, i11cluiildo


os 1ni tocônd rios, que vào ser ii1corporados aos dcscende11tes. É ela portanto
que direciona as <:aracterísticas dos méSmos, em um caso de herança extr.;icro-
mossômica n1itocondrial.
3.4.2.2 - Colónias "Peuteº de leveduras
E1n culturas,da levedura Sacc/Jnro,,1ycts c.ert-visiae a semeadura de células
em 1neio sólido produz uma certa freqiiência de colônias de ta manho peque 4

1lO, chJn1adas de "pctitc ",As células de colónias "pctite" têm i1lcapacidade


de utilizar oxigC11io, por lalt.1 ou alteração de enzimas respiratórias, possuin·
do tinl nletabolisnlo ai\aeróbico. AJg,1mas colô11ias "petite" dão scgregaç~o
mendeliana nornial, isto é, cru:.:amentos de células norn\ais co1t1 "pctite" prQ-o
d11zen1 por meiose qua tro esporos sexuais, sendo dois de fe11ótipo 11orn\al e
dois "petites" ("petites" segregacionais). Entretanto, n(l maioria dos casos a
scgregaçlo de um cruza1nento normal x ''petite" produz os quatro descenden-
tes normais ("petites'' neutros) ou quantidades variáveis não mendelianas,
cllcgalldo a quatro "petil'e s'' e ne1lltu1n 1\0rmal ("petites" supressivos). Os m\1·
tantes segrcgacio11ais tê1\l a ntutaçào localizada 110 cromossomo e porta11to
não constituenl casos dc herJ1\Ça cxtracro1t1ossôn1ica. Os neutros têm fa lta to·
tal de DNA mitoco11drial e assin\ cruzados con\ células l\Ormais têm s uas mi-
tocôndrias norniais restabe lecidas. Os supressi\'OS perderam e1n diferentes
grçius parte de se\1 DNA U\itocondrial.

3.4.3 - Cr~érios para se esiabelecer casos de herança


extracromossômica
O geneticista, 1nicrobiologista e todos os que tral>all1an1 com nticrorga·
nisnios dcve111 estar sempre atentos para d istinguir entre características ge1téti·
case aquelas que são condicionadas apenas por variações do ambiente. Tambén\
deven'l estar ate11tos pt.\ra S.."lb~r se as características genétjcas s!o regidas por gc·
nes croniossômicos ou extracro111ossô1nicos, is to porque as primeiras são muito
nlais estáveis que as extracronlosSÔn\icas. En\bora alta instabilidade en1 lil1J\a-
gens microbianas possa ôCOrttr devido a f.atorb nue:l~ares. ('Omo aberr.lç~
cromossômicas. transposições e outra~ caus.1 .. (48, 49. 50), as modificaçhe~ s~
néticas extr.1cromossômicas. de modo ger.11, produzem maior instabilid<'tdc, o
que se constituj u1n problema em linholgt.•n.s industriais. Assim, os critérios
p<1r'1 d istinçi\o t?ntre herança extr<lcromo~sõmica e c-ro1nossômica to r11am·se
dé rcJI valor. Os principais crit~rios pnriJ d isting uir os dois tipos de hcrançn
são: a) Cruza111entos recíprocos - st un1iJ linhagc11\ mutilntc é Ut\ildil corno
1n.,tcrua e iJ nor1ual con10 patemi'I e vicc~versa e, sempre o c..'\ráter da linhngc1u
materna é o úniro a ser transmitido pilril a dl!sccndência há fo rtes indícios de
herança é).tr.1cromossômica. b) Scgregil~ 1\30 mcJtdelianas - se em crua·
ment~ entre eucariotos \tia meiose. as scgregações mt'lldelianas do tipo 50"4
rom gene norm.ll, SO-.. rom gene mutante n.\o forem obtidas. pode-se suspei·
t.tr de hcr•n(.i extracromossõmica. e) Teste de he1erocárto - ê muilo us.ldo
em fungos fit..mcntosos. Kesse leste duas linhagens.. uma sel,·agem e oulr.1
mut.lnte ,,.,o combinadas em um hetcroc.irio t.t os conídios desse hett"r()('.irio
são an'11isados. r\ gr~1nde maioria deles deve ser no\'amente dos tipos que for·
marJn1 o hctctOC'ário. Caso contr.irio dC\'C ter h.lvido alguma i1tfluéncia cito·
plasmática suo crindo heranç,, nJo nuclear da c.1racterística 1nutante. d)
C~ l ul;i s que se multiplicam por fissl\o binária ou mitoses e ainda i1ssin1 segrc·
ga.111. produzindo colônias conl setores. Embora isso possa ser dcvidc,)" n1uta·
c;õcs írcqüentes, em 1n\litos Ci'ISOS hcrnnç.'l cxtracro n1ossômica pode estar
envolvida. e) Indução cspC'C'ífica - se u1n con1posto químico produz alta írc·
qü4!-ncia de um tipo de mutante, cm geral hcr.,nç.i extraC'ro mos.sômica ~ J rcs·
pons.i\'CI por isto. Exemplo típico é o caso de indução de murante$ "'pctite"
em le\·t'duras (Otn ae:ridin"'5. Esse coranle pode chegar a produzir 100°'0. de co--
lõnias mut.ant~ (óm fenótipo "'petite... .lpós o tratamento de células normais
de le\•cdur..is. O ~l odificaçóH \'i.S(,•eis em org.lnclas do citoplasma i\ô mkros-
<'ópio eletrônico. Nesse caso não só pode ~r car.icteriuda a modificaçlo ex·
tr.lcromossl>mica, como inclusive ela pode ser relacionada com orga11clas
citopl.1Snlátic.1!!o como mitocônd rios e cloropl.1stos.

3.5 - Considerações finais


A gcnélica 1n icrobi<'t na, e n1bo r,'\ d e introdução relativan1entc recenlc
q uando comparada com a genétic.1 de plnntai'- e anhnais s uperiores. possível·
mcn1e j~ fornecéu mais dados para umA maior ron1prce-nsão da ciência de he·
redilariedade e biologia moll"C'ul•r do que a contribui(àO fornecida por todo11o
o~ outros seres ,;vos que n.\o os microrgan111omos. Isso. como citado, foi de\'i·
do a propricd~es que os tomam muito fa,·o r.\veis para sett-m usados cm(")·
tudo.. genéticos. Somam-se a ~s característKa.s a facilidade de ob1enç3o dos
mais dí\·ersos tipos de mutantes e • dC'SCobert.l dos diferentes sistema.> de re--
combinólçJo como os descritos neste Colp{tulo em fungos. bactériils. algas. pr<>-
tozooirios e vírus. Além d o mais. a CcnéticJ microbiana adquiriu t.1mbém m:.,ior
importAncia ,1p6s a introdução das técnicas de Engenharia Genético\ que, cm
110 .......... ~------

g<ande p.>rte, utilium microrganismos como hospedeiros de genes ou DNAs de


microrganismos como \•ctores para transím"ncia de genes de uma espécie p:ira
outra. Finalmente, a. introdução cada vez 1nais freqüente de espécies microbirt·
nas cm processos biotccno16gicos t(>nlan\ o C'Stt1do da Cc1\ética de Microrg.1nis·
mos funda1nerttal para qtle po.ssa1n ser rc.-lizndos programas de melJlor.:intê1llO
genético ctldn vez n1ais eficazes nessas esp6cics.

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ELEMENTOS
DE ENGENHARIA
,
GENETICA
Ana Clara G. Schenber11

4. 1 - Introdução
O surgi me1l to da Engenharia Gc1lética, na década de 70, íoi unln de-
corrência natura l da grande quantidnde de conhecimentos que vinham se
ac-umtllando na área de Biologia Mole<ular, en\•Ol\•endo principalmente as
bactéri~s e seus ' 'irus. Entretanto, em contraste com os dem01is progressos
\1erificados nesta ãrea. o ad,·ento da Engenharia Genética te,1e um impacto
formid~'·el sobre a Biotec-nolog1a. liofe. o homem pode inter\fir diretamen-
te sobre os comandos da \1ida: é possível programar geneticamente o~ orga-
nismos ,,i,•os, não apenas para a superproduç-ão de algum nletabolito, mas,
ainda, de substâncias que só são normalnlente produzidas por outros org:inis-
mo:,. Pclrt facilidade de n\anipuJ.-.ç,l\o que p roporcionam, os microrg1.1nismos
íora1n os primeiros a serem cnlprcgados co11\0 hospedeiros do info rn1aç1'0
gcn~lica hct·c rólog~'· Eir1 princípio, qunlqt1e r proteína pode nssio1 vir a S('r
p roduzida cm fe r1nentaçõcs induslrl<'lis, d('sdc que o gene que" codifica seja
enxer1,1do num microrganisl'no (Ott, cnl oulrt'ls pala\·ras. clonado) e p.'.lsse a
ser por ele expresso.ido. De crucial import.\ncia é a possibilidade que a no\•a
tecnologia trouxe de ampli(icar sequências indi,•iduais de DNA: a clont'lgcm
de um dado fragmento de DNA permite que. partindo-se de apenas uma mo-
lécula. boCjam produzidas quantidades ilimitadas desta mesma molécula. ()e..
pois que um fragmento de DNA 11,·er sido assim isolado e amplificado. as
suas propriedades podem ser caracteri1adas e a sua seqüê1\cia de nuclootfde..
os detcrnlin:lda com preic;i sâo, o que proporcio1\ou um progresso \'Crtiginoso
do C'01\l\Ccimcnto básico. Por outro lado, a relevância bioteicnológi<'a dc<'orre
do falo de que a síntese de pro tcrnas cslrnngciras pelos microrgnnisnlos leva a
unltt in1porta ntc red1..1ção dos custos de p l'oduçl'º· J'arn cita r a penas u111 cxc1n·
p io, para prodt1zir, pe las vi(IS tradicionais, 5 n\g de son\atosta tina, um hormô-
nio de vertebrados, são necessários 500.()(Xl cérebros de carneiro. Qu<'lndo se
conseguiu, por meio da Engenharia Genética, enxertar o gene da somatostati-
na na bactéria E.scl1erichia coli, o O\CS O\O rendimento fo i <llcançado com apenas
7,5 kg de bactérias, o que se obtém de maneira rápida e pouco dispendiosa.
Chama-se de E1\ge1\haria Genética <'10 conju1\to de técnicas que tornam
possfvel a criação de novas combir1ações génicas, inexistentes na natu r~a. A
reco1nbil\<lÇâo genética consiste na form aç~o de novas con\bi nações estáveis
de genes, p rovenientes de d iferentes organismos, pode1\do, cm conseqüC1\cia,
surgir novos fenótipos. Entretanto, na nature-.ta, a recombinação genética so·
mente ocorre entre organismos de uma mes1na esp&:ie ou de espécies nltiito
proxim(lmente relacionadas. J\ E.n genharia Genética, também conhecida sob o
1lome de Tec1lologia do DNA Re<:ombiila1\te, pernlite que contrariemos a na·
tureza no q ue se refere à recombinaç.ão genétic<'l. Tornou-se possível construir
novas espécies de material genCtico, a1ra\ és d(! recombinação re.-.lizada a rtifi·
1

cialn\ente no laboratório entre moléculas de ONA isoladas de organismos não


relacionados. Hoje e1n dia, as possibilidades de manipulação do material ge-
rlético en\ ttibo de ensaio (iu vitro) são praticament·e ilimitadas: costt1ma-se d i·
zerque a única 1inlitação reside na c.-.pac-idade i1nagit\ativa do pesquisador.
En\ 197'2, numa experiência q ue viri<"t a revolucionar toda a pesquisa bio-
lógica e criar pe rsp<"Ctivas inéditas para a Biotecnologia, PAUL BERG e seus co-
laboradores"1 demonstrara1n que era possível cortar ;,, vitro moléculas de
DN1-\ de d iferentes origens e ligar os fragn,cntos rcsult<lntes entre e les, obt'e n-
do assim moléculas J\íbridas de DNA, inexistentes na natureza. Essa expe riên·
eia pioneira foi realizada por intermédio de d i,,ersas nla1lipulações genéticas
e bioquínlicas, que se tornaram viáveis graças a uma série de de.s<:obertas, que
ocorreram e m rápida sucesstio nos 5 anos que antecederam a expe riência de
Paul Bcrg. Entretanto, não faria sentido guardar o 1\ovo ONA no tubo de ensa-
io. Na verdade, a Engenha ria Genética pressupõe uma segunda etapa, in tiivo,
que consis te na introdução do material genético co1lstruido artificialnlente
(DNA recon1bi,,anle) 1\tuna célul(l viva, onde e le possa se manifes ta r. Essa eta-
pa de transformaçâo genética é mais delicada, não sendo poucos os problemas
qtte o ONA Lnontado iu vitro terá que {'nírentar ''º interiot da célula viva. Para
que tenha realmente um sig.nificado biológico, é necessário que o DN.l\ re·
co111binante seja não apenas 1nantido ao longo das divisões celulares d(I cé-
lttla originalmente transformada, mas, ai1\da, transcrito e t radu zido n.-.
p ro te í1la que codifica e, em muitos casos, o p roduto do gene estra ngeiro
de ,•erá ainda sofre r passos ad icio1lais de processamento pós-traducion;;il
n.-. célula hospedeira.
Como esquematizado na Fig. 4.1, são esse11cialmcnte ne<:êSSários quatro
passos p<lta unla experiência desse tipo:
1) Urn 1nétodo para clivar e voltar a ligat in vitro diferentes moléculas de
DNA, originando a molécula de ONA recombiila1\ te;
"""~ l IS

2) Um elcmc1,to transportador de genes, o vetor genético, que, ao ser


multiplicado pela célula hospedeira, possibilitarã que o gene estrar1gciro que
transporta ta1nb~m o seja;

J) Un\ meio de introduzir o vetor nu1na célula viva, capaz de multipJi ..


cá-lo;

4) U1na maneira de selecionar, dentre uma grar,dc populaç~o de células,


apenas aquelas que tiverem c(etivamcntc i1,corporado o ONA rccornbi1,a1\te.

l Silio « diva;çm

ri'til'flrt::====~IUll~I r11~'Rft:====~l~lllll
0.\A l'"fAA

Flg\Jl'a 4.1 - Esqucrna gcralde\ll'n~r«ideE:ngc~ Ccnh;IC.'I. NuM ll.lbode MSaio. oórcVodc DNAcle
dupbfttaquec~11Uoovetoréc"-'adoporuawne!'l(ocom1.1"N~asedcrest~para3q.Ja1a~uM
(nco sí'OOSU$Ct!M!I. ~ ul't'I,\ tr'IOlécula de DNA ll'le.v. Num 2.•tJx>de ensaio. o [)N;'..qvc se óesejl c.lon:aré
fr.tgmcnt&do por meio ele tr.ll;imento com~ mcsml enzim.i de rcstni;âo. para a(f.ial corubn vtinos sltios wscetfJCrs,
Em seguida. asOJ.as preparac;ões de ONAsJo ~ DJm ~o wbo. ao qva! se WC$(cnt.a a ei'lllMl DNA ligas.e, o
qtie' result.lf.S na foi'~ de MO!écú.ls (Ir~ re<ornbt\al'.tes.. coropostM do ONA do \'Ctor e óe vn fr;tgmemo
do ONA.~. Es~pt'l:'paraç.\oé então empregada para~ uma linMgerr'l~!'W\asensNelaoanti­
b«M:o tcttaci<fil'\o\. p;ira o~ o vetor corkrc «:Sist~ncia. Ao st-rem scmead.Js em pr~ de tet:r'aôdru. sometite
~!"do .)S c&ilas que concr.-erem o vetor. Aô se nUtipk.V. ess.is cait\s 1r.k>Ol"@IW uma popcJaç$o de cê~·
IM·fihn ~s (dane). toda$ port<idonis do ONAft'<ombnatite.
4.2 - Enzimas de restrição: as tesouras moleculares
que cortam a molécula de DNA em pontos especfficos
A collstrução do DNA recombinante req11er que seja possível cortar as
1noléc-ulas de DN'"\ de 1nodo pre<"iso e reprodutível. J-\ ll!m de ~r necessário
corta r o vetor num iínico ponto específico, onde será inserido o DNA estran-
geiro, é imprescindível que todos as inoléc-ul<'IS do vetor sejam cortadas exata-
mente na mesma posição. Con_seqüentemente, não se pode realizar esse tipo
de co1\strt1çào através d<l clivagem aleatória do ONi\ do vetor. Na verdade, a
Engenharia Gen ~ ti ca só se tor11ou possível após a descoberta de uma classe es-
pecial de enzimas, as endonucleases de restrição, que rendeu o Prên1io Nobel
a 1'V. Arbcr, H. Sn1ith e D. Nathans em 1978.
A observação inicial do fen ô1neno de restrição tinlta sido (cita cerca de
30 anos antes por LURIA e HU~·t ANc:i, que havia1n descrito a capacidade que
algt1mas cepas da bactéria E. toli apresentam de se p roteger da in fecção por
bacteriófagos, ou, nas palavras desses autores, de restringir o crescimento do
bacteriófag<>. Hoje se sabe que tal 1nccanismo de defesa consiste na produç.ão
pela bactéria de uma enzima capaz de degradar o ONA vira i in\rasor. O
DNA próprio da bactéria fic'1 protegido do at'1qtLe pela enzin1a de restrição
porque, ao mcsnto ten1po enl que p l'oduz a e1lzinla de restl'ição. a bactéria
também p rod uz uma enzin1a de mod ificação, pela ação da q t1al são acrescen-
tados grupos ntetila a algumas das bases que contpõent a seqüé1lcia de DNA
que é- reco11l1ecida pela enzima de restrição em questão. Uma vez metilada,
essa seqüência deixa de ser reconhecida pela enzima de restrição. Assim,
para unla deterntinada enzima de restrição, existe"'"'ª enzima de n1odifica·
ção corre-spondcntc e fa la -se ent sistentas de restrição·modific<'lção.
As endo1tucleascs de restrição são sintetizadas por 1nuitas, sertão to ·
das, as espécies de bact~rias, sendo comu1n uma mesma espécie bacteriana
produzir nlais de uma enzin1a de restrição, mas tais enzimas nunca (oram
encontradas {'n\ organisntos cucarióticos. Essa clas...,.c de enzim<'IS compreen-
de três tipos, que d iíc re1n quanto à ge1t6tica e enzimologia . As enzim'1s de
restrição de Tipo 1 e Tipo Ili têm um modo de ação n1ais complexo e não são
de utilidade ent Engenharia G{'nêtica. Ent contrapartida, sem as enzin1as de
restriç.'io de Tipo li? não teria sido possível a Engenharia Genética. Assint,
daqui por d iante, quando falarmos em enzim'1s de restrição, estaremos nos
referindo àquelas de Tipo li.
As enzimas de restrição são endodesoxiribortucleases, ou cndonuclea-
ses, que reconhe-ccnt seq i.iéncias especííicas de nucleotídeos na molécula de
DNA e cortam as duas cadeias de ONA nt1m ponto dentro desta seqü~nc ia .
Uma determinada e1tzima de restri(ão irá catalisar a qu{'bra da dupla fita
apt'.'nas qua1tdo cnco1l tra r aquela seqiiência particular que reconhece. É essa
espéeificidade que faz das enzimas de res trição instr\1mentos tão importantes
em Enge1l1laria Genética. Assim, por exemplo, a enzim(I de restrição chamada
Pvul (produz.ida pel;:i bJctéria f.roteus mlgaris) cort(I o ONA so1r1cntc quando
encontra uma seqüéncia de 6 nucleotídeos CGATCC. l,or sua vez, a enzinla de
restrição J>vu ll, produzida pela mesma bactéria, só corta o DNA qt1ando en-
tontrar tima seqüência hexanuclcotídica CAGCTG. A maioria das enzimas de
rtstriçâo reconheçe seqüências hl'X<inucleotídicas, mas há tanlbém a lgu1nas,
que reconhecen1 seqiiências de 4 a 12 nucleotídeos.
Adn1itindo que os 4 diferentes nucleotídeos ocorran1 com a mesn1a fre-
qüência ao longo da n1olkula de DNA, c..1lcula-se que um(I d(ld(I seqi.lência de
1
4 pares de bases (bp) ocorra en1 n1&:1ia a cada 256 bp (0,25 = 1/256), enquJnto
uma de 6 bp ocorr;:i a cada 4.096 bp da 1nolécula. Entretanto, con10 a d istribui -
ção de sítios de rcconhecirnento não é regular, tuna detern1il'1ada região do
ONA pode ser cortada 1nais, ou n1enos, freqüenten1e1l te do que a m~dia esta·
tística. Os diferentes fragmen tos origi1\Jdos pela digestão com uma enzima de
restrição podem facilmente ser separados uns dos outros, com base no seu ta·
n1anl10, a 1-ravés de eletroforese cm gel de agarosc ou de poliacrilan1ida. A par·
tir di:-sses dados, é pos:siv('I con.struir o que se chan1a de 111apa de restriçifo, o
que envolve a detcrmi1\<.'IÇàO da posição e da orientação de cada íragrnento na
moléc\l}a de DN A original.
As seqíiências de reconhéeimento no DNA apresentanl unta sio1etria ro-
tacional. Enl geral, a sc-qüência de reconhecimento constitui un1 palíndr<>mo,
isto é, as 2 fitas têm._.. mes ma seqíiéncia, se tLnta ~ lida da C's querda para a dire-
ita e a outra, da direita para a esqucrdJ (ou, e1n termos de DNA, se ambas são
lidas na direção 5' para 3' Oll ambas são lidas 1\a direção 3· para 5'). As seqüén·
ci<.'ls de reconhecinlento de Jlguma.s enzimas de restrição estão apresentadas
na Tabela 4.1.
A p ri mei ra enzima de restriç;\o foi ÍS<>lada e n1 19701' ' e hoje já seco-
nhecem mais de 2.500, isoladas a partir de uma vasta gama de espécies bac-
terianas.. con1prec11dcndo 230 diferentes seqüências de reconhecin1e11to. En1
muitos c;;1sos, duas ou mais e nzimas de restrição, provenientes d(' diferen·
tes bactérias, reconhecem a mesn1a seq lí~nc i <l de DNA: ess<is t:-nzimas são
chantadas de isoesquizômeros. Hoje, encontra1n·se d ispt)nÍvl!iS comt:-rcial-
111c11te aproximadan1e11te 170 difere ntes C1\Zi1nas de restrição.
O rest11tado do corte pode ser di(cre11te, segundo a enzin1a de res trição.
Há C1lZimas que cortan1 exata 111e11te no rneio da seqüência de reconhecinlento,
comt) é o caso da Pvull e da Ah1I (ver Tab. 4. 1), originando o q\1e se chama de
extremidade cega ou abrupta nos fra gmentos de DNA resultantes da s ua
ação. Por outro lado, u1n ntímero considerável de enzinlas de rcstriç~o corta a
dupla fita de maneira a gerar t•xtre111idadts cMsiws 11os fragmentos res ultantes.
••• e-.~..--

Tatt.&&4..1 - Ú'l;Dml$de~ EsdoCl"CW.:wlte~~de~t.a~dt


°""~rt<ortlf<('ITl.A. T.GtC~OJ~dt~~~·~~
~ N. lech.as n:liQrn opcw'llO eme)A 1 CJ'lllf'N<M <.ldlt.IN CbS ir.as dtt10'0 dia~ 4t ~
~ Nourqvt ornubdo INI f ~ \JN ~de '""dl.fll4.
ORGANISMO NQ.\tE DA SEQ0tNCIA DE CARACTERISTICAS
PKOOUTOR ENZl~IA RECON ..l l!Cl~IÉNTO REl.EVANTES

Seq\1êftcla 1>,1,lindrôrniC;•
5' ...GIA A TTC...3· de 6 nuclootfdt.'0-. O cor-
rcrhrr1'r}1ío roJí l"rcRI
te- se~ C:litr('n\id•d1.--,. r,g..e..
3'. ..CT A AIG...S-
Si\'41S,
'--
5 lCC
' TGC...3'
A
SeQu.mri• No P"'hnd'6-
EcoRfl mk~. O <ort< gtr41 ,,.,._.

A . mid.Adirs '°"'1,...,
3 CGTCCl ...s

5' .C A CIC T G... l' O <'Ott\" gera óJ\lrc:mida·


l'tillt ilJ vi;lg11ri.s Pt111ll
3'. ..Ç 1' CIG A C .. S dcs ,lbrup1.tc ou «ga.!'.

5'. .... A GIC T.....3' Sé!qu~n.cln d" ·I nucl\•ulf·


~,ou.,Nrttt lutr11s A/til dcos. Extl'<'n,ld"dt.•.t ce·
, ......T etc A .....s· gas.

5' C~P)• CCPuG..J' QualqutT puriiu (Pu) ou


A••fww tvri.bilis And pinm1d1N1 (Py) podt- no
3' Cl'uGCP)'· c . .S- t.l.r prHntt'f'

s cc.ccc ccc.l' ~... ~ 3 nuckotf·


1\f""rJ• -'1tAJJS<.11riitnt111 ~·1111 d~. JXIU'O frtqitn~ no
3 cccccctccs DNA de m.tmffft'~

5 .. C T C C AIC ...3' Ext«midod« '""'''"


Prot•1J1•11(111 ~tuarlli P$ll com t'X l(:n~o de flt11 ~lm·
3". ..ctA e e ,. e ... .s· ptt.'$ "'"' ) ".
1
Onde- N pc>dc >er \iual·
-
IJ4(itf1tj ~ttilrolhi'r~•tophi· 5'. G!C T NA CC..3' quer purin.- O\l J>lrln\ldl·
Bs1Fll na. Um.1 d11.,. r.:tirll" <-n11l·
t11i (T 3'.CCAN TGIC..5' m41s qut' produ.t <'\trn·
sõn dt' m•t.i d~ '4 b.tsn.

Isso ocorre porque tais en.zima.s n.\o cort.am a$ duas fitas da molécula de ONA
topo .1 topo, mas cortam de um modo '"desencontrado'" denlro d01 scqü~ncia
de rl.'(onhcc-imento. o que produi e xtre1nidades de corte dotadas de c urta.$~·
qllêncins de fit,1 s imples, conlplenlental'CS entre s i, como está n\os trado p.iról o
e.aso dr. en7,ilna F.co RI tu\ Fig.4.2.
1~
ONA. l1t1•1hl.1do d•
Sl&ttl'flloffo (lOl'l'I
e..rtr~ COHft'alo

CTTAA G

~dtDNo\~~di!~úoRI Urll~de~Cl"Narde~fllacor.­
f;,..wa4.l -
Wldl>~"""'~dt~•o*"Plf*.1~de~ bN. .Ç165~c;o'ne5U
~ 'Se'á ~ n.ma moita.Q ...._ «W"l ~ <OC$1"41$ dei; aipo&.oN

Assim, por 1nenor que seja a semelhança c1l trc ns scqüé-n.cias de 1"1uCl('O·
tfdeos de duas moléculas de DNA, a en1hna de res tri('IO saberá encontr.i·la e
corlar.i amb.1s a~ molécula$ neste ponto. Fragmentos originados a partir de
molttulas de ONA diferentes, porém digeridas pela mesma enzima deres·
trição, quando dotados de extremidades coesivas, ir.,o se nssociar com gran 4

de fac ilidade ntra,1és dn complement(11·ldndc de seqilêl\cia, como n1ostrado


na Fig. 4.1.
Todas a~ enzimas de restrição cJi,1am a ligaç~o fosfodiéstcr, deix;indo
grupos 5' fosf0110 (5' P) e 3' hidroxila (J' OH) nos fragmentos rcsultJntes,
que co1\s titucnl cxata1ncntc o s ubs tra to dn enzinta DNA ligase. Assim, os
íragmentos gerados por nçAo de unla cnziml'I d e restrição poder:\o ser faci l-
mente reunidos alra\'éS de ligação covalenle. por adiçJo da ONJ\ ligase,
que catalisa a íormação de novas ligações fosfodiéstcr. Também é possí\reJ
realizar a 1igaç3o entre fr.agmentos de DNA dotados de extremídadcs
abruptas (conto. por exemplo uquelas geradas pela digestão com a enzima
de restrição l'v11ll), enlprcgando-se a ONA ligase produzida por E. coli in-
fectada pelo bacteriófago T4. O modo de ação da ON1\ ligase de 1;. coll e o
da DNA ligasc de T4 são n1uito semelha11tes, diferindo e11tretanto q\1anto
ao co·fator requerido: Enquanto a ONA ligase de E. coli requer NAD".. a de
T4 requer ATP.
Apesar da facili taç.ã o que !iC obtem para a et.'.lpa de ligação, quando se
utiliza a 1ncsn\a cnzinl<' de restrição pJra antbas as t"Spéc-ie-s de ONA a serem
recombinadas, surgcn\ tamb~m a lguns inco1\ve1\ icntes. Coolo, por cxen,plo,
unla extrenlidade EcoRI vai ser cápaz de se emparelhar com qualquer <>utra
cxtrcmidade EcoRI, no ntomento e nl que a enzima ON.l\ ligase fo r adicionada
ao sisteo\a, algumas moléculas do vetor irão se rec-irc\Llarizar através da rea 4

ção entre as suas 2 extre1nidadcs, sc1n que tC1\llJ ocorrido 11c1lhu1na i1lscrç3.o
de DNA estrangeiro. Por outro lado, também irão se formar nloléculas híbri 4

das, co1\ ICl"ldo i1tserçõe-s de vários fra gn1entos do ONA estrangeiro religados
entre elcs atravt:s das suas exlrentidades Ecol~I. Como nlostrado na Fig. 4.3, a
recircularização do plas1nídoo pode ser evita.da, se, <'lntcs da ct.-.pa da DN1\ li·
gase, o plas1nídeo lineariz(ldo for submetido à a('ào da enzima fosfatase alcali-
11a, que ten\ovc os fosf., tos das extrenlidades 5· da nloléc-\1la, impedindo em
conseqüência a ação da DNA lig<is(', cujo substrato é constituído de ('xtrcnli·
dades 5'P e 3'0H. Assim, quando as 2 espéciis de Di\IA a serem recombinadas
íoren1 postas ent presen('a uma da outra e da ONA ligase, as extremid(ldes 5'P
dos fragmentos do DNA estrangeiro serão ligadas às extre111idJdcs 3'0H do
plasmídeo, nltnla das fi t.'.ls. Na outra fita, sobrará urna interrupção, p<>rque
tanlpouco poderá ocorrer a ligação entre as extrenlidades 3'0H do DNA es·
trangciro co1ll o plasmfdeo, nlas a célula l>acteric1na é cJpaz de reparar tais
interrupções de fita simples, de modo que, un\<i vez dc11tro da célula, o plas-
mídeo recuperará a sua integridade conformacional. Outr<'IS a lternativas
existentes para coiltorn;;1r o problenl(l da recirc\ilariz(lçào do vetor serão ex 4

plic..1d.-.s nl<'lis adia1\te.

4.3 - Vetores genéticos: as moléculas de DNA que veiculam


a propagação dos fragmentos de DNA de Interesse
Um vetor genético nada mais é que iuna molécula de DNA, que pode
aceitar introd\u;ões de ONA estrangeiro e n1 regiões não essenciais para a sua
nlultiplicação de1ltro da célula hospedeira . TJis molé<'ulas de DNA serão,
p-0rta11to, <'IS transportadoras do DNA hetcr6log0 p<'lra o i11tcrior da célula
hospedeira, possibilitando a sua nlultiplicação, sob a forma de uma nlolécu·
l;;1 hibrida. ~desejável que o DNA do vetor poss.a ser extraído em separado
do DN1\ cro111ossô111ico do hospedeiro, P<tra faci litar que se rC<'t.1pcrc o DNA
e~ t ran$;eiro inS4?rido nesté \•etor. Entre as b;tct~ r ias, São freqüenten,ente en·
c-ontrados elementos genéticos extracrom<>ssômicos, tais como plasnl~deos e
vitus (l>acletiófagos), que preenc-hen1 esses requisitos. Pode1nos dizer que a
Erlgcnha ria Cen~tica S<) se tornou realidade porque plasnlídeos e vírus bac 4

tf)rianos se mostraram capazes <le reproduç.ã o após a adição de seqüências


de IJNA estrangeiras ao seu genonla.
o
Fo5ta1.&so alcellna

-
Llgase
Nêooootre

HO P
p OH

Interrupção de l\1a simples

.._..... _
F"fSUra.'4.l ~dove.o.or_ hfa~~w-~ sem~nsttçio~ON.\~
oONA do l)lnmldeo lirlc.1nucb~ ~~a ~d.l MM'l.l fosf.nase ~ ~ <1t wpoAO
em prnenc;.1 do fr~to de ONA ~e d.l ONA ~tJJf

1>ara que o ONA rccombi1'1a1,te possa pcrpct-u ar·sc entre os descenden t e~


da célula viva que o recebeu inicialmente, ou, em outras pala,,ras, para que o
DNA recombinante possa ser clo,,rido, é preciso que o sistema enz.imático de
sínt~ do DNA (processo de replic•çAo do ONA) desta célula r~nhoç• o
"°''º DNA. Par;1. tanto, é necessária a prewnça.. no ,·ctor, de uma seqO~ncia
cor"respondentc a uma origem de ttplic~Jo compatf\•el com o sistema de sin·
tese de ONA da célula hospedeira. Plasmídeos e bactcriófagos contém tais ori·
gens de rcplicaçJo e apresentam portanto replicação autônoma.. independente
do cromossomo da célula. Sendo replic.ldos normalnlente pela c~J u la hospc--
deirJ, lluvcrj cópias de tais replicons crn todas as células do clone que t>Sta e~·
lula irá originnr :.o fin' de sucessivas d ivisões.
Por outro lado,. para que aquel.1s C'élula;s que ti,·erem efct1,•amen1c incor-
porado o novo DNA posSilm ser identificadas. o replicon deve conter algum
ge11c que confira às célula~ umíl nova <"aracte rís tica, facilntente detectável
(n\arcridor g<'nético). Os marcadores gen~ ti cos mais frC'qÜ('nlernc11tc utiliza-
dos parJ a n\a11ipulilçâo de b.1c1\'!ril1s s.'lo os genes de rcsistê1\Cia n drogas.
Assln1, das 1nilhares de bacLérios sub1nctid,'ls ao agcl't te infeccioso, podcrAo
ser facilmente selecionados aquelas poucas que tive rem realn1entc sido infec-
tadas. através de u1na simples se1\\eadura sobre meio contendo t\ drog::i cnt
qucst~o. à qual as células erJm originalmente sensí,reis.

O primeiro ' 'etor a ser utiliz;ado em Engenharia Genétic.t foi o plas-


mfdeo pSCIOI,. um pequeno círculo extracromossômico de ONA de dupla
fita, naturoll da bactéria E. toli# portador de um gene que confert> resistên·
eia ao ilntibióli<"o tetraciclina. COttEN t'I 111. 1 ' utilizaram es~ plasmídeo.
porque ele continha apenas um sitio de reconhecimento para a enzi1na de
restri(3o EroRJ e, conseqücnten\cntc, após digc-stào por esta cnzin1a, é
con"ertido numa moléctila li11car, dotada de extremidJdes cocsi"as do
tipo fco RI. Quando essa 1nolécu l;i de DNA li nearizada foi pos ta cm prê·
scnça de difc re 11tcs frago,cntos de ONA de outra procedéncia, por~1\1 tan\·
bén1 obt id os por digestão pela Eto l~I . e cstil mistura s ubmctid:.i fl r.çl\o da
DN1\ ligase. formaram-se difere1\tcs plasnlidcos híbridos. Cad.• t i m dcs·
ses continha um ou mais peda(OS do DNA estrangeiro inseridos no sítio
de EcoRI do plasmideo rccirc-ularl:tado e se mostraram capaze:,. de trans·
formar uma linhagem sel,·agem dól b.lctéria E. coli,. sensf,•f'l .>o ilntiblótico,
numa linhagem resistente ao antibiótico.
A poilrtir dos plasmídeos naturais de bactérias,. foram a -'>eguir deriva-
do,,. no\'OS plasmideos. mais iidequados para servir como ' 'Clores de cio·
11agcm . O 111ais conhecido desses plasmídeos artificiais é o pBR3221", um
pcque1\0 plasmídeo mtilticópios, de 4.363bp. construído a partir de frag-
1l1cntos provenientes de vários plasn1ídeos na turais de E. coli (Fis. 4.4). A
1tua origcn1 de replicação provt;;o\ do plasnlídeo ColEl, cujo 11úmero de có-
pi{lS por célula é 1\orn1almc11te 15, n1as que pode a inda S('r on1pliíicado a té
3.000 cóp i as/c~ lula, atra,rés da adiç.lo de cloranfenicol à cultur.i . Ocorrt
que a replicação desse tipo de pla~mfdeo estâ sob controle dito relaxado, d~
toll modo que, embora a maquin01ria de repli<"açlo de ONA e de síntese pro-
t~ica da célula hospedeir.l stjd inibida pelo cloranfenicol, .i replic.1(lo do
plasmfdeo ainda continua por v4rlas horas após a adição da droga. 1\lt'm
da origem de replicação do plasmfdeo ColEJ, o plasmídeo p8R322 contém
2 1narcadores: de seleção. A,,1p11 e Ttt' (genes de resistência à ltn1picilin'1! e t~
trttciclina), e apresenta 39 sflios únicos de reconhecimento para dlferenlel
cntimas de restrição, a lguns dos quais s ituados inclusive dentro desttt
111a readores.
...,....,._ a--.:i.-or~-~•rr •:'4-...,._. lll

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A.itllt
Mkl 1 Pv\111

_.._..._,,.....,....
Sap 1 TUlffl t

"""'"" • ·• 11\,ll'loideo ~2L l"'dtt~ (lrcvllf de l>'ôA dt o..pa ÍltAI. ((lf'lltnelo""" orcem dt' r~Jo (on)~
~~.Niip•"e1'e!"'.quecorie<tm~b'lclil~nCllc)ticos~e~.~.,_..
li' ['D)lf'(ioc:.IÓQll.i,.n~\t.of.Ü"'ICOSdr~Of'li'~IOl).V•~~l"l'\llSQe~."4.~if'ICtl(Mn

Como sc pode obsen•ar pel.l Fig. 4..&, ~ utiliz.lnnos o sítio Ps/f p.1r,1 a ln·
:;er(lo do ONA estrangeiro, o gene Anip• í1c.lr.1 inJtl\•ado e, conseqüentemente,
.t bactéria tr.ln.sformada por este pl41Snlidt'O r1.'Con1b1nanté ficará resistente ape·
n.1:t à tetr.iciclin.1, porem co11tinuar,i sensível:. tlnlpicilina (fenótipo 1\1np~ Tett).
Como as c~lul;i:t não trans fo r1n.-.das lcni fénó tipo Anlp~ Tets., será possí,1cl d i!'I·
tinguir de iinediató, num teste e1n placA de l>étri (basl<l semear as c~lul as sobre
meio con1pleto adicit)nado do í.\1'\liblótico), as ctlul<ls não transformadas das
ttlula:t tran:,forn1adas pelo plas1nfdoo recombi1'l.lnte e, ainda mais inlportantc,
daquelas tr.11lsfornladas por um plasnlfdeo n~o rt-comblnante, ou sej3, cni que
nlo ocorreu inscrçJo do fragmento ('Str.lng('iro: ~s últimas serão n."':ti)IC1ll~
.tOS dois antibióticos (Amp11 Tet~). A possib1ltd.ide de- 1.tJ inari,•ação in~ion.ll,
acamt.-ndo um Ít'nólipo (acilmentc n~nht.'('{,·cl, qut' resulta da pf'ti.Cn(.l dc-
dois gt'nb de resistência contendo sít1o:i- de clonagem di(erent~. fe., do
p8RJ22 um in.strumento extremamente útil em Engenharia Genética. Po:.teri-
orn1t:nte, for,1m conslt\tídos pla~mídco:. ,1ind.1 m.11s aperft'i('O.ldos par.1 de·
sempenhar o pJpcl de vetores de (. (O/;. A~i 1n, por exe1nplo, o pl~s111fdúo
pUC18 cont~ 1n u1n g rande Jltin,ero de :,ítios tinico:, pilra d iferentt-s enzi n1as de
restri(ÃO, todos reunidos num.l única região. que foi denominada de polylin·
lr:er. Como o polylinke:r est.i situado dt>ntro do gene l11rZ, uma inser(AO de
DNA est rangeiro em qualquer u 1n dos sf1ios d o polylinke r ir.i acarrclnr a ina·
t-iva(AO ins.crcional do ger1e lncZ. ScnlCJndo·se as células em 1neio contendo o
indicndor X-Ga l. a s colônia$ tra ns íorn\adas pelo plasmidco rcconlbinantc po-
dc 1n ser fa ciln,c1, te reconhecid as, unla vez que passam da coloração azul para
brar1c.'1 . Uma vantage m adiciona l. proporcionada pelo polylir\kcr, consiste na
possibilidade de se inserir dire1an1entc um fragmento com exlrenlidodes gera·
dos por d uas d iferentes enz imas de rcstriç.lo (desde que existaol sítios para
eln~ no polylinker), sem ter que recorrer a manipulações adícioMiS.

Por outro lado,. foram tam~m dt"Senvol\•idos sistemas de clonagem


para b-ac1érias. empregando bactcriófagos ao in\rés de plasmfdeos. fu.ses siste·
nlaS proporcionam maior facilidade de isolamento das moléculas hibridas,
poii,., permitindo-se ao fago concluir o seu ciclo lítico, serão liber,\das p<t rlfcu·
las fágic.'\S coil tendo o DNA rcrombin<inte (obté m-se facilmerltc: uma a mplifi·
ca('Jo de 1cr vezes no lisado). Entreta nto, hilvCrá um limite de lJnlanho para o
ON A q ue se dcsej<'I clona r. já que só poderá ser en'lpacota da 110 cab(.'(a do íago
unta 1n ollku la d e DNA de un1 detL"r1nhlad o comprimento. Os bacterióli'l gos
tên\ aproxinlada mc-ntc de 10 a 5-0 genes e podenl ser n\a1l ipl1lados para trans·
porta r outros genes em s ubs ti tuiç.lo a a lguns dos seus . Assim, puder.1m ser
construidos vetores, consistindo do genoma do bacteriôíago l;imbda, do q'till
se removeu uma região não e5SCnclal par.-. o dcsen"·ol\"imento do cklo lítico,
que pode portanto ser substituída pelo ONA e5trangeiro. EsQ abord;igem
apresenta ainda a "·antagem de que o DN1\ do fago sem a inserção ser.1 peque-
no demais para ser empacolado e, conseqüentemente.- só ser3o geradas partí·
cuias f:Sgic:as contendo o DNA reco1nbinantc, conta11to que este contenha um
frag mento heterólogo de ta1na1lho .1dequado para compensar a região :Juscnte
do genomn fágico. Poste riormente, 1an1b6m fora m desenvo lvidáS t~cnlcas que
pcrnlitc nl <> en, pacotan\ento i11 vitro do DN1\ recombinante. Obt6n1 -sc dessa
n1oncirn un\ vírus infeccioso portador do DNA recoinbioantc. o que a u111enta
s ignlíicativamente a eficiência do processo, em re lação à transforn1açAo utilí·
zando plasmídoos.
Visando combinar vantagens dos dois sistemas d(' clonagem,. o dos pl.1s·
mídeos e o dos biicleriófagos,. foi d~vol"ida uma ºº''ª cl.-.sse de \ 1ctores ar·
taficiais, os chamados cosmídcos.. Tratam-se de plasmídeos nos quais foram
in~r1das pequenas seqüências do DNA do bac:te ri6fago lambda (os síti0i,. CM),
necessárias para o empacotan\ento do DNA do fago 1\a c.abe(a di partícula.
Tais vetores conservam a caracteríittica de serem mantidos na bact ~ r ia sob a
forn1n de plasmfd eos, m:'IS, por out ro Indo, poden' se-r empacot:idos irr vitro,
origina ndo l'artícu las de fago, ca pazes de in f('( t<'l r a bactéria, o que, con10 já
vimos, constitui 1ul' p rocesso a ltonlcutc eficiente. Os cos1llídcos continuam
sujeitos à linlitação de tamanho imposta pela ca~çá da partícula, n\;;ls pcrnli-
ten\ que seja enlpacotada unla quani-idade muito maior de ONt\ estrangeiro
(até 45 kb), un1a vez que tivera1n ren1ovida praticamente a totalidade do geno-
ma fágico. Enl relação aos plasmideos, os cosmídeos apresenta1n a vantagem
de que o DNA pode ser acondicionado cn1 particulas de fago, que são muito
mais {>Stávcis, pcrmiti11do que o Dt\'.t\ seja conservado por períodos de te 1npo
mais 101\gos. Existe1tl ai1lda vários outros vetore-s, derivados do lambda e de-
dife rentcs bacteriófagos, porénl a sua descrição foge ao escopo deste capítulo.
São dignos de nottl os vetor('S derivados de fagos de ONA de fita simples,
como é o caso do fago rvtl3 de E. eoJ;, porque facilit-anl grandemente certas eta-
pas de n1anipulação genética. /\.ssin\, por exen\plo, o seqüenciamento de
ONA, a mutagênese i11 v;1ro e certos 1nétodos de preparação de sondas reque-
te1n ON.hi. de fita simples, com<>veremos adia1\te.
No caso de organisnlos elLCarióticos, conhecem-se a lguns poucos pias·
mídeos naturais1•>, conlo, por exemplo, o plasmídeo de 2iun da leved ura
Saccl111rott1yees eertvisiae, do qual se obteve a origem de replicação para a
construção da maioria dos vetores da levedura. J>ara outros organismos, cm·
pregam-se vírus co1no veto r~ de clo1lagcn1, con10 é o CclSO de vírus de mamí-
feros e de insetos.
Tambén\ foran1 constru ídos vetores-ponte ou bifuncionais, que contênl
origc1ls de replicação e marcadores de seleção compatívéiS com dois s isl'e1nas
hospedeiros diícre1ltcs. Na verdade, a maioria dos vetores construídos para
diff'rC1\tes células cucariótic.'ls consiste de vetores bifuncionais, c..1pazcs de
transforn\ar tanto a célula euc.'lriótica em Qllestão quanto a bact~ria E. et>li.
Essa estratégia é intercssa1\te, porque pcrn\jte que sejanl a proveitadas as van·
tagens dos d<>is sistcnlaS hospt'.>deiros. Assinl, por exenlplo, e nlbora a levedura
também seja um microrganismo, ai1\da é nluito 111ais cômodo realizar alguns
dos passos da nlanipulaçào cnl E. ct>li conlo, por cxenlplo, a amplificação e ex·
tr.;ição do ONA plasmidial, o que se pode realizar com grande facilidade
quando se \1tiliia \lnl vetor bifuncional.
Qua11do se trabalha conl geno1nas de eucariotos supe riores, é necessário
clonar fr.lgnle1ltos grandes de DNA. Para acomodar ta is frag1llentos, foi de-
senvolvido u1n tipo especial de plasnlideo de levedura, chamado YAC {Xcast
Artificial C.hromosonlé), que é capaz de aceitar inserções de -300 kb? ou seja,
10 vezes mais ONA do que aceitan1 os plas11lídeos bacterianos. O YAC c-0nté1n
todos os elementos de um vérdadciro cto11lossonlo (origen1 de replicação, ccn·
trõn1ero, 2 telômeros, a1énl dos genes inarcadorC"s) e é portanto mitoticanlente
estável após a inserção de fragmentos gra11dcs.
Enl resumo, são as segt1intes as carJterísticas que deve ter o plasmídoo,
para ser utilizado co1no vetor de clonagen1:
a) Tér baixo peso molecular.
Pérmite que o vetor seja faci ln\ente isolado intacto.
b) 1\prese1\tar pelo me1\0S unl sítio \Í.nico para unla determinada
enzima de restrição (sítio de clonagc-nl),
Permite que o vetor seja clivado 1\unl só po1\IO, 01lde será i_n serido
o DNA estrangeiro. Evidente1nente, a prese1\ça de vários sítios
únicos para d iferentes enzi1nas de restrição é a ltamente desejável.
c) Ser portador de u1r1a origem de replicação compatível com o sis-
tema hospedeiro.
Per1n itc qllC o vetor se perpetue entre a descendência da célula ini-
cialmente transformada, origina1ldo um clone 1nolccular.
d} Conter pelo menos um ge1tc marcador.
Permite a seleção dos clones transformantes de1ttre um graitdc Jl(t-
mero de células submetidas ao processo de tr.lnsformação.
e) Ter controle relaxado de replicação.
Pern1ite que o DNA do plas1nídeo seja a 1nplificado, possibilitando
a obtenção de quantidades ainda nlais s ig nificativas do gene es-
trangeiro.
f) Nâo ser u1n plasnlidco co1ljugativo.
Trata-se de un1a nledida de segurança, visando evit(lr a dissenlina-
çào do DNA recombinante fora do laboratório.

4.4 - Construção da molécula de DNA recombinante:


diferentes estratégias
Há casos em que 1\ào é possível empregar enzi1nas d(' restriçSo para a
clonagen1. O priilcipal proble1na advénl do fa to de que pod(' l\avcr s ítios su.r
cctíveis à ação da e1lzima dentro da seqüência gênica que se quer clonar, sen-
do po rtanto grande a probabilidade de se incorrer na inativação do gene. Pal"I.
contornar esse proble1na, procede-se à fragmen tação n1ecânic-a do DNA, quf'
gera quebras ao acaso, g:ara1\tindo que p('IO me1\0S a lgumas das moJéc-ulns não
sejartl quebradas dentro do gene de inte resse. Essa coleção de fragmentos aJ
atórios é mais representativa do gc-noma e essa abordagc1n foi port-al\to b
tante 11tiliz.ada para a construç.'io de bibliotccas genô1nicas dos 1nais d ivc
organisnlos. €1ltretanto, não é evidentemente possível o bter extrenlidadcs
esivas a través des5(! procedinlento. Além disso, o enlprego, seja de genes si
téticos, seja de cDNA (ver adiante), tampol1co fornece cxtren\idadcs coesivas..
Nesses casos, u1lla alternativa consiste 1lo emprego da enzima tra1lsfe
se terminal. Diferê1\tenlC'ntc das denlais DNA-polinlerascs, a tra 1\sferase t
127

:-:.nal, enc:ontr,'\da em 1-i mo de vitC'la, ten1 a c~1 pncidadc d e .'ldicionnr nuclcotí-


.:ç..'" às extremidades J'OH d.l~ (adcias de DNA. Sént necessitar dt! uma !it.1
.:.- DNA·molde. Fs..-.a cn2ima foi portanto ntui10 utilizada cm Engenharia <Õ
-1r:1c.11·. Por ~,:.e proce- dimcnto, ch.;imado de mctodo das exten..~ homopc>-
- ,..-ric(1s, podcnl ~e r .1dicion.:1d0i cerc.1 de lOO resíduos de \1n1 dctern1in4tdo
.. ~.: l eo tídco (pt,r cxe1n plo, dATP) às cxtre 1nid.idl'S do vetor e. por t>utro lado,
..:i1rl.'.a d e 100 r'-'síduos do nucleot ídeo con1plc1ncn1,,r (no caso, dírl') às êxtrc·
- .'"t,1des d o OKA a ser in.;;cridn itel!lte \·etor, dC" tal forma qu(', qu.1ndo esta"
.: .: ...rentes molécula~ (orem <"OIOC:ddas em prt~ô(.l1 poss..im l'mparelhar-se
1::.ivés de su.1s eAtremidades romplementarth- (Fig. .J.3)

53·· ----
-- • ~:r
e:=: 5'

:r ---
S' ---· AA(A>.,AA·~H
HO-TT(Tl.
c::==:::::i3'
n c===::is

ONA llgnse sela


cova!entemente
0$ f1~mtl'lt0$

5·: :::: AAJ,A),.AA C~~~~ 3'


3' TT(T),,TT 5'

·~.f 5 - ~.õ:do ~·~l'o 'q'd-"!"oo(- Por-.içioci ........,,.:r.-<1-~'~ • t.lo..!c.o-31:SM.~


• o ~'!"~O.-: cA' '-~»e~cT.a.:> ..~..or.Eu..s",·~<Ot"'~..utl lot"'do~·
..,.l'e po• lóir;.ioe• ONA ;:~ .t0S"l'~"'.l ~"' IC "fl.4 g.tÇklb.'oc! ts!~ft"!t:'~O •1"" •or·•gr"('l'lo"O f n
vt"l Qe t'~~C'"'~S po CIA.'p()l·d- ;xxkmtJ"'lo+·n ~l°(n.::.s.e(t~r~ pOI cJC':>Ol,·CG ~ M ~<1.o~ ..t Zil·
~ fa1tm dCíP e- óCTP
Uma \•an1agem desse mélodo é que não há possibilid,ade de o vetor
voltar à (orma original; só ir3o recirculariz.ar-se os pl,asmídeos contendo a
inser(30 e, conseqüentemente, todllS as células trans(ormadas conle rAo o
DNA rcconlbinante. Tamb ~ nl é preciso considerar que, qtH.1ndo :,e trabalha
con1 extrc 1nidades coesi\ra s geradas por un1a e1tzima de res tri çõo~ alé1n de
outras reações parasitas, diferentes fragn1e1\ tos do DNA a ser clo1'l ado poden\
ligar-se c11tre si, de modo que tcrc 111os representada, no p los n1fdco re<on1bi-
na11te, uma sitt1ação diferente daquela do genoma origínal: seqUênclns que
nJo e ram contíguas no genon1a orlgin.ll poder-Jo (icar contígu<'I S no plasn1i-
dco. t\ aplicação do método dJ~ ex1cnsões homopoliméricas C\'it~ esse tipo de
tlrte(01to. Entretanto .. a des\•antagem é que esse procedimento introdt•l longas
regiões de l"''es poli(dA)-poli(dT} nas junções entre as duas csp«ies de
ONA, o que pode afetar a full(ãO gl-nica. Outra des,1antagem E que haver..i di-
ficuldades e m se remo,•er do vetor o (ragmen10 de interesse, em etapas sub-
seqüentes da clonagem. Hoje dispõem·se de outros métodos, que con~istcm
c 1n se recorrer a ~' ligadores"', sintetizados quimicaLnente, constitt1fdos de oli-
gonuclco1ideos contendo a seqüência de reconhecimento dt! un1,i dctcrn,ina-
da cnzinln de restrição. Tnis ligndorcs s.lo adicionados, por il(30 dn enzinla
ON;\ ligtise de T4 às extrenlidodcs do DNA que se quer clonar e, trntnndo-se
"'"' scgtiida este ONA com o eniinio de restriç.lo e1n questAo, serJo originndas
as extremidades cor-respondentes. Um.i das \•antag.ens dessa estratégia é que o
DNA inserido pode depois M!r r.:mo\•ldo do vetor, a tr.'lvés do tr.lt,1mcnto com
.1quela determinada enzima de reslriçlo. Hoje encontram-se di)ponlvcis no
mercado ligadores sintéticos desse tipo, para qualquer enzima de restrlç..\o, de
modo que é possí\'el inserir qualquer (ragmento estrangeiro em qualquer sírio
do \'Ctor. A técnica. da l'CR (\'Cr abaixo) também permite que se crien1 <'IS ex-
trcn1idadcs desejadas no fragn1e1110 de DN,\ a ser amplificado.
Quando se realiza urna re.1(âo de ligação entre n1oléculas de DNA d i·
geridas por uma mes1na cnzin1a de rcstriç3o, a jnserç~o do írag1n cn10 hctc-
ró logo pode ocorrer e 11l qualquer un1n dfls d11as 01·icntnçõcs cn1 rclaç.lo ao
veto r. l!1n certos casos, isso 11Jo tcn1 inlportãncia, 1nas, c111 outros, ncccssi·
ta-se do entrada do (r~1gmcnto apenas numa deterntinada o ri cntJ ç.~o. 1>ara
obter a h1scrç:ão na orientaçJo correta, pode-se lançar m.lo do uso de dtras
diferentes en7;imas de restriç.lo, que produ7.am diferentes extremidades coc-
siv,as (extremidades A e 8 ). Como somente duas extremidades A ou duas ex-
tremidades B vão poder se lig.Jr. ,a entrada do fragmento no \"etor também
aberto por essas mesmas duas enl-ima.s de restrição.. \•ai OCOrrt"t somente numa
das oricnta(ões. Essa abordagem t.1mbém apresenta a ''antagem de que o ,retor
nllo poderá se recircula ritar sen1 inscrçJo.
O ntaterial genético a ser clonado pode ser obtido, seja direta mente a
pnrtir do gen<una de outro organisnto, seja por meio de síntese;,. v;Jro. ;\l ~nl
disso, qt1ando se co11he<c a scqil~ 1lc io de ílnlinoácidos da proteína (cnsos pou·
co freqüentes), é possi,1el deduzir n scqi.iê11cia de DN;.\ que a codificn e obter o
gene atrav~ s de sintC'sc química . Ess.i última abordagen\ só é viável no caso d('
polipeptídeos e foi empregada para a clonagem do gene da soma tosta tina, um
pequeno hOfmônio de apenas 14 amln<>Acidos, tendo constituído um dos pri-
meiros sucessos da Engenharia GenétiC3 ,..
Entrct11nto, unl dos c11 nl i1\l\OS mnis d iretos para o isola1nc1'llO de uol de-
tcrminodo gene consiste na clonag.en1 do que se chama de DNA coutpl~111~11tar
tcDNA). S.1be..se que os genes de euc.,.riotos são, na St1a grande mólioria. -ge-
nes partidos.... isto é, apresentam a sequência codificante interrompida pela
presença de introns. Os introns são scqO~ncias não codificadoras, que n!\o irão
resultar cm ~eqüênci a s da prote ína que o gene codilicll. Enl contrapartida, o
RNA mensageiro mad uro é o nlolde que será utiliz3do para a s hltese da pro-
teína. Assim, quando é possível isolar o mRi.'JA de uma dada proteína. a clÕ"
n.>gem fie°' gr.tndemenl<' f.lcilitada. A partir dt"SSe mRKA podC4se obter o
cDNA in ritro, por ação da enzima tr.lnscritase in,•crsa: essa enzima é capaz
de sintetizar um DNA de dupla íita a pnrtir de qualquer nlolécula de RNA, Íi·
cando o proccdirncnto mu ito s impliíicado, q 11ando o RNA ío r portador de
uma seqiiência poli·A 110 seu terminal 3', como é o c.iso dos mRNAs cucarióli·
cos.. A Fig. 4.6 mostra os passos necess'rios par3 a obtenção docONA.
Quando não se pode dispor do gene isolado. a e:i.tratégia consi111te na cons·
ln1çâo de uma coleção de plasmidOOS (Oll Íagos), COJ\tCndo todc>s OS genes de Ul'tl
determinado organisn10. Par.i obter um11 t.11bibliolt'tfl 8tndntita, ou bf1'1eo geuúuu··
(O, ou genoleca, deve-se proc(."(ter à frag1ncntação do ONA total extraído do or·
ganismo, de modo a otiginar uma coleç3o de ítagmentos aleatórios. Isso pode
ser conseguido por meto da fragmen1açAo meci.nic.t do DNA, ou por meio de
uma dign tAo apenas parcial por uma ou mais enzinlaS de restrição. Em geral,
utiliza-se 111na enzinta de testriç-ão que reronllcce un1n seqüência curta, como a
enzi1na Sf11t3A, que reconhece unia ~qUê 1lci a de 4 1luclcotfdcos, sob cond ições
cm que não consiga d igerir o DNA por completo. NesS."lS condições de digestão
parcial.. ne.m todas as moléc:ul.as de DNA se~o corldd.JS em todos os 5.ítk>s susce-
fi,•eis à en7Jma e alcança-se portanto uma distribuic;Jo quase randô1nica de lrag·
nte1\IOS. Com essa coleção de fragmentos, pode-se ent.,o e:riar uml\ roJeção de
pl"smídeos híbridos, representativa do gcno1na inteiro do organisn10. O 11ún1ero
de clones necessários para cobrir todo o gcnonla será d iferente, conforme o tanta·
nho do genoma do orgdnismo. Assim. por exemplo_. urillz...\ndo lambda como ve--
tor. serão necessários 1.500 clones recombinantes par~ construir uma genotec.a de
E. coli, 4.6<X> C'l ones para S. ctrevisiat e 800.000 clones p<tra mamíleros. Evidente·
mente, o nú1ncro de clones 1tc-c:essários ,r,ii t<lnlbénl depc1tder do l<ln1nnho médio
dos fragn1l'n tos: quanto n1nior o tamanl10 do frago1en10, nlenos clo11es serào ne--
cessários. Conseqüentemente, para a C01lstr\1ção de bancos genéticos, prefe-
rem·se ' 'elores que aceitem lragmertt<r.. grandes, tais como cosmidcos ou YACs.
Uma outra abordagem consiste em se construir uma b1h/;ottca dt cDNA.. a partir
do mRNA total de \tnla determinada cé-lula. A biblio t..'(~1 de cONA, e11tretanto,
representa apenas os genes que estão se expressando naquele dc1er1nini1do nto-
n\cnto da vida da célulri. Tendo em màos uma biblioteca genética, pode-se em·
preender a busca do gene desejado, C'OfT\O veremos no item 4.7.
110 ~°'~ ...... ~·

mRNA~ 1 MAMI :r
TTTn
Síntese d•
primeira

...,,..
!lta decONA Transc::riCase
lnvena ..-
- (dT)

mRNAS' AAAAA 3'

cllNA3' TTm s·

lf\terru.PQOes

M~~bo1
l RN~MH

ICJI MMA 1
TTTTT

OHI\ poti11,......
s....... • dNTPs
seguida fila 0NA li9ê1H
decDNA

°""" ...
.. cONA
MMAI
TTTTT

ôtunçlodo(ONA. Umdos~!Odos ~ wcbcetcONA• ~do ~~<0.quecOf'Cbw


Figun • .6
~it~~~,..su,a.~ 1·.~emll'l(lbiifomflNA.o:irn~(a
go(dT)~ql.,tfdOhbncW~.:tpcl(~1ef'W'do<O"'OP"W"'IMPi!Q•~~~"""lf"llUll'•' •f(ldcl.
cONA. p_.. ~•iQdt~dt~ ~. klvir1':S~ Uma~<0"154tccmutb.ar •~
ma An.He Hde E.. C(I ... Q:Jt lfi ~OÔJU f'I~ N ru~ RNA.(t..IC <Of'!l>Õt .l ~ hlbtlda. T.llS ll"l:er'l\4>'
ç6ci ~ \lll'lzacf.lS como~ de ll'llOOÇSOp.1r.i i'I cnz.mi ONA·p)lmel"i!I~ Ide E. c-oY, c;pJC: 1r.\ Slrltew:.v 11 2.• (~de
cDNo\lor'NnOopormolde•• •fu Ot:ltrnop.J.$soCOl'MteN~deONA.~.qi.ie11i~~iri~
çk> ttl'Ntlet(O'ltc

R<.t tntementc, (01 descobert<1 uma nova técnica de sínlcse de DKA ir1 r 1·
Iro, qut:> permite ~mplificar d ircta1ncnte uma dctcrmil\ada região do geno1na
Tra l.:i·sc dil técnica ele J'CR (Polyuu:ras;,• Cltaiu Rt'"ctio11l'1, que teve um impac10
fornlid.tvcl em Biologia ~1 olecular. P.iara aplic-at a J;>CR, é entretanto necess.ir'°
~ :.~ ('Onheçam áS S<'qlit!nc:ias (-20bp s.lo Sl1fitientes). qu,· ladeiam a seqüên-
.=-i .!.'° ONA de inler~sw. para poder primeiramente procedl'r;, sintese quimi·
.:2 ..:.t>sl~:t o ligonucle-0tídeos. qu e i rão C1"llA0 servir con10 iniciadores do
?'",'\:t>SSO de p ol in1c1·izaç.10 (prin1trs). O p 1•in1er é ncccss.i.rio pc1rque a
~ .-.\·pol hl1c rase rt•qucr um,1 pequena tt>gi.io di' DNA de dupla fit,1 pdr.a inic:i·
r .1 ~intcse da (ila~filha : a grande ''ant~gcm é que. quando se ulili1am dois
;l'!"'.~~rs, só será sinte ti:t<lda pela ONA·polin1cr.,se a regi3o de DNA compre·
e ..::J a ent re eles . En1 o utras pJlavritS, os pri1ncrs ir,,o lin1itnr ,, sí1"ltcsc n unla
~:.lo t•spf..'C'ífic:a do IJNA. o q irc lcv.lrâ à an1pl ificação ape1la!'i dest.J seqüência
:=~ .:. -&.7). O procedimento é b.1stJnte simple~: uma prep.1r.1c;~lo de ONA. que
=-'"\.!e- conSillotir do gcnom.l inteiro do organismo, é prime1rarnente dc&1laturada
~:: tra la 1nc1l to té r1niC'O, cm presc11çil dos d oi~ p rin\crs comp l cn1 én l .i rc~ ,\s se·
: .:J.:\cias q ue ladc ian1 a seqiiênci,1 de interesse, c m an1brt!!t '11' fi tas d('sn,ltura·
.:.JS-. Com a presençJ d°' quatro dNTPs ptecursor~ e dil DNA·pollmcrase
:o.!::t?ri~na no sistct'niti, ocorrerá a 1tíntese da fita simpleit complementar ao
:>7'.J,\·moldc, a part1r da extrem;dade 3'0H de cada prin,cr. Assim , cadrt ciclo
J,, PC R t.'nvolve o seguinte:
l) O\!sn.ltur.i(Jo t~rmica da dupla fita do ONA·alvo.
2) Res(rianwn10, p.lra pernlilir o t>mparelhan1ento do.) primttrs con1
a:, regiões compJcmcntarcs nas dua:; fil JS dcsnatur.1d.1s do DN1-\ .
3) ExtL'nsào d os prin1e rs, por nçAo da ONJ\ ·polin1er.1:,c.

A grAnd~ \'3.Jl"'s~m da PCR consiste na possibilidade dt> se repetir o cick>


:.1eiro por várias vcLcS, bastando p.1ra isto d~sna t 11ra r as 1"1ovas ntol\X'ulas de
:)~A dup la fita que v3o se forn1a11dt>, cn1 cond ições de exçc:-,so de pri1n crs. Ore·
..·.. ltado é u1n crcscin\cnto exponencial da cegião ele i11tecessc, detinid.J ~I~ dois
;-nmers: a!'tõl.Ím, repetindo-se o c:klo por 25 ,·ez<.'S. obtcm·~ \lm.l amplitic.l(;\O de
i:~ -lx106 d~ região de interesse. Con1 a dcscobctta de ONA·JX,limer..tses tcrmor·
:i':;istentc~. o PCR pôde :-.cr autonlalii;idil e, hoje cn1 d ia, é possível á1nplific.'lr se·
-tuênciil.S de DNA d e ,11é 30 k b, en1 n1áquir1as pouco 011crosas.
A té<nica da PCR \'t>io re,·olucionar todól ,, área da Fngrohatia Genética,
:-,,rque pemlite que"'<" produtan1 ilimitadas rópias de u1n M->gn1ento ~"f1«ífico
~.., O~A. sc1n ter que recorrer à cJonJgem . Como mencio111ldo acin1a, un'a vez
...;uc sâe,) (),.; dois pt in, (•rs que d cfi 11cn1 o segn1cn10 que se q11cr an"lpl i fictll', não é
;at:>,ess.irio i..olar estt• M!gmento p.Jr11 poder aplic.1r a PCR. Alé1n dis.!!to, .J q\1an·
::..1ade de DNA nece">.s.Sria para come'(ar o processo ê muito pequena, wndo
-uíicic1\tcs qua nt idadc~ da otd('nl de IJig de DNA genô1n1cn. Ta1npouco é ne·
.:~~sã rio un' nlto grau de pu reza do DNA, podendo se r c111prcgado di rctamcn -
:i' DNA obtido a p;irtir da l isc ccl11lar. A técnica da l'CR é- extremamente
.. ~Kátil e 'cm. con.st'qt•Cnlcmentc. 1.>nrontrdndO inúmcr.t!t aplicaçõt"S, dent~
J .. quais se dl!St.tcam o diagnõstiro dt> di,·ers..1s doenças mfe«iosasl ht'm con10
lll (~-.......,.,..~

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ONA
$4tq&ênd& AIVO originail

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l ONA ~M

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2 oOpi<as •
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••

·- 3'

3'
S'
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• =


Ciclo 3

•1
••
3' = •
S' • =
....... 3' =
,.=


5'
• =
S' • =

-= --- ""'"°'
~ 4..7 -A~'locmQQNdol~(PCR).O~ccntendo;a~•w~(WniókS&lf
~~poo'tlr.~$~~·~-2bdo~"
~irli~ lno. .... (l'.as~~pe'95iectm). lp.WOtacD-.mcbP'll'T'Cl'\(tW
runlotókS.n)•~COTOn'Clldta'cat.~ Oocfodt~6~.tiqutWOO­
tcMai a~'°~ do~o de ONA. Of:y(>.s.c l'Qa.' Q.IC'- ~OCCl'l1o l llfY.tSe dt 11~1 fl!Olt·
cubstl'\M b'!f..Mdo Que'•~ M. nw 11"1\o<Mlin'·seaob'Cõdos ôCb ~e ll"lo ~r«i ~
n.ir na~ ~Bhn •Ptl'tMdl ~·Mvo, ou K')l, dl scqOénoa cOflt;oCll et1trc os 2 pin'IM
de doenças genéticas. Além disso. a alta sensibilidade da PCR permitiu o de--
sen"ol\'imento do " DNA lingerprinting· (impr<1>Sào digital do DNA). uma
técnica de alio poder de resoluçào, que possíbilita a identificação de indivfdu~
os (detcrininação de palemidade. determínaçlo de s uspeitos e-m casos policia·
is), a partir de amostras diminutas do seu DNi\ . A S(!nsibilidade da 1>CR é tnl
que jó pcr1nitiu a ampliíicaç.õo e clonage1n de DNA obtido de nltí1n ias llt11na·
nas e de pla ntas e animais já cxth,tos. A ti nica cxigênc;ia da PCR é n disponibi·
Udnde dos p rimers adequados: é preciso saber quais são as scqilt!ucins
vtzinhns à região de interesse que se deseja <11nplific-ar. Entretanto, qu<lndo se
dispõe de ttm fragmento de DNA qualqt1er.. inserido num vetor conhecido, é
óbvio que essa dificuldade desaparece, j.;\ que se podem u tilizar como primers
as sequências contíguas do próprio ' 'etor.

4 .5 - Expressão da infonnaçio genética heteróloga


Co1n os desenvolvimentos da En.gc1lharia Genética, é hoje possf\'cl ex·
pressar qualquer gene em qualquer organis1no hospedeiro, desde bac-t~r;as,
leveduras, fungos filamentosos e in~élOS, at~ pla1,tas e mamíferos tr\\1tsg(!ni ·
cos. Vetores especializados tivcr.lm cntrc t;i1, to de ser desenvolvidos~ p<lr<l nt\o
apenns trans forma r eficic1, temente$ 1n 3s ta nlbén' fo rnecer as cond ições ncccs-
sdrias para o expressão do DNA clonado cm c;ida t1m desses tipos celul<'! rcs.
A síntese de uma proteína funcional a partir do g~nc clonado dep~ndc de
\•ários p.lSSOS metabólicos.. que de,'cr;lo ser rcJlizados pela célula hospedcir.1:
1) Tr"1nscriçlo do gene, originõ'lndo o mRNA.
2) Processamento (..S-plicing..) do mRNA, que irá remover as f\."'-
giões correspondentes aos introns.
3) TraduçAo do mRt'IA em proteln•.
4) Processamento pós·traducional: há pro1cfnas que.. uma vez sin·
te lizndns, necessitam ainda sofrer nlodific.. çõcs, pa ra poderc1n ter
atividade bioJógica.
5) All!n' disso.. uma vez pro1,ta, é p reciso que a proteína hctcróloga
n~o scj<ldegradada pela célula hospcdclr<l .
Evidentemente, li.ma falh.:i em qualqtacr t1m desses passos resultará na
ausênci<l do prod\1to do gene clonado.
Para gar.11n1ir a expressão do gene clonado, foram desen,•ol\•idos \tetores
especiais, chamados de w tores dr rxprtSsdo. que sAo portadores dos diveDOS
elementos genélicos necessários às e1<1p3S de transcrição e de traduçlo que a
célula hospedeira deverá realizar. i3: importante ressaltar que diferentes siste·
mas hospedeiros: exigem elen\entos cspccfíicos. Vanlos aqui nos liinit<lr ., des-
c rever os requerimentos especfficos d<l célula bacteriana. Na Fig. 4.8 cst.1
rcprcscntndo t11n modelo de ' 'etor de cxprcss.fto paril E. co/;,
Tormint'CIOI'
de tranSiÇtio

Pro!eina

Figura 4 .8 - Vetor de exprC$SSo de é. co~. O OC'lA. do v«or <0016-n os~~~ nece$~ p.lra a
tta"ISCl'iç.10 (ptomo:or e tetmlOi,\Clor) e p.'l~ a tr'ad~ (rbs, <~ ~ scq(Jêno;1S.ô ~ o c6don de 1~)
do gene to'$1f.vigt1ro.A setaincfiaa d~emque OCOl"l'trá a tranKl'il;k>do6'Cnc pell RNA.po'lmerase dabactMt
Ql)IC~~ste~f~C

Para que ocorra a trau~riçào, é nccessârio que o gene clonado esteja in-
tercalado entre un\ pronlotor e un1 ternlinador de tra1lSCl'ição - seqüências
de Of\IA q\1e são rcct)1lhctidas pela RNA·polimerase da célula llospcdcira.
Hoje, já foram isolado~ d iferc1\ tes pron1otores bacterianos, que varian\ quanto
à sua intensidade e seu modo dC! a~.\o. Os pronlotores fortes são aqueles que
sustcnt,1n1 un1a a lta taxa de tra11scrição, e foram isolados de gc1tcs cujos pro-
dutos são requeridos em alta s co1tcentrações par<i o funcionanlcnto 1\orn'lal da
célula. Pol' sua vez, os promotores fracoss que são relativan1ente ineficientes,
foram iwlados de genes cujos produtos sào s uficientes enl pequenas q\1anti·
dades pa r<i o fu ncionan\cnto norm(I) da célula. Depc1\dendo da fi nalidade da
clonagen\, às vezes pode ser i1, tercss..1Jlte utilizar um promotor fraco como,
por exénlplo, no caso de proteínas tóxicas para a célula hospedei r(I. Entretan·
to, <i situação ideal é poder cultiv<ir a bactéria portadora do gene clor1ado até a
cultura a tingir a máxinta densidade de células, para só e1tt5o provocar a ex·
pressão tl'laciça do gene clonado. l.,ara ess(I fin(llidade, são n1uito utifi;r...idos
vetores co1ttcndo un\ pro111otor r c:g11ltivel, que perntite un\ controle m(lis estrito
da expressão. En' E. coli, a regulação da tran.scriç.io pode ocorrer, seja por in·
dução, seja por repressão. Um gene induzível é aquele cuja transcrição sõ
t)COrre c1\\ presença do indutor: gcralotente, o indutor consistirá do subs trato
da énzi1na codificada pelo gene em c1uest.'\o. Enl co1\trapartida, um gene re·
pressível é aquele cuja transcrição deixa de ocorrer em presença da substâ1'l cia
repressora. Um dos pro1notores 11\ais freqüentemente \ltiliz(ldos para a ex·
pressão eot E. coli é o promotor lac, qt1e controla a transcrição do gene lacZ,
codificador ela e1lZi1na tl·galactosidase. Esse promo tor~ i1\duzido por lactose
ou outros l}-g,alaçtosídcos. co1no o isopropil-tiogalactosídeo (IPTG)s de ntodo
que, ao se adicio1tar fPTC ao n\cio de cultura, o pronlotor lnc entrará e1n ação
e haver.i trans.crição do gene que ti,rer sido clon(ldo sob o seu controle. Outro
pron\otor bastante u tilizado é o pro1notor trp, que é teprimido por triptofa1lo,
podendo ta n1bé m sct induzido p-Or ácido 3-indolilacético. Um p romotor cxtrc·
mamente fo rte é o p romotor 1,1>4 , um dos pron1otores responsáveis pe lil trans-
crição dos genes do bactcr-ióíago lambdJ , Esse- promotor é re<onhecido pela
RNA-polimerase de E. c()fi, qt1ando o fago está desenvolve1\do o ciclo lítico.
Quando o fago está no ciclo lisogênico, esse p romotor é reprimido pe lo pro-
duto do gen(' },e/. Os vetores de expressão qu(' co1l tê n' o pro1notor J.I't s...'lo uti·
lizados com tima linhagem de E. coli, portadora de uma versão 1n uta nte do
ge11e cl (no próprio ,retorou então n~1 m profago), que sinte tiza uma forma tér·
mosserl.sível dJ proteínJ repressora cl. t\ ssi1n, co\ tc1np('ta turas até 30ºC, essa
proteína mutante mantén1 (l capacidade de reprimir o promotor l.Pv em tem-
pcratur.ls nta is elevadas, a proteína é inativada e, conseqüentemente, ocorre a
tra nS<:riç~o do gene clonado sob este pro1tlotor. Um outro sistenta dt> expres·
são nlt1ito eficie1l te, qt1e utiliza tlm pron1otor do fago T7 e a RNA·polimeras.c
do próptio T7, foi dcse1lvolvido 1\lJ is rccenten1c1lte . Quando o fago T7 infecta
E. toli, a bactéria passa a p roduiir a RNA-polirtlerase de T7, que rccor1;llecc
npenas os promotores de T7, de 1nodo que a bactéria pass(lrá a transcrever
prcferenciahtlC1\te os ge11es de T7. l "ira11do proveito desse fato, for(lnl constru-
ídos vetores onde o ge1te clonado fica sob o controle do pronlotor de T7 e que
co1l ténl ao n1esmo tempo o gene qt1e codific;;i a RNA-polin1erase do filg;O, sob
o controle de um pro1notor regt1lável de E. coli conlo, po1· excntplo, o pronto·
tor lac. Quando se tr.lnsforma a bactéria com esse vetor, a expressão do gc1\e
clonado ocorre logo npós se izlduzir a tra nscrição da l~NA-polin1erase de T7.
Como essa RNA-polirnerasc reconhece apenas o pronlotor do (ago, ocorrerá
transcrição apenas do ge1le clonado e não dos demais genes da hospedeira.
Por otitro lado, como as bactérias 1tâo stío capazes de realizar o processa-
mento do RN1\ pa ra se obter expressão de genes contendo introns (a grande
maioria dos genes de orga11isnlos et1c(lrióticos), será necessário primeiranlcn·
te remover estes introns. O ca minho 1nais d irêto ~ sc1n dúvida realizar a clo-
nagem docDNA.
Para que ocorra ., tradução, é necess.irio que o 1nRNt\ conte1l lla unl sítio
de ligação ao ribosso1no (rbs), que inclui o códo11 de iniciação da tradução
(AUG ou CUG) e tutla seqliéncia complcn1entar ao t·ern1inal 3' do RNA ribos-
sôn1ico t6s (seqüência Shine-Oalgarno, ou S.D). Co!lseqiientenle11tc, vetores
de expressão devent conter tinla seqüéncia rbs logo em seguida ao pro1il otor.
A seqüência S-D pode variar e n1 co1nprin\C1lto (3·9 bp) e precede o códon de
iniciação ent 3·12 bp. Essa d istância deve ser respeitada para se obter boa cíi·
ciência da lradt1ção. O processo da tradt1ção termina qt1ando for e11contrado
um códOI\ stop (UAA, UAG ou UCA) no lllRN1\.
No que di.z respeito ao processa n1ento p6s-trad11cio11nl, JS bactétias s...'lo
incapazes de realizar a maioria das modiíicaçõcs cJ racteristicas das proteínas
cuc.lrióticas. Tal é o c.'lso, por exenlplo, d(l insulina h11mana, qu e~ siiltc tizJda
na forma de um precursor, a pró·instilina, contendo, <l1én' das c.a deias A e B,
unla seqüência adicional de 35 an1inoáci.dos (a cadeia C), in\portante p<lra que
a nlolécula de insulina adquira a si1a confo rmação tridimensiona l final, mas
que deve ser removida antes que a insulina se torne biologicamente funcional.
A bactéria não é c.cipaz de rcn\over a cadeia C da pró-insulina, de modo que,
p;:ira obter a insi1lina humana a partir de bactéria, foi necessário clonar e ex·
pressar separadame1\te genes sinteticamente const-ruídos das cadeias A e B,
pt1rificá-las e só entào ligá·las 1\t1n\ passo;,, vitro'91• Assinl, quando se deseja
obter t1n1a proteína euca riótica que prccis.1 soírer esse tipo de modificações,
dcve·sc usar como hospedeira uma c~ l ula ei1cariót-ica como, por cxe1llplo u1l1a
levedura.
Em certos casos, con10 por exen,plo o da expressão da somatostatina e
interferon hun\a11os e n1 E. coli, a prote ína sofre degradação pelas pro teases
da célula J\ospedeira. Para con tornar esse problema, pode·sc realizar a cio·
nagem de forma a rcsultJr 1\uma pro teína de fusão com a lguma p roteína
natural da hospedeira, o que protege a proteína estrangeira da ação d;:is pro-
teases. Assin\, foi possível obte r somatosta tina produzida por E. coli, sob a
fornla de uma fusão com a íl·galactosidase bacteriana. P(lra libe rar a soma·
tosta tina biologicJnlente a tiva, a p roteína de fusão precisou ser clivada, o
que se conseguiu num passo subseqlic-nte, realiz;:ido in vitro, co11sis tindo de
tratamento con' brometo de cianogênio<='• . Entretanto, nem semp re é possível
realizar satisfatorianlente esse ti l timo passo: como o brometo de cia1\ogê1l io
cliva a cadeia pept,dica a cada resíduo de metioniJta, esta abordagen\ cxperi·
n1ental só func iona para peptídcos que não conte1\J\an\ metioninas inte rnas,
como é o caso da son1atostatina. Unla otitra maneira de atenuar o problema
da degrc'ldação protéica consiste em se utilizar co1no hospcd('iras li1lllage11s
mutantes, que apresentam um complemento reduzido de proteases intrare·
lulares. ·rambénl a localização celular da proteüla l1eteróloga pode influir na
sua estabilidade na célula hospedeira. Assim, no caso da pró-insulina de
rato expressada en\ é . coli, foi verificado que a meia-vida da proteína hcteró·
Ioga era de -2 n1inutos no citoplasma, mas de -20 ntinutos no pe riplasma da
bactéria hospedeirai1º'.
Quando se deseja obter a secrcçtlo da proteí1ta codificada pelo gene cio·
nado, é ainda necessário que ela seja sintetizada sob a fo rma de um pre<:ursor,
tendo no seu ter1niilal amino um peptfdeo·sinal. O pcptídecrsinal consiste de
unla curta seqüê1tcia de antillo-ácidos hidrofóbicos, q ué ~ responsávél pela
passagem da proteína atrav~ da n1en1bra11a celular. O peptídeo·sinal é natu •
ralmente renlovido por ação de tulla peptidase, à nledida em que a proteína
vai sendo secretada. Pode·se portanto anexar ao vetor de expressão a seqüên·
eia de DNA que codifica o peptíde<>·sinal de algu1na proteí1la 11ornlalmente
secretada p('la célula hospedeira, de ta l modo que a clo11agcn1 resulte numa
fus;.lo gl'oica, 11a quJ I deve ser observada a fase de leitura correta, para origi·
nar o precursor protéico contendo o peptídeo-sinal.
4.6 - Isolament o do gene clonado
Em última análise, o sucesso de um experimento de clonagem depende
da possibilidade de se distinguir e isolJ r o clone que conténl o gene de inte-
resse. Entretanto, essa tarefa é muitas " ezes comparável a se achar uma agu-
lha no palheiro. Considerando que o tamanho do genoma de uma c~lul a de
mamífero~ de aproximadanlente 10~ bp, unl genc(-5.000 bp) representa ape-
nets 0,0005% do ONA total. Mesmo 11m organismo tão s imples q ua1\to o E. coli
contém milhares de genes, de modo qite unla digestão por e nzima de réStrição
do DNA total irá p roduzir não apenas o fr:igmento portador do gene qtte nos
interessa, mas uma população de fragmentos contendo outros genes. Durante
a etapa da DN1\ ligase, todos CSSl..""S diferentes frag.me1ltos estarão s ujeitos a se
inserir separadamente numa das moléculas do vetor, e, conseqüe1\IC'mcnte, SC'·
r~ o produzidas diferc1ltes 1noléculas de DNA recombinante, e.ada uma con-
tendo um pedaço diferente do genoma do orga1l ismo. Após a transformação
da célula hospedeira conl essa coleção de p lasmídeos híbridos, será obtida
tamMm uma coleção dé c l o1\~ rí>Combintantes. Qua1\do essa coleção fo r repre-
sentativa do genoma inteiro do o rganismo, teremos en\ n\ãos unla bibliot'ec.l
gc1\ômica, como descrito acima. E: portanto necessário poder identificar no
meio dessa coleção aquele clone específico que nos intcrc-ssa. Diferentes estra-
tégias poden\ ser utilizadas para essa finalid(lde.

4.6.1 - Métodos genéticos


Consistem em se conseguir a complcmc1\ tação de a lguma ft1nção defici-
ente na célula hospedeira. Foi assim, por exemplo, q ue pôde ser isolado o
gene LEl/2 da levedura S. ctrev;sit1t', que codific.a a enzim(l isopropilmala-
to-desidrogenaseºº. Transformando-se uma linhagem 1l\utantc de E. coli, i1\ca -
paz de produzir essa enzinla, com tima biblioteca genômica da levedura, fo i
isolado o plas1n ídoo do clone bacteriano que mostrot1 ter recuperado a capaci-
dade de produzir a enzinla: este plasmídeo era portador do gene LEU2 da le-
vedura. Embora seja extremamente d ireto e eficiente, esse método exige que
ocorra a expressão do gene clonado e, a lém d isto, que a proteí1\a hetcrólog3 de-
sempenhe u.ma fu1,çâo detectável na céltila hospedeira. Um exemplo peculia r
de detecção direta do gene estra1\geiro foi o da clonagem do gene da luciferase
de vagalt1n\e em E. coli: (IS colônias reconibinantes puderam ser identificadas
porque se tornaram luminesc:enté'S no escuro!

4.6.2 - Métodos imunoquímicos


Q11ando a proteína estrangeira não te m uma funç.:lo aparente na célul(l
hos pedei ra,~ necessário emprégar um método de detecção imunoquímico. A
apJicaç-ão de 11n\ método inl unoquímico \'(li depender de se dispor do anticor-
po contra a proteína codificada pelo gene em questão e pressupõe, portanto,
que este gene esteja sendo expressado pela célula hospedeira. Assinl, quando
se prete nde utilizar essa metodologia, costuma-se partir de uma biblioteca de
cDNA construída em vetor de expressão. Enlbora exis ta 1n várias versões de
rastreamento inlu1lolõgico, a ntais poplilar ~ aquela que se realiza direta-
n\cntê co1n as colónias réc<>mbinantes, con10 esqt1entatizado na Fig. 4.9a. As
colô nias (ou p lacas de lise, no caso de se ter utiliz;:ido um lago como vetor)
são printeirantente t·ransferidas por "carinlbagcnt" da placa-mãe sobre um fil·
tro de 11itr<x:clulose. Esse procedimento tr,tnsfere unta a1nostra de cada colô-
nia, mantendo a ntesnta localizaç.Jo das colônias na placa e no fi ltro. O íiltro 6
então tratado p<tra lisar as células e expor as p roteínas de cada colônia, e, a se-
g uir, incubado c<)m unta solução contendo o anticorpo contra a pr<>teína dese-
j(lda. Após renlover-se o anticorpo não ligado, utiliza·se um 2. 0 anticorpo ou a
protl!ína A de Slapllyloct~ttui; t1urc11s, par(l localizar a posição do 1.0 anticorpo.
A proteína A liga-se especificantentc à imunoglobulina e, utilizando-se proteí-
1
na A 11tarcada conl :'1, a detecç!io da colônia que está expri1nindo a proteína
desejada se fa rá por auto-radiografia. Na altto-rad iografia, expõe-se unt filnte
sensí,•el a rctios X ao filtro$ para. então revelar-se o fi lme: se ho \aver radiativi·
dade c 111 algun1a colônia, aparecerá 11ma mancha preta no filme, na posição
correspondente à colônia. Tendo sido identificada a colôni(l$ volta-se à pia·
ca·nlãe de origem pJra recuperar as células vivas, que estarão 1l<l posiçàt> cor·
rêspondente.

4.6.3 - Métodos de hibridação de áódos nucléicos


Esses ntét<>dos irão ide1l tificar o próprio ONA clonado, 1\30 necessitando
portanto que a cél\Lla esteja exprilt\i1tdo o pr<>duto gênico correspondellte. Ta is
1\l étodos bascia1l\ ·~ na propriedade que moléculas de ácidos 11ucléicos en1 fi ta
simples (DNA ou RNA) apresc1\ta1t1, de se associarem atra,rés de pontes de hi·
dr-0gênio, formando moléculas de dupla fi ta híbridas, desde que haja unl grau
suJicic11tc de complên1entaridade entre a seqüência de bases das duas fitas sint-
pléS. Esse tipo de moléc\Lla híbrida pode ser fo rrnado entre d t1as fitas de DNA,
duas fi tas de RNA, ou entre tuna fit,t de R:NA e unla fita de DNA.
Essa propriedade pode ser utilizada pa ra a identificação de u1n dete rmi-
1\ado clone recombin(lnte, bastando para isto q ue se disponha de tinta souda
gtuêtica, consistindo do DNA 011 llNA conlplententar ao gene desejado. l'o·
de-se c11lpregar csse 1nétodo de detecção, diretan1cntc (iu silu), e n1 colô nias
bacterianas ou c11l placas de liSt? de bacteriófagos, con\o ilustrado na Fig. 4.9b.
Através de um procedintento análogo ao descrito acima, após o crescimento
das colô nias, estas são "carin\badas'' sobre unl fi ltro de nitroc{'lulose ou mem·
bra1\a de náilon. Esse fi ltro é inicialntcnte tratado para expor, desllatur:ir e fi·
xar o DN.r\ de cada colô ni(l e então incubado en1 presença da sonda genética
n1arc;;ida. J>ara 54:! obter a sonda marcada$ o inélodo clássico consiste na incor-
poraçJo de \U\l 1tuclcotídl.'() rádiativo (" P)1 de Lnodo qlu~ a detecção d(I hibri·
dação, no passo final, é fe ita através de auto -radiogralia. Hoje em dit1, está·se
da.rtdo prcferê11cia a o utros n1étodos de marcação, que não e11\10Jvern radi<1ti·
vidadc1 par.-. evitar riscos desnecessários ao pesquisado r e ao meio ambiente.
Foram portanto desenvolvidos métodos alternativos de marcaçJio, dentre os
quais se destacam aqueles que se baseiam na reação entre biotina e a\•idina,
esta última acoplada a um marcador de fluorescência. Uma vez ide1ltificado o
clone que contém o ONA desejado, volta-se à placa origillal da qual foi obtido
o /ilt·rocarimbado, para se recupera r as células vi,1as.

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(~et idenlif<;ldo por~r ptoô.luw:lo~pnxeínl<C<ld<~pelogcnc clon.\dO. b)~porrneio de
SOl'dl ~ o (lone f't<Qmbnan:e E detltk.kfo Por (()ll«r o ONo\ c~tar à sonda.

É possSvcl ter umn sondn gené tica d isponível nos scgtiintcscnsos:


a) Qunndo se isolou o RNA correspondente ao gene em questi\o, tRNA,
rRNA,, ou mRNA. Assim, por exe:mplo. o t.• gene eucariótico a ser isolado foi
o gene da globina de coelho, a partir do isolamento do seu mRNA •'11• O isola·
"'ento do nlRNA da g lobinn a partir de e ritróc-itos é cxlrcmanlente fncilitado,
tuna vez que os eritrócitos sl'\o células especializadas, que só produze1n globi·
na. Essa não é entretanto a situação que~ veri fi<a pi'lr.l a grande maioria das
proteínas. Como aJtematíva. pode-~ obter o mRNA atravk da sua capa<ida~
de de d irigir a síntese do produto do gene desejado nu1n sistema de tradução
iu vilro, nt;;1s esta abordagem já é mais sofisticada. Hoje enl dia, g raças aos de-
senvolvimentos oa área de síntese e seqüc1lcia1ne1\to de oligont1clcotídeos,
cu ltura e transíornlação genética de células de mamíferos, <llém da PCR, tor-
11ot1-se be m mais simples a tarefa de obter cONAs completos,. assim como a de
clonar cDN1\s a partir de mRNAs pouco abundant~ na célula de origem.
Um(I vez tendo em 1nàos o 1nRNA, este pode evidentemente ser utilizado
co1no sonda para identificar o clone gcnô1llico.
b) Qtlando se trata de u1n gene co1n alto grau de conser,1aç~o,. é possível
empregar t11tla soilda heteróloga, ou seja, o DNA de outro organismo. Assim,
por exemplo, o gene da actina de S. cerevisine foi isolado e1npregando-se como
so1tda t11tl cDNA de actina de Oictyosteli11111 discoide1111t''SJ.
e) Quando já se tiver algumas informações sobre a seqüência da proteín(I
codific-ada pelo ge1te de interesse, é possível sintetizar o oligonucleotídeo corres·
pondente,. representando urna pcquc1·u1 seqüência do gene, e este o1igont1cleotí-
dco será empregado como sonda. Assim, no caso do citocromo e da levedt1ra, já
Sé dispunha de dados de análise da seqüência da protelna, donde foi deduzida
uma seqüência de DNr\ de 44bp, que pOOe então ser utilizada conlo sonda para
o isolanlento do gene C)"Cl"''.
Qua1tdo se d ispõe de uma sonda genética, além da hibridação de colô-
nias descrita aci1na, pode-se realizar a l'libridação do tipo So11tlrer11. !\'esse
nlétodo hibrid(l·Se a sonda com o DNA extraído das células recombioa1ltes,
p re viartten te identificadas pela hibridação de colônias. Esse DNA é p rimei·
ran1ente digerido por uma ou 1nais c1lzi11tas de restrição, separa1n-se os írag·
1\\C1ttos rcstiltantes por elctroforese e m suporte de gel e desnatura m-se os
fragn1e11tos ;,, siJu, al\tes de tr<t itsferi-los para unt íiltro de nitrocelulose, que
será incubado com a so11da 1narcada. l'or 1ncio da auto-radiografia do filtro,
pode-se porta1lto identificar o fragn1ento de ONA que corresponde àquela
determinada sonda. 1\ ntes1tla téc11ica, com ligeiras ntodiíicações, pode ser
realizada utilizando RNA fi xado sobre o fil tro e, 11este caso, o procedimento
é de11ontillado de hibridação do lipo Northern. Po r meio do 1Vortl1er11, po-
de-se verificar se urn deter1ninado gc11e é tra1lscrito apeoas nun\a deter1nina-
da silt1ação ot1 tipo celtrlar. Para tanto, extra i-se o RNA total da célula, em
diícre1ttcs lll01t1c11tos do seu ciclo de \rid(I, ou ent d iferentes condições de
cu ltivo, o t1 de d ife re11tes tipos celulares, par,. a realização do Northern. Se
ocorrer l1ibridaçâo com o ONA do gene clonado, sabere1nos que estava haven·
do transcrição do gel\c: naquelas cClulas. Tambént as proteinas das células
tr(lnsformantes poden1 ser separadas por c letroforese, para serem em seguida
identificadas, a través de rcclção con'I o anticorpo especifico e, 1teste caso, a
,.n~l i se ~ dc1
lon1irlada de Westtru.
Uma Vl'Z isolado, o gene p<>dc ter a S Uil scqi.iê-ncia d e nuclcotídeos detc r-
ai.inada, ser submetido a a l tern~.i, dirigidas, qul' permitirão conlpreender as
ttl.1côes encre ncrutura e (un(lo. bem romo ser trart:Sferido p.lr.i diíerent('S
~etores, que irlo transformar outr.1s células hospedeiras.

No que se r1tfcre ao 5{"qiJ4•ucin1ne11to d1• 01\IA, destacanl·SC as contribu i-


(ÓCS de Fred Sanger. que desenvolveu diversas 1n etod ologir.s, dás quais a
m;iis utilizad;i é nquela que utili1.a, como p recursores para a síntese de ONi\ ,
2',3'-did<-"so:.:inuclcotídeos (ddNTPs). que inlcrroinpem a elonga(3o da cade-
w de DNA pela DNA·polimer.1-M? \f. O dideso)ilnucleotideo pode ser eficien-
temente incorporado na cadei.1 nascente. toda\·l,1, irá bloqueólr J progrcss.lo
dJ síntese da e.ideia, porque n.lo ten1 o grupo hiroxila na poSi(Jo 3' do açú·
c.1r. Como esse grupo hidroxila é 11ccc ssário p;i ra q tle o nuclcotídco seguinte
seja acrescentndo à cadeia, toda a v ez que un\ ddNTP for inoor porrido, ocor·
rerá a terminaç.\o da cadeia neste ponto. O pri11cipio do m~todo é s imples:
quando se C'olocam., num tubo de ensaio,. além do fragmento de ONA a ser
seqüenciado (em fita s imples), a DNA·polimcr,1~. um primcr m.lrcado radi·
Jti,•amentc, todO!t os q uatro dcS-Oxiribonucleotfdcos no r mai~ (dNTPs), e
mais apen11s un\ de les na for111n (t idcsoxi, por exc1nplo, a tin1ldil''Ut (d d"íTP),
toda a ,•cz r1n que hota\•er h\COrporação de tuna ddITI, na fita q ue a
ONA-polimt>rase está sinteti1ando.. ocorrer.'\ a par.1'da da síntese neste ponto.
Isso demonstra que,. precisamente naquele ponlo d.l fit<t·molde, existe uma
.. dcnosina. Na' erdade, utilii.am-se quatro tu~ em paralelo. c.1da um con·
tendo ape1\as um dos NTPs n.i forma di desc)~i. No passo seguinte, os frag-
mentos s intetizados em c<\da un1 dos qua tro tubos s.ào scparil<los de aco rdo
co11\ o seu ll'!mrtnho, por meio de cletroíoresc c 1n gel de po li.1crilnn1ida des-
naturante. Par.i a leitura da wqUência, expóe··" f um filme de r.iios X ao gel.
Na Fig. .i.10. estJ (.')quemariuido o procedimento. ~ importante ressaltar que
,, proporç.io ddr\TP:dNTP dele ser cuidados.1mente estabelecida, para per·
n1itir que a seqüência de DNA St!ja deter1ninada corretanlente. De (ato, se
houvcr cxccsso do ddi\ITP, só scrJi possível ler () início dil seqüência.
Hoje di)põcm -se de m~qui1\as auton\ati:rc'ldas. que permitem o se·
qüenciamenlo de g('nomas inltiros~ como ~ o tt1so do seqüentiamento to·
t.1 1 de todos os cromossomo~ d.i fe,•edura S. ttrecisiat>,. que JCab.i de ser
con1plet;ido em .lbril de 1996 por uma rede de labor.1tórios 01sso<iados. A
levcdurJ ~ portonto o p ri1n ei1·0 o rganis mo e ucnriótico a ter n s uo sc<1üência
genética inteiran\ente dctern1 inadn, mas está cn1 curso tan1bt'!n1 o J,rojeto Ge-
11oma Hun1ano, que se propõe 1.1 ~cqúcnciar todo~ os cromossomos huma1\0S.
Tc11do·se em 1nAos" seqüenci.1 do gene, pode-..e deduzir a seqü~ncia da pro-
teína que ele codi(i<"a. Na \'erdadc, é mais fác il obter a seqüL•n<ia da proteínil
por esse caminho do q ue pelo sequencian1ento do1 própria proteína,. que
pode leva r mc.•sc.•s ou a té ~nos.
5· 3'
A T TGCAAGGCGATTC I NNNNNN I
• ••• • •
1 PRIMER 1·
3' 5'
+ ONA polimcr.'lse

4dNTPs
+ ddTTp

ATTGCAAGGCGATTC I 1 fita-molde


ddT AAG ( 1
ddT CCGCTAAG J 1 rita.S·fllh3$
ddT TCCGCTAAG 1 1
CldTAACGT T CCGCTAAG 1 1
5'
3'
/
o4r ddC ddG ddA
o -
-
T
A
3'

-
- A
e
- G
- T Leitw a da seqüência
- T da fita sintetitada

--
e
e
- G
- e
- -
T
A
- A

o - G
1

Eletroforese + Auto-radiografia

Fig,vn. 4, 10 - Scq~o ~ 0."4A.pdo~Cftz~ode Saf'f!:l. O fragmento de ONA.q..ie: seqvcr sc-


<iver<..,,.. foc iniQQlmcnlc clonado nc.m pbsrrldeo de f!UI ~ P~a lf'llOaf a SÍI'\(~ lf'I V'llfO d<t nova fu pela,
ONA.poarncras.c. 6 ac:kion.'Kk> vm pnnror:r. ~(.)dõ na sua e.xtfetndade S', Cons6U'ldo de um.l <uru seqüblcia C(lt'no
pitf'tllet'IW ao ONA.do ~· EmQdl 1,6?'1do$ 4 bJbos. adoonam-\C and.l os 4 dNTPs l'IOrma:;$~~ U"l1
ddNTP{ddATP. ddTTP. ddCTPou ddGTP). tm ddNlP. 30 $Ct ~ l\l Í!l3 de DNAn.ucetit.e, llC.!i«eur.\a.
(~ioda 2.• í.u t1oeSte pot'(O. No PlSi<OSCgv.t'(C. ems 4 prepV;a~ s.k>Sl.bme'lid;:ts ~ ~ ~t'Cf does-
l'l.'1u1"21r'l~. para sep.var os ftagrnent0$ pelo seu ~ A il\.W·Qdqraf11; do gel mostcyj; ~ f~ ~
<ém·s.ntetludo\. D.a~ llCl.l no al.lt()(ad'°'lfama. dcdVl·se a ~ia(complcmcnlar)dt> ONAongin.)I.
O DNt\ isolado e seqü.en<'iado pode também ser mutag:ê 1l i J"~do in vilro,
de maneira muito precisa e deliberada, sc1ldo e11l seguida devolvido à célula
viva, 011de o efeito fenotípico de diferentes mutações poderá ~ r C'Stltdado. A
Engenha ria Gert~tica inaugurou uma nova era no cantpo da n1utagênese: en·
qu<tnto os agentes ntutagênicos naturais p rovoc.;im 1nutações nos ntais varia·
dos genes dentro da célu la, é agora possível prodt1:r::ir 11111tações sftio·dirigidas,
1an1bém chamadas de oligonucleotídeo·d irigidas. O proced inlento básico con·
sistc e1n sinlctiz.Jr um pcqtu~no oligonucleotídeo en1 fita simples. contendo a
mutação pontual desejada e colocá-lo ent presença do gene que se quer mut.'.'l·
genizar, clonado num vetor de fita simples. Num passo Si!guinte, o oligonu·
cleotídeo sen•irá de p rimer para a DN1-\•poli1nerasc, que irá sintetizar a 2.' fita
do vetor, inclt1si,1e o gene de interesse. Esse vetor de fita dupla, <'Ontendo
agora umá das fitas mulada 11um sftio específico, será introduzido na bacté·
ria hospedeira, onde será replicado, originando múltiplas cópias. A natureza
semiconserva tiva do processo de replicação do DNA fa rá com que SOo/o das
moléculas resultantes seja portadora da mutaçâo em antbas as fi tas. Há hoje
inúmeras variações desse proccdime11to básico, que não iremos descrever
aqui. É preciso entretanto ressaltar que a mutagênese sítio-dirigida tem u1n
enorme potencial, tanto para J pesquisa básica quanto para a aplicada. De
fato, através da análise de a lterações introduzidas na scqüénci;;1 de a minoáci-
dos da n\ol&:tila da proteína, pode-se ''ntapear" a molécula, descobrindo·se
quais são os resíduos que cortstituern o sítio <'ataliti<'O, os diferentes domh\ios
de ligação ao substrato, etc. Em Biotecnologia, como llá agora várias proteínas
importantes sendo prodtizidas por microrganisnlos recombinantes, podc·se
aplicar a n1utagênesc sitio·dirig.ida para obter uma proteína ntais ativa, n1ais
estável e que não aprésente efeitos coJaterais indesejados. ~o que Sé chama de
E11genliaria de Prote{ttas, um campo novo e a ltamente pron1issor, que se tomou
realidade graças à Engenha ria Genética.

4.7 - Transformação genética da célula viva: difere ntes


sistemas hospedeiros do DNA recombinante
As características ideais que um organismo deve apresentar para ser
utilizado como hospedeiro de genes clonados são: capacidade de crescer em
n1eios de cultura pouco dispendiosos, ter crescin1ento rápido, ser está,,el cm
cultura e 1\ão ser patogênico. Os hospedeiros 1nais tltilizados têm portanto
sido alguns microrganismos, bem caracterizados do p<>nto de vista genético1
tais con10 a bactéria E. coli e a levedura S. ctrevisiae.
1\té l\á pouco tcn1po, existia tambén1 a necessidade de se conhecer um
m~todo que pernlitisse a transformação genética de cada tipo de hospedeiro.
Assim, para possibilita r a e11trJda de ONA em E. coli, foran1 i11icialn1ente de-
s~nvolvidos protocolos en1pregando cloreto de cálcio e choque térmico. No
caso de S. cerevisiae, o primeiro procedintenl'o de transformação rcqtieria a
protoplastizaç.ão {obtida por meio de enzimas hidrolíticas da parede celular),
segtiida de regeneração dos protoplastos a pós o tratamento com o DNA. Esse
procedimento extrc1na 1nente laborioso pôde subseqüentenlente ser substitt1í-
do por tuna téc1\ica que e1npreg:a cloreto dé lítio para fragiliza r a paréde.
Entretanto, todos esSéS procedimentos mos trara 1n ser <i lt-anlcntc trau1ná ticos
para as cê-lulas, deixando pot1cos sobreviventes, da ordenl de 10·•.
Foi recentemente desenvolvida uma nova tcknica, chamada de clctrop().
raçti()~,.•• quC! pe rnlitc que se tra1lsíorme geneticanlente qualquer tipo de célula,
procariótica ou eucariótic<l, deixando cerca de 50% de sobreviventes. Para a
e letroporação, as c~ l ulas sâo colocadas 1\unla solução conte1ldo o DN1\ e sub-
metidas a lllll breve ptilso elétrico, que pr<>vcxa a abertura trans itória de orifí-
cios no envelope celtilar, por 01lde c1ltrarS o ON,\.

4.7.1 - Hospedeiros procarióticos


O organismo mais utilizado a té hoje continua sendo a b act~ ria E. cóli, em
virtt1dc da gra1lde qua1\ tidade de conhecinlento acumulado sobre os seus nle-
canismos genéticos e bioquhnicos. E1ltretanto, esse hospedeiro a presenta a l-
gunlas desvantagens, principa lmente quando se passa à produção em larga
e'S('ala de proteínas recOnlbinantes. Ocorre que C!SSa báctéria ~ normalmenté
encontrada 1\0 tra to intestinal l\1unano e é potenciahnente pa togê-nica . lvlcsnlo
linhagens não patogênicas produzem endotoxinas, que podém cont<lminar os
produtos, o que é particularmente problemático no caso de produtos fa rma-
cêuticos injetáveis como, por exenlplo, a insuli1la. Al~tn d isso, é'SSa bact~ria
1\ão secreta elicientenlente as proteínas pa ra o meio, mas retem-nas no espaço
pe riplnsnlático, o que em certos caS<>S não<: desejável.
8acill11s subtilis, un\a bactéria g ram positiva, tem também s ido utili:t..ada
conlo hospcdeir.l. Essa b.1ctéria não é patogênica, não produz endotoxinas e
é boa secretora, 1nas apresenta certos inconvenientéS para a clonagem. O
principal probleola consiste na i1lstabilidade estrutural e scgreg<icio1lal dos
plas1nídeos recombinantes, que não se mantêm após repiques s11cessivos e
sofrem inte1lsa r('('ombi1laç.\o. Conseqüentemente, o DNA estr<ingciro acaba
se dil11indo na popt.tlação.
Evidentemente, no caso de hospedeiros procarióticos, devem ser utiliza-
das linhagens nl11t3ntes, que não produzam en:i;inlas de restrição.

4.7.2 - Hospedeiros eucarióticos


O mais utilizado dos hospedeiros eucarióticos é a levedu ra$. cerec1isiae,
para a qua l se desenvolveram vários tipos de vetores plasmidiais especializa-
dos.Trata -se de unl organismo unicelular, não pa togé1lico, e que <ipresenta a
vJ ntagcm de ser cap;;1z de reali;:ar a nlaioria das 1nodificJçôes p6s·traduç5o
que as proteínas de mamiferos sofrenl nas células de- origem. Tais modifica-
ções incluem: ren\oção da inetioni1la do ternlinal anlii'lo d:i proteína, ácetila·
çiio do 1crn1inal an\i110, acilaç.'\o, fosfo rilaçâo e glicos ilação. Além d isso, a
!ie\'C'dtlra mostrou-st- capaz d(' realizar corre ta nlénte o "folding" das proteínas
de ma1n ífc ro, indispensável pa ra que estas adquir3m a s tra conformação tridi-
mensiona l correta e, portanto, a sua plena atividade biológic.l. Um dos excm-
plos mais nlarcantes talvez seja o da n\ont.-.gc1\' pela levcdul'<l de pa r1ículas do
,·irus da hepatite 13. A partir da clonagern do gL'"ne d(' um dos antígenos dc s u-
perfície desse vírus (HBsAg), a levOOura nâ<) apc1,as s intetiza este antígeno,
mas ainda monta t1n\a partícula lipoprotéic.l mu lti m~ric.l complex:a, muito se-
melh.;inte ao envelope virai, resolvendo o problen1a de apresentaç,ã o do antí-
geno, um dos principais proble1n"s das \•acinas dl! subunidades prod uzidas
por DNA reco1nbi1lante111' . Essas partículas (déStituídas de DNA do vírus) São
<1ltanlc1\tc i1l\U1\ogênicas e permitiran1 o desenvolvinlento da 1.' vacina recom-
binante a scr lil>crada pa ra uso ll unlano. Essas c3racterístic3s, (ISSociadas ao
fa to de q ue a lev('dura S. cert.-visin1: vem sendo explorada pelo hon1en1 hã n1a is
de 8.000 an(>S, pnr" p r<>duzir alimentos (piio$ cerveja e vinho), sem nunc-a ter
se nlosttndo patogênica, tem lev(ldO à escolha deste organisn\o par.,:t a expres 4

são de prodt1tos de \•ertebrados de alto valor agreg.1do, princip(llmente par(t


aplicação te rapê utica. Por outro lado, co1\sidcra1,do que S. cerevisine já é un\
organismo tradicionalmente empreg<ido e n\ processos biotect\Ológicos, o de·
senvolvime1lto da EngenJ\arifl Ge1\ética desta levedura ta1nbénl pt"rlll itiu q tu~
se realizassenl p(lssos de n1clhorame1\tO geoéti<'O dti própria <'élulti hospedei·
r(I. Assin1, por exemplo, íoran' obtidas lii\l\agens reconlbina ntes de S. cere\'iSi-
Je, C(lpa:t:es de degr.1dar a mido, por 1neio da clonagem de ge1tl'$ que codificanl
enlintas an1il0Jíticas em outros org.1nisnlos11 ~ 1• A principal di:.>sv.1ntagent que o
sistema apresenta se reíert" aos rcndi1tlentt)S, que sào s igniíi<',.tiva nlentc infe-
riores en1 relação ils bactérias. Ultimamentí!, outras le\'OOuras a l ~ 1n de S. cert-
tiisine estclo sc1\do en\pr('gndas conlo hospedeiras, jil que apresent(lnl n1elhores
rendimentos: as leveduras metilotróficas, con10 Picliin 1111storis e Picllia a11g11sta
(c>:·Hnnscuula poly111orplln) são as ntais t>en1 estt1dadas até o n\01\te1tto.
Também são utilizadas co1no l\ospcdeiras divé"rsas linhag('1\S de células
de m:irníferos enl cultur(I. O s iste1l'li\ de célulJs de ntarl\ífcros ttll\ sido muito
út-il para estudos de genética ht1ma1\a, câ1lcer, doenças iníecciosas e da pró-
pria fisiologin déSt.1s células. Conlo não se conhecent plasntideos para c-élul.1s
de mc1mífero, os vetores <-tispo11ivcis silo sentpre vírus. O vírus SV40, qt1e catf 4

sa tumores em prinlatas, fo i o primeiro a ser utilizado, porque o seu geno1na


consiste de ONA de dupla fita circular e a sua seqi:iência nuclcotídic.a fo i tinta
das primeir;;is a ser inteir.lll\ente conhecida. Foranl construídos vetores deri-
vados do S\ 140 que não induzenl câncer, q ue continua 1n a ser mt1ito t•tiliza·
dt)S. Por outro lado, tambén\ s.'\o tttilizados rétrovírus para a introdução de
genes em células de n1amífero, llllla vez que ('StCS \•írus acabám se integrando
1\0S crontossonlOS da célula hospedeira. Tantbém é d igno de 1nenção o vírus
vaccinia, unl gr.1ndc vírus de Di\JA de dupl(I fita, que vem sendo tttilizado
p;;i ra •' clo1tage1n de diversos genes virais para a produção de vacinas. Para cé-
lulas de nt.1n1f(cro, a lém da eletroporação, empregam se tambén\ os proced i
4 4

n1entos de fus.io de lip-ossomt)S e de microinjeção. O ON.4 p<>de ser


incorporado n lipoSSOlllOS - \'CSÍ<'ul:as lipídicas a rtificiais - que se fund em à
membrana celular é liberam o seu col'1te(1do "º <'itoplasnla. Por st1a vez, a 1ni-
croinjeç.oio de ON1\ pode ser agora l'<.'J lizada <'On\ um aparelho conlputadot i-
zado, que au1ne11ta em a proximad(ln1ente 10 vezes o nlímero de células que
podcn\ ser injetadas nt1m único experimento. A principal di:svantage1n das
c6lul<1s de n\anlifero é que o seu cultivo é caro, o que dificulta ntuito o esca·
lor1anle1l to, alén1 de se obtet níveis de expressão rela tivamê1l te baixos.
Ultimamente, o uso de céluJ.,s de inseto enl cultura vcnl ga1\l\ando 1nui·
ta importância. As linhagens celulares de in.scto são mais fáceis de cultivar e
foranl desenvolvidos vetc)res 1nuito cficie11tes a partir de u1n vírus de ONA, o
baculovfrus, que infecta especificamente células de inseto. Altos níveis de ex-
pressão de diversas protéÍl\aS heterólogas est~o sc11do obtidos nesse s istenla,
ut-iliz.ando-sc o pron1otot do gene di'I poliedrina do baculovirus, proteína que
é normahnente produzida en1 grandes quantidades pelas células infectadas.
Para a tra11sforn1ação genética de plantas, o vetor mais entpregado é t1n1
plasmídeo bacteria1lO, chamado Ti, 1'tatural da bactéria Agrobtlctt•riur11 tun1efnci·
e1ts, agente patogênico, que é responsável pelo aparecimento de um tunlOr na
plallta . Ourante o processo de transformação nlaligna da célula vegetal, tinla
parte do plasn\ídeo Ti, c-o1thecida como T-ONA, é tr,,nsferida da bactéria para
a planta por um processo ~mclha1\te ao da conjugaç3o bacteriana. Esse scg-
nlento do plasmideo, correspondente a cerca de lOOk do set1 genonla, penetra
no núcleo e iJltcgra--sc em nt(Lltiplas cópias no DNA cronlossônlico da célula
hospedeira. Conscqüenteme1\t(', ioserindo·S<' o gc1t(' cstra1\geiro 1\0 T·DNA.,
este gene acabará também integrado no genoma da planta.Foram obtidos
plasmideos Ti nlutantes, nos qi1ais as propriedades tunlorigênicas estão su-
prinlidas, que vem S('ndo lltilizados par.-i a EngcnJ\Jtia Ce11ética de plantas,
num sistema que inclui um outro plasmídco auxiliador. A principal limitação
desse sisten1a é a especificidade do plasmídeo Ti para as d icotiledôneas. Siste-
n1as alter11ativos, utilizando virus de plantas, tais conlo os gen1il1ivirus, vírus
de DNA que télll un\ largo csp-ectto de l1ospedeiros e o vírus do n\osaico dou•
rado do tomate também estão sendo desenvolvidos. Entretanto, esses ~is té·
n1as ainda não são nluito eficientes. Também para as plantas, o método de
1-ransformaçJo a través de c letropor.1ção ntostrou·sc muito útil, 1nas exige que
scjanl usados protoplastos. Para a tral\sfot1naçâo d ireta de células intactas,
desenvolveu-se um sistema de biobalística. Nesse procedin1ento, esíeras d in1i-
nt1tas de tungstê11io são recol>ert~1s com o ONA, para cnt seguida scren1 proje-
tadas para déntro da célula, a un\a velocidade de -430n\/s, por um revólvl!r
éSpi?cial. Essa técnica apresenta aiilda a vant.,gem de permitir a transformaç.ã o
dos cloro1, lastos dentro d(I célula veget(ll, embora isto ocorra con1 un1a efi-
ciência 100 vezes n1enor do que a transforntação do genon1a 11uclea r.

4 .8 - Questões de segurança e preservação ambiental


O descnvolvin1c11to da Engenharia Genética foi cxtre1namente frutífero
para a Biotecnologia e um grande nú_n1ero de organisinos teconlbiJl:·u1tcs ou
CEt>.1s (do inglês, Cenetic Engineercd Micr-0organisms) fo ratn criados para d i-
fe rentes íi.nalidades. Entretanto. a própria r.1pidez com que essa ciência se de-
senvolve gera u.nla constante preocupação, por parle dos pesquisadores e da
sociedade, com relilção aos risco,s inerenlt"S à manipulação genética e a uma
pôSSível contaminação do nleio an\bie1lte por tais CEMs.
De fato, cm illguns casos, foi verificado que os CEt>.,ls são C<;lpazes de in-
terferir em pop\ilações microbianas e seus procê'SS-Os fisiológicos ''º solo. O
principal ponto levantado sobre essa questão é o fato de muito pouco se co-
nhecer sobre o comportamento de-sses organismos íor;;i do laboratório e sobre
o tipo de interferências ambientais que poderia1n advir da recombinação ge-
nética ou nlesnlo de mutações que os CEfVfs viessem a sofrer em seguida à sua
liberação na natureza. Um proble1na adicional qtte se apresenta é a fa lta de
controle da nossa patte sobre a transferência de material genético de um orga-
nismo para outro, fenômeno corriqueiro, principalmente entre bactérias, atr.:i-
v~s de processos como conjugação, tr,1nsdtu;ão e traosfor1llaçtlo, que poderiam
ocorrer entre os CEMs <'os microrganismos naturais do meio ambiente.
Na verdad<', os próprios descobridores das novas nletodologias reco-
nhec<'ram desde logo os riscos potenciais que elas apresentavam, tendo to·
mado a iniciativa de organizar, já em 1975, a Corlíerên<'ia de Asilon\ar sobre
Moléculas de ONA l{ecombinante. que teve c<>mo principal objetivo discutir
as ma1lciras de se trabalhar com microrganismos genetican1ente nlanipulados
e buscar definições e estratégias par:i garantir a segurança dos p.::squisador('S
e da populaçâo1" 1• Definiram-se~ naquela ocasião, regras de cond tita bastante
rígidas pa ra que o trabalho cientifico (os.se realizado com o nlinimo de riscos
para o pesquis<;ldor, a popttlaçAo e o ecossiste1na. Barreiras biológicas e físicas
adequadas deveriam ser criadas para conter os novos microrganismos formados
a partir do ONA reconlbina1lte. f·eliz.mente, e.ss.:1 regulamentação íoi posterior·
n1ent·e nbrondada, para não tolher em demasia a liberdade dos pesquisadores, o
que poderia vir a obstruir o prog:resso cientifico.
A mctn pri1lcipal do desen,,oJvimento de sistemas biológicos de conten-
ç.ã o dos CEMs consiste na eliminação (ou, ao menos, em redução substancial)
de tilis populações nlicrobianas introduzidas nos ecossistemas, ti.ma vez q\1e sua
ft1nç.ão já tenha s ido completada. Otias diíerc1\t<'S abordagens se aprescntanl
para o estabelecime1lto desses siste1nas de coníi1lamento: a) um mecanis1no
passi\'O baseado na dcbilitaç3o da linhagem, tornando-a incapaz de sobrevi·
ver muito te1llpo íora das condições de laboratório. Assim. p<>r exemplo, foi
COl)Struída a linhagem mutante x1n6 de E. coli, que, para a constituição da
parede celular, necessita do ácido diaminopi1nélico, nlolécula raramente en 4

c;ontrada na nat\1reza 1:.•. Entretanto, css..1 estratégia apresenta a desv;.'lntagenl


de que essas linhagens pc-rdem inuito do seu vigor, mesnlo c1tl co1ldiçõcs óti·
mas de laboratório, e, evidentemente, não Sê prestam para desC'nvoJvcr algunl
tipo de tarêfa no meio ambiente, onde não serão c;apaz.es de conlpetir com a
flora natural; b) um nlecanismo ativo, pelo qual o tempo de vida da linhagem

-
seja controlado através da induçolo progr01mada de uma proteína letal: o de--
sempenho da linhagem é portanto nor·mal. até o momento em que ela comete
suicidio. Esse n1eC.lnismo de auto-destruiçAo pode, en\ principio, ser introdl1-
zido enl qualquer linhagem sadia, que pass..irit1 então a carregar o gene capt1t
de dcscncJdear a s ua própria morte1 ~ 11 •
Os genes as.sassi1'os~ que vcn' scnd(> utili ztidos ptlra o cstabcle<imcnto
de tais sistt•,,tns·suicidas, são principaln1cntc genes que interferem conl a ÍlllC·
gridade da tnc1nbr.lna celular, tais como os genes que codilican1 as proteínas
da família Cc(u1• Entretanto, foi vcri(icado que o DNA liberado pelas « ll1las
mortas pcr~i.stc no meio ambiente por períodos de tempo sufic:ientcs para a
sua ITansfer.:ncia p.lra outros mic:rorgani"mos. En1bora a transformaçJo gené-
tica rutitural entre bactérias da mesma c-spécte Mia conhecida h.i quase 70 õlnos,
s6 r~cn1cmcn1c foi comprovada a ocorrência de transformaçdo genélica no
ambiente entre diferentes espécies bac1erlan.1s' . Na ' 'erdade trata·se do mes·
mo fenônlcno, onde ocorre a entrada. na célul.l bacteriana,. de fragmentos de
ONA li,•re (cromossômico ou plasnlidi.11), que podenl se incorporar no cro-
1nossomo da célula, de maneira que a iníormaç3o gcrlética acaba sendo trA•lS•
1nitida às ger.,~õe-s s ubseqüentes. Fr.,gn\cntos de DNA livre-s 1\0 anlbientc silo
contint1n11,enl<! prodltzidos por lise cclulnr, forn1<lndo agregados de l)NA, que
se distribuenl en1 superfícies de 1nincr;iis e outros se-dimentos. conlo t;i1nbén1
en\ pnrtfculas ~u~pcnsa.s nos habit;its \lquosos. Esse DNA extr.lcelular pode
transfornl<l.r células compí'lê1ltes ou ser degradado ~la. atividade de DN1\ses
el{tra e intracelulares. sendo os produtos desta degradação então utilizados
como nu1rien1cs 1' . Em conseqüência de:..s.as descobertas.. ultimamente vem
sendo dado1 preferência a genes que codificam nucleases a construção de sis-
temas suicidas. No que se refere .i funç..\o suicida,. as nucleases apresentam
vantagens M>bre a.s proteínas da família Ccf. um.i vez que são c:apazes de d~
gradar dire1anlente o material genético. além de destruir a fonte de todo~ os
elementos celulares.
Evidentemente. o ponto critico parJ a conslrl1Ç~O de u1n siste1t1a suicida
reside 1111 rcguh1(Jo da expressão do gene assassino. Prinleiramentc. é inlpôr-
ta.nte que nJo ltaja "\1az.amento" da cxprcss!\o do gene, Oll seja, que só ocorra
cxpress"o após a indução. Em ~gundo lugar, é 1\é<C.Ss.ário conhecer as co11dl·
ções an1bic.•ntais às qt1a.is fica rá sujeito o CEM. par<l proceder-se à escolhtl do
promotor rcgul.ivel mais adequado. Entre diferentes altemali\1as. prOn\Otores
que s.ão induL1dos por carência nutric:ional vênl n1erecendo especial .,,tenç3o,
~que, fora do laboratório. esta W.lvez stja •condição mais: comumente en<c>n·
trada pelo mkrorganismo.

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ELEMENTOS
DE ENZIMOLOGIA
Bayardo B. Torres

5.1 - Introdução
Unla reação qufn'tica pode ser ar'tal isada quanto à sua ter,,todiná1rrica ou
quanto à s ua cinética. A Ternlodinântica est1.1da a viabilidade e a reversibili-
dade das reações, a pa rtir da análise do conteúdo energético dos ~tados inici-
a l e fina l de uma tra1lsíorntaçào - ''ºcaso das reJçõcs quimicas, o conteúdo
energético dos p rod utos e reagentl"S. Nada e'S<'larece, porém, sobre a velocida-
de com que a tr'1nsformação ocorre. Essa in formação é d<lda pela Cinética.
Uitla reação quí1n ica pode ser te rmodina micamente viável (isto~. se ocorrer, o
conteúdo energético dos produtos será ntenor do que o dos reagc1l tes) mas
não se efetivar em determinadas condições (0\1 sej(l, ter velocidade igual a
zcto ou n1uito ptóxima de zero). Nos parâmetros termodi1tâ1nicos, os organis·
mos não podcn1 interferir. Como setá visto ad iante, sua i1l tcrvenção i1tcidc ex-
clusivan1e1\te sobre o aspecto cinético, isto é, sobre a velocidade das reações.
Tomando o exemplo simples da conversão irreversível de uma s ubs tân-
cia A em 8 (A ~ 8), a velocidade da reação (V) será:
V = d(B) ou V =-d )A)
dt dt
A unidade de V é nloles por litro por segundo, se IBJ e (AJ representa-
rcnt as concentrações ntolarcs de 8 e de A.
A últinla equação mostra que a velocidade da reação dimi1lui à n1cd ida
qt1c a rcaç.'io prossegue e a concentração de A din1inui. 1\ velocidade é, por-
tanto, proporcional à concentração de A :
V=-d (A) =k (AI
dt
A const.tnte k é chamada co11stantt dt tvlocida4t da reaçJ.o, com unídndc
de s·•. Ess.1 é uma reaç.io de pri111~ira ordtrtt, j.1 que sua \'elocidade depende da
concentraç.\o do reagente com expoente 1.
A mriior parte das reações qu ínlicas procC'SSndas nos organis rnos sJ.o
n1ais co1nplcxas, por envolverem pelo menos três mol~c-u las di(ere1\tes e 1>or
serc1n, gcrahncntc, rcversíveis. S~o reações de segunda ordetu, represcn1ridns,
por exc1nplo, por
2A++B +C ou A+B++C+D
para as quais, pode-se demonstrar, as vclocid<tdes de reação serão, respccti\la-
mente
V e k(A(' e V • k(A((B(

Nesses C.lSOS, a \•elocidade da rcaç.l o é explicada pela teoria das coli-s&s.


Essa teorin cstnbelece que. para teagir. as moléculas presentes em uma solu-
ção dcvcnt colidir com orient(lçâo apropriada e que a colisão deve lcv6·1as a
adquirir unln quantidade mír1i1r1a dê C1lcrgla que lhes permita a ti1lgir unl esto·
do rc•.,tivo, cha m<'ldo ~stado de lransiçlfo. Par.l lcví.lr todils as 1nol&tllas de um
mol de urna s ubs tância até o estado de transiçAo, necessita-se de umn qua1l ti·
dade de e1\ergia dcíi1\ida conlo trrrrgia dr ntivaçdo. Essa energia é, portanto, a
barreira que separa os reagentes dos produtos. A decorrência direta desse mo-
delo é que a velocidade das reações pode ~r aumentada pelo menos de lrês
maneir.lS difererttes: (1) aumenlando o número de moléculas em soluçlo, ou
M?ja~ S\Ji\ concentraçAo, como pre,1isto ~la cquaç.lo da ' 'elocidade; (2) aumcn•
tando o ntímcro de choques entre us molé<ul;is; (3) diminuindo a barrciroi im·
posta pcl.-i energia de ativação.
Enl uma população de nloléculas, nenl todas têm o mesmo contctido
energ~ ti co Cn\ un\ dado instante. Algun1os tênl contc(ldo mltito peque no, ou·
tras nluito grande. e í.l 1naioria apresentn un\ co1, l'c údo médio, car.1cteristico
da tc1npcra tur.1 ''ª q ual a populaç3o se cncorttrí.l. Qua1,do se eleva a tempe ra·
tura de l1m s istema, as moléculas, 1\0 seu conjunto, adquirem um conteúdo
energético maior (Fig. 5.1 (a)), mas é respeitado o me-smo padrão de distribui·
c;ão de energia entre elas. Como em um ~istema qualquer. a ''elocidade da re•·
ção será dirct.11mente proporcional ao número de n\Oléculas com energia 1g~
ou maior do que a energia do estado de tr01ns1ç3o, o aumento da temperJtut•
de um sistema acarreta uma maior \lelocidi.1de da reação química (Fig. 5. 1 Cbli
Por Ot1tro lado, se a energia de ativac;lo necessária para a reação ocorrer for
menor, ffiC'!tlt\O nlantida a temperatura inicial, t1m número maior de ntoléculu
conterá cncrt;in nta ior do que a do cstJdo de transiç.õ o e estará, portanto. em
co1ldiçõcs de reagir (Fig. 5.1 (c)f; neste cnso, n velocidade d~ rcaç:'1o tnnl~ftl
~ r.\ a umentnda.
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firwa s . 1 ... E~c11dcrrCuçlode~~·~cOll'1C>O"reusd!U"ft~.abat-'a~ ..
º'"* dli W'OJil dt oaçloe •.na hiduacli ~ 1 poi.,~de trd!0*5 con eieJll ~
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~~ (a)~dt~cm~<SW~_,.a T 11J)~dt~t'l'l"IW..lel•'9f"111A
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T doo..e T (<)Dsll"o.M;lode ~dc\n\'*""'fll~ T. ~ICba~ ~no
.,.,,. • t"'1""I' de ltl'v)Çlo pN ~ dt U'l"I GMlllrWdor

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• •

Fl1ur.a S.2
- •

Cooroentdl óe fe&ÇàO

~VN cU rc~<J,kna<OM e sem c.11.d~, Sk>u~.a ~tg\l lrwe padrlO dl rt~


(tlG~).ou~adfcrt'f'IC.li«'ll~o(()l"ltoUóoene~o<kK~odos~~es.ea~~aw~(óG').
A rcdu(ào no ' 'alor da energia de ati\•a(ào pode se-r obtida pela presen·
(a de rfttnlisndores. compostos (apa1es de aumentar a velocidade da rcil,AO
se1n 1.1ltcra r a proporção entre reagentes e prc>dutos encontrada no final da
ren,:io e SC1l\ serem eíeti,ran1ente consumidos durante o pro(csso. l'ode1n,
porttlnto, rituar en1 quantidades nifniin:i:;. dilílS cntnfitiens, várias ordens de
gr.1ndcza n1enores do que a (01\ccntr<l(AO dos reagcnt~s. O catalisador p:irti-
cipr1 cíctlvanlente da reaçào, sofrendo 11lterações de sua estrutura quínlica
durante o processo; invariavelmente, poré1n, retorna à sua íor1lla original no
final da rea(3o.
O processo pelo qual os cat.1lis.1dorc' act'leram uma re.-i(;lo químlc.;a ron-
~iste fm criar um no,·o ..caminho"' de rca(Jo,. p-ilra o qual a Crtetgid de ati\'.l(JO
requerida é menor (Fig. 5.2). Um ell.emplo simples d~ n<>''º caminho~ mos-
trado na Fig. 5.3, atra,·és da hidróli!!oe de um l~ter catalisado por íons 1f ". A re-
aç,\o consiste no ataque do oxigênio (que tem carga residual ncga1lv8),
pertencente à molécula de águ;;i, ao c;irbo1\0 presente no êstcr (que tt'm c;trga
re:tidunl positiva, em v irtude de sun dupl:i liga(ão com o oxigênio). A energia
de ntivr1çAo requerida para á tingir o estado de transição é <llt.1. A presença dos
íons Jof' cria t1n1 ca1ninho <llternativo pnra n re;iç3o: o io11 H. liga·sc ao oxlgê·
nio presente no éster, aument,1ndo a c;irga positiva do carbono~ torna11do-o
111.lis :tusccptível ao ataque do oxigênio da ~guí.l. Para esse novo c.lminho a
energia necess,iria é menor e. port.lnto, cm uma mesma ternperatur.l, mais
moléculas poderão reagir e a ' 'elocidade da reação será aumentada pela pr~
s.enç.:. de H ". Seguindo modelo semelhointc, muitas reações químic.1.s poderlo
ser aceleradas por ions OH-. por fom de metais, etc.

o
li O-R1
R~ 1
H

F;,ura S.3 - Me<ancsmodl hidrólise ele um ts~C'f cdUI~ pot' H ' .A presença do iona":tf•11 d!J1n~kl<kcAr·
iªs cltv.c:;iis do ~ter, m 1ndo um çimnho óc rcaç.\O Q11t llC«t.iol'la cnetg<a ~ wvaç.\o menor do que o dõt f'elÇlo
n.\o C.ltillis.)(l.1
Praticamente todas as reações quln1icas que se processam nos organi::i-
mos são cat.1lisadas. Os C"1talisadore-s biológicos são proteinas chamadas euzi-
'"as. A catálise d<ls r~açõe-s biológic<ts é iinprcscindível pt\ri'l a con sent<l(~O e
reprodução dos seres vivos, uma ve7. que a maioria das reações químicas q ul'
ocorrem nos organismos têm, na ausênci" de catalisadores, velocidades mui-
to bai.x.<ts. É <'Ot\\um Ct\Cóntrarmos nas cé\ulas reações que, na ausência de
catalisadores, demoram várias horas, d ias ou anos para completarem-se ou
têm velocidades iguais a (':e ro, quando medidas em tempo fin ito. 1>or exem-
plo, a oxidação de gli~ose a C01 te''' velocidade ptati<'<tO\C1lte 1\ula: pode-se
conservar un\"1 soltu;ào de glicose em contato com o oxigênio do ar por mui-
to tempo, s.cm q ue sua concentração seja perceptivelmente alterada . Nas cé-
lulas, entretanto, graças ã presença de enzin1as, a reação con\pleta-se e n\
min\1 tos. O fato de n1uitos microrganisn1os multiplicaren\·Sí.' co1n vclocida·
desde divisão menores do q ue uma hora, só 6 possível pela catálise de suas
reaçôt!'S. Oé fato, as reações catalisadas por enzin1as têm velocidadt:s 11111ito
altas, entre 1 0~ a IOi: vezes m."liorcs que as reações 11âo C<ltalisadas e <l1gu•
mas ordens de gr<lndeza 1naiores que as rea\ões catalisadas por catalisado-
res inorgânicos.
1-\l61n disso, as enzimas apresentan1 sobre os catalisadores inorgânicos
outras vant"1gens. Conto será visto ao longo deste capítulo, gr<lÇ<lS à s ua estru•
tura complexa, podem apresentar un\ alto grau de especificidade, propriedade
ausente nos cat"11isadores inorgâ11icos e, portanto, sua prcse1\Ça pct1nite a sele·
çâtl das reaçôes que poderão ocorrer en1 um organismo, ainda que milhares
de conlposlos d iferentes cs teja1n presentes 1\0 i11tcrior das célul<ls. É tarnb~m
devido às propriedades estruturais d(IS proteínas q\u,_• a reg11laçilo da atividadi
e11::i111ática se processa, pcr1n itindo tun ajuste contínuo da vel<>cidadc da rea·
çiio catalisada às ('Ond ições cel\dares vigentes. Alén\ disso, as enzin\"1S são,
geralmente, si,,tetizadas nas próprias cê/11/as 011dc <ltua1n e sua conceotraçào Cê•
lular também está sob rígido ('Ontrole.
Res\11nindo, as en:.:in1as (l) din1in\len1 a energia de ativ.1ção, levando a
altas velocidades de reação, (2) são muito específicas, (3) são sintetizadas
pelas próprias cél\1las onde at\1an1, (4) têm concen lr(lçào cel\ilar variável,
de acordo co1n <'IS condiçt>es fisiol6gic.1s e (5) pode1n ter s ua atividade 1no·
dulada, permitindo um ajuste fin o do n1ctabol isnlo ao meio a n\bientc. O
conjunto desses aspectos favoráveis justifica o a lto investimento energético
necessário para a síntese de eozin1ns e possibil it<t a 1l1a11ute1tção da vida
c<>mo a conheceinos.

5.2 - Estrutura das enzimas


A melhor conlpreensão das características e p ropriedades das enzimas
depende do conhecin1ento de sua estrutura. As en7,imas são proteinas globu-
lares e, con10 tod.1s as protcinas, são heteropolímeros de vinte d iferentes
1$6 ...._..... ' 41

aminMcidos; algumas incluem cm s ua estrulura um componente


nâo·proléico, designado grJIJJO prostltito. São macromoléculas, com peso
n\olccular variando entre ccrc.l de 5.000 a até mais de 1.000.000 de dáltons.
Dálto11 é uma unidade de massa, equivalente a 1/ 12 da m;;tssa de ttm á tomo
de carbono 12. Com cxccç3o da prolina, os ami1\oácidos conlponcntes das
prolcfnas (fig. 5.4) apre-sentnn1 umn por~·''º ç()mun1: tun áton10 de carbono
ligado a un1a carboxila, n um grupo a1ni110 e a um á tomo de hidrogê1lio. O
quarto substituinte do carbono é un1a cadeia,. chamada grupo R, específica
par01 cada a 1ninoácido. As propriedades particulares de cada aminoácido s:io
d3das,. portanto,. pelo grupo R.

5.2. I - Estrutura primária


Na molécula protéica, os aminoácidos estJo ligados uns aos outros atra·
\'éS da Jiga~.lo pcptfdica (Fig. 5.5), est.lbclc-cida entre o grupo Cl~arboxila de
u.n \ aminoácido e o grupo cc.·a1ni1\o do aminoácido subseqüe11te, formAndo

,_
uma lo11ga cadeia.
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dOI ~dOl kdos aqucb q,IC ~ Wtl ~ ~ ""S:i11'4 ne5st pM ~ ~ l>M<:os.. os
~ lfm <M'lo' poRtMI 0$ •'l'llf'IOkdos tpOl.arel ~um O\JPO R.hó°'6b<o. Os alTW'IOkldol poQres sem
Ofti)~\~~ ,t'\'iUv.m~sercar~ elê(flt.I ekl1v.1. Nocat que ogvpo 1'.A.~dco loefos OIM'll•
nQkldos t\1~ ...olt.ldO pn ~ esql..ICfdi, cxpllOWldo lf~•IC ÓO ll$Õn'lcto t. Arrw'lo.\ódQ$ 0 ~$\o~~ f'Gt.
pt'Ot('tr\11~ df qualq'# 1oer '"-'O· A pr~ ~ um~ com uma eslf\ltur:t t!S~. cm que No existci: Bll.4X> ami·
no.~. .l np". umamoo.kldo.
t..t..n.•...,... IS7

No1e-sc que essa ligação é sempre ftit,\ com os grupos Q; grupos Ct\rbo-
:c:ila e grupos amino p resentes no radical R (como no glutamato. aspartato e li·
sina) jamais participam da ligaç-3o pcptídica. Portanto, uma cadei<i protéica
con,posta por, por exemplo, 150 aminojcidos, terá uma. cxtrenlidadc C•ll que o
grupo a -amino do primeiro an\ irloácido estará livre e outra em qttC a et·carbo-
xila do últiino <i mii,oácido ta mb~m estará livre . Por convenção, n cndcia de
a1ninoácidos é sc1nprc escrita inicinndo·se con1 o aminoácido que 1cn1 o grupo
a-nmino livre.
O que c.tracteriza cada enzima é o nútttero de aminoácidos componentes
de sua adeia e a ordem em que eles se: t-ncontram. ou seja. a sua Ntr11lura pri-
m6rio. Assim, apesar de constituídas por apenas 20 aminoácidos diferentes. as
possibilidades de estruturas di\'Cf'S.l.S p.11ra as proteínas são muito grandes.
Como se ver~ cm seguida. a estrutura primoir1a é responsâ\•el pelas estrutur.1s
de ordem superior que a proteína exibe em sua íorma celular, ou nat1w.

POLARES
(HidrOfilOI)

Po&at e• com c.rg• potltlva


(B*sioOS)
Po&eres COf'n C..<fl• n• t1• t lv1
C'-•l
l
Arglninl
(IVg)
coo·
Lhlno
(l)'$)

coo·
...coo·
Klt lidlN
( )
Aspa.IUto
{l'SP)
coo·
GMamato
(Ga>)
coo·
..,,.. 1
·C- H
1
0
tyf -C-H ..,,..-e-H 1 • 1
tyf -C-H
• 1
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1 1
~ '/"> CH,
1
~
~:; ~ !-} coo· coo·

?-NM2
°'•
1
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H H
3
NH,
Polartt tom e-1rg1

A1p119fln•
l""'l
Cb tt'ina
(Cys)
Glutamln.
C""l
......
(S.)
Treonlna
(Th<)
Tiro.ln•
.....
( )

coo· coo· coo· coo· coo· coo·


1 1 1
..,,.·.c-H ..,,.·.c-H ..,,.·.C · H K~"- C•H ..,,.·.c-H Hlf"-~· H
1 1 1 1
~ '/"> CH,
...
ô
H3C -OI
/e,°" 1

l
CH, OH OH
1
M1N O
,e~
M2N 0 OH
J
Con1~ da Fc. S.<t
Ligação poptídica

H O
1 11
l
Ha.N·-c-c-- N-C-c-o- + H20
H O
Ili
1
1 1
R H R
'
Figurt. s.s - ~ ~ ~ <» I.~ pcp'lidca. tt~ p.eio vaço n\!is klngo. êss.l re~ iamM
3COl'lte<e nas e~: o proc~so que lc-4 à M form.~ ~ MullO ~o. MYOo'.-erdo 100!. a tnaquf'la!'\l ce!Wrde
$inlC$C pr«éia. ~ irdJi óíetel'l'I~ q:>osdc RN-\. nl.lo$wmos. e~. O esqi.«na tt~t.\ llpton..U o t-tSul'.ado p..vci·
ai do ptOCC»O.

Note-se que a mo noto1tia da estrttl\tta p rotéica é apenas élpélrente. Adi-


vérsidadc dos radicais R e as l igações q uímicas que ocorrem entre eles (arão
con1 que cada tipo de proteína, com sua estrutura primária própria, apresente
uma conformação espacial que lhe é peculiar e lhe perntjte exercer sua f\tnção,
q ue é dependente da sua forma. De (:.to, a cadeia peptldica linear, conlo está
representada abaixo, não existe em so1uç,ào.
A cadeia pcptídic(l pode ser, porta1tto, representada assi1r1:
Ugações peptidic<'l.s

'
1 1 1 1
oH H H o HO
• 1 li 1 li 1 li 1 li
H,N-y- C N- C - C , - 'f-C N
1
• N•C-C· O ·
1 1
1 1
R, H R2 H Rl H H R,,

Am"'°""'°

5.2.2 - Estrutura secundária


Dois tipos diíerent·e s de organizaç.ã o r~gt11a r, chamadas e:struturas se·
ci1ndárias, são cn<:o1, tradas nas enzin1as. A cadeia peptfdica pode te r seg1nen·
tos organizados en\ a-hélice. Essa estrutura é formada e estabilizada por p<>n·
tes de hidrogênio estabelecidas entre o átomo de nitrogênio e o átomo de oxi·
gênio (Fig. 5.6).

Fipni 5.6 - PQnlC de hld~ ~ (Qm Q$ ~!ementai di lig.~ pcptíbc.a. A ponte de h.<lrogb'»o é U'nl li·
~ln!J!l.Ofl';K;lcm<ompar,}ÇJoàligaçâo<ovt~lemas.oomoexis~~gnnden(mcro,IM'lp.'IP!lll'Tl(lOtUr'l~Nl
twV:Ur'a p<Oté<a.

Cada ligação peptídica oferece os clententos para a forn1ação da ponte


dé hidrogênic>: um á to n10 de hidr<>g&nio covalente-n\cnte ligado ao nitrogê·
nio e o oxigênio, preso ao ca rbono por un1a d up la ligaçJo. Cada ponte de
hidrogênio é uma lig;u;ão fraca, mas o g rande núntero dessas interações con·
fere n1uita estabilidade à estrutura q ue mantêm. J-\ s ligações constituintes do
eixo da cadeia protéica não tênt ângulos de 180º, como o esqt1c1na a presenta ·
do acima s ugere. Os átontos dispõem-se espaci<llmente como perte nce11te-s a
unta J1élice, co1n 3,6 an\iitoácidos por volta, de tal form<l que a ligação por
po11te de hidrogênio é éstabclecida entre os á tootos constituintes de 11ma li·
gação peptídic:i qualquer e os á tontos da qu<1rta ligação peptidica s ubse·
qüente, que a volta da hélice a proxirnou da primeira (Fig. 5.7). As pontes de
hidrogênio d ispõen1-se paralelamenté ao eixo da h~lice e os grupos R proje·
tant·se pa ra o set• exterior.
O S('gundo tipo de ('Strulur<i S('Cu1tdária e1\rontrada na.s proteinas é chama·
dafollin fl-pregueadn (Fig. 5.8). Essa cstrt1tur:i é for1ltada por un1 arranjo paralelo
de dois ot1 mais segme11tos de cadeias peptídicas quase totalntente distendidas
e ta n1bén1 é n1(lntido por pontes de hidrogênio for1nadas pelos n1es nlos ele-
n1entos que constitue1n as pontes de hidrogênio da a -hélic('. Ne-sse c~1so, po-
rém, a ponte de hidrogênio une dois segmentos distintos da cadeia protéic.:l, e
s itua·se ent posição perpendicular ao eixo da cadeia polipcptfdica.
Deve-se 1totar que a ~tr utura scctLndá ria ten1 sempre um padrào rc-gu·
lar, já que é íornlad.1 por e le1nentos derivados de outra es tru tura absolul.:'1·
n1ente regular na cadeia protéica, a ligação pcptídica. As enzi1n as a presentam,
em sua conforma\àO espacial, as duas cstrutoras secundárias descritas. Parte
da cadeia está organizada ent a-hélices p(lrte em fo lha ~ ·pregueada e apare·
cent ainda regiões de conformação irregular, conect<1ndo os segmentos com
arranjo deíinide,'> (fig. 5.9).
160 a.m.tecllldt~

o
'' .."' '.'
"•
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''
.....
C'.l"",
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p , ••

'
____,'''

Fiaun S. 7 - Esquen1>l da <t·~~. ~lir.ldapor poncesdt hid~. dispo$1as ~nteà cadeia;


polipcpcld'ic.a,

coo ·r··
•-~ .,,."(_e-•

O = C/
" N-H ••• O = C/

"
"
N- H

/
"
C- R R- C

"
H-N / C =O

"
C • O ••• H- N/

/.
"
R- C C- R

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N - H ••• O -C /
......._
O=C N- H

" e-• """""'-.,


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~ ~
""'
,..,.,....
pregueada

A&w- s.t t1C'IAA dl '5onrN.. •dcM:w:btqT... ~ .,.,_.~. ~cm lol\I ~ (ftk.ld


JO X\a)e""°"'~~~

5.2.3 - Estrutura te<ciãria


1\ cstrttlttra terciária descrC\'C n coníornlaç3o tridime1lsional q ue a mo h
cttla proté ic" assume em solução. É sua coníorn\ação real, pois os níveis inít
rio rcs de orga1l ização tt!m a pe 1,as interesse d idá tico, não existindo protc íno
que contcnha1n apenas aquelas estruturas. A estr11tura terciária explica o de
bran1ento da cadeia peptldica com os cnrolan\entos. dobras é volta.s que
compõem e que a levam a uma íorma geral globular. As ligações química
que estabelecem e mantêm a C$1rutur.l terciária são fo rmadas sempre entr
os grupos R dos aminoácidos. Como es~ aminoácidos ,·ariam em número
~m posiç.\o paira cada enzima considerada, a organização espacial tõlmbér
varia para cada enzima. As forças qufmicas, porém, são comuns a toda!
Para entender o enovelamento da cadeia protéica, deve-se notar, em primei
ro lugar, que os g rupos R dos aminoác-idos podem ser divididos em dois t i
pos (Fig. S.4). Cerca de metade deles slo apoia res e, porta nto, h idrofóbicos
Os outros sAo polares. Entre estes, a lg uns npresentam carga el~trica líqu id.
(positivo o u negativa) e os resta1l tcs, c nlbora não tenham carga elé trica, sA•
polares por apresentar regiões do grupo R 1nais negativas (como o ox i g~ n it
da serina e da treonina e o enxofre da cistcína) e regiões mais positiva
(como o átomo de hidrogênio ligado àqueles átomos negativos). Como ;
~gu., é um sol\•ente polar, os grupos R apoiares tendem sempre a aproxi
mar•se: uns dos outros (de forma a excluir a água) e, no seu conjunto, situa
rem·se \10ltados para o interior d01 molécula, t'nquanto os grupos polare:
voltam·se para a superfície. Essa localiiaçJo diferencial dos grupos R, pro
voc~1da pelas int~rações ltidrofôbicas, cons titui uma (orça poderosa de dobra
n\cnto d!-' cadeia polipcptídica.
Outrns forças devem també 1n ser co1\Sidcradas. Grupos R rom c;irga (!)~
trico positivn (presentes en\ lisina e nrgininn) fazem ligações clclrostá ticat
162 ~-~''"*"'"

oom grupos R com carga negativa (aspart.ito e glutamato). Esse tipo de liga·
(lo, também eh.amada sol1no ou iõni<'1, é encontrada m.1is frequi"ntcmente
n;i $upcrfícic dJ molécula en.cimática, po r formar-se entre radicail!i hidrofi-
licos; pode, por~m. estar localizada no seu interior, porque g rupos con\ car-
gn e létrica s ituados em unl s egmento prcdominanlcn1cntc hidro(óblco da
cadeia polipeptfdica são sequestrados para a regilio l1\térna da n1olécula
pela interiorl,.1ç.30 da ...egilo apoiar. Outr.1 fo rça importante de dobramen-
to da a-hélice slo pontt'l dt lridrqgê1rio, forma das entre grupos R. Notc--se
que essas pontes, ao contr6rio das po11tcs de hidrogênio da estrutur.1 se-
cu11dária, nlio apresentam qun lquer p(ldrAo regular, pois a locali za(iló dos
grupos R cap•tcs de oferecer os elementos para a fornt.lç-ào da ponte de hi-
drogênio estlo distribuídos irregularmente ao longo da cadeift peptídica
segundo a estrutura primáriJ da enzima.
As interoçõcs referid'1S ,1Lé aqui corno responsáveis pela estru1ur,1 tridi·
nlc11sional das cnz.imas s;'io todas íorç;lS fracas. rvf;lS podc s er CJ\COntrada
t;lmbém uma lig.1çâo covalente fazendo parle das liga(ôes que mantêm a
estrutura terciária das proteínds: são as ponlN di$$111frto, ou pontes S.S. Essas
ligações slio formadas por oxldaçJ.o de dois g rupos ~St-1, c.;ida um dos quais
presente ll(l cadeia later;ll de u1n resíduo de cist~hla , o único amh1oácido a
nprcsentar -SI 1 no grupo R. Dcsig1ta-se fé'Sfduo de anlinodcido à fraç.\o da mo-
lécula de aminoácido efetivan1ente inserida na cadeia protéica. Ne1n toda a
molécula do aminoácido est.i presente, porq,1e .llguns átomos foram elimina·
dm na íorma(.10 da liga(:.'io peptídica.
É in1portl1nte ressaltnr que a forn10 espacial d a cnzin\a, responsável
pela sua fun çAo, é result11do indireto de s ua estrutura primária. Unln muta-
(Ao que levasse à troca d<-' un1 único a minoácido da longa cadeia polipeptí·
dica de uma cn1ima poderia aca rretar sua comple ta ini.lli\1aç.io, se o grupo
R do "'no''º .. aminoácido nJo puder l"Stabele<er uma lig.1ção d e hlrutura
terciá ria essencial par;;i a conformação correta da cnzin1a. De fato, ~ fácil
prever,. por cxantplo, as conseqliências par.la cstl'uturo terciária da s ubsti-
tuição de unl resíduo de glutan1ato (con1 grupo R negritivo) por un\ resíduo
de lisina (com grupo R positi\•o) ..<\Fig. S.10 ilusr-ra a:i. prine:ipais ligações
da e~ t rutura tcr(i.iria.

5.2.4 - Estrutura quatemâria


Os termos polipeptfdio e proteína n.\o são sinônimos. Pol11'f'plldio é a
c.1deia constitufda pelos amino~ci dos lig.idos por ligações peptidic.-s; tem..
portanto, u1nól ncepç-ão estrutur.ll. A p:tlavra proteí1111 está ass ociada o l11na
função. !i.1uitas e 1tz imas sã<, co11s titt1ídas por unla \ínicn cadeia pollpcptídi-
c11, organizada c~pacialn1en 1 e pelas íor(as químicas já dt'!S<ritas e, por te--
1 ~-- 163

rcm uma funç3o, são, é claro, consideradas proteínas. Outras e nzimas são
lormadas pol' duas ou mais cndc ias polipcptfd icas, iguais ou diícre11tcs,
que isolada11lc11tc não têm capacidade catalítica; nestes casos, o termo pro-
teína só pode ser aplicado ao conjunto funcional, e não às subunidades
(Fig. 5.11). Estrutura quate rn4ria é a organi7a(30 presente nas proteínas
compostas por mais d e uma cadeia polipeptídica e descre\re quantos e qua-
is monômeros co1npõem a mo1 ~cu loil e como estes monômeros cstdo associa-
dos. 1\s íor(as que 111antêm u1lidos os monôn1cros co1nporlC1ltcs de cnzin1as
co1n estrutura quaterná ria são as n1esmas que mantêm a estrutura te rc iária,
ou seja, interações hidrofóbicas, pontes de hidrogénio e ligações salinas,
íormadas entretanto, entre grupos R de aminoácidos pertencentes a cadci·
1

as polipeptidicas d iferentes. A exceção sJo as pontes dissulíelo,. ausentes


da estrutura quate rná ria.

H
1
H3C- c - . r (•)
l
1
CH0

(b)

<e>

l•>

(•)
164 ,__._.~

E~1M1n QWte~~ hemoglobln.l (um.i f)l'Ole<ru n5o·el'lllmitia). composu por q...,JVOC<\de"4


Fls ura s .11
~lí6eat.. ~ cluas a dws

5.3 - Ação catalítica das enzimas


A partir d.t estrutura prolé~• pode-se entender melhor as proprle-dades
catalfricas das enz.imas. O primeiro ponto a considerar é a grande diferen(A de
t~mõ\nho entre a enzima e seus substrJtOS. Um exemplo numérico: .i en1ima
urea~. que catalisa a reação de hidrólise da uréia, tem peso ntolC<"ulJr aproxi-
lll<ldO de 500.000 dá1tons, enquanto rt ur~ ia tem peso moleculJr de 60 e a água
de 18. O investimento energético pJr.1 a síntese de unta 1nolécula protctica tAo
grJndc justifica-se pela obtcnc;!'io de until estrutura inuito precis<i, con1 recn·
trAllcias de for11la apropriada e cor1t grupos quilnicos localizados ent posições
CX<ltJS parJ servir à catá líse. P.-r.1 que esta seja exercida~ os reagént<.•:, (aqui
chamados substratos) devem lig.1r-~ à mo l ~ula da enzima em uma rcgi3o es-
pecifica de sua superfície, chamad.:i sítio atitio. O sítio ati\'O é um01 c.1vid.1de
com ÍOT'ma definjda. aberta na SUJX!rfícic da molécula globul.tr da en1ima.
coru.tituída por grupos R de .lmi~cldos que podem estar distanciado" na es~
trutura prim;iria da proteína, m.as que os dobramentos da estrutur.t terciária
trou>.tram à proximidade uní, dos outros. ~essa forma definida do sítio ati\'O
que confere espttifiridade à catálise enzimática: para ser reconhecida romo
s ubs tr.110 uma molécula de\•e ter a for1na adequada para acomod01r·se ''ºsítio
ntivo e os grupos qujnticos capazes de estabelecer ligações con1 os grupos R
ali prc:,c111es (Fig.5.12).
A 8 e o

+ o +
o

Flaura S. 1:.Z - Esqutma de ut'l\'I tt'.lyiO do llpô A+ !)-) C + 0, QJt e~ tia varderb-6! de IA'I WIJ,PO <JJÍ'l'KO
do~10A p.v-.to<Ot'l'ÇOS1o 8 . Arcav'c> dopcndc d.1 c~So cn~ ~ molêaJlas de A~ B l\l pioso(J!()f.lYOf.i-,-d.
Com :i lig~çio dos $1Jb$!r.itos <lO $bo :tb'YO W~ ~ ~ t f~l-uda.

A rclaç.ào espacial entre substrato e en.zinla nào deve ser v istrt segundo
um n1odelo rígido de chave-fechadura. A aproxin1a~ão e a ligação do subs tra-
to à enzima a ltera o delicado balanço de forças responsá\•eis pela n1anutenção
da estrutura tridimensiona l da enzima, amoldando s ua forma à fo rma do
s ubstrato e fa zendo-a adquirir unta nova c:onformação, ideal pa ra a catálise.
Assim como a ('nzima, os s ubstratos têm s ua conf<>r1naçào tcnsio1\ada e distor·
cida, aproxi1nando·S(' da conformação do estado de transição. Além disso, o
substrato, corretao1cnte posicionado no sítio a tivo, está próxinlo de g rupos R
decisivos p:ira a catálise. Retomando o exemplo mostrado na Fig. 5.3, o grupo
positivo H . da catálise não-enz inlática poderia ser substituído por um radical
I~ positivo de um aminoácido do sítio ativo na catálise enzi1nática, passa1ldo,
portanto, a reação a independer dos choque:s casuai!t êll lrê as nlol&-ulas dos
reagentes. É esse conjunto de mecanismos q ue torní.'I í.'I catá lise C1lzinlâtica tão
eficiente.

5.4 - Inibição da atividade enzimática


A cat.ilise enzinlática pode ser impedida por compostos, que , q uando
presentes no meio, ligam-se direta mente à enzi1na, impedindo sua ação. Exis·
ten\ basicamente dois tipos de iuibidores: competitivos e não·co1npctitivos.
Os ;,,;bidores con1pelitivc>s são s ubs tfiucias que tênl fo rma estruti.1ral sufi-
cientemente ~melha nte à do s ubs trato pí.'lra podcrc1n ligar-se ao sitio ativo da
166 ~ °' ....,...,..

enzima. F011tam·lhes. mtTetanto. grupos químicos que pudessem le\lar a rea·


ção a cabo; o resultado da sua prescnç:a no meio de reação é o est.ibelec:imt'nto
de uma competiç.10 entre as molêc-ulas do inibidor competitivo e as do subs·
trato pela lig.lçào com o sítio ativo da enzima (Fig. 5.13). Naturalmente. o por·
centunl de inibição resultante dependerá de dois fa tores: (1) as co1lcentr<1çõcs
rclritivas (IC substrato e inibidor co1tl pcti tivo; (2) da afinidade dife rencial da
cnzi1r1a pelo subst-ra to e pelo inibidor. J>or suas características. a inibição com·
petitiva é bastante específiC.l.

coo·
1
C• O
1
CH 2
1
coo-

Succinato Malonato Glut.11110

Os inibidores nA.t>-con1pelifil"O$ tê-m me<.11nismo de ação complet.imente


di\•erso. Sua forma estrutural não guarda qu;.lquer semelhança com a do
substrato e a inibição é exercida pela sua Cclpacidade de ligar-se a grupos R C5"'
peciíicos. geralmente fora do sítio ati\•O. Essa ligaçjo, altera a estn1tura da en·
zi1na, inlpedindo a catálise. Por exemplo, íons de metais pesados. como l'bt• e
Hg:. lignn1-se fJc ilmente a grupos ·SH. Estes s.lo grt1pos freqüentes cm protef-
nas (prcsc1l tes nos gtupos R de cistcínn}. A açllo inibitó ria dos íons é, por Isto,
bas t;intc incspccífica. incid indo sobre um grande número de enzi111tls. o que
explica a toxidez destes íons metálicos, alvo aturil de sérias preocupações a1n-
bientalis1as.
Os inibidores competiti\'OS, pela surt C":tpt."Cificidade têm tido largo em·
prego terapéutico e constituem um instrumento potencialmente interessante
no controle dr \•ias metabólicas. A presenç.J de inibidores nJo-compelili\105
n<» organismo) é, gcralmertle. acidentttl.

S.S - Regulação da atividade enzimática


Os orgnnismos podenl regular a vclocid.lde de uma reação cata lisada
enzi1nnticnn1entc en1 dois níveis clifcrc1l tes. l'ri1nnria1ne1\te, a síntese dn cnz,i·
m,a é um processo controlado, respondendo às variações das condiç~ e
meio. Como a \1elocidade da reaç.10 C.Jtalisad.J é diretamente proporcional
ronccntra(~O da t>nzima. uma maior velocidade de sintese privilegia a v
metabólica da qual a enzima participa; o contr.irio também é vcrdadeir
Esse nf\rel de regulação está localizado no prOC\..~so de tranS<"riç~o do gc1
que codifica a enzinla e é objeto de e~tudo da Biologia A+folccular.
As C1lzinlas já sinte tizadas, poré1n , nl\o tê1n unla atividade cor1sta ntc; e
tão 5,1jc iti'IS n u 1n segt1ndo nível dl' rcg uln ç.~o. A 1nodulação de sua a tividnc
pode d:ir·sc a tra\rés de regulaçdo alostéricn ou 111odificnçho covalente.

5.5.1 - Regulação alostérica


Algl1ns compostos produzidos pelo metabolismo têm a propriedade e
ligarem·se, com alta especific:idade1 a uma região de determinadas eniima
designada sitio alosltric-0 diferente do sftio ativo. Como é possÍ\'el pre\•er, a 1
1

gaç.\o de um compos10 qualquer modifica a eslrutura terciária da cnzim


com dois resultados possí,reis: a no\ra conformaç!o pode auxiJiar a catálise o
prejudicá·Ja. No primeiro caso, o composto é dito efetuador nlostérico posllit'D
110 segundo. rjc--tundor nlosttrico 1tega1l110; a enzima q ue aprescnt.:i o sítio nlost•
rico, e portn1lto pode receber o (ou os) e fetuador alostérico (ou os cfctu:.idor<
alostéricos), é cllamada e11zin1n nlosldricn (Fig. 5. 14).

r
j>-
-
<•> (b)

r-auraS.14
- - - - - -- ---
E1q.Jef"'.ióeU'l"ll~~ New~. alieaçk)do~~,.oaow.
alo5tb'lco ..-. a tw\.Cln dt f'!"illtl\l. ~•~do tubwar.o aocemo at.w ~- porurco. a~

E~se recurso para a regulac;Jo da atividade enzimática é largamenl•


empregado pe1as células no controle de seu metabolismo. Pratica1nente to
das as \1 ias n'ctabólicas contam com u1na reação ca talisada por uma cnzinl:
a losté ric.1, sc1lsivel a a lgum dos produtos íinnis da via, que a tua co11lo cíclun
dor a lostórico 1lcgati''º· A ligação do cfclt1ndor a losté rico à c1lzin'a é rl'vcrsí
168 r~•- ·,
v('l e, por't.into, o porcentual de enzima que se encontra ligada ao efetuador
está n.1 deptndéncia da concentra('Jo dt..-ste. Quando o composto acumula -se
em virtude do alto funciona mento da via,, sua liga('Jo ã en:zima a lostérica
acarreta diminui('Jo da velocidade da rcaçào por ela catalisada e a via é desa·
celerada. Se, a seguir, o efetuador alost6rico é consumido por outra via, 1.1 dl·
minuiçào de s ua concentração provoc.i seu desligamento da enzinla, que volta
a funciont\r con1 velocidade "1\ornlal". O processo constit\1i um mCC1lnisnlo
perfeito de fc:ctlback, impedindo o aClÍnlulo de produtos desnecessários. O cfci·
to a lostéric:o é espi..--cífico para um par e fetuador ;ilostéric~nzima. Assiln. um
determinrtdo co1npos10 pode atuar como efetuador alostérico negativo sobre ai·
gumas l"nzimas e como efetuador alostérico positivo sobre outras. pe-rtt"ncentes
a vias met..lbólic.a.s diferentes. Quando a con«ntração celular do efetuador
alostérico aumenta,, algumas ,,ias s.\o inibidas mas. simultane.imentt", outr01s
vias s.lo e)timul41das, 1omando harmónico o funcionamento celular.

5.5.2 - Modificação covalente


r\lgu1nas enzimas são s ubmetidas n un\ processo de regulação que con·
s istc na ligaçilo covalente de un1 grupo químico à s ua estrutura. Um exc1nplo
frt:..' qiientc é o 1ransfcrência de unl grupo fosfato, provcnit:-nte do J\ TP (ou seja,
Adenosina Trifosfato, o principal ctunposto de alta energia presc1lte nos orgn·
rlismos) par~, <'I cnzima·al\'o (Fig. 5.15). Naturahtlente, a presença do grupo
fosf,,to acarreta a mudança da conformaçl'.\o espacial da enzima, outra \'C1.
rom duas co1\scqt.iências possiveis: para algusnas enzimas a no"'ª conforma-
ção é c•taliticamente inati,ra; para outrots, ~ entào forma-se um sitio ati\'O
funcional. A»im. quando ,·árias enzimas s.lo simultaneamente fosforiladas, o
metabolismo é drasticamente alterado,. 5endo acionadas ' 'ias que estavam ina·
tivas e inibidol.S \•ias até então funcionando.

o + ATP +

5.6 - Influência do meio sobre a atividade en:zimática


A estrutur.1 e a forma do s ítio ativo são u1na decorrência da estut\1ra
dimcns ionnl da enzima e podem ser afetadas por quaisquer agentes capa
de provocar nludnnças conformacionals n11 cstrul\1ra pro téica. Isso tornn a
\'idade enzimá tica dependente do meio ambiente, notadan1ente d o pH e tem·
peratura.

S.6.1 - pH
A maioria das erlzimas apresenta unl \1alor de pH para o qual a sua a ti·
\ridade é máxima - a velocidade da reação dimin\1i à med ida que o pH se
afasta desse ' 'a lor ótimo, que é característico para cada enzima mas, com fre-
qüência, está próximo do p H neutro. ;\ influência do pH sobre a catálise enzi-
mática só pode ser compreendida a partir da análise dos grupos dissociáveis
presentes nos g rLtpos R d os anlinoácidos. De fato, histidina, arginina, lisina,
g lutamato, asparta to, cistcína e tirosina (Fig. 5.4) têm grupos R que podem ser
considerados ácidos fracos de Brõnsted. Pela definição de Brõnsted, ácidos
são compostos capazes de d issociar-se, liberando H*. Ácidos fracos são aqlte-
les em que a dissociação não é completa, restanto em solltção também uma
porcentagem do ácido não dissociado; existe, portanto, um equilíbrio químico
que pode ser escrito:
HAf-+A + H"
Como a equação acima s ugere, as concentrações relativas de HA e de A
dependem do pH. Quando o valor do pH é baixo (alta concentração de pró·
tons), o equilíbrio rearranja-se pelo aumento da concentração de HA e diminui·
ção da concentração de A. Quando o valor do pH é alto (baixa concentração de
prótons), ocorre o inverso. Os grupos R dissociá,reis d os aminoácidos con1-
portam-sc de maneira análoga, como está exemplificado na Fig. 5.16. Portan-
to, cada g rupo apresenta-se ligad o ou não ao próton, dependendo do pH .

- CH,-coo· • H' (a)

H' (b)

Figura S.16 - Ors:sooaçk>dosgn.ipos A.de aspartato(a)e de lrSina (b).

A forma dos aminoácidos representada 1la Fig. 5.4 são as predominantes


em pH = 7. Nesse valor de pH, alguns grupos R (como o grupo -coo· prcsen·
te 110 g lutanlato e no aspartato) encontram-se dissociados e com carga elétrica.
Outros (como o gru po - NH; da lisina) encontram-se associados ao próton
mas também têm carga elétrica nesta sitl1ac;ão. Uma e11zima que se encontras-
se em solução de pH igual a 7 apresentaria, portanto, os gr\1pos R de seus
aminoácidos ila s it\1ac;ão descrita e, portanto, aptos a formar ligações eletros-
táticas importantes na estrt1t ura.terciária da molécula. Se o ' 'alor de pH da so-
ll1ção for dinlinuído, alg-l uls grl1pos do tipo -coo·
captam prótons, atendendo
ao a umento de sua concentração e à necessidade de reajustar o equilíbrio da
dissociação. Convertem-se, assim, em - COOH, perdendo a carga e lé trica. A
ligação e letrostática da qua l e\•entualmente participavan\ (-coo-- - N H ; )
deixa de existir e a estrutura espacia l da enzima é a lte rada. A1\alogamente,
se o valor de pH for ele\ra do, g rt1pos do tipo - N HJ·serão dissociados, con-
vertendo-se a - N H:, perdendo tanlbém a ca rga e lé trica; a ligação eletrostáti-
ca da qual participa,•am será igua lnlcnte desfeita. Além de contribuírem
para a manutenção da estru tura te rciária da enzinla, algun s desses grupos po -
dem faze r p'1rte do sítio a tivo e para exercerem SClt papel deverão apresenta r
carga elétrica.
Em res11mo, a inílut!ncia do pH sobre a catálise enzimática é exercida
sobre os g rupos dissociáveis de vários aminoácidos. Alg1tns desses gr11pos
pode1n fazer parte do sítio a tivo ou serem importantes na manutenção da es-
tru tura espacial da molécula. 1\ cada ,,a tor de pH, a lg11ns desses gru pos
apresentam-se p ro to1lados 011 desprotonados. Existe uma concentração h,i-
drogeniônica que propicia um dete rminado a rranjo de grupos protonados e
desprotonados, que Jeva a nloléc11la de e nzima à conformação ideal para
exercer seu papel catalítico. Esse pH 6ti11to depertde, porta nto,. do número e
tipo de g rupos ionizáveis q ue uma e nzima apresenta,. ou seja, depende de
sua estru tura primá ria. Por ou tro lado,. q uando o su bstrato contém g rupos
ionizá,reis, as ''ariações de pH ta mbém poderão afetar sua ca rga. A eficiên-
cia da catálise dependerá, então, de encontrarem-se, enz ima e substrato, com
conformação e carga adequadas para permitir sua interação.

5.6.2 - Temperatura
A infl11ência da tentperatura sobre a cinética da reação e nzimática deve
ser entend ida en\ d11as fases distintas: em princípio, a u mentos de temperatu-
ra levam a aumentos de velocidade de reação, por a11me1ltar a c1\erg ia cinéti-
ca das moléculas conl p01\C1\tes do sistc1na, a u1nen tando a p robabilidade d e
choques efetivos entre elas. Esse efeito é observado em url\ intervalo de tem-
peratura compatível com a manutenção da estru tura espacial da crtz ima.
Tempera tu ras ma is altas levam à des11aturnçlf<J da enzima, ou seja, à perda de
sua estrutura nativa, catalítica, por a ltera rem as ligaçõe-s q uímicas que nlan-
têm sua estru t11ra trid imension'11. Rompidas as pon tes de h id rogênio, que
são ligações bastante ternlolábeis, dcserlcadeia-se uma cascata de alterações
estru turais, levando a enzima a 11nta nova coilformação 011"' um estado scnl
estr11tura definida; a enzima é d ita, então, desnaturada. A temperatu ra q ue
provoca desnatt1ração natu raln\ente varia pa ra cada enzirna mas, geralmen-
te, está pouco acima d<? sua ten1peratura ótima.

5.6.3 - Desnaturação
A desnaturaçiio p rotéica é entendida como a perda da estrutura que p ro-
piciá a ft1nçifo da prote;nn. H t1bitualn1e11re, os agentt..">S desnaturantes preser-
~ .. (. _ 171

' 'ªm apenas as ligaç~ cova.lentes da csLrulura protéiQ,, ou seja, as ligações


peptídicas (da estrutura primária) e as pontes dissulfeto (da estrutura lctciá·
ria). Não só temperaturas elevadas levam à desnaturaçAo. Outras v01rláveis do
meio que nfctam as ligrições químicas hJnl o mesmo efeito. Assim, vnlorts ex·
lren1os dr pH, provocando protonação ou desprotonaçlio de grupos. 0<.isionam
perda da ati,•idade da enzima. ~ dettrgtnlrs contêm porções hidrofóbicas em
$Ua$ moléc·ulds e sua presenç..1 em soluç.10 interfere fortemente nas interações
hidrofóbiC.lS entre os grl1pos R. importantes na manutençJo da f.'Slr'utur.1 pro-
téicá. Solve11tes 11polares, 1nudando a constante dielétrica do meio, alteram a
força das ligações eletros1áticas, provocando desnaturtlçào. Na nlalor porte
dos casos, a dcsnaturaç.\o é um processo irrevecsível.

5.7 - co..fatores e coenzimas


Muitas C1lzi1nas necessitam da as.sociaçt'lo conl outtos 1t,oléiculas ou ions
para exer«r seu papel cat.ilflico. Esses componentes da re.açào e1lzimátic.a sào
genericamente (l\amados «>-fatores. Os co-fatorH podem ser i<m.s 1ntt6liros ou
moléculas orgânicas, nJ.o protéicas, de complexidade v.1riada, que recebem o
nome de tOt',,Zi111as .
Os tons tne tálicos ligam·se a g rupos R de aminoácidos da e.ideia pro·
1éica ou estão presentes em grupos prostélicos. Cumprem papel decisivo na
c-.11álise, participando efe1i,•amente da reaçJo químic.J. Algumas enzimas
aceitam vários íons metálicos bivalentes como ativadores, como Ca1 •• ~lg:·
ou Mn1·, enquanto outrl'ls exigem um fon cspe-cifico parl'I a catál ise. Esse ion
pode ser de Fc, Cu, Ni, Co. Zn, Se ou de outros "'etais.
As coenzimas atuam como aceptores de átomos ou grupos fu1lcionais
retirados do substrato em uma dada tt.lçJo e como doadores destes mesmos
grupos ao participarem de \1ma outra re.1çJo e, por isto, ·diz·se que <15 coen2i·
n1as são transportadoras ele determinados grupos (Quadro 5.1). Durante a
catálise, cOC•lZima e substrato acham-se a lojndos no centro ativo da cniima.
consistindo 41 reação na remoçAo de det<"rminado g·rupo qutmico do s ubstratc
e sua transferência para a CO<'n2ima, ou vitt•\'etsa. Vê~. portanto; que asco-
enzimas n3o apenas sofrem modificações tm sua estrutura ao pllrticipar d(
uma reação cn~i m á tica, mas são necess:trias em quantidt1des es tequiom~trica!
c1n relação ao s ubs trato. Todavia, o fato de as coenzin1os estarem sendo cons·
tantementc r«icladas, oscilando entre 4tpenas duas fornlas, permite que suas
tonCentra(6es celulares possam ser bastante redui.idas; muito menores de
que as concentrações de substrato.
172 ~Ó<~

COENZJM1\ CRUPOTRANSPORTADO

1\dl'nosino\ t ri fosf<ito (ATP) fosfato

Bio tin.a co,


Coenzima 1-\
Flavina .-.dcnin" d in ucleotídeo (FAO} Hidro-g~n io
'--~~~~--"-~~~~~-

ictr.lidrofoli.ltO Carbono

Niootinamid,1 adcnina dinuclootídeo (NAO.)

Tiamin,1 pirofo:.;f:ih) (iPP) A ldcid<.>

Nem semp re~ i1ncdiata a diferença entre s ubs trato e cocn.zii:r1a. No en·
tanto, un\ crité rio dife rencial é o fato de o s ubs tr<lto sofrer novas a lterações
rias reações metabólicas subseqiientes, enquanto a coenzi1na, através de outra
reação, volta à sua forma original. i-\ rcaç-ão que n1odifica a coeni ima e a rea-
ção que restau1a stia forma original s.ão cata lisadas por enziolas diferentes e
específicas, que tê m e 1n coinun\ apenas o fato de utilizarem a mesma cocnz.i-
ma. AJ~m disso, 1\a nlaior parte das reações, a ligação da coenzima à enz ima
precede a ligação do s ubs tra to à e1lzinla .
Em algu1ls casos, a coenzin\a c11contra-se covalentemente ligada à molé-
cula enzimátic.a, co11stilt1indo, portanto, um grupo prostético da proteína; em
outros casos? a coe1'lzima é t1Dla 1nolécula ''livre", reunindo·se à enzima a pe--
nas ''º 1non1e1lto da catálise. Duas coenzi1tlas tra1,sportadoras de hidrogênio
podem servir como exe1nplo das d uas possibiUdiides: a fla vina adenina dinu-
cleotldio (FAD) aparece sempre como g rupo prostético de enzin1as, enquanto
a nicotinan1ida adenioa di1lucleotidio (NAD') é gcralntentc livre, podendo
a tuar co1no coeni in1a de d iversas t'JlZii11as (Figs. 5.17 e 5. lS).
A cs1-rt1tt1ra qtiímica das coenzimas é bastante variável. Alg\1mas coenzi·
mas, como o 1\ TP e o CTP (guanosi1la trifosfa to), são integralmente sintetizadas
pelas células. Outras apresentam e1n s ua 111olécula um conlponente orgânico
que não pode Sêr sii1tctiz.ado pelos animais superiores. Esse co1npo11c11te, ou
t1n1 precursor in1ediato, deve e1'ltão ser obtido atra\•és da d ieta, constituindo
uma v ito111i11a. As vita nlinas são, portanto, compostos orgânicos indispensáveis
;:io crescimento e f\1nções normais dos anin\Jis superiores e q11e, ao contrário dt-
carboidratos. protcí1\as e lipidios, são requeridos na dieta em peque11J.s quanü--
dades (microgramas ou 1niligranlas d iários), já que são prec11rsores de coe.nzi-
OlJ.S, cujas concentrações celulares são O\uito pcquc1las. Na rvticrobiologia as
vitan1inas incluem-se entre os co1tl postos qtle, generican1ente, são chamados
JatorN 1/u crtscinte,,tt.>, assinalJndo a nttcssidade de sua presença no meio de
cultu ra para o clcsc1\volvin1cnto do "'lcrorganl!'\ n10. A 11ecc.ssidade dcssés
eompost·o.s ,raria com a espé<ie. Esthrr;c~t;o coli, uma bacté-ria ronltlm no trato
intestinal humano. f capaz de multiplic11r·se em uma solu(Ao rontendo a~
nas uma fonte de cJrbono (glicose. por exemplo). uma fonte de nitrogênio
(Nl-1~·· por exemplo) e alguns sais miner.1is; é, portanto, capaz de s intctiiar IO·
dos os compostos necessários à sua manutenção e reprodução, inclusi\'e aque-
les que, pa.ra os animais superiores. constituem \'Ílaminas. Outras t"Spkies
bacterianas nect-ssitJnl vitaminas, amino.icidos, bases nitrogenó'lda:s, etc.

~~:Ú~b~o
'
0
O-f>-
HH H
0 -C ·C-C-
' ' C-CH2

"• ldHI
1
1 -
OH OH

o 0 NH2

0-P-0-C><~
H~N>
t...;-.N - I W
1-0-CH, 1
~
O
1 H
O H H
OH OH OH
NAO• FAO
FipraS. 17 - ~dtAias<OCl"IM\l.._.~~dil'ludtotido(NAD")e~adMnldt'lucleo­
tao(FA.()t e.d.~ f ~por U'l'\I bM ~ ..-N ~e lnl&!'CJO to.Wo..

Ai. vitaminas sJo clas1tican1ente divididas C'm l1idrossolúveis e liposso·


lú\•eis. S.\o hidr<>S.1tOlú\1ei.s: tiamin.a (\1i1.-.mjn.a 8 1) . r1bona,·ina (81), ác.-ido pan·
totênico (B.J, n icotinó'lnlida (BJ, piridoxina (8.), biotina (81 ), ácido fó li<o (8.),
cobala111ina (Ou) e ácido ascórbico (C). As v ita 1ni nos A, D, E e K são li posso·
lúveis. As vitaminas hidrossolú\'eis são as que têm !unção de coenzimrts ou
fazem parte de moléculas de coenzjmas. A participaçJo das \'it.iminas lipos-
solúvl'iS n<1s reações me tabóllc11~ é muito menos conhecida.


MAO• • SH, ~ HAOH • H• -+ S
FAO • $Kz - FAL>H, • S

9iN"2 •H'

A
NAOH
(..O.-)

g, H 0
CH31""".(N y v NH • 2H' + 2e ..- CH3"'f""Ynyc_~H
c"·~.....,.c-o º"'"""""'"'e-o
R R H
FAD
CoxkS&do}
F.,.,.... S. 18 - ~6n deo~~PQl"CN.llNSQUC tCmWJ>' o.i FK>corno<oenrimas:osubf-
nio ~(SHJf~. ~dt+ctododc~de~'IOe•QX'N.""*~-~~ oNAO·
l"Kebe~~~""~k.wiooo~~"°~·OFKJ~°'dols.,,,.d!hd~
(tio~~ aptNS n par!!"S mc.v» ~(õe'IZIT'l6. o~ d.l l'flClltcl.lcsd ~por ll

5.8 - Medida da atividade enzimática


As medidas de concentro1ção de soluções, expressas em unidades de
mnssD por 11nidadcs de volu1ne. de uso corrente 1\a Quí1nica, nf\o têm aplica-
ç.'\o para solu(Õ'"5 c.·nzimáticas. já que para estas o que inlporta llâo é a nlassa,
mas a ati,•idade. Uma soluç.\o de en2:ima~ desnaturadas conserva a massa
protéica mas a propriedade c.italítt.ca ('St,i perdida. Dnnaturaçõe$ pi'rciais po-
denl levar duas soluções de mesma concentração enzimática a ter atividade"$
nluito diferentí.'S.
Em virtude do exposto, a dosage1n de en2.i1nas é sempre fe ita atrav~s
da mt.-dida de sua otioidtldi!, que é avali.1dJ pêla \•elocidade da rc.-içJo que a
enzim.1 catalisa. o.,da a especificidade dns enzimas, essa med idri é possi\'CI,
mesn10 ll(l prcsc1\ça de outros proteínas. 1,nr(l efctu\\r essas dosogcns, un1a
amostr.l da soluçào co1\tt>ndo a enzin1a é incubado com concentrnçõe:S altas
de substratos (par.- garantir a \'elocidade m~xima t impedir que pequenas
variações na concentração do substrato possam afetar as medidas). A vt>loci·
dade da r eaçâo ~ nledida e expressa en1 Unidades Jntcrnacionais, Uma Ll1ti·
dadr luter11aciounl (U) é a quantidade de enzima cap.1z de formar lµnlol de
produto por minut·o t>m condições ótimas de medida (pH_. tempcr.itura etc.),
especificadas par,1 cada caso.
A medida da atividade enzimática é imprescindfvel para monilorar a
purificação de uma enzima. Quando se pretende purifkar uma enzima, ini-
cia-se o processo de isolamcnlo a p>'lrtir de um macerado de células, órgJo ou
tecido, o t'.rlrnlo ctlular. To1na1\do uma amostra d esse extrato, dcvc--sc deter-
minar a atividade da enzlmo d e intetessc (c1n U/ n\I.•• geralmente) e a quanti-
dade total de Unidades presente$ no \'Olumc tot31do4.'Xtrato. Pa ra adotar um
pari.m4.'tro qu<- permita a comparação tom outras prep.ar-""(ÕeS e com et01pas
posteriores do processo de p urifica('Jo, é necessário us.1r um referencial; are--
fc rt!ncia hí'lbitua lmente utillzada é a concl'ntraçl'io total d e proteínn presente
na preparn ~l\o. Define-se, ossinl, a alividndr l!Sptcifica, o u seja, o 1\lÍnlcró de
Unidadis de enz.ima por inilig.rama de proteína. Pr<>cessada a prinlcira etapa
em di~âo à purificação da enzima, são feitas OO\ras medidas de ati\•idade e
de concentra(.lo de proteSn:a, e calculada·' no\•a ati\•idadc l'Specífic.... Se t1 eta~
pa de p urifica(.lo foi bem s ucedida, a ati\'idnde espe<,fi ca encoiltr.lda deve
aumentar. Esse aumento significa, naturah11cnte, que o procedimento adotado
eliminou protehtas indescj4vcis. Novos processos de purificação s~o e fetua -
dos até que, no caso ide11I, a o11tividade espcdfica da preparação toma -~ máxi-
ma e constante, indicando que a enzima est~ pura.

S .9 - Classificação e nomenclatura
Pelas regras oficiais de classificaçAo e nomencla1ur.11, as enzimas sào di-
\lididas em ~is grupos, de acordo com o tipo de rea(ÃO que ca1alisam (Qua-
dro 5.2). Cada um d esses grupos é aind3 ~ubdividido em classes e subclasses.
11umeradas d e tal fo rn1a que cada enzintil possa ser identificada scnl an1bigüi·
dadc. Assim, por exen1plo, a cozima que Cillalisa a re 1110(ào de e l~ tron ~ do
etano) (port,.nto, uma oxidorredutase) é designada d/('O()/: NAD":oxidorrcd11ta~
e rttcl>e o ndmero de classificação EC 1.1.1.1. (EC, de Enzyme Comission).
Essa nomenclatura oficial é. na prática, muitas "'eies de-sobedecida, em favor
d e nomes mais simpJcs o u que se tornaram clássicos. Assim, por excn1plo, a
enzima cit<idri q t1e catalisa a oxidação do eta nol ~ COll\t1111c11te referida como
lflcool dtS;drogru11sc; a enz.i1na que cataJisa a síntese de gllcogé1lio (oficialn1ente
designada UDPglicos<:glirogboio 4-a·D·gli<o>1/tr11nsjtr11s.) é chamada glirogboio
si1rta.S<. Como se \'é nesses e>..emplos, na nomenclatur.1 usual, o nome é dado
indica1\do o s ubstrato, seguido de uma o utra palavra tcrn1inada em ase que
especifica o clpo d e rcaçJio que a cnzima catalisa. r..4esn10 essa formfi simplifi·
cada de 1tomenclatura apresC'nta cxct"(Õ<'S, ronto é o caso das enzinlaS digesti-
' '.as: pqsin•. tripsina etc, c-ujos nomes triviais tornar1im·se clássicos antes que
M regras sistemoiticas de classificação e nomenclatur.1 fossem estabelecidas.
Apesar disso, não é neccss.ário memorizar os nomes das en2in\as pois, com
um pouco de prótica, é possível pre\rer o non1e da en zin1n conhttC'ndo·se a r~·
ação que ela cala lisa, ou vice-versa.
CLASSE T IPO OE REAÇÃO

Oxidorr('duç.\o
- Oxidorrcdullll)(!$
A. + B '-+ A + e·
Tr.1nsferên<'i11 de grupos
A·X + B ... 1\ + B·X
Hidró lise
3 - Hldrola~
A·B + H~O ~ A·H + U· Ol-1

Adiçiio de gr,1po!i., duplas ligações o u


r('m()(iio d e grupos. d<'bcando dupla lig<1çJo
X y
1 1 f-+ A =8 + X-Y
A- H

Rearr.tnjos intramoletulari.'$
X Y Y X
1 1 +-+ 1 1
A-B A-8

Conden$nção de duõ\s mol~c-ul.-s, <lSS()('iada


à h idróliS<' de umi'I ligaç~o de alt.l
en erg i., (em gerill, do ATP)
A -+ 8 ... 1\ · 6

Leituras complementares
MARZZOCO, A.; TORRES, 8.B. 8 i0>quími<a 8 ~$i<.a .21 ~-d iç,\o Rio d <' )ilneiro, Guan.tb.a·
' "· 1999.
LEl•INli'\GER, A.L..: NELSOl\~. O.L.; COX. M .~i. Ptlnclpltt o( 8iochc mis try. Ne"' Yorl:,
1
\\o rth Publis h<'rs, 1995.
S'rRYF.R, L. Biochcmistry . 4 .' ed. NC\\' Yo rk,. \V, H . Fr~man and Compan)', 1995.
VOET. O.; VOET. J.G. 6 iochcrnist1y. 2 .' ed. New Yo rk, John \Vilcy & Son s, 1995.
1-IO RTON_. l'l.R.; MOR.AN l..A.; OCl-IS R.S.; RA\'ll\1 J.D.; SCR l ~tC EOU R K.C. J>rinci·
p lt:s of Bic.>che mistry. EngJ<'h·ood C li(fs, NJ, Neil P,1ttcrson Publishet$·Prcntice H:ill, 199.l.
ZUBAY, C .L.; P1\R$0N, \\1.\V.; V1\ NCE, O.e. rrin ciplC's of Bloch emJstry. Oubuque,
Wn\. C. 6 r()\\"n Cé.>rnmunicatiOn$-, lnc .. 1995.
GARRET, R.H.; GRISHA~l . C .?--1. Biochemlstry. Fo rt \\10 rth, Saun dc:rs College Publis·
h ing. 1995.
K11iER, P. BiC)chemi.Stry•>\ Found;ition . P.icilic Cro,·e. C.tlifornia, Brook$/Cole l)u·
bli$-h ing Comp.iny, 1996.
CAMINHOS
,
METABOLICOS
Otto Jesu Crocomo e Luiz Eduardo Gutierrez

6. 1 - Introdução
Tod:is as rcaçõ<>s quínlicas que acontecem no contexto d<'I célula e, por·
tanto, são reações bioquímicas, são import(lntes para o aparecin1ento e conti·
1,uaç~o da ' 'ida sobre a Terra; nlas J\á algun1as qtte historican1ente (lpresentanl
maior i1nportância. É o caso das reações da fermentaçiio d<! carboidratos, n\ais
especificamente de hexoses, qtie Gay Lussac em 1815 representou pela seguin·
te equação ger.ll:

C, H,,O, -+ 2CH,CM,OM +2C0 ,;<1F = -56.000Cal / mol (6.1)

Na realidade, a reação bioquímica representada por essa equação eng.lo·


ba uma $érie de reações intermediárias elucidadas, graças à descoberta pelos
irn1ãos Büchner nos finais do século passado cnl cél\llas de levedur.1, de enzi-
mas que seria1n r~ponsáveis pelo prOCC'SSO fcrnle1\tativo, C' aos exaustivos tra-
balhos de Parnas, Embde n, os Cori, l-Ori, tvleyerhoff, \-Varburg e muitos out-ros
pesquisadores, na primeira ntetade deste sé<ulo. A degradação de glicose nos
músculos dos aninlais e a ferment.lçào alcoólica e1n leveduras são sentelhantes,
o que facilitou a visualização das reações..A bioquín,ica comparada auxiliou
grandentente o avanço dos conhccintentos nessa área. Esses resultados foram
corroborados com o uso de ttknic.lS iso1<)picas enl levedura por KOStiLAND,
\.YESTH1~1r...1 i;~~11 fazendo com que se estabelecesse definitivamente a scqiiên-
cia de reações bioquímicas que recebe o no11le de glicólise, ou seja, a molécu-
la de hexose (representada pela glicose) é cindida (lisis) cm unl dctcl'ntinado
nlomento na série de reações. Inicialmente há forn1ação de açucar fosfori lado,
S('guindo-se seu desdobranlento att,'; trioseíosf,1to, o qual sofre oxidação pro-
duzindo íinahnente piruvato, produto final da glicólise.
178 ~~

6.2 - Processos de obtenção de energia

6.2.1 - Glicólise ou via de Embden-Pamas-Meyerhof


O can1ii1ho nletabólico d(l g1icólise envolve vá rias fases:
1." fase - Fosforilação do açúcar
No fina l do século passado os trabalhos de Cren1er apontaran1 pa r;;1 o
fa to de que extr.'.'ltos d(' levedura cor1te11do 10,.,, o u n1::iis de ::içucares fer1ne11·
tescíve is eran1 capazes de si11te1i:iar glicogênio. Observou-se pos1erioro1c1\ lé
que o g licogênio ér.l 1netabolizado eo1 levedura, a tr;.1vés de processos <le fos-
forilação e que <> produto era un1::i 111istura de glicose e frutose·6·fosfato. i\l.1os
íiniliS da décadil de 30, o grupo de Cori dén1onstrt)U que extratos de múscul<>S
d ialiiados desradavan1 glicogê11io a glicOSl'·l·fosfato (chamada éStér de Cre-
n1er-Cori), pela ação de uma fosfori lasc, que existe em células de levedura.
Observe-se que, e n1bora essa enzin1a seja detectada em leveduril, o g licogênio
11ão pode agir conto tínica fonte de carbono i11 vii)(> tnna ve?, que essas célll1as
Jlão produzen1 as a n1il(1ses nece.ss<Írias pa ra a sua degradação.
A glicose-1-fosfato é co11\'ertida cm glicose-6-fosfatt) (t1ster dé Robin·
son) pela énzin1a fosf<>glicon\utasc, que<: t 11c<uttrada em células de levedu-
ra. fons n1anganês, ntagnésio ou cobalto Sã<> exigid()S com<> fato res para a
ação dess(I enzin1a, que catalisa a transferência do g rupo fos fa to do C-1 para
o C-6 da n\olécul(I de glicose. Essa complexa reação foi el\1cidada pe lo grupo
de Leloir, na Argentin;;1, evidenciilndo a glicose·l,6-difosfato con10 coc11zi·
1lta. Util izando co1t1postos ntarc(ldos con1 ':P, os pesqu isadores obser\':.l rant
uola troca entre o g rupo fosfato m(lrcado na enzinta (fosfoglumu tasc) e gli·
cose- 1·fosfato, o que pern1itiu resolver n.110 son1e11te o n1odo de ta 1tsf('rênci,1
d<'> grupo fosfa to 1n.'.'IS tamb ~ 111 o envolvimento de glicose-1.6-clifosfato n.l
reação.
A enzinta age sob duas formas, uma fosforilada (fosfoenziina) e unta
não fosforilada (defosfoenzimã):
A) A fosfoenzin1a transfere o grupo fos fa to par(! a n1olé-ct1la de gli·
cosc-· l ·fosfato, produzindo-se g l icose~ l,6·difosfa10:

Glicose-1-fosfato + fosfoenzima H
glicose-1,6-difosfato + defosfoenzi nta (6.2)

B) A dt:fosfo('nzint<'I re<.'l ge con1glicose·1 ,6-difosfato:

G licose- t,6-difos fato + defosfoenzima H


glicose-6-fosfato + fosfocnzio1<.'I (6.3
Segue-se; então a isomeriiação de glic~-6-fosíato em fru tose-6-fosfato
(éster de Neuberg), catalisada pela enzima fosfohexoseisomerase (Fig. 6.t).

CH 20H

l __.OH
Hll1 o

"lº"_j
HC
1

Fn.itose--6-P
(éster de Neuberg)

A formação dessas duas fosfohexos.es pode dar-se tanlbém pela trans-


fcr~ncia de fosfato da moléc\da de adenosina trifosfato (ATP) para a nlolécu-
la de glicose ou de> (rutose, pela ação de hexoquinas.e, cm prcsc1lça de íons
magnésio:

Glicose+ ATP tt glicose-6-fosfato + ADP (6.4)

Frtltose + ATP t t fr,1tose-6-fosfato + ADP (6.S)

O equilíbrio da reação desloca-se no sentido da formação dos ésteres


fosforilados. entretanto experimentos com glicose-6-fosfato-11C e> glicose-11C
indicam que ela é reversível.
Hexoquina~ exige Mg:. porque um dos componentes (ATP) da reaç.ão
não está sob a forma de ATP' e sim 1\n do complexo MgATPJ· (Fig. 6.2).
Ribose

o o o

"'9l • Ad'9f'lin<i
' ''
o- /
/
' o-
i1
O- P-0- P-0 - Rlbose

lio lio

Fieun. 6.2 - ~ Mg..ATP

f'or outro lado, glicose-6-fosfato sofre isomerizaçâo p roduzindo fru-


tose-6-fosfato pela ação da e1lzinla fosfoglicomutase. Essa reação envolve a
nligração do oxig~nio carbonílico do C-1 para o C·2, exige também íons
magnésio e é prontamente reversf\•el.

Clicose·6-fosfato +.+ frutose-6-fosfato (6.6)


Uma vez formada, frtltosc-6-fosfato converte-se enl frutose·l,6-difosfato
(éster de Harde1l·Young), em presença de ATP e ío1ls magnésio, em unla rea-
ção catalizada pela enzima fosfofrutoquinase.

Frutose·6·fosfoto + ATP +-+ frutose-1,6-difosfoto + ADP (6.7)


2: fase - Desdobramento do açúcar fosfori lado
Graças à ação de frutose difosfato aldolase, ou si1nples1nente aldolase, a
frutose-1,6-difosfato é cindida e1n duas moltkulas de triosefosfato: fosfodii-
droxiacctona (PDHA) e gliceraldeído-3-fosfato (GA-3P). Tão logo são forma-
das, essas duas triosefosfatos entra1n em equilibrio entre si, enl presença de
fosfotrioseisomerase.

Frutose-1,6-difosfato ~
diidroxiacetona fosfato+ gliceraldeído-3-fosfato (6.8)
Ess..i reação é a. eis.ão da molécula original de hexose que foi fosforiJada
nos C· t e 6, e então cUvada para íormar as 2 moléc\llas de triosefosfato, as quais
na realidade são 1nohkulas de gliceraldeído·3-fosfato, uma vez que as reações
posteriores dependem de GA·3P e, portanto, esta moléctda é q\te será desassi·
milada, dando formação a ácido 3-fosfoglicérico.
3.~ fase - Oxidação de tr-iose-fosfalo

Needham estudou a oxidação dl? 3-fosfogliceraldeído em ~lu las de


1núS<ulos e Meyerhoff, e também Green, em músculos e células de levedura.
Trabalhos posteriores de Ncgelein e de Warburg de1nonstrara1n que a oxida·
ção processa-se em duas etapas: inicialmente a molécula de GA-3P dá forma·
ção a 3-fosfogliceril-fosfato (também deno1ninado ácido l,3·difosfoglicérico:
l,3·DPGr\} cm um<.'I reação catalisada pela enzima de-sidrogenase de gliceral·
deído-3-fosfato e qtie exige fosfato inórgânico e din\1cleótido de nicotinami-
da·adcnina oxidado (NAO).A oxidação da forma aldeídica é pre<:edida pela
sua fosforilação, com formação de um éster tiólico como internlediário. Glu·
tationa ftulciona co1no grupo prost~tico da desidrogenase de GA..JP, que é
uma enzima-SH. Desse modo, a oxidação de triosefosfato pode ser visua1i7,a·
da na Fig. 6.3.
3CH20P
1
2CHOH
1 o
GA·3P t C~ NAO
H
+
SH
1
eni
3CH20P 3CH 20P
1 1
3. Fosfogliceril. 2 CHOH Pi 2CHOH
tosfato 1?o ( 1 NAOH + Hº
1 e, 1C=O

.,,,
1
• O '- P
SH ..,
1
s1

Figun 6.l - ~de trioselosiato

Essa é uma das reações glicolíticas onde ocorre conservação de energia a


qual, posteriormente, aparecerá sob a forma de ATP. Observe-se que durante
a reação o grt1po aldeido de CA~3P sofre desidrogcnaçâo, produzindo t1m ani·
drido carboxílico com o ácido fosfórico (Pi ; fosfato inorgã1\ico). Esse anidri-
do é o 3-fosfogliceril-fosfato q\1e é um acil fosfato com a lta energia livre de hi
4

drólise padrão(6G' = -11,8 kcal/mol) localizada no C-1 de sua molécula. A li-


r

g•çAo fosfóric• do C-3 é de baixa energia li••re de hidrólise padrAo, cerca de


3,2 kcol/ mol.
A enzima gliceraldefdo (os(J to dcsidrogenase tem peso mole<:ular igual
a 140.000 e contém 4 subunidades idênticas, cada uma consistindo de u1na ca·
dcil.'I polipeptídica simples, com aproximadamente 330 rtsíd\1os de nmillO~Ci·
dos. A cnzinl<1 é inibida por iodoncctato, que se combina co1n os grupos -Sl-i
essenciais dn enzinta, inibindo-a. A descoberta dessa inibição 6 um dos 1nais
ín1portnntcs nlarcos 1\a história da clucidnç3o dos passos metabólicos conlpro·
metidos n:i g licólise e no proct."SS-0 fermentativo.
Na segunda etapa, a enzima (~fogliceroquinase, na presenc.t de fon.s
magnésio, Ctl.talisa a transferência do grupo acil(osfato rico de energia para o
AOP. recuperando a energia sob a forma de ATP. Ao mesmo lempo form;)-se
o ;\cido ~rosfoglicérico (3-PGA):

3·fosfoglicerilfosfato • AOP ++ácido 3·fos foglicérico + ATP


(6G' • -4, 50 kcal/mol) (6.9)
Essa reação mais a que ri precede, constituem un\ processo de acopla·
mcnto bioquímico de energia.
Nos estudos iniciais da glicólise. Embden observou que extratos de ml'.is,.
culo eram capazes de metabolisar 3· PGA, con\ formação de piruvato e fósforo
inorg~nico. Essas obsentaçõcs furam seguidas pelas de Lohman e de Meycrhoff,
que isolaram o ácido 2·fosfoenolpirúvico como intermediário nesra rcaç.lo.
A forma.('ão desse ácido fosforilado ocorre pela eliminaçJo de água e
d ..vío do grupo fosíórico da pos1ç3o C-3 para a posição C-2 na molécula de
3·PGA. Postulou·se, então, e comprovou-se, que em extratos de levtdura o
2· PGA era intt>rmediário na reaç.lo. A conversão de 3·PGA em 2·1'GA se dâ
graças à ação da enzima fosfog1i~romu tase, que requer o ácido
2,3-dífosfoslittrico (2,3-0PGA) como coenzima (Fig. 6.4).
CH 1oP CH 20P CH 20P CH 20 H

1 1 1 1
CHOH • CHOP CHOP
• CHOP
1 1 1
COOH COOH COOH COOH

).f'GA 2.3oOl'GA 2-PGA


.......... e..-"'"""""""... 3-l'GA .... l ·......

4.' fase - Formação de piruvato


A formação do p roduto fiJ1al da glicólise. piruvato, é prcccdidn pe la re·
n1~3o de uma n\olécula de água de 2~1>GA, cata lis:.da por enolasc, produzin·
do fosfoenolpiruvato (PEP) em presenç.i de fons magnésio, em uma re.i(3o
com gcra(.lo de composto fosfatado rico de energia:

2·fosfoglicerato ++ fosfocno lpiruvato + HtO


(6.10)
(óG' = +O, 44 kcals/ mol)
A C1\crgia livre de hidrólise pndrí1o de J>J!p é de cerca de ·14.8 kcal, en-
quanto que a de 2·PGA é de cerca de -4,2 kcnl. A perda da molécula de água
de 2-PGA dctcrntina uma rcdistribuiç~o de C1\ergia dentro da molécula, crian-
do uma molécula com alta energia livre, que é liberada quando o grupo fosfa-
to de PEP é posteriormente hidrolisado.
A enzim.;, enolase possui peso molK"Ular igual a 85.(X)() e exige k>n:. mag·
nésio, que formam um complexo com a en11ma antes da união com o substr;ito.
A enzima é inibida por íons fluoreto e fosf.lto; na realidade o ron Ouorfosf,lto
une-se ao magnésio, formando o verdadeiro agente inibidor. Entretanto, fons
manganês podem substituir os rons magnésio como co--fatores da cn1ima, e
nesse caso n.lo ocorre a inibição.
Finnln1c1tte, pe la ação de quinasc p irúvica, fosíoenolp iruvato transfere
seu grupo fosfa to rico de enegia par,, o A OP, com formação de enolpiruvato e
ATP, cm presença de íons magnésio e potássio:

Fosfoenolpitu\•ato + ADP +.+ enolpiruvato + ATP (6.11)

A forma enólica de piru,•ato sofre um re.irranjamento rápido e n3o enzi-


mático par..l produzir a forma cetônica (cetopiruvato), que predomina. em pi 1
7,0 (Fig. 6.5).

C"i · c-ooo· CH-C - COO"


'
1 li
OH o

O equilíbrio dessa reaç-.Jo desloc.t*Se par.a a direita e, por açAo de massa,


a reaçlo de quina.se pirúvica é direcionada para a fo rmação de cetopiruv.ltO,
dando umri reac;Ao global assim repre:,entada:

Fosfoenolpiruvato + ADP + H ' _. cctopiruvato + ATP


(6.12)
óG' • -7,5 kcol / mol
A reação processa-se em presença de fons pot~ssoo e magnésio ou manga·
nês. O cle\•ado valor da energia livre padrJo dessa reaçJo é devido, em parte,
ao f:ito da conversllo espontânea da forn1n cnólica do píruvato para a íorma cc-
tônica. Cerca de metade da energia livre padrão de hidrólise do fosfoenolpiru·
valo(·l4,8 kcal/mol) é rttuper•da romo ATP (·7,3 kc~l / mol), sendo o restante
(·7.S kcal/ mol) u11lizado para direcionar a ~ação para a direita, uma ' 'ez que
em condições fisiológicas est.-i rcaç-Jo é essencialmente irreversi,•cl.
A seqü~ 1lcia geral das reações bioquhnicas envolvidas no processo g1ico·
litiro, e apresentadas acima, está visuali7ada na Fig.. 6.6.

õ .,..,

.,_
t <D
Glucose • 6 · P

-~
ATP+-.._J @

COOH
1--ADP
lJlL• •._ .•.p C-O•P

CH2
PEP

®Mg'·
2.f'GA
2,3 · 0PGA

®
@
0A·3P
~NADli•H" ATP
NADl,3 - Df'GA ~
AOP
fiswa6,6 ~fec*.co &iMw I}~ l)fodotitc ti~l)~-1) ,.._
aD<e.S)~6)~"netW.7)~delr'Clidosúoo:8J~ 9)........,0'IV-
ta.W 1O) tr'ICl.l.W: 11) ~ pt\Mc:a

6.2.2 - Fermentação alcoólica


~ um processo anaeróbio para produç.10 de energia. que ororre rom dt-
gr\lduçJo de carboidratos e formação de Clanol e CO: como compostos prind
"'--•~•-.. 18S

pais e, como subprodutos glicerol, ~cidos pirúvico e s'1cxCn.ico e áJcoois supe--


riores. I! realizada por leveduras, principalmente do gênero Snccliarot,,yet$ e
b.lct,rias como a Zymorrwnas mobilis.
A seqüência dns reações é a 1nesmí.'I a presentada 1'1;\ Fig. 6.6 do processo
glícolltico até a (ormação do piruvato. A partir de piruvato as seguintes rea-
ções ocorrem:

A\.10 da descarboxilasc pinívic01

COOH
1
co e~ + CHO (6.13)
1 1
CH3 CH3
PiN\•ato Ac«taldoldo

A descarboxilase pirüvica exige p irofosfato de tian1ina (TPP) con\o


co-fator e a ati\•idade é prqudicada pela presença de sulfito, pois este des-
trói Tl,P. A e1lzima nâo é altame1\tc específica ntuando sobre outros cetoá-
cidos.

Ação d. desidrogm.u alroóüca

CHO CHzOll (6.14)


1 + NAOH + 11 - -• j + NAO
CH3 CH:J
Acebldeido Etanol

A enzima é irlibida por s ulfito, porque o acctalde(clo formri um co1npos·


to de adição com 0An1on HSO.~ .
EFEITO (>ASTEUR: em nleio a1\aeróbio ocorre decréscimo na p roduçAo
de etanol e reduçJo do consumo de açúc.ir. A eliplica(JO mais areila é dada
pela atividade da fosfofrt1toquina:,c, cnzin1a alost~rica da glicólise, que é ini-
bida por ATP e citralo (presentes em maior quantidade 110 meio aeróbio) e a li·
v.1da por AMP, ADP e fosfato inorg3nico.
EFEITO CRABTREE: para algumas Je,•eduras, a1tas concent rações
de açúcares inibem ri atividade de enzimas respiratórias e 01 formaçJo de
mitocôndrias, ocorrC'ndo portanto produção de e ta1lól, mesmo c1n meio
acróbio.
186 ~~

FORMAÇÃO OE GLICEROL: duwnte a fe rmentação alcoólíca cerca de


5% do açúcar consuntido pode ser convertido em glicerol a partir de um des-
vio da fosfod iidroxiaceto11a da glicólise:
CH20H CH20H CH20H
1 1 1
C=O + NAOH + H+ -4 CHOH CHOH + J>i
(6.15)
1 1 1
CH20P CH 20P CH 20H
Fosfodiidroxiacetona Glicerolfosfuto Glicerol
A form<'lçào de glicerol durante a fermentação alcoólica foi explicada por
NOR0$1.RO!\iro como conseqüência da produção de biomassa pelas leveduras,
pois é um processo oxidativo que exige NAD oxidado e também por 0URA(3)
segundo o qual a forn1ação do ácido succínico seria a prh1cipal causa da for-
1naçâo do glicerol.
FORMAÇÃO DE ÁLCOOJS SUPERIO RES: durante o processo de bios-
síntese de a lguns aminoácidos como valina, treonina,. leuciJ1a e isoleucina são
produzidos cetoácidos intermediários como des<:rito por W E66;(NCIU\t<IAM11>.
Ocorre descarboxilação e redução desses ácidos pela descarboxilase pirúvica e
dcsidrogcnasc alcoólica cont produç..,o dos álcoois como esquemati;::ado:
Leucina > alfacetoisocapróiro isoamflico
Valina alfacetoisovaJérico isobutíliro
Lsoleuc:ina aifaceto betanietilvalérico > amilico ativo
Troo11ina alfacetobutirico n~propíl ico

FORMAÇÃO OE ÁCIDO SUCCfN ICO: o ácido succínico é formado du-


rante a fe rmentação a lcoólica,. a través da fase oxidativa do ciclo de Krcbs:
Pin1vato - > 1\cetil..CoA

Oxaloacetato + Acetil-CoA - - - > Citrato


!
Isocitrato
!- > NADH
Alfacctoglt1tarato
!- > NAOH
Succíni.1-CoA
!
Succinato
Como e1n meio anaeróbio não há forma\âO de mitocôndrias ativas,. a
desidrogenase succín ic~ não apresenta atividade e porta11to acumu la-se
succina to .
~-~--.. 187

6.2.3 - Fermeotasão látia


As baclérias láticas homofermentativas como Ltttoboeillus t1tuloplrilus, L
l«tis, L dtlbruttk1i, Slrqtoroccus thtrmophilus e Ptdiococcus damn(ISus fermen·
tam glicose, frutosc, galactose, manose, Jaclose com produção de ácido lático
.11ravés dt'I sequ~ncia glicolíticn. Como o meio é t'lnncróbio, há necessidade de
regeneração de NAD pela desidrogcnase lática:
clícóli5'1
gJialoe ~ --+ - > pirúvi<o + NADH + H• LACTA10

No caso de galactose, as batlérias láticas fosforilam até galactose-6P, em


l'J.Cguida ~ iscnncrlzada até taga t0~·6 P, fosforilndn até tagatose-t,6-diP e cindi·
dl\ nas triost'S fosfodiidroxiacctonn e gliccraldc(do-3P.
No processo heterofernlcntalivo pode ocorrer, dependendo d;. espécie
envolvida, produ(ao de lacta to, etanol, gás CC'lrb6nico e acetato. A formação de
etanol pode ser ~uematizada pelas reações:
glicose - -:> gl~P --~> 6P-gluronalo nbul~Sr

rib~dose--5P ---<> xilulose-SP - - -:> acelll · PO~ + (;a.3p


~
3<tbl-CoA


-.Old...SO
~
ETAl\'OL
Alguns subprodutos da ícrmcnt-açâo lática, como acétttldcfdo, acetona,
acetoína e diõl«til 530 importantes para o aroma cm alimentos produzidos com
essas bactéri;1S. Acelaldeido origina-se do piruvato e dos ami.no.kidos aspátti·
ro. metionina e treonina; diacetil e acetoína são produzidos a p.art1r de cilrato.

6.2.4 - Fermentação acetona-butano!


A íerme1\ll.'l('t\o de açúc.'lr(.-S con\ produção de ácido butírico foi dcscober·
ta por PASTEUR em 1861 (GOTISCtlAl.K(-5)). De n1odo geral. aperu.s .-.naeróbios
obrigatórios como Closlridiu,,., s.\o capazes de formar ácido butfrlco como pro-
duto principal da (ermentaç.ão.
Algumas espécies de Closlrtdi11rn como Clos1r;dium aatob11tylieum, são
1

capazes de produ1-ir pequenas quantidades de butanol e acetona, como pode


ser visto nas passagens:
glicólbc
Glicose

A<etoacetil-O>A - -> ACETONA


! _ __,, OUTANOL
l}utiril·COA butiraldcfdo
6.2.5 - Formação de meWlO
Outro processo anaeróbio interessante é a formaç3o de metano pelas
b"1ctérías metanogênicas como as Mtlltauobacteriu111, Metlrauococc11s, Mtthauo-
snrcina e Mttlla11olob11s, que co1\SCgucm obter energia a partir dos substratos
hidrog~1lio molecular, gás cnrbónico, ácido fórnlico, "'etanol, rnctilan1ina e
ácido acético, dependendo da espécie.
A formação de CH 4 a partir de n1etanol e H: está acoplad3, cm Mt•lltnu~
urci1111 barkeri, com a íormaçJo de ATP pcln ATP sintase.
Exemplos de capacidade enc.-rgétic:a de algumas reações:

CH, -OH + H, ~ CH, + H,O &, = -26.9 kc•I (6.16)

CO, +4H, ~ CH, +2H 20 <1, •-32,4kcal (6.17)

4H-COOH ~ C~I, •3C0 2 +2H20 <IF •-34.Skcol (6.1 8)

6.2.6 - Mecanismo de Entner-Doudoroff


O processo glicolítico ot1 de E~1BDEN·PARNAS-MEYERliOF descrito a11te-
riormcnte é encontrado em C'Ol\SiderAvel número de organismos: microrganis·
mos, vegetais e animais. Porém, há microrganismos como Ps.tudo,,1onos
sacuthophil•, Alazligenes ~ulropln1s, Rl1i:ôbiu,,1 j.aponicum, X11nthomor111s ph11MO/i,
Thiohcillus f~rroo::ridans que apresent.i.m outro mecanismo para a degradação
de a(úcares, mecanismo conhecido como de EN11\"ER·00UOOROFF(EO). No
ciJso d01 Esclitricl1ia coli pode ocorrer a presença das duas vias em funçJo do
subslr<'lto: na presença de glicose ocorre glicólise e na presença de g.luconato a
via de Entner-Doudoroff. Esse mecanismo é encontrado em gr.1nde número
de bact~rias gramnegativ;is.
Como pode ser obser,1ado "'-' Fig. 6.7, a g licose-6P é desidrogcnada até
6P-gluconato, reação que envolve a p resença de NADP e água. Em seguida,
6P·gluconato ~ ron,•ertido em umn 1nolécula de g.liceraldeído-3P eº"'ª de pi-
ru\'ato, atra,•és da ação das enzimas dcsldratase e aldolase. Glict>raldcído-JP é
oxidado até piru\1ato pelas en:1..imas do processo glicolítico. Um ponto 1nteres-
unte f>41Ca destacar é a produç3o de ATP, enquanto na seqüencia glicolftica o
ttndimento l!quido é de 2 ATP/ molde glicose. na Entner-Ooudorofl é de ape-
nas t ATP/ moldeglucose.
Existem muitas enzimas con1t1n:i. aos dois processos, sendo que as ént:i·
1nas chaves do processo Entner-Ootadoroff sJo:
6P-glt1conato desidrata.se
2 • ccto • 3 ·deoxi -6P gluco1wto n.ldolnse
"*-·""""""°°'..... 189

Dois métodos podem ser utilizados pair,,i detectar qual processo a céluJa
está utilizando para a degradaç3o de açúcares:
Método 1: coletor as c~lula s crescidas c1n glicose; extrair as enzimas e
detectar as atividades. Se níveis ele,•ados de 6P·gluconato desidratase e
2-<eto-3-deoxi-6P·gluconato aldolase e bai>.os "'''eis de fosfofru toquinase fo.
rem encontrados, trata-se de um organismo realizando o processo EO.
Métod o 2: comparando-se o processo glicolítico (Fig. 6.6) com o pro·
cesso EO (Fig. 6.7) nota-se que o carbono corboxílico do ácido pirllvlco na
glicólise origina··s e dos carbonos 3 e 4 da glicose. enquanto no prOCí'SSo ED
origina-se dos carbonos 1 e 3 d1 glicose. Assim o método de radiorrespiro·
metria. utilizando glicose com os carbonos 1,.3 e 4 radioativos. pode ser uti·
lii;:ado para essa diferenciação.

CtlO COOH COOH


1 1 1
CHôH CHOH C-0
1 NAOP NAOPH 1 1
CHOH
1 • H,0
:> CHOH
1 • H,0
> c72
CHôH CHOH CHOH
1 1

.._
CHOH CHôH CHOH
1 1
CH,oP
1
CH20P CH,oP
GicoM.eP &P-o 2-cet<>-3-dtoxi•

~O'W'\lllO ... , t ' htase

Aç;ao,<'41 2~34toJHP~to ..-...:

COOH
1
""°1
e'/' COOH
1
CtlO
1
CHOH C=O + CHOH

- --
1 1 1
CHOH CH, CH,oP
1
CH,c>P
2-oeto-3-dtoid·
6Pi1lucon&10

6.2.7 - Procesro do ciclo das pentoses

l A maioria das células de microrganismos, "egetais e animais utilí1am o


ciclo das ~ntoses (Fig.6.8) para • produç~o de pentoses necessárias para a
formação dos nuclootídeos dos ácidos nucl~icos, ATP, coenzimas,. etc.,. além
da fornlação de NAOPH + H. para os processos biossintéticos.
Alguns microrg.-iniinos conto Tltiobacill11s '10vtll11s e Bruc.clln nbortus são de·
ficicntcs em en;;imas chaves dos p1·ocessos glicolíticos e EO, entrcta1lto crescem
e:m 1tleio de glicose. Essas bactérias utilizan1-se do ciclo das pentoses, desvia1l-
do gliccraldefdo-31' para oxidação até piruvato e posteriormente do ciclo de
Krebs para a produção de energia acoplado ao transporte de elétrons. Tantbém
llá a possibilidade de excreção de acetato, como ocorre na Cll1co11obncter, bacté-
ria acética que apresenta o ciclo de Krebs opera,ndo parcialmente.

Lactona-'W 6P·Gluc:6nieo
NAOPH:r ,,,,.___,J_
~./ ... C02

_____.
Xllulose..sP
Ribulose-SP
"'...
Ribose--SP

TPP transcetof.:lse

6 glooose-6P. NAOP _.. glooose-6P. 6 002 . 12 NAOPH

r.gura 6.8 - Cido dM pet'ltOSeS

6.2.8 - Processo aeróbio


Os orga11ismos, q\1e se utilizant do ciclo de Krcbs (ciclo do ácido cítrico
ou dos ácidos tricarboxUicos) para a prodttçâo de cocnziMas reduzidas para a
cadeia respiratória e de compostos precursores para as biosslnteses, são mais
eficientes ito processo de obter energia a partir da gJicose, podendo aiilda rea·
Jizar essa obtenção a partir da de-gradação de ácidos graxos e aminoácidos.
Para a operação do ciclo de Krcbs a partir de piruvato há necessidade da
reação inicial de ativ.lçâo com a formação de acetil-coenzi1tla A. O cornpJexo
~··~ ............ 191

en.Llrnátiro da piruvato oxidasc, que exige os co-(alores NAO, coe1lz.ima A,


piro!osfato de tiamina, ácido Jipóiro e magnésio, converte piruvato em ace-
111-CoA conforme a reaç-.1.o;

. Ácido lipóico
Piruvato + NAO + J-IS.CoA > Acetll·CoA + NADH + 1r (6.19)
Tl''I> Mg+2

Acetil-CoA pode ainda ser formado a partir da betaoxidaçAo dos ácidos


gr.lxOS e da oxidaçlo de aminoácidos.
Component<.-s do cic:lo de Kttbs c:omo alf3.ce1oglutarato e O\aJo.1cetato
s:io precursores para ;:i síntese de glutam;:ito e aspart.lto, rcspectlv~mcnte. Sue~
clnil..CoA é precursor par:i a síntese das p<>rliriníls.
As rcaçÕ<.'s do ciclo de Krcbs estão sumari1adns na Fig. 6.9.

FH
Ç-0 • ~· NAO
~J
= C.01• NADH,• ~
_ ....
Ctt3

Fisun 6.9 - Cdo de~

As coenzimas FADH: e NAOH + H . s:io reoxidadas no processo do


transporte de elétrons acoplado à !osíorilaç.\o oxidativa~ conforme esquema
aprtSCntado na l;ig. 6.10. De\·e-se chamar atenç~o JMrol a n('('essidade de algu·
mas vitaminas do complexo 8 p.irol a formaçJo das coenzima.s atuantes no
processo aeróbico de obtenção de energia: ninei na (N>-\0), tiaminJ (TPP), ribo-
flnvina (FAO}, ácido pantotênico (rocnzima A).
ATP
Rotenona - - - - - +
Fl•~•í~I

FADH; o i )
--+
"--...Coe<>2'ma a
FN> . , - /

Antimicitla A - - - - _...
/
Clloitoan.,Mm~oo b

!
C..Oouroc
ATP

i
QloaOl'llO ata.)

Cianeto - - - - - - - _ .,
~o - ------• ATP
o

Oesaoopladores: Arsenato, Oicumarol,


2,4 Olnitrofenol tiroxina
Ffsura 6.10 CldN~ trnpot'W'dtC!~~ ~~-a

6 2.8. 8oc:tênas ~
As bactl!rias acéticas do gênero Acetobacter são organismos e~trilamen­
tc acr6bios, que obtêm ATP a partir da oxidaçJo do etanol até ácido ac~tico:
CH3 CH3
I + Cocnzilna ox. - > 1 + Coenzima n."'CI. (6.20)
Cll20I 1 CllO
etanol ncct.11dcfdo

HiQ CH3
... Coertzi.ma ox. - > 1 + Coenzima n!d. (6.21)
COOH
kido acet.lld<ído

As coenzima.s reduzidas s3o transferidas para citocrome»o da C.ldeia


respirJtória, gerando força protonmotiva para a formação de 1\TP. O ácido
acético é excretado, podendo atingir concentrações elevadas no meio, por
exemplo, de 100 g/L em condições ideais de oxigenação.
Se etanol não está mais d isponível, o ciclo de Krebs passa a opcr\lr de
mod'> completo e o ácido acético pode ser oxidado at~ gás carbônico e ógua.
...... lt)

6.3 - Biossíntese
6.3.1 Carboidratos
Bactérias e leveduras em meio ausc1lte de carboidratos como ncct;ito1
glicerol1 hidrocJrbonetos e ácidos graxo~ :,Jo capazes de produzir carboidra-
tos, utilizando-se do Ciclo do glioxilnto pnrn íorn\açtio de S\1ccinato, e ntividndc
de gllcol\cogêncse com as enzimas rcvcrs rvcis da glicólise, conlo pode St'r ob-
servado nti~ Figs.6.11e6.12.

ACIOOSGAAXOS -
9"'
COSCoA
- · CoA

~--\
())c11oect1.aeo CH2 - CC>Oti
HO· ? · CC>Oti

/ e;..,.+
CH2 ·COOH

CH2 - COOH
1
CH·COOH
1

Gk»dlalo 1
CH,
1
COOH
~3 SYo:IMeo!
COSCoA •
Aeebl - CoA AÇUCARES

F11un 6 .11 Ceio do~

A trealo.!!oe, dissacarídeo não redutor constituído por duas unidades


de glicose unidas peJo carbono anomérico. é um carboidrato com iunçAo
de prote(lo conlra agentes estressantes e de reserva nas células \•eget.ili·
\'aS de le\·eduras e esporos de fungos.
A biossíntese da trealose é realiz.id,l ~las t!'nt.imas sintetase de lre.a-
lose-P e trealose·P (osfatase a partir de glicose, como esquematizado:
AçJo dn hcxoquinase e fosfoglucomuta.sc

glícosc + ATP..+glicose·6P (6.22)


194 ~ ..~

(6.23)
gli<Ooc·6P--+ glic:coe· IP
A(JO da pirofosforilase
(6.24)
glicose· IP+ UTP--+ UDP·glicose +PPi
A(âO da s intetase de tralose-P
(6.25)
UDP·glicose +glicose-6P--+ trealose-P+ UDP
Ação da trealOS<>-P fosfotase
(6.26)
Trealose-P --+ trealose +Pi

6.3.2 - Ácidos graxos


O sistema para síntese de ácidos graxos saturados a partir de acetil-CoA
está localizado no citossol. A acctil-CoA, enzima alostérica inibida por
11cil-CoA de cadeia longa, é o prhneiro pnsso para a síntese, produzindo ml.llo-
nil-CoA n pnrtir de acetil-CoA e cxigind o ATP e biotina, sendo ativado por ci-
tr:-tto e frutose-l,6~diP.
- 19S

Amil-CoA +C0 1 - t malonil-CoA (6.27)


O complexo enzimático da sintetase de licidos graxos realiza a conden·
sação do malonil e exige que o radical acil esteia ligado ao grupo sulfidrila da
proteína carregadora de grupos acil (ACP), de modo semelhante ao que ocor·
re col'n a coc1lzima A. Resumidamente, o processo pode ser esquematizado
co1n as seguintes passagens:
Acet11 -SACP + malonil-SACP - t aceto.1cctil-SACP (6.28)
(iniciador)
Aret-l-SACP+NAOPH+ H - - t O(·)·bcta·OH·buliril-SACP (6.29)

O(·)·beQ·oh· buliril-SACP- t crotonil-SACP (6.JO)

Croionil-SACP + NADPH + H ' - t buhril-SACP (6.JI)


Butiril-SACP retoma para a rcaç.\o (6.28) para mais uma incorpor.iç.lo
de malonil e o processo se repete até a formação de ácido mirístico (14 carbo-
nos) ou ácido pnlmítico (16 carbonos).

6.3.3 - Poli·OH-alcanoatos
São polímeros produz.idos principalmente por bactérias com a funçAo de
reserva de Cõ'rbono ou de energia. A produ(3o é estimulada em determinadas
condi(ÕeS. como por exemplo a defici~c-ia de nitrogênio, e pode alingir alé
~do mater-ial celular seco.
Bactérias do gfnero Alc.aligt11n s.Jo capazes de produ7ir po-
li·OH·.butir.lto a partir de glicose e sacar~. o género 8urkholdtr1d a partir
de glicose. frutose, sacarose e gliconato e RJrodococcus ru~r prodl1Z um copo-
límcro de poliidroxibutirato com 3·0H·v.llcrato, otediante a adiçlo de .icido
propiônico ao substrato constituído por glicose ou sacarose, segundo o se-
guinte csquénta:
Propionnto + liS.CoA --+ Pr<>pionil.SCoA + AMP + Ppi (6.32)

Entner-Doudoroff
Glicose - > --> --> --> Acetil-SCoA (6.33)

Propionol.SCoA + Acetil-SCoA - -> J.ttto,.aleril-SCoA (6.34)

v NADPH +- H•
0(-)-WH·\•aleril-SCoA

! Polimerase
l'QL.fMERO
Poli-OH butir:ito é um polí11lero do 0(-)-beta-OH butirato com peso mo-
lecular entre 60.000 e 250.000. É co1\siderado como resen1a de energia caracte·
rtstica de procariotos como: Alcnlige11i-s tutrcphus, Azot()bacter vi11eln11dii,
Bt1cill11s ,11tgateriut11, Pseudo"'º""s 11111ltivora11s. RJ1odospirill11111 rubr11111; Schaeroti-
lus 11ata11s. bacilos de modo ger:il e bactérias fototrópicas. Acumula-se nas cé·
lulas, como granulos cercados por membranas. e1n condições de d('ficiência
de nitrogênio. As reações de síntese estão apresentadas na seqüência:

+ NAOH
2 CHyCO-SCoA-> CHyCO-CH1 -C0-5CoA > CH3-CHOH-CH,-CO-SCoA
AcetiJ.·CoA Aceto.1cetil-CoA bctn-OH~buritil.CoA
i
POU-OH-BUTIRAlD

Referências bibliográficas
Citadas
(1) K0$1il,.ANI), 1).€.JR.; \VEST1 1El1'.tER, F.l l. Jo urn.al Amtrit'an Chemical Society,
... 12. p.3383-338$. 19$0.
(2) NORDSTROM, K. \'e.tsl gro\vlh and gl)'tttol form.:itiQn. Acta Chtm.it'.t S<andinavl-
ca, v. 10, n.4, p.1016-102S, 1966.
(3) OURA, E. Rcaçti()n producl~ of yl-.i$l fcrmentations. Pr0<e.ss Bi0<hemistry, v. 12,
p. 19-35, 1977.
(4} WESB, A .O.; INGRAHAJ.1, J.L. fusel Oi!. Adv:i.nct".s in A ppl icd ~1 icrobiology, v. S,
p.317·53. 1963.
(5) GOTTSCHALK, C. 8.1c-tcrial mctaboli$0t. 2.cd. No\'a Yotk, Springtr·Vcrlag, 1986.

Recomendadas
C ROC0~10, O.J., Tr.-nsfom'laçOes metabólicas em microrg.inismos. lnst. Biol. Pcsq.
Tccn.E.Par<tná, Curi1íb.l, PR, 1967
LStlNINCER, A.I..., Principies o f Biochem.islry. N0\'3 York, \\1()rth Publi$hers, 1982.
::..:__=:==--=====---,
-~CINETICA_
DE_REA-çOES_
,
-
==-- -ENZIMATICAS=-- 1

Walter Borzani

7.1 - 1ntrodução
A Cinética de Reações Enzimáticas ~. a rigor, um caso particular da Ci-
1\ética QuSmica. Seus objetivos são:
a) medir as \•clocidade:s das transfor mações que se processam;
b) estudar a iJ'f1u~1lcia de condições de trabalho (como, por exem-
plo, concentrações dos reagentes e das enzimas, temperatura, pH,
concentrações de ati\•adores e de inibidores) naquelas velocidades;
e) correlacionar (qt1er por meio de equações empíricas, quer por
nleio de nlodclos n1atcmáticos) as velocidades das transformações
com alguns dos fatores que as afetam;
d) colaborar na otimização do processo considerado;
e) estabelecer critérios para o controle do processo;
f) projetar o reator mais adequado.
Esses objetivos, resumidamente apo1\tados, dispensan1 co1nentá rios adi·
cionais relativos à importância prática desse estt1do.
Em um curso de g raduação não cabe um estt1do aprofundado,. com vis·
tas ao exame de todos os casos conhecidos e de todos os i1nporta1\t{'S pormc·
1\ores inere1\tes a s istemas complexos. Visa-se, tão somente, estud<:'lr alguus
casos s i1nples, com o p rincipal objetivo de adquirir e consolidar conhecimen·
tos fundamenta is indispensá\leis a futuros dc-sc-nvol\limcntos. Os interessa·
dos em um estudo mais comp leto poderão constiltar a literatura indicada no
fi nal deste capítulo.
7.2 - Medida da velocidade
Consideremos o e-aso em que, em solução aquosa, um dado substrato, de
fórmula moJcc-ular $,é tra1lsf?rinado em produtos de fórmulas molectLlares P,
Q, etc., e~ uma reação catalisada por uma en7.imJ de fórmuJa molecular E.
Esquematicamente:
s.....i.....r+Q+...
Como ~xe~plo, poderíamos citar a de<:omposição da água oxigenada
e1n água e oxigênio, na presença da enzima catalase:
H 10i c.i.&o..r >H 10 +f0 :
O primel°ro prob/cn1a que se nos apréSenta, ao pretendennos estudar a cinéti-
ca d<1 reação, é a medida de sua velocidade em o:>ttdições experimentais conhocjdas.
SuponJt.a1nos que stja possível, no sistema que nos interessa, nledir a con 4

«ntraçâo do substrato (ou de tim dos produtos) dura1tte o desenvoJ\rime1tto da


reação a partir de set1 início. Essa.s 1nedidas condt1iirão a curvas do tipc>das re-
present<1das na Fig. 7.1 . Ess.1s CtLn•as nos mostram que a velocidade de consumo
do sttbstrato (ou de formação do produto escolhido) varia com o tempo, porque,
como conseqül!1lcin da reação, varianl ns condições em que o siste1na se encontra.
De fato, dttrante o descnvolviJnento da reação, mcsnlo mantendo-se constantes a
temperatura e o pH, a concentração do sttbstrato decresce e a concentração da
C1\Z.i1lla, levando em conta sua labilidade, também pode diminuir considerave1-
ntente, sem esquecer que, em muitos casos, os prodt1tos formados podc1n atuar
com.o inibidores da ação catalítica da enzin1a.
A rigor, portanto, o tinico insta1tte em que as condições experimentais são
conhecidas é o iz\Stante inicial. Por esse motivo, a velocidade da reação eiu.imática
deve ser calculada, sempre qtte possível, no instante t=O, obtendo-se assim a t~loei­
dade inicial ou de constamo do StLbstrato, ou de formação do produto (\•er Fig. 7.1).

l ''

'
'
,,
,

'' Subs:tra\O

/
o
o Tempo

Figur-a 7. 1 - ~~K'..i.dMv~ões~<onctntrai;õesdosvbstratoedo~o.~W.S
~ nol!'l$Wlte 1 edn ..'<'IQOO.)deS lt'ICr.llS (t=O).
~--·...· - ·· ....... u.·~·,..,_ 199

Muitas s~o ílS reações cn zhn~ ti cas cujas vclO<'idades iniclAis podem ser
determinadas, desde que se tomem os devidos cuidados experimentais. Além
da já citada decomposição da !gua oxigenada, poderíamos citar, a tituJo de
exemplos; a hidrólise da sacarose catalisada pela in,·ertase e a hidrólise da
uréia,. catalis01da pela urease.
Há,. poré nl, casos ma is complexos,. cm que a velocidade inicial n~ o pode
~r medida, ot1 porque não existe uma técnica experimenta l que permita
acompanhar as variações das concentrações no sistema em estudo, ou porque
• transforma(ÃO nJo pode ser representada por uma equaçJo qufmica com
reagentes e produtos bem definidos. A velocidade da reação, nesses casos, é
freqüe ntemente representada por uma velocidndt ,,,fdia de consumo, ou de
p rodt1ção, de s ubstâ ncias conveniente mente escolhidas (' •er Fig. 7.2) ou, a in·
da, de \1a riaç3o de uma propriedade do sistema (viscosidade, textura, absor·
b.ãncia,. etc.) em um inter·valo de tempo preíi:-.ado. O amolecimento de carnes
pela ação da papafna é um exemplo de proctsso enzimático em que não há
condiçõeS de medir uma velocidade inic-ial.

"----- - ~

7.3 - Influência das concentrações da enzima e do substrato.


l ei de Michaelis e Menten.
Consideremos uma dada reação e.nzimAt1ctl cuja veloc1da1l~ '"'''ª'
pode
ser determiní.ldti experimentalmente. lmagincnl0$ vários cns.liOS diferindo,
um do outro, n11t11ns pela conccntroção inicial do C1lzima. A experiência mos-
tra que, dentro de certos limites, a velocidade da reação é proporcional à con-
centraçâo da enzima (Fig. 7.3) .

o •
o Conoenuaçêo da enzSna
Agu...a. 7.3 - ~ ~bad\ ~ dl concentraçloda CtlUl'ai navelooclldc oo ~·

Se, por~m, os ensaios realizados diferirem entre si ape,,as p('la concentra-


ção inicial do stibstrato, a velocidade inicial d(I re(lção ser.i afetada, como indi-
ca a Fig. 7.4. Em otitras palavras, a curva obtida é análoga à que se observa em
fenômenos c1n qt1c ocorre saturação: a velocidade da reação é íu1lção crescen-
te da concentração do substrato até um determinado valor dessa concentra-
ção, mantendo-se praticamente co1lsta1lte para concentrações de substrato
superiores a esse valor.

o
O Coneenlf8Çào do wb$.trato

Flgu..;a. 7.4 - ~~cb~dlconcentr~<bsubw.ltona~~~


~-__..~(11_..), .......... l • • ....._.-,.....,. 20 1

O modelo cinético de Michaelis e Mente1\ ~. ainda l\oje, \llt'I dos n\ais


.aceitos com o objeti,•o b.isico dt explk.lr a influência das concentr.l('6e:s inicia·
is de enzima e de S\1bstrato na velocidade inicíal da rcaç.lo enzimática. As hi·
pótcses básicas desse 1nodelo sno:
a) o substrato e a enzima reagem re\·ersivelmente entre si íormando
um composto intermediário denominado curt1pl~xo tH:;n1a·sttb$/rato;
b) o complexo formado ou se decon1põe, ou reage com oulrn S\1bs·
t.incia.. regenerando a en7ima e formando os produtos da retlç:io.
Consideremos o caso mais simples possível, caracterizado pelos i,e-
guinte:s ponto~:
a) a formação do complexo en2ima-subslto\tO se dá na proporção
de 1 molde subi,lrato prira 1 molde enzima, produzindo t nlol do
complexo;
b) o complexo formado se decompõe,, sem reagir com oulrtl! subs·
t.lnciilS existentes no sistcml'I.
Esquematic:01mente,, teremos.. em um dado i.nsta.ntc t:

!,+.! :~ f§-f;-""tE +P
• •l • • • •

sendo:
k 1 =constante de velocidade de formação do complexo
k : = ronslante de velocidade de di~sociaçAo do complexo
k, 2constante de velocidade de dec:omposiçJo do complexo
fornlando o produto
t'"= velocidade de rormaçlo do produto

s= molaridade inicial do substrato


t • molaridade inicial da l'nz.ima
.t-a molaridade do romplexo no in~lante I

Podemos, então, escrever:

dx =k,(t - xXs r)-k, ·x - k, • X (7.1)


dt
Admitindo, o que é muito comu1n na pr.itica, que a conce1\traç~o do
substrato é muito maior que a da enzima e.. portanto, muito maior que a do
complexo, podemos desprezar x em rclaç~o a s. A eq. (7.1) será, cnlJo:

(7.2)
Supondo, a iilda, que após tim regime transiente inicial muito curto
(da ordem de alguns microssegundos), a concentração do conlplexo se
mantém consta nte (hipótese de Briggs e Ha ldane), isto é, d•/dt=O, a eq.
(7.2) fo rnece:

(7.3)

sendo:
(7.4)

A t?q. (7.3) permite, agora, calcular a velocidade de formação do p ro·


duto:

v=k, ·x=k, ·e-"--


K"' +s
' (7.5)

O máximo ,,alor da velocidade será alcançado qtra.ndo tada a enzima se


c1lcontrar 1la fornla de complexo, is to~. quando x=-t. Jndjc.ando·se com V essa
velocidade máxima, teremos V • k , ·e.
Logo, a equação (7.5) nos dará:

v=V '
K. + s
(7.6)

que é a equação de Micha('lis e ~1enten, representada na Fig. 7.5.


V
V • •• •• • • •• • ••• ••••• • • • • • • • • • • • • • • • • •

.,
V
\

Figun 7.5 - Rtprescn~ ~d;t cqw.çiodc Mlc:hds e Mcntcn.

A cons tante K~,. denominada constante de Michaelis da enzima (ou, se-


gundo alguns autores., co1\sta1lte de Michaelis do substrato, ou ainda consta1l·
te de Michaelis do sistema enzima-substrato), é a concentração de substrato à
qual corresponde uma velocidade igual à metade da máxima. De fato, fazendo
s=K... na equação (7.6), resulta v=V/2. A tab. 7.1 reúne a lguns valores de K,...

Tabela 7.1 - Valoc'esda.Con.switcôeMtC:hacis

ENZl~iA SUBSTRATO "-


(l'\\'ettase S11c;1rose 0,020 mol/L

Utease Uréi:i 0,025 mol/L

Cat.'llase H10 l 0,025 mol/l.

Amllase Amido 4,0g/ ~

Se a constante de velocidade k, for m\lito menor do que kl, a eq. (7.4)


dará:

(7.7)

isto é, K,. será, neste caso, praticamerlte igttal à constante de equilibrio de dis-
sociação do complexo ES.
Quanto menor for o ' 'alor de K~ maior será a afinidade da enzima
pelo s\1bstrato.
A determinação de K,.. e V a partir de valores experimentais de s e v,
pode ser efetuada linearizand°'"sc a cq. (7.6).
Para tanto, um método mt1ito utilizado, chamado n\étodo de T~inev.·ea­
ver-Burk, consiste em inverter ambos os membros da eq. (7.6):

1 1 K.,. 1 (7.8)
-=-+ - ·-
V V V s

Essa 1,.lltima equação nos diz que 1/v varia linearmente com 1/s. Os coe-
ficientes linear e angtLlar dessa reta são iguais a 1/Ve K.,/V, respectivamente.

- .'
Tendo-se os ,.3 Jores experimentais de se os correspondentes valores de tJ de-
rcrmina·se, por regress3o linear, os valores de l/V e K,./V e, consequente·
mente, V e K. (ver Fi~. 7.6).

l/v

,'
, ,'
1
v-.......... ,
,,
,'
,' '
'
-'-
Km
o

A líneariuçlo da eq. (7.6) pode ~r rea1iuda por outros métodos, .i1ém


do de UnC\vea,·er-Burk já citado. faremos reíerência apenas 3 mais um deles,
o método de Hnncs, que consiste sinlplcsmente cm multiplicar por s ambos os
membros do cq. (7.8):

s K 1
(7.9)
-=---!t.+-· S
V V V

Neste último método,. s/r:r varia linearmente com$ e os coeficientes line-


ar e angular da reta cor-respondente são rc:tpecti,•amcnte iguais a K.IV e 1 /V.
Qualquer que seja o n1é1odo utili1.,do, uma boa detern1ina('.ào de K. e V
requer un1a cuidadosa análise estatística dos valores experimentais.
A tirulo de exemplo. consideremos os valorH da Tab. 7.2, que nos dá,
em um.l reação cn1imá1ica, a \•clcx:idadc inicial de íor-mação do produto para
d iver:,os vi'llores da c01lcentra('l\O inicial do substrato (ver Fig. 7.7).
•lg/LI •(g/L hl
0,25 0,78
0,51 1.25
1,03 I~

2.s2 2,19

•.33 2,35
7.2S 2,S7

1 -

o ' -.
o 2 • 6 8
• (gll.}

...... 1.1 -~v"a ... -..doT..... 12

Se aplicarmos, aos valores d<l Tab. 7.2, o método de Line,..•eaver~Burk e o


de Hanes, ob1eremos os resultados representados, respectivamente 1l'1S Figs.
7.8 e7.9.
1,2 1V = o•3668 • o' 2200 . ..!.
S

\
(f . 0,9995}

o L--~--.---~-~-~--,----~-
0 1 2 3 4

+ (l / g)

Fig u..a 7.8 .. ~dcVeK,.,,pdomé-tododelaneweave1..&.!ÃapiodoC10S~da Tabela 7.2


(r• codiOcntedc e~),

+ =0.2417 •0,3595.s

(t. 0.9996) ""'

g
>
'•
V=2.78g f l ·h

K,..,=0.672g/ L
l
o
o
'(gil)
• 6 6

Figun 7,9 - Otterm.~ ót V e K,.. pdo método de Hat'le$ ~plicado .10S valore$ da. Tabdl 7.2
(r• coet'1Cierne 6e <OtT~}

Resta·nos examinar a ordc1n da reação enzimática em duas situações


particulares.
Se a concentração do subst-r ato íor muito menor que K...,. isto é, ~
K ., +sil: K ., , a eq. (7.6) nos dará:
V
V :;t--S
K.
isto é, a reação se comporta como se fosse de primei.ra ordem.
Se, porém, a concentração do substrato for muito maior do que Km, de
modo que Km +s a s, teremos, pela eq. (7.6):
v~V

ou seja, a reação se comporta como se fosse de ordem zero.

7.4 - Influência da presença de um inibidor


Chama-se inibidor da reação e1"tzimática uma S\tbstãncia que acarreta di·
1nin\lição da velocidade da reação.
Quando o inibidor reage irre,•ersivelmente com a enzima, bloqucan·
do·a parcial ou totalmente, a inibição é do tipo denominado irreversível. Se,
porém, o inibidor reage reversivelmente c;:Om a enzima, a i1\ibiç1lo é do tipo
chamado reversível. Esse ú ltimo caso é o que tem interesse prático e, por
este motivo, será considerado neste item.
Cumpre destacar que, em alg\tns casos, o inibidor pode ser uma das
s ubstâncias que participa da reação, quer como substrato, quer como produto.
Assim, por exemplo, a invertase (que catalisa a hidrólise da sacarose, forman·
do glicose e írutose) pode ser inibida pela sacarose quando esta se encontra
presente e1n concentrações relativamente altas, enquanto a alfaamilase (que
catalisa a hidrólise do amido produzindo dextrinas e maltose) é inibida pelas
dextrinas e pela maltose.
Consideraren"tos, entre os muitos tipos de inibição reversível de reações
enzimáticas, apenas dois: inibição competitiva e inibição não-competitiva.
Comecenlos pela inibição competitiva.
Diz-se que um inibidor é competitivo qi1ando co111pete <:Om o substrato,
ocupando o sítio ativo da enzima.
lndi<:ando·se c;:om 1 a fórmula molecular do inibidor e çom i sua molari·
d:tde inicial, o modelo de Michaelis e Menten, no caso mais sin"tples possível,
pode ser representado pelas seguintes equações químicas:

g +í, '• g_§ 7


• E+P
~ -Jt·y ,. . ' •

E, + / • El~
, E + P'
-
f-1.-, -
,_, t) -y •

onde v., velocidade de fom"tação do produto P, é obviameilte menor que v (ver ite1n
7.3), \Ul\a vez que parte da enzima está "bloqueada" na reação co1n o inibidor 1.
Teremos então, unla vez que, na prática, s>>X e i>>y:

:: =k, ( e-x-y)s - (k, +k, )x (7.10)

:; =k,(<-x-y)i - (k , +k, )y (7.11)

Cumpre destacar qt1e na reação entre a enzima e o inibidor pode não


ocorrer a for inação do prod\tto P', isto é, pode-se ter apenas:

E+I •''ET
e, conseqüentenlentc, k.:=O
"
Sendo dx/ dt=dy/ dt=O (ver item 7.3: hipótese de Briggs e Haldane), as
eqs. (7.10) e (7.11) nos darão:

X= ---' =-·=·- -
Kfl'l (l + i/ K; ) + s
(7.12)

sendoKm =(k, +k, ) / k, e K,=(k , +k, )/k,.


A velocidade v. será; então:

(7.13)

ondeV • kJ ·t.
Aplic-ando-se, na equação (7.13), o método de Linea,ver-Burk, tere1nos:

1 1 K. (1 +i,K1 ) J (7.14)
- • -+ ·-
V, V V s
representada esqt1enlaticamente na fig. 7.JO.
A eq. (7.14) pode ainda ser graficamente representada colocando-se,
em abcissas, a concentração do inibidor em vez de 1/s, como nos mostra a
Fig. 7 .11. Pode-se aqui demonstrar que as retas obtidas para diíere1ltes con-
centrações d~ substrato cruzanl -se 1lo ponto de abcissa -Ki e ordenada,
l / V.
1-\s eqs. (7.6) e (7.13) JlOS pcrnlitem calcular a relação entre as velocida-
des da reação sem inibidor e co1n inibidor:

-'' = 1+ Km .,. (7.15)


v1 K1(Km+s)
1/v


••

1 . .'·~:~..
....:.....
.
v-........_ :.:~··

.....
J..11+.&.)
V s
•'

...,

• " ,
s • ••
·K;j(HK;) ••/." /
. ..
••····
. .
.. •. .
. ...
, ...• ····
.
V

-K, O

Fl1un 1. 11 ~~oa&~.iodo mt'Ododc ~-Burt.ao0$0 ele~


<()mpCbCIW. 0etMYW<3o de K.
210 ~- ......- -
... ,

• . ~-=-~-- ·

"""'·''
na~ ../w
___..............._ .._...__
o

Essa liltima equação, representad.i n.i Fig. 7.12, nos mostrti., influência
das concentrações do substrato e do inibidor na relação v/v1• Em pílrticular, se
íor possível trabalhar com conce1\traçõcs de substrato relativnmcntc riltas
(m<itcm<itican1ente, s - . «>),a influência do inibidor pode se tornar dcsprczS·
vel. Essn tendência pode ser também observada no exemplo num~rico repre-
sentodo no Fig. 7.13, no qual V• 6,10 mg/ L·min, K. =2,50 mg/ L e K,• l,60
mg/ L.

cuova i Í!!!l 'l}


f o
2 4.8
3 11.2

K,,. . 2.50 mg / l
l<,• 1.eDmg/ l

50
'
• (mg / l)
Um exentplo de inibiçAo contpctitiva é o observado no efeito inibidor da
glicose na hidrólise da sacarose, catalisada pela invertase. A inibiç3.o, pro,•o·
c.11da pela alfadtxlrina na hidrólise de amido catalisada pela alfaamila.se, é ou·
tro exemplo de inibição competitiva.
Uma vez exnminados os pontos ft1ndamcntais da infl uência de um inibi-
dor competitivo na velocidade dn reação enziinática, passen1os ao exame de
um caso simples de inibição não competitiva.
Nesse tipo de inibição,. o inibidor não compete com o substrato pelo sitio
ati\•o,. mas v.11i ocupar outro sftio da enzima (sftio regulativo ou de inibiç-Ao)
como indicado, esquematicamente, a seguir:

E +S E:S~ E+/'

E+/ E/

ES+I EIS

EI +S EIS

formando-se. além dos complexos E.S e EI. um terceiro complexo, enzi-


ma-inibidor-substrato (EIS).
A velocidade da reação enzimática será, neste caso:

v•V-~ · 5 (7.16)
K, +i K. +s

Como exemplos de inibiç:io nlo competitiva podem ser citados os efei-


tos inibidores, tanto da maltose quanto da dextrina limite na hidrólise do ami-
docatalisadn pCl<'I .,lfa -amilasc.
Finalmente, parece-nos aC01lSélhável examinar o caso de inibição não
competitiva irrrwrsJveJ, ou seja, quando o inibidor reage irreversivelmente
com a enzima bloqueando-~ em parte, como acontece quando o iníbidor é um
metal pesado.
Sendo ia molaridade inicial do inibidor e indicando com :·1' n molarida-
de de c 1\zima por ele bloqueada, o modelo de Michaelis e Mentcn pode serre-
presentado pelas seguintes equa('ões quí_mic:as:

Considerando que s - .\' as, podemos escrever:


dx =k,(e-x-z·i)s-(k, +k, )x =O (7.17)
dt .
Logo:

x=(e-z ·i)s (7.18)


K • +s
onde: Km=( k 2 +k, )/k, .
Teremos, então:

(7.19)

Conside ra1ldo que k 3 ·e • V, resulta:


(7.20)

representada graíica1nente na Fig. 7. 14.

oO Conoenttaçào do Súbs:trato
'
Figura 7. 14 - R.epresentai;Jo ~ dl itllluência d.l concentt~ do subw.lto na vcloodbáe dl ~ na
presença de um "'IÕ!dOt' nio~. que reage im:versivcmMte com a MZ>Ml.

A apUcação do método de Linea,\'er·Burk à eq. (7.20) nos dá:

- = - -!' --- + K,.. 1 (7.21)


v1 V - k 3 ·z . ; V - k 3 ·z·i s
csqlte1nilticamente representada na Fig. 7.15.
~•...-n lll

1• \

.•
.
.•
.• ../
..• ....
. .. ...
. •
...
. .: ...· .•
: .·· .. ··
....
.:.·:..____,___________ u.
_ ....,:......
·,/;

As eqs. (7.13) e (7. 16) nos mostram ainda que, enquanto na ínibição com·
petitiva a velocidnde nldxima niio é n(ctílda e n cons tante de Michaelis é multi·
plicada por um fator nlaior que 1, na inlbiç.\o não-competitiva a constante de
Michaelis não é afetada e a velocidade máxima é menor do que V.

7.5 - lnftuência ela temperatura


Na reação en1imáti<a

E +S ES...!...., E +P

a constante de velocidade k, dentro de certos limites, é função crescente da


temperatura do sistema.
A experiência mostra que a innuência da temperatur..1 na constante de
\relocidade k obedece ~ lei de Arrhenit1S, representada pela eq. (7.22) e pcl.-i
Fig. 7.16:
k • k o· t! u ltr (7.22)

onde Cl é a energia de ati\•ação, Ré a constante dos gases p;trfeitos e T é a tem·


peratura absoluta do sistema.
11 T
Figura7.16 - ~._-davanoçi<>da~cdeYdoodade(l)ooma_.""°"'(T~

Lcmbr.indo, porém, que as enzimas são termolál>eis, ao mesmo tempo


que ocorre a reaçC1o enzimá tica que 1\0S int·e ressa, desenvolve-se também a re-
ação de inativação térn1ica da enzima que atua no sistema:
E~ Enz ima inativada
e a constante de vel~idade desta reação (k') també1n ~afetada pela tempera-
tura de acordo com a lei de Arrl1enius:

(7.23)

sendo (J a correspondente e1\ergia de ativação.


A experiência mostra que, enquanto o valor de« se situa no intervalo 4
a 20 kcal/mol, o de p é consideravehnente maior, atingindo 40 a 200
kcal/n10J.
Levando em conta esses fatos, suponhamos uma dada reação enzimáti-
ca com c:c.=12 kcal/mol e '3=120 kcal/ mol, desenvolvendo-se a 201)C e a 3cr'C.
Tanto o valor de k quanto o de k' aumcntan\ quando a temperatura passa de
20ºC a 30ºC, e as eqs. (7.22) e (7.23) permitem calcular esses a umentos: en-
quanto k (constante de velocidade de formação do produto) se torna a proxi-
1nadamente 2 vezes maior, k' (consta1\ tc de velocidade de ina tivação té rmica
da enzima) se torna cerca de 860 vezes maior. Compreende-se, assim, por
que nlotivo a elevação da temperatura acima de um certo valor acarretará,
devido às altas velocidades de inativação térmica da enzima, diminuição da
velocidade de formação do p roduto. Gráficos como o da Fig. 7.17 represen-
tam esse fenômeno.

"

1/T
~7. 17
......... (•}
_ . . _ _......................... -...(T) ... -dt...._...
7.6 - lnflu~ncia do pH
P.irtindo-sc do fato. bem conhe<ido, de que o pH do meio aquoso em
que se desenvolve uma reaçAo enzimática afeta trtnto o cst11do de ioni1açJo da
enzima quanto a vclocidodc da reaçõo, pode-se s upor q\1C l.'l lltividade cataliti-
ca da enzima depende de seu estado de ionização.
Imaginemos, então, o seguinte sistema relativamente simples:
1) A enzilna se encontra em tr'1-s estados de ionizaçilo, representa-
dos por E.'°1• E'''' e E'-t•:
2) Somente lt 1 apresenta ativid~e catalític.l;
3) Os seguintes equilfbrios coexistem no sistema

e as respectivas constantes de equilíbrio são K, e ~;


4) As molnridades de f"t, f'·11, e -:-i e Hº são. respectivamente, t., t\,
t,eh;
5) A molaridade total da enzima presente no sistemi! é t,
Podemos, então, escrever:

K , •h·~.
-
e,
(7.24)

h ·~:
K,•- (7.25)
••
(7.26)
qut" nos permi1em e.ileu lar'• (concentraçJo da fração da enzima que apresentõ1i
atividade catalítica) em fl1nç3o de e (concentração total da enzima no sistema)
e de Ir (e, conscqücnte mc1\tc, do pH). O vnlor de e, vai determi1lnt a velocida-
de v na eq. (7.5).

7. 7 - Comentários finais
No início deste capítulo tivemos o cuidado de informar que não seriam
exanlinados, aqui, todos os tcmó'ls que intC'grnn1 o vasto campo da cinétic-a dos
prOC'~ enzim~ticos.

Em particular, não fizemos referência aos casos em que se utilizam enzi·


1nas in\obilizadas. cujó'l importl\ncia ve1n crescendo consideravelmente. Esse
assiultOserá cxan1inado nos Volumes 2 e 3 desta colcç1lo.
OuttO tópioo que, por seu potenc-i"1J interesse pr.itico ''em merecendo
atenç.\o crescente, é o da aç~o cat.ilític.i de enzimas em meios não-aquosos.
A Literatur.1 que indicamos a seguir poderá ser consultada ptlra llm pri·
mciro nprofund amcnto dos cstudos.

Literatura recomendada
(1) BAILEY, J. ~ & OLLIS, O. F. Blochitmlc.tl li-nginterlng Fundam•nl•l.f, McGr.. ~··
Hill, N Yorlt.. (1986).
(2) OIXON. ~t lc \\'E88, E- C Cruym~• .)..• EdJ('Jo. Ac.aditmk PttSS, N Y0tlt.. (1979).
(3) ILLANES, A Blott('nologl.a dt Enzim.lj Ed1.ciones Un1\trs1târias de V;alpar.tUo d~
la Unlvc.•r11idad Católl<'1I dl~ \'alpar•fso, Y.1l~rai:so, (199-4).
(4) l.;\101.F.R, 1(, J. & BU1'.'TINC, I'. $. The Chtn1lt'.al Klntll<'f of Enayn1e A('lion, 2.'
Ediç.lo, Clar-tnd~n Pl'f"», ());ford (1913).
(5) SEGEL..1 li En&ymt KintUn.. \\'il<ty·lnlt~. N. Y0tl (1975).
TERMODINÂMICA
DE REAÇOES
,
-
ENZIMATICAS
Otto J. Crocomo e Luiz Carlos Basso

8.1 - Introdução
lofoje, 1nais do q\1e nunca, est.1mos conS>cicntes de que a e1u.•rgia, n capa·
cidl\de de realiiar trabalho, é vital para umo civiliz.ação modcr1la. Nas suas
diversas formas {elétrica, mecânica, química, calorifica, luminosa etc.) é uti-
li1.ada para a manufatura de produtos, transporte, aquecimento, refrigeração
e demais trabalhos.
A dlula '\•iva igualmente necessita de energia para a realiiaçlo dos di-
versos trab.alhos fisiológicos que ela t'.\ttut.:1: biossinteses (trabalho químico),
tran)porte ativo (trabalho osm6tiro), contraçJo muscular (trabalho mecãnico),
bioluminescência etc.
A bioct1trgélica é o campo da bioquímica que trata das transformr1ções e
uso da cncrgí.i pelas células vivas, estando s\1jcilJ aos mesmos princípios du
tcrnlodiilft1nica, nlas as peculiaridadetS dos sistemas biológicos cxigc1n umu
abordagcnl diícrcnciada, como será apresentado llO presente capítulo.
Enl sentido amplo. as células íotossintctizadoras e as heterotróficns ali-
mentam-se nlutuamente. As primeiras ;iproveitam-se do C01 atmosférico
para produzir carboidratos e devolver 0 1 ao nleio ambiente. As heterotróíicas,
por sua \rtz, utilizam os carboidratos assim produzidos e o 0 1 e liberam CO,
para a atmosíer<.1. A Fig. 8.1 moslrt11 essa interdependência nutricional (sintro-
fia) R."SS<lltotndo-se o acoplamento dQ) cicl~ do carbono e do oxigénio na bios--
fera: durante a íol0$$íntese, a energia sol.1r é transíonnada em energia química
sob a forma de ATP, NADPH e carboidr.1tos (glirose).. os quais s.'io utilí.to.ldos
pelas células heterotróficas na realizaç:.o de atividades que consomem energia.
A luz solar é, cm última análise, a prhneir.l fonte de energia tanto ptlra células
autotróíicas conlo hetcrotróíicas.


Figura 8. 1 - OododoATP/ADPcatrlnllerinoa.dc~ttoosehd~ wavésdoMteml~.

No ciclo biológico da energia e, portanto, no Ouxo de energia na biosfe-


ra, est3o comprometidas grandes quantidades de energia. Anualmente, as cé-
lulas fotossintctizadoras capturam cerca de 1()11 cal de e1\crgia solar, e
aproximadamente 33 x IO't de carbono fluem através do ciclo do carbono na
biosfera. Esse fluxo se processa durtlnte o tr;1nscorrer do metabolismo, ou
seja, durante as reações bioqu.fmjcas de degradação de subst3nc-ias complexas
(catobolismo) e de sf111cs.o de compostos complexos (anabolismo). As primei-
ras re.i(6es são acompanhadas pela libertação de energia livre das estruturas
complexas de grandes moléculas org.tnic-as, com a consen•aç-.lo des.sa energia
sob n forma de ligações ricas de energia do ATP. Por outro lado, nas sínteses
enzimáticas de moJ&uJas ron1pJexas (proteínas, Acidos nucJciros, polissacarf·
deos.. lipídeos) a partir de precursores mais simples, ocorre aumento no ta.ma~
nho e complexidade da molécula, levando a uma diminuiç.lo na entropia do
sisten111, e)(igindo o forneci111ento de energia livre, proporcionada por ATP.
Tanto catabolismo con10 anab0Jisn10 consistem em dois processos simuJ·
tâneos e interdependentes. Um deles - o me/abolismo int~rmtdi4rio - é uma
seqüência de reações enzim.iticas pela qual o esqueleto covalente de umo bio-
1nolécula é degradado ou sintct-iz.ado; seus intermediários quín1icos sno cha·
mados 111tlab6/itos. Cada reação q uímica do metabolismo intermediário é
acompanhada por uma variaçlo no conteúdo de t>nergia. Ou seja# em ttrtos
passos da seqüência catabólica, pode ocorrer conservação de energia dos me--
tabóli1os - usuahnente como ATP - e, cn1 certos po11tos dr.s reações anabó--
ljcas, pode ha\1er necessidade da introdução de energia. Esse processo ~
~cteT~ 2 19

chamado acoplan1e11to de energia. O metabolismo inter1nediário e o acoplamen-


to de energia são obrigatoriamenté interconectados e interdependentes, fazen-
do com que, quando se estudam os processos metal>ólicos, sejam analisadas
não somente as reações quinlicas que transformam a estrutura covalc1\te do
prec\1rsor no produto, mas também as variações de energia que acon\panham
essa conversão. É deste último aspecto quê 1rata rcmos neste capítulo.
Moléculas orgânicas altamente organizadas, como glicose, possuem mu-
ito pouca entropia, Quando oxidadas por oxigênio molecular, elas se desorga-
nizam., sofrendo seus á tomos uma crescente randomização, separando-se uns
dos outros. Como resultado, a moléc\1la sofre uma perda de energia livre, a
q\tal, sob condições de temperatu.ra e pressão constantes, é \ttilizada para pro-
d uzir trabalho químico.
As oxidações biológicas são combustões que ocorrem a baixas tempera-
turas. Ora, calor não pode ser usado como fonte de energia para os seres vivos
(que são essencialmente isotérmicos), a menos que, sob pressão constante, seja
levado de regiões mais quentes para mais frias. Nessas condições, o calor pro·
duzirá trabalho. Nas células, entretanto, a energia livre dos conlbustiveis é
conservada como energia química das ligações fosfatadas de ATP. O ATP as·
sim formado pode difundir-se para outros compartimentos dentro da célula
onde s ua energia é necessária e, desse modo, pode ser visualizado como uma
fo r1na de trans porte de encrgia. A energia qujn1ica de ATP é então libertada,
quando seus grupos fos fato terminais são tra11sfe-ridos para aceptores específi-
cos, os quais se tornam ricos de energia e podem p roduzir traba lho.
Um ot1tro n\eio de transporte de energia que ocorre nas células é sob a
forma de e létrons. Os elétrons são transportados enzimaticamente de reações
oxidativas produtoras de e l ~ t-rons para reações onde haja necessidade de re-
d uç.ão de ligações duplas em ligações s imples. Os C<)adjutore:s dessa transfe-
r~ncia são as coenz.i11\as que transporta1l'I {'létrons, sendo a mais importante o
NADP (fosfato de dinttcleotídeo de nicotinamida-adenina). Do 1nesmo modo
que ATP é o transportador de g rupos fosfatos ricos de energia, NAOP é o car·
regador de e létro1\S ricos de energia, transferindo-os de reações catabólicas
para reações anabólicas que exigem elétrons.

8.2 - Princlpios da Termodinâmica


Uma re\ isão dos princípios do equih'brio termodinâmico é essencial
1

para a compreensão do ciclo de cnergia dJ célula - e, portanto, da f\1nção do


ATP - em bases fisicoquímicas. O objetivo pre<:fpuo da Termodinâmica é a
energia em todas as suas manifestações, uma vez que todas as outras formas
de energia, que não a calorífica. são coovertidas em calor, e podem ter tido
origem no calor. A Termodinâmica Química pi:-ocura determinar o que torna
realidade unta reação quf1nica e o q\tC faz con\ que a n1esn1a se complete, c1n
termos das variaçõe-s de energia com ê la associadas. Se bem que energia
calorífica esteja en,rolvida, e que medidas termodinâmicas sejam medidas de
variação de calot e1n um sis1e,,1n que está sofrendo variação química, elas de·
vem ser interpretadas em termos de uma redistribuição de seu conteúdo ener·
gético entre as várias forn1as nas quais essa energia está presente no sisten1n.
Um sistentn é considerado um conjunto de matéria objeto de análise.
Tudo o mais no universo que 1\âo faça parte desse sistema particular é o meio.
Sistema e nleio formam o universo ter111odi,,âu1ico. Nesse universo, energia
pode passar do sistema para o n1eio e deste voltar ao sistema. Esse fluxo de
energia ~ analisado termodinamicame:ntt':! em termos do conteúdo energético
do estado inicial do sistenla + meio e o estado fiual ap6s o eqllilíbrio ser ati11gi·
do. Atributos mensuráveis, como temperatura, pressAo, volume, massa e ou·
tros, são os responsáveis pelo conteúdo de energia e:m e.ada estado, o que é
for1nulado por uma cq11aç11o de L~tado. Ora, a Termodinâmica analisa as varia·
çôes de energia considerando a matéria como um todo, Otl seja, usa parâme·
tros mac-roscópios e, portanto, rtão requer o conhe:cimento da composição nlo-
lecular do sisten1a ou seu meio, ou do mecanismo nl.olecular a través do qual
um processo tem lugar. A análise tern\odinâ1nica das variações de energia
leva em conta somente os estados inicial e final do sistenla e iildepende da in·
tensidade conl que os processos ocorrenl, o que deve ser e:studado por méto·
dos ciiléticos, um outro capítulo da Fisicoquímica.
Um sistema pode ser ;rolado, fechado ou aberlo. Este últinl.o disc-utircnl.os
posteriormente. Um sistema é iwlado quando não troca matéria e energia con1
set1 meio. É fttllado qt1ando não troca matéria com seu meio, n1as c11ergia é li·
vrenlente trocada. A análise dos sisten1as fechados é relativamente simples,
porqt1e só se co1l.sideram os estados i1l.icial e final após o equilíbrio ter sido
atingido. O estado de um sistema pode ser definido enl. termos de sua pres-
são, temperatura e composição. Quando pressâo e temperatura são mantidas
constantes, as variações de energia podem ser diretanlente relacionadas com
as trocas na conlposição n1aterial.

8.2.1 - Conservação de energia


A primeira lei da Termodinâmica estabelece qtie a "a energia total de
um sistema isolado é constante, apesar de que, dentro desse sistema, possa
ocorrer \rariação enl. sua forn1a". Ou seja, a energia nào pode ser criada e nenl.
destruída, n1as ela pode sofrer transformação de uma para outra forma, como
energia calorífica, luminoS3, elétrica, mecânica e química. O pri11cfpio de con-
sen1ação de energia engloba não só os sistemas isolados, mas também as tro·
cas de energia que ocorrem entre ttm sist·e ma fechado e seu n1eio, uma \tez
que ttm siste"'ª fecJ1ado + se11 '11eio for1nam um sistema isolado.
No caso de um proCesso químico, a primeira lei d iz que, quando ttma re·
aç3o qul'n1ica ocorre, a diferença entre a c1\ergia potenciaJ dos reagentes e a
dos produtos resultará em t':!nergia que está sendo liberada ou absorvida. A
quantidade de energia depende sonl.ente da natureza química dos reagentes e
r
dos produtos. Parte da energia pode ser liberada como calor e parte como lr.l·
balho, mas, para uma quantidade fi.\a do reagente, a soma do calor e do lri.1b.l·
lho sempre ser~ a mesma. Quantitativamente essas considerações podem ser
expressas como
t.E • Et1iv1 - L1,111NJ (8.1)

sendo t.E a variação na energia quando o slstcnla vai do estado inicil'll paro o
final.
Um sistema fechado pode rcali1ar vArios tipos de trabalho sobre ~cu
meio, <uj•s quantidades podem S<>r somadas sob o termo W (tTa~lho), quan·
do ent.lo • energia total gasta pelo sistenl• para fazer o trabalho é - \\1'. Ao
me5mo tempo em que o sistema isot~rmtco, sob prêSSão (P) constante, perde
energia intrínse<:a para seu meio (-~V). ele tJmbém adquire energi.t sob• for·
ma de calor (+Q) a partir de seu meio. Nes!'J.C taso, a ,·ariaç3o em sua '"ncrgid
intrínseca )erá o resultado da soma da 01quisiç3o de energia Q e perda de ener-
gia -W:
t.C Q - W (8.2)

01'1dc W é o ttí.'lball\o feito pelo sistema c Q o calor absorvido pelo sistcmo. O ~i­
ní.'11 - indica que o trabalho feito pelo sistema envolve gasto de energia, en-
quanto o sinal + indica que o calor absorvido pelo sistema representa ganho
de energia.
A tntrgia pode ser transferida de um sistema para outro. stja por meio
de nu~o de c-.ilor ou por meio de trabalho. ~ importante ter em mente que a
energia (E) é uma propriedade caracteristic01 de um sistema. Fluxo de tr.'lb.ilho
e calor nlo :,..\o propriedades de um sistema,. mas constituem mtios pelos quJis
a encrgií.'I ~ tr.1nsferida quando ocorre a tr()(.l.
1\pesar da existência de muitos tipos de trabalho, em Química os mí.'liS
signiíicativos s.âo o trabalho elétrico e o retilitado pelos gases cm expnns:lo.
Trabnlho clét-rico pode ser prodtiziclo por células el<!t-roqufmicas, cnqun1\lO
que trabí.'llho e1n expansão resulta de tuna varií.'l çJo no volume dos sistemas
envolvidos e é usualmente chamado dl' lrabalho prcssào-volun'e (trilbí.'llho
PV).
Para qualquer sistema isotérmko f(.'r(hado que não realiza outro trabalho
sobre seu meio senão aquele que deriv:. de sua expansão, temos:
a) volume constante,
Eó =Q, (nllo pode se expandir;) (8.3)

b) pres.:,3o constante,
(8.4)
Q é o calor absorvido sob volume consti'lnte, quando nenhum trabalho
é reali~do; Qp o c.llor absor\rido sob pressJo constante, quan~o nenhum
trabalho é realizado além do trab.ilho press.'\0--\10lume de expansao; P ·óV o
trabalho p res,sâQoovolume realizndo pelo sistema sobre seu meio como consc·
qilé1,cii'I da expans,lo; e ô.E o aun\Cl\lo 1\a energia intrínseca .
Considerando-~ também todas as outras formas de trabalho (W'), a pri·
meira lei pode ser assim escrita:
L\E •Q- P ·L\V-W' (8.5)

Entrctant·o , se W'= O,
(8.6)

Essa expressao d.1 primeira lei é a mais útil dOS químicos.

8.2.2 - Entalpia
A energia intrínseca (E) de um sistema é um atributo que depende does-
tado presente do sistema; é uma fun~3o de estildo. N3o se pode medir o valor
de E de um sistema fechado em um estado qualquer, mas é pos.sí\•el medir-se
a diíercnça entre os \1alores que E adqttire cnl dois estados, obtendo-se á(.
Isso porque, sob Te P constantes, L\E ~ Q - W. As vias pelas quais essa varia-
ção tem lugar podem ser \•árias e, cm cada uma delas, Q e l\f têm valores \lni·
cos.
Sob press.io constante, o valor de Q pode ser calculado a partir da equa·
ção

Q,=AE+W (8.7)

e, ent3o,

Q, • L\E +P·L\V (8.8)

Como • <nergia "ªi de um estado 1 para um estado 2, a Eq. (8.8) pode ser as-
sim rttSCTita:

Q, =(E 2 -E 1)+(1'V2 - PV1) (8.9)

que nos dá
Q, =(E 2 +PV,) -(E, +PV1 ) (8.10)

Desse modo. o calor Jssociado con\ urn processo que ocorre sob pressão cons·
tantc pode ser obtido pela diferen(.l entre dois l<'rmos E + PV.
~fiel~ 223

Ora, Qp é uma função de estado e 1 portanto, pode ser expressa conlo a


diferença dos ,,alores de un\a p ropriedade de estado entre os estados i1\ici·
ai e (inal. ~o que indica a Eq. (8.10). A (unção E+ PV recebe o símbolo H, e
é chamada de to11ttúdo totol dt colar ou t11tolpia do sis1ema. Para um dado
processo que se desenvo lve sob pre:tsâo cons tante, o calor liberado ou ab·
s orvido é dado pelo termo ó.li, que é variação nti entalpin do sistemt1 du·
rante o processo:
óH•Q,•H 2 -Hl; (8.11)

H é un1a função de estado e pode ser expressa em tcrn1os de E, P e V, sendo


cada um deles também uma função de estado.
Se, sob condiçAo de P constante, calor f. liberado no meio, o sistema de\•e
decrescer em entalpin (ôH será negativo); a reaç3o quhnica ~ chan1ada cxotér·
mica. Se calor é absorvido pelo sistema, há um aumento na entalpia (ti.H *rá
positivo) e a reaç..\o qufmic.i é chamada de endotérmic.i.

8. 2.3 - Energia Livre


Algumas limitações quanto ao tipo de tramformaçõcs de energia que
ocorrem em processos químicos ou físicos são colocadas pela segunda lei da
Termodinâmica, a qual prediz em que direção unl dado processo provovel-
mente se dá. Essa lei estabelece que "reações espontâneas sao aquelas que,
quando realizadas sob condl(ôe:s apropriadas, podem realii.ar trabalho útil".
Esse trabalho útil é expresso pelo termo energia li\·re (G) sugerido por C1bb$,
que é o potencial n1áximo do s is tema que cst.i sob Te P constantes. A v;iri.1ção
no valor de C ~simbolizada como àC.
Geralmente se supõe que, quando um sistema sob P e T constantes per·
de c:alor p.ara seu meio, ele t<'lmbém de\'01 estar sofrendo um.1 transformaç1lo
cspont~nea . Se esse fosse o caso, todas as reações exotérmicas seriam cspontâ~
neas. Por outro lrtdo,. supõc·sc tamb~1n que as reações endot~rn1icas não OC-Or·
ram espontaneamente. Na reoilidade, nenhuma dC$.S3.S suposições é correta,
pois a variação de calor que acompanha uma reaç.lo, sob P e T constantes, ou
seja, ô.H, não é, cm si n1esn1a, \Lma medida real da c.1pacidadc de um:'I rc.1ção
produ1lr trabalho '1111. É o sinal de õC que indica S(' uma reac;no é capa1 de re·
alizar outro tTabalho além do trabalho PV. Se for 11tgRtit10, o sistema ter.i ptrdi-
do energit1 livre, a qut1I pode ter sido utiliuda para realiiaçlo de trabalho. Se
íor positivo, o s istcmri terá rt"(cbido energia livre, e a reação n~o pode realizar
trabalho. No prhl1eiro caso, a reação ~ chamada de txtrg611lcn e, no scg\11\do
caso, de reação rndtrgóniCtJ. A segunda lei, portanto, diz que uma rcaçlio es·
pontâne.1 é caracterizada pela ~rda de energia li' re. Ela também prediz que
uma reaçAo tomarS uma determinada d ircçJo, porénl, não prediz com que \'e-
locidadc a mesma k dará. J'' orta11to, unli'I reação i:;Oté rmica podt:! ser
cxolérmica: óH é negati\•O; exergônica: AG é negali\•O;
endolérmica: âH é positi\•o; endergônica: .õG é positivo;
1\ssim, as reações esponlfineas 530, obrigatoriamente, exergõnicas.

8.2.4. Entropia
Ul'nn reação l'xergônica nl1o ~ 1lcccssarianlente exotérnlica•. 1n~s é cspon·
15nen sob Te p constantes. Logo, a quantidade de calor absorv1dn ou geroda
por umn reação, quando nJo está realizando trabalho ú ti l (ou S<.'ja, ôli), geral·
mcn1e difere do valor AC. Essa diferença freqüentemente é tJo grande que
tom09 óJ1 sem vaJor como um índice de espontaneidade da rea(Jo. Ainda
ma•~. de\'e ocorrer uma outra \•ariaçJo na distribuição da energia a qual não
est~ impli(.tda na \•ariaç-Jo da energia livre. A diferença entre os valores de H
~ C, de f<1tO, pode ser atriblJúJd '1 UmJJ YaT.iafJO simuJtãnea no \'a for de uma
outrJ funçJo de estado do sjstema, a t1tlrop1n.
A terceira lei da Termodini\mic., estabelece que "no zero absoluto, os
cri~toi:. perfeitos de todos os conlpostos têm entropia nttla". Ou seja, quanto
mnis orde1~ado for o sistema, nlcnor será st1a e1ltropia (S). Aliás, entropia é
ttnlu nlcdida da desorgo1liznçllo de unl sisten1a. É um va lor que determina
qual a porçõo da energia de uni s is tcm.i que é incapaz de produ1ir trabalho
útil.
Sob urna dada Te P, d ''.JriaçJo na entropia Sé igual à soma das cntropi·
as dos produtos menos a soma das entropias dos reagentes. Numa re.açlo iscr
térmica, ó1I difere de âG por uma quantidade relacionada a AS:

óC ô.li - T · llS (8.12)

Na realidade, entropia é umo> funç.10 matemática de ,,,irias \•;iridveis,


como temperatura e pressão, e é cxprcMn em 1111idades dt e11tropia, sendo que 1
u.c. • 1 col.grau· 1.mol"1.Sob unla dnd,, tcn1pcratura, os gases possucrn oltu en·
tropia, os lfquidos entropia intl'rnlcd l6ria e os sólidos baixa entropia.
Todo p rocesso te11de para a direç!1o en1 que a entropia do sisten1a + meio
aumenta, até que o equilíbrio é ati11gído, no qual a entropia tem o máximo va-
lor que pode possuir sob as condições de p~o e temperatura do momento.
Equilíbrio pode ser definido como um e&tado além do qual nenhuma variação
quími(a ou físi(a lem lugar e no qual temperatura,. pressão e <'Onccntraç.lo
permanerem constantes em todo o sistema. Aliás, um sistema em equilíbrio
e;..aur1u sua capacidade de produzir lrab.llho sobre seu meio. Desde que um
processo ocorre com aumento em entropia e atingiu o equilíbrio, ele não pode
mais sofrer uma reversão espont3nca e voltJr a seu estado inicial, poi.s isso exi·
girin um de<résc-imo na entropia. Todo processo que se dá com aunlento na
entropia é chan1ado irreversível, enquanto que os processos que se dJo ~e1n va·
ríaçõo 11a l!11tropia são chanlados reversfr1eis. Em nosso mundo físico, todos os
processos rcnís, i11cluindo a vida, s1'o lr,.<·vers(veis.
Desse modo, em todos os processos, sejam físicos ou quCmiros, ocorren-
do portllnto no sentido de se aumentar a entropia, parte da energia "'útil"'
(aquela (apaz de reali:rar traball\o) é "degradada" pnro uma forma de energia
"'inútil"'. incapaz. de produzir tr.1balho.

8.2.S - Implicações biológicas


Da Eq. (8.l2) e da Eq. (8.l3), a qta.11 define entalpia, podem-se extrair ctr-
tns implicaçõe-s biológicas:

(8.13)

As reações químicas dos sisten,as biológicos t·Cm lugar em soluções


~quosas diluídas sob temperatura, pr('Ssão e \'Olume constitntes. Quando se
cria uma condiçào na qunl 6.PV tor1\<l•SC zero, então ól-/ será igual a 4.E. Nesse
(350,pode-se substituir o \'alor de AH na Eq. (8.12) por AC (Eg.8.14).

(8.14)

Esstl cquaç.,o pode ser ent.lo transformada em

AE=AC+T·AS (8.15)

~modo, sob Te P constante$, a \'Arlação na energia total do sistema


âE, equivulentc li variaçJo no c;ilor, é n :>oma dos termos T · dS e a variaçlo na
energia livre óC. À medida que o siste1na se ;iproximn do cqullfbrio, a er1ergia
li\•re decresce par.i o mínimo.
Ora, sob cond ições de tc1nperatu ra e prc~s.lo constantes no sistema, este
troca livremente energia com o meio, nào ocorrendo, ent:relanto, troca na mas·
~. Quando um sistema sofre \•ar1ação que le\'tl a um equilíbrio# a energia total
do s istema + meio permnnece constante~ apcs.,r de n energia total do sistemn
sozinho crescer# licar constante ou decrescer. 1\0 mesmo tempo, o s istema pode
ceder calor para o meio~ ou receber calor do meio. J~ se sabe, por outro lado,
que, d urante um processo, a entropia do sistema + meio aumenta até ,1lcançar
um má),,imo no ponto de equilibrio. A for.;a que rcalmc1,te dirige qualquer pro~
cesso é a tendênciol para aumentar a entropia no uni,•erso.
A entropia s6 do sislct11a não necessnriamente aumenta dl1r,1nte um proce~·
soque se dirige para um equillbrio. Síou "'alor pode aumentar, ficar constante
ou decrescer. Se ela dtcrt'SCer, então a entropia do nt~JO de\'erA oumtntar uma
quantidade tal que faç.., com q11e a somn das variações do entropia do s istem11 e
do meio aumente. É o que acontece quando os organismos vivos crescem: a
entropia do organismo (sistema) decresce: enquanto a do meio aumenta.
A vida, já definida fi losoficament~ conlO sendo um conjunto de princípi-
os que resi.ste â morte. caracteriza-se pela busca e manuten~3o de estados alta·
mente organizados. Tal organização, seja de moléculas, organelas, células ou
tecidos, como fornlas vivas it,ais complexas_. é atingida às custas da energia
obtida do meio. A vida, pois, pode ser entendida como um processo que
"luta" contra a entropia,a desorga1lizaç.io, o caos inexorável.

8.2.6. Variação-padrão de energia livre


Considereinos uma reação química bimolecular:
aA +bB <-> cC +dD (8.16)

Nessa equa~.ão, a, b, e e d são os números das moléculas de A, 8, C e D,


substâncias químicas que participam da reação. A co1lstante de equilíbrio K'
para a Eq. (8.16) é:

K' ~ IC)' 10 ]• (8.17)


[AI' [8]•
A partir do conheci1neno do valor de K', o valor da variação da energia
livre é dado pela expressão
t.G s t.Gº+RT ln K' (8.18)

onde &Cº é a variação-padrão de c11ergia livre. Seu vaJ01 é obtido quar1do a rea-
ção se processa à temperatura de 25ºC, e todos os componentes da reação es-
tão em seu estado-padrão. O estado-padrão é uma cond ição de refer~ncia
conveniente na qual as atividades são arbitraria1nente definidas conlo uni-
dade para líquidos e sólidos puros, gases a 1 atm e conlpostos em solução
em concenitração aproximadamente lM. Segue-se, portanto, que óGº é u.n1a
constante para uma dada reação.
Oeve--se ter em mente que é o valor de óG e não o de bCº que indicará se
t1ma reaçtio é espontânea ot1 não. Entreta nto, as tabelas que se encontram nos
textos sempre incluenl os valores de ACº, porque são quantidades definjdas,
enquanto que &G pode ter qualquer valor, dependendo das condições i.mpli·
cadas na Eq. (8.17) que, obviamente, reílete-se na Eq. (8.18).
Qttando uma reação atinge o equilfbrio, óG = O. Nesse ponto, a energia
livre é míni1tla e ni'io Jlá possibilidade de posteriores transformações.
Obtén1-sc então

ac• = -RT ln K' (8.19)


ou então;
LIG'= -2,303RT log K. (8.20)
..... • ' " - · aQ 127
1
Na realidade, os \'afores de &G• !Ao adilÍ\'OS, ou seja, a v.ariaçào-padrào
de energi.1 livre de uma reação é a diferença entre ., cnergia·padri1o dos rea·
ge11tes e a cnergia·padrAo dos produtos:

a) L+M ..., N+O (11c• -8.000cal / mol)


b) N+O+-> P+Q ( AGº • +6000col / mol)
E1,t,\o: L+M ..., P+Q ( AG•· - 2.000 col f mol)
Quando as nledidas de ''ariaçAo de energia livre de unta reaçAo são fei-
tas em ot1tras temperJturas que não 2.S"'C, o \•alor de óC° de,·e ser seguido da
ind icação da tcntperatura. Da ntcs mo forml.l, o valor de t.C• é modificJdo
quando a.s rea('ÕeS cnvol\ em diferentes valores pH. A variação-padrão de
1

energia livre a pH 7,0 é dcsignt'lda como óG•.


A lõq. (8.20) possibilita o cAlculo de AG de qualquer reaç3o, a uma dada
temperatura, a p.1rtir de sua cons1ante de equilíbrio, a qual ~determinada por
m~todos l'nalíticos. Se K' • 1,0, então L\G• ; 0,0 e não ocorre q\1alquer v<'lriaç.lo
na energia livre quando 1 ntol dos reagentes é complcta me11tc convertido nos
produtos, sendo que todos os comportentes es1Jo na c:once:ntr.1ção 1.0 M. Se K'
for maior do q ue l ,O, entõo óC• :,cr.i negativo. Se K' for menor do que 1,0, L\G•
será positivo. T(lm-se assim. as reações exergõnicas e e1\dergônicas, rcspccti·
vamente. A Tab. 1 mostra uma relaçJo entre~ \•aJores de óC• e a grandeza da
constante de eqt1ilíbrio.

.\e• (cal)

• 4089 0.001
1.
• 2126 O.OI

• 1363 0,1

o
- 1:16}

2126

too
401><) tOOO

Os \•.1lorec;; d:a Tab. 8.1 for.1m obtidos con ...iderando··st" que. enl uma c;f .
lu la vivll, o eqo1líbrio ~a ti ngido, por~nl rcage1ltes e produtos são 1nantido~
dtntro de l>Str('itos limites, en1 níveil> dl> regi1nc estacionário, que podem ser
bastante diferentes dos n{veis de equilíbrio. Entretanto a energia liberada ou
utilitada em uma reação depende da magnitude com que o sistema se desvia
do equilíbrio.Na realidade, uma cxpressao matemática de AC de uma reação
deve, cnt.lo,conter dois termos: \lm indicando as concentrações atuais dos rea-
gentes e produtos e outro indicando as concentrações no equilíbrio. Assim,
para a rcaç:io
ai\ +b8 ... cC +dD
t·cmos

AC • -RTlnK' +RTln [CJ'(DJ• (8.21)


(A)' IBJ"

AC . - 2,3RT log K' + 2,JRT log ICJ' r0 1: (8.22)


(AJ' IB]

que, n 25ºC, nos leva a

AC •-1363logK'+1363log ICJ'IDJ• (8.23)


JA]' IBJ"

No equillbrio, a relaçio entre a concentração dos produtos e a dos rea-


gentes é igual a K' e, portanto, AC •O.

Logo:

LIC' • - 1363 log K' (8.24)

Desse nlodo, o valor de óGº está relncio1lado com K'.


A Tab. 8.2 mostra uma relação de valores de LICº de algumas reações de
import~ncia biológica~ calculados a partir de medidas de equilibrio e dos va·
Jores de energia livre de formaçlo. O 4G• de uma reação quimica é igual à di-
ferença entre a soma das energias livre$·padrào de formação dos produtos e a
soma das dos reagentes, levando-se em COl\ta a estequiometria da reação.
Observe-se que, na Tab. 8.2 estao indic.dos dois tipos de reações, que sc dão
com decréscimo especialmente grande na energia livre de hidrólise: a hidrólí·
se de onidridos (anidrido acético piroíosíoto) e reações de oxida(~O. Essas rca·
çO<!s sno de grande significado bioqufn\iCo nas trc;insformações de energia na
céluln.
REAÇÃO l IJ.C• (lr.caJ M\ pH 7.O e 25°C)
OxidaçJo

gli<ose- • '°z
Pahnll•to • 2302
llidr61ite
~ 6CO.z • 6H10
~ t6CO~ + 16H10
e -686

-2l38
1
1
anidrido Att1icc • H,:0 ... 2 .11«"1.1110 1 - 21.8

pirolot/.tto • ~o -+ 2 fosf;1110

gli<-O.í..r.10 •~o ~ s•><- +


-
l: J =
- s.o
3.3
- -
glutaminll + 1120 .... glut.,m11.to • NI~ - 3,4

waroH • • 1120 ~ gU~ • fruto.~ - 7,0


-
Re.tgrvp.àmf'nlo
-
g.Ji~l·fotf.tlO • gl~fosfo1110 ... 1.7

frutose--6·fosf;110 -. glic~f06f.110
' -º·"
...
Eliminll(.iO

1-
m•l•to ..,. !1.11nar•to • H,0 • 0.75
-- --

8.2.7 - Potencial de oxirredução


Oxidação é n perda de elétrons e redução é o ganho de clétrons1 SC1ldO
ambos os processos co1nplement~rcs. Um sistema de oxirredu~3o (OR) típico
pode ser escrito
(orma reduz.ida ... forma oxidada + n ~
onde n ~ o nlimcro de elétrons (e) envolvidos na reaç:io. Se um eletrodo de
nlctal inerte (pltllina ou prata) é imerso cn1 uma soluçJo de um sistema OR,
cstnbclcce-se \lnln diferença de pot·enc i ~ I l'ntre os elétrons na sol\tçào e os 1\0
1nctal. Essa condiçno dá nascimento a unl potencial de eletrodo (E), cujo valor
é assim calculado:
Eº é a cons1<1nte esp~ia l para um dado sistema conhecida como pole11cial
de cl<lrodo·padrdo (ou fem -padrâo); R a COl\Slante dos gases(= 8,314 )/mol.I<);
Ta temperattlra absoJuta; ,, o número de equivalentes envolvidos na reação; F
Faraday(= 96.494 C) necessário para converter 1 eq11ivalente de 11nt eleme1tto
em 1 equivalente de ío1ts; e ox <' rcd são concentrações das forn1as oxidada e
reduzida do s istema OR.
Um eletrodo imerso c1n uma solução de um sistema OR forma o que se
coithece como semjcélula, cuja difere1tça de potellcial é imposSÍ\'Ci 1ttedir, já
que ele é unl eletrodo siJnples. Para medí-la, deve-se combiná-lo com outra se.-
micélula, formando então un\a célula contpleta. A diferença de potencial entre
ambas as semicélulas é medida conectando-as por meio de 11n1 potenciômetro.
1>ara se determinar o potencial de eletrodo de um con1posto, 11sa-se o eletrodo
de hidrogênio como padrão de referência, cujo potencial é arbitrariamente to-
ntado como zero. Porém não há 1\e<;essidade de se fazer uso do eletrodo de hi·
drogé1tio em qualquer medida; basta qtte se use u1n eletrodo de constrt.u;ão
mais fáci l, como o de cé'llomclano, cuja diferença de potencial foi acuradamen-
te determinada en1 relação à sen\icêlula de hidrogênio. Conseqüenten1ente1
surge un1 novo símbolo Eh, onde o fndice li indica que o eletrodo de compara-
ção foi aferido e1n relação ao eletrodo de hidrogênio.

E,=E-E 11
onde EH é o potencial de eletrodo do hidrogênio que, por definição, é zero.
Portanto a equação geral para o cálculo do potencial de um s ist·e nla OR é

O valor Eh aun1entará 011 será n1ais positivo se a proporção (ox)/{red)


auntentar e dinlinuirá, ou será mais negativo (ou menos positivo)1se a forma
reduzida fo r n1aior que a oxidada. Quando ox/red • 1, Eh = E.4 • Conhecen·
do-se o valor E4 , pode-se calcular o potencial de eletrodo do sistem<'I em qual·
quer grau de oxidação ou redução. Por outro lado, o grau de oxidação pode
ser obtido medindo-se o potencial de eletrodo.
Na Tab. 8.3 estão exen1plificados ' 'ários sistemas de OR biológicos.Qual·
quer s istema será capaz de ser oxidado por um sistema mais positivo, isto é,
situado acima dele na escala, e, por sua ve.z, oxidará qualquer sistema mais
negativo que ele e, portanto, situado abaixo dele na escala. Não se deve esque.-
cerque un1 catalisador pode ser necessário a frn1 de deterntinar a reação entre
ambos os s isten1as. En1 uma reação enzimática, da formação do contplexo en·
zima-substrato (ES) resulta a necessidade de menor quantidade de energia de
ativação, ou seja, a co1nbinação da enzima com o substrato determina \ln1a di·
minuição na energia de ativação deStê último.
~-T~ 211

Note-se que s:~ refere-se a medidas feittlS no valor pH zero. o que fre--
qüentemenle é impossí"el. Usa-se o termo E. para indic.ir que o polcncial de
eletrodo-padrão foi estabelecido J u1n dndo v.-.lordo pi 1.

8.2.8 - Energia livre das reações de oXJrredução


Consideremos uma mistur.t de dois diferentes sis1emas OR. no mesmo
pH, por~m e<om potcnci.-iis diferentes. Entre ambos ocorrerá umil re.1ção. a
qual, cn1 um dado nlOn\ento, a tingirá o equil íbrio, ou scjn. os dois sistcrnas t1I·
cançaram o mc-smo potencial. Como exenlplo, tome1nos o caso do sistema
desidrogcnase succínica/ azul..de·metileno, processando-se a rea(3o, por
exemplo, no tubo de Thumberg:

s uccinato ++ íu1naralo + H 2
A~1 + H 2 +-+ AMl>f2 (8.25)

succinato + A~I ++ Í\1m;irato + A~ll 12


sendo AM aiul-dc·1nctilcno e AMH 2 aiul·dc·n\etileno rcd\1iido (lcocobase).
A const;inte de equilíbrio será

K' . (fumara to] (AMH ,J


(succínato] (AM)
1 Quando as soluções sâo "'isturadas,o sistema succinato/fumnrato, ten-
do potencial mais b.ilixo, reduz o sistema azul-de-metileno e se oxida.Conse-
qüentemente, a rela(Jo íumarato/ succinato aumenta e a relação A~1 / At\1H2
diminui, determinando \1m aumento no potencial do prhneiro sistema e um
decrfscin\O no potencial do último, até que o cquilíl>rio ~ t1lcanc;ndo, quando
então an'bos os sistemas ter~o o rncsmo pot('ncial (Eht • Eh2). A temperatura é
de30'C•n = 2.

F.-o• ~fum-~-u«l + 0 ,03.log lfumorotol = C.o


r•
(A~I A..\itU} +
O/J I (AMI
3· og '"""--'-,
(sua:inato] IAMll 2 )

AE' • O.Oll -O.OOS • O/J3.I (fumar•to)(AMll2 )


• og (succinato)(A\1) '

O/J06=0/J3.log (lumoroto)IAMH2 1
(SU«in.ltO) (AM)
REAÇÃO (escrita na form.a de redu ção E' pH 7,0(V)
M02 ... 2H' . ic _,, 1·120 + 0,816

Fc*' +e --.... Fc*: + 0,771

)1.01 +H10+2e- H10 2 • 0,30

<'ilonorno a - Fe*3 + 1é ---+ cit()('Ion~ a - Fe' 2 + 0,29


citocromoc - Fe*'+ I('---+ citocromoc- Fc*2 +0,2S

crotonll - CCJA + 2H" .. 2 e - butlrll-CoA + 0,19

ubiqu inona + 2H" + i t : - ubiquinona -H 2 + 0,10

fun\arato + 2H' + 2c ---+ succlnato + 0,030

i:AO + 2!1 + 2 é - FAOHl - O,()(,

().'(3.1().'l«t:uo + 2H' + 2e - mal.ato -0,102

et • o.:toglut.ir;ato + Nli J + 2fi T2e -~ g lulõlm;ito + li20 - 0.14

.areiakleido + 2H' + 2e ---+ e«a.nol - 0,163

p iru""to + 2tf' + 2e - l:idato - 0,190

NAD' + 2H' + 2e- NAOH + H' - o.~20

NAOP* ... 2'·r ... 2c _ , NAOPI 1+1'1* - 0,320

p ir1.1v."1to • C02 + 2H" + 2ç - r.n.iJ;ito - O.J3

,1ret1J. CoA • 2H" + 2e---+ acei.aklcido + CoA -0,-11

CO: + 2H' + 2e ~formato - 0,120

H' + lc - )1.Hz - 0420

ícl'T'Cdoxin.1 • fc'3 • Je ---+ ícrredoxin.i - Fe': - 0,432

a<etato + 2H' • 2e - a~aldcldo -0,60

acet.alo + CO: + 2H' + 2e---+ piruvato - 0,70

• A:Mrude ~ de todos os ~res. e.x:eco H que é trlll"lbCfo l!m <OnCcnl~


1&7 M.Osg~.a 1 atm de ~.
1

Como as concentrações iniciais dos quatro componentes foram iguais,


temos

0,006 • 2.0,()3.lo (fumara to) •


g )succinato)

1 (fu.marato) • O,IO
og l•uccinato)
e ent.lo:

(fumarntoJ . IAMH 2J • 1,26


)succinato) )AM]

Fazendo-se x = 1"~ de AMl·l2, temos

X
..,.,,--• l,26
100 - x

X • 55,8%

Logo, no equilíbrio, 55~ do corante estarão na forma reduzid;i. No


caso discutido, temos

L\E: • RT ln K'
11F
de onde se segue que

(8.26)

Ora, a partir dos conceitos de Termodinâmica, sabf!...se que 11G• est! rela-
ciorud1 rom K':

õG•• -RT ln K' (8.27)

Segue-se portanto, que

(8.28)
Isso significa que a variação-padrão de energia livre de un\a reação e1\·
tre dois sistemas OR pode ser calculada a partir da diferença entre os \ alores
1

t.\E~. De maneira semelhante, pode-se ca lcular a ''ariação de energia livre para


sistemas i1\dividuais e, desses dados, calcular-se a variação na energia livre
dos sistemas combinados:

Na Eq. (8.28) o valor de .6.E~ deve ser positivo, a fim de se obter AC nega-
tivo, ou seja, um valor âE~ positivo indica uma reação espontânea.
O potencial de redução de ti ma meia-re(lção, na qual as formas oxidada
e reduzida da substância estão presentes e1n concentrações não-padrão, pode
ser calculado a partir da equação de Nernst:

• 2,3RT !oxidada)
E IS E• + 108
11F !reduzida)

A 30'C, o termo 2,3RT/F = 0,06 V e, portanto,

log !oxidada)
lreduzidal

8.3 - Os níveis de energia livre


Em 1927, Eggleton & Eggleton e, pouco depois, Fiske & Subbarow isola·
ram creatina do músculo; essa s\1bstância se apresenta fosforilada e, tal como
a do fosfato de argi1tina qtle tantbént se encontra 11os músculos, tem tima e le-
vada energia de hidrólise (Fig. 8.2). Isso s ign ifica que, quando a ligação fos-
fatada se rompe, liberta energia livre de alto nivcl que ~ utilizada para o
processo de COJ\ tração ntuscula r.
Lundsgaard, em 1930, observou que o ntúsculo envenenado por iodoa-
cet(lto ainda era capaz de contração. O tipo de i1t ibição por iodoacetato já foi
estudado. Ainda 111ais, 11essas ntesmas co1tdições, o fosfato de creatina desap(l-
rccia JtO meio. Deveria haver, portanto, uma outra fonte de energia capaz de
realizar aquela ação. Supôs-se que essa fonte fosse o trifosfato de adenosina
(ATP), que já havia sido isolado de músculo, por Lohmann, em 1929. Nos
a1\0S subsequentes elucidou-se sua estrutura e o ATP mostrot1·sc ser um com·
posto rico de energia existente en1 células de animais, plantas e microrganis-
mos, com a função de arn\azenar a energia advinda das reações exergônicas
(Fig. 8.3). A energia livre produzida J\a l1idrólise de suas ligações fosfatadas é
tttiliz(lda nos processos e1tdcrgô11icos da céltila.
o
H

... C-N - POH
1 1
NH OH
1
Ciit·CH2·CH2·CH· COOH
1
NH>

o
H 1
HN - C- N - POH
1 1
H1C - N OH
1
CHzCOOH

Fot.fó\IO de eteatilf
F!cur.a8.1 - Fod'atode~efodatodt~IJl'\,l

o o o
1 1 1
HOP- O - P - o - p-OCH,
1 I 1
OH OH OH
o

F'&ura.8.l - '°"*'6t~.ATP. ~s·~.K>f. ~s·-ôfod.tto;Nf• ~


...,..s·.monofoóMoe....,_,
Apesar de ser tão importante, o ATP exl~tc nos músculos cm diminuta
toncentraçio, uma ,.ez que ele é parte do reservatório de compostos ricos de
energia, tais como os .. fosfog~nios", que são a fosfocreatina nos vertebrados e
fosfoargininl'I nos invertebrados. A reação de formação de fosfogênio é a ..rea·
ção de Lohmon .. , pois foi Lohman quem demons trou que essas substâncias cs-
t:'io em equilíbrio com ATP:


creatina +ATP +-+ AOP+íosfocreatina (8.29)
O valor ó.G'° dessa reação é pequeno, unla vez que K aproxima-se da uni·
dade. Isso tem dois s ignificados:
• a energia passa facilmente de ATP para a creatina;
• a reação se dá nos dois sentidos, dependendo da concentração dos rea·
gentes.
Há outros compostos que, como o ATP, possuem também fósfo ro lábil:
os fosfatos de uridina, de citidina e de guanosina. Esses conlpostos, por hidró-
lise de seus grupos íosfato, libcra1n energia Jivrc. Se be1n que ATP seja o rea-
gente mais comum dentre os fosfonucleosídeos.. UTP, CTP e GTP (Figs. 8.4;
8.5; 8.6) são tambénl importantes respectivamente no nletabolisnto de aç(Lca-
rcs, 1la biossíntese de lipfdeos e 1la oxidação de ácido et-<etoglutárico.

o o o
1 i i
HOP .,.,.. OP .,.,.. OPOC!i,

1 1 1
OH OH OH O

Fii"ra. 8.4 - Fosf.ltos Oc ~ VTP • ~.5·.~ UOP • Ul"iónl·Sº-<Wosfato: UMP ul"d·


t11-5'·monotosfato(iodo ~)

""'
"'- N

o o o ),
1 1 1 H 0
ttOP - OP - OPO Cf'2
1 1 1
OH OH OH o
o
o o o

HOP
1
-
1
OP -
1
OPOCK, (N
1 1 1 N
OH OH OH

Note-se que, nas fórmulas estruturais indicadas, o sinal (-) ind ica liga·
ção rica de energia.Essa Jigaçii.o ~ t-a1nbém encontrada em Olltros compostos,
fosfatados Otl não. A Tab. 8.4 mostra os valores de energia livre-padrão de hi-
drólise de algtLns co1npostos fos forilados.

COMPOSTO óCº ( kcal)

Clic-erol· l · íosfato 1 - 2,20


1
ClicOS<l·6- fo$f~tc> -J,30
~
Fru tosE-·6· fosí~to - J,80
~
' -5,00
Clucose· )·fosfato 1
ATP - 7,30
-
Fosfoarginina .. 7,70

Atttllfosfato - 10, 10

F~foc-rc:itina - 10.30
1,3-difosfogl iecr., to
-Fosfoe1,olpiru,•ato - 11.80

- 14.$0
-

8.3. 1 - Energia IM-e de hidról~e do ATP


A medida da energia livre de hidrólise do A1'P deveria ser realizada, em
princípio, a partir da eq. (8.30), util izando-se a Eq. (8.27).
All'+H,O --+ ADP+Pi (fosfato inorgãniro) (8.30)

Entretanto.. na prJricJ, a medída direta da constante de equilíbrio dessa


reação~ dificultada, principalmente porque os métodos analíticos disponíveis
11ào sllo suficicnteincntc sensíveis para deternlinnr o n1ome1lto cn' que o equi·
Jíbrio foi atingido e, conseqüentemente,. as concentra~ões de ATP, ADP e J>i
nesse ponto. lsso s.e deve ao fato de que, no equilíbrio, quase lodo o ATP ~ hi·
drolizado a ;\OP e Pi. Utilizamos, então. a natureza aditi,•a dos \•alores de
óC"O' de re<1ções co1lsecutivas, medindo a energia livre de hidrólise do ATP a
pH 7,0 a 3~C e na pl'escnçn de exccs.:-to de Mg 2•, Íílzcndo-o reagir com glicose,
na reação de hexoquinase. NcssD reação são produzidos ADP e glico·
se-6-losfato:

glicose +ATP """""""'1 glicose -6-losfato+AOP (8.31)

(K' =661; óC;· = 4,00 kcol)

Em seguida mede--sc .i constante de equilíbrio e o valor de AC., da hidró-


lise de glurose--6-fosf~to, cat.iJisada por fosfatas.e:

glicose-6 - fosfa to+ll 20 """'""" >glicosc .. losfoto (8.32)

(K'•l71;4Ci • 3,30kcal)

Somando as Eqs. (8.31) e (8.32) tem-se a equaç3o da hidrólbe de ATP.


Desde que os valores de AGº'de ambas os reações sno oditivos, pode·Sé calcu·
lar a energia Ji\ re---padrão de ATP:
1

dC;" •óC, +óc; •-4,00+(-3,30) •-7,30kcal


A reriçAo é extrcn11.1n1ente exergônico.
O grupo fosfato terminal de AOJ> tJn1bém tem o mesmo nível de energi;,
livre de hidróliSê:

AOP+ll 20~AMP+Pi(óG~• -7,30 kcal) (8.33)

Por sua vez, o grupo fosfato de AMP tem baixa energia livre de J1idrólis.c:
AMP+H,0--+odeoosina +Pi (dC~. -3,40kcal) (8.34)

Obscr'\'~se que as ligações enlrc o~ grupos fosfato são de anidrido, en·


quanto que o ligação c11tre fosfato e ribose é ligaçno de ~stcr.E.sso diferença
parece estar nas propriedades tanto dos reage11tcs quanto dos p rodutos, pois
a energia livre·padrão de hidrólise é uma medida da diferença entre a.s ener·
gias livres dos reagentes e dos produtos..
En'l pH 7,0, as 1noléculas de ATP possuc1n cargas negativas que se situ-
am n1uito próximas no espaço, repe1ind<>-se mutuamente. Existe, portanto,
um e-stresse elétrico, o qual é parcialn1cnte removido quando a ligação fosfato
terminal é hidrolisada. Os produtos rê'Sultantcs sâo os ânio1\S HP04 e ADJ>:l-,
qi1c têm muito pouca tendência a se atrair de,,ido à repulsão de cargas, e por-
tanto não se recombinam prontamente para for1nar Ai·11• Por outro lado,
qt1ando acetato de etila, por exemplo, que possui ligação de éster, hidroli-
sa-se, produz etanol (que não tem carga) e tim ânion de acétato. Esses produ-
tos não se repelem, mas possuem uma gra1tde te1\d~ncia a se recombinar.
Um outro fator que contribui tambénl. para que o ATP tenha uma grande
energia livre-padrão de hidrólise negativa é que os dois produtos de sua hi-
drólise são estabilizados como "híbridos de ressonância". Os elt'!trons em tor-
no dos átomos de fósforo e de oxigênio do fosfato terminal de ATP contpetent
entre si pelas orbitais que posstlem conteúdo energético mais baixo. Co1no re-
sultado dessa ressonância competitiva, nc1n todos os elétrons da ligação piro-
fosfórica no ATP intacto podem atingir níveis tâo baixos como os qt1e existent
en\ ADf' e HPO~. J>or outro lado, quando acetato de etila se hidrolisa, o eta1\ol
que se forma não sofre estabilização significante. O ATl1, sendo um anidrido
ácido, possui u1na caractcr[stica ressonância competitiva, ou de oposição, e
porta1tto tende a ter valores de L\.G°" bastante 1\egativos.
O tcr1no "energia de ligação fosfato" usado pelos bioquímicos 1tão deve
ser confundido com o termo "energia de ligaçtio" utilizado pelos físi-
co-químicos. Esse últi1no termo designa a energia exigida para "quebrar" uma
ligação entre dois átomos. Em Bioquímica, o termo ''energia de l~gação fosfa-
to'' é a difere11ça e1ttre a energia livre dos reagentes e a dos produtos, qua1'ldo
um composto fosforilado ~ hidrolisado produzindo fosfato inorgânico.
Um exame mais atento da Tab. 8.4 nos indica que os compostos com va-
lores 1nais negativos sofrem hidrólise mais completa no equilíbrio, ou seja,
possuem tima constante de equilíbrio maior do que aqueles co1n valores nte-
nos negativos. Ou seja, os mais negati'' ºS te1\dem a perder grupos fosfato
mais prontamente do que os menos negativos. Note-se, ainda, pelos dados da
tabela, que não há uma linha divisória entre compostos de alta energia livre
de hidrólise e os de baixa e1\ergia. Há compostos que, inclusive, possuem
energia livre de hidrólise mais negativa do que a do ATf-', o qual tem \lm \•alor
intermediário na escala termodinâmica. A i1llport.!incia do ATP reside na fun-
ção que o siste1na ATf' / ADP desempenha na célula, como um carregador in-
terntediário de grupos fosfato, originados em conlpostos de alta energia livre
de hidrólise, para compostos de baixo nível de energia.

8.3.2 - Compostos de al1a energia livre de hidrólise


Os compostos fosforilados de alta energia livre de hidrólise podem ser
di,•ididos cm duas classes: a dos compostos produzidos durante a dc-grada~ão
240 T~ÓlfNQOn~

de 1noléculas e a dos compostos que são reservatório de ligações fosfatadas ri-


cas de energia.

8.3.2. I - Compostos p<oduz<fos durante a degrada).!o de molé<:ulas


Na glicólise (ver Cap. 6) o fosfato do C-1 da mol~cula do ácido 1,3-difos-
foglicérico ~transferido para a molécula do AOP, formando-se ATP e ácido
3-fosfoglicérico em uma rcaçào catalizada pela enzima fosfogljceroquinase.
Conhece1\dO·~ a constante de eq1tilíbrio da reação de transferê1lcia de fos fato,
calcula-se a encrg:i a livre-padrão de hidrólise do ácido difosforilado.Em pH
7,0 t•m·se:

1,3 - difosfoglicerato + ADP-ll- 3 -fosfoglicernto + ATP, (8.35)


(K' = 2070; e.e•·= -4,50 kcol)

ATP+H,o~ ADP+Pi (e.e··= -7,30kcal)


Aplicando-se o princípio da adição para essa seqüência de reações, a
energia livre-padrão de hidrólise do grupo 1-fosfato do ácido será
11c•· =-7,30 + (-4,50) = -11,8 kcal

8.3.2.2 - Compos<o< qoe são reseivatórios de 1;gações fosfatadas ricas de "'1e<gia


São os fosfogênios, já discutidos. A 1latureza rica de energia de fosfoar-
ginina e fosfocreatina reside no fato de que os grupos guanidino e fosfa to so-
frem tima constrição e1n sua cstabili.zaç:lo ressonante normal. Quando o
grupo fosfato é hidrolisado, essa constrição diminui, e os produtos de reação
formanl híbridos de ressonância estáveis.

8.3.3 - Compostos de baixa energia livre de hidrólise


Quando ésteres fosfóricos de álcoois orgânicos sofrem hidrólise, o áJcool
livre, em pH 7,0, possui pouca ou 11enhuma estabilidade ressonante. Existem
enzin1as,como a gliceroquinase e a hexoquinnse, que catalisam a transferência
de grupos fosfa to de ATP para aceptores específicos para formar compostos
de bllixa energia livre de hidrólise:

ATP +glicerol g!i.:croquin.t...:;c > AOP +glicerol • 3 • fosfato (8.36)


(t>C•' = -5,10 kcal)

ATP +glicose-tl('tOSuJ~ >AOP +glicose · 6 .. fosfato (8.37)


(t>C•' = - 4,00 kcal)
Devido ao fato de os valores de óc-' dessas reações serem menos neg'1ti-
vos do que para a hídrólise de ATP1 amb4s as reações tendem para a direita.

8.3.~ - Transferência enzimática de grupos fosfato


O mlo.canisnlo pelo qual umri rcaçl'o exergõnica dirige um processo c1\·
dergõnico pode ser exemplificado pc ln shltese de um éster e a llid rólisc si1nul-
tân ~a de ATJ> cm A_M P + Pi:

a) R-COOH+HO- R' ++R-COOR'+H 20 (aGº' •+ 4000col)


b) ATP+H 20++AMP+PPi c.~c·· • - 6000cal)
Somo: RCOOH+HO-R'+ATP-> RCOOR' +AMP+PPi (àC~ = -2000G>I)

No caso presente, a reação (b) somente guiaroi a reação (a) se for COnJU·
gada a \1m intermediário comum, como no seguinte C<'ISO hipotético:
e) R·COOH + ATP++R-COO- AMP+ l'Pí (<~G" • O)

d) R·COO· AMP+HO· R' ++ I~ -COOR' +AMJ' (àG" • - 2000 c,1!)

Soma: R • COOH + HOR' +ATP-+ RCOOR' +AMP+ PPi (aG.. = -2000c~I)


P Pi • pirofosfato inorgânico

O inlermedíjrio R-COO-AMP é um ac:lladenila10 (Fig. 8.7) e é um anidri-


do entre o <icido carboxilico e o fosfato do 'cido adenílico.

o o
li t
R- e - o _.. P- 0 - CH
1 '
o
o

...,_....,. (RCOO ·AMP)


Figura 8,7 ~ (RCOO.AMP)
Na formação de um aciJadcnilato, rompe-se a ligaç:to entre o pirofosfato
e a porçtlo adcnflica do ATP, sendo o produto final um pirofosfato e não um
ortofosfato.O valor âG.. dessa ligação é algo menor do que o \'alor da primei-
ra Jigaç3o do ATP. Devido à pequena varia~3o no valor da energia livre, a sín-
tese de tam ~ster orgãnico íltrJvés desse me<anismo nllo é muito favorecida.
Os destinos metabólicos do pirofosfato parecem não ser muitos.Há,entretan-
to, pirofosfarases que catalisiim a hidr6Jisc de pirofosfatos, produzindo orto-
fosfato,rom 4c••-= -7.000 cal. Por conseguinte, a hidrólise do pirofosfato
formado duranle a síntese de um éster toma essa síntese irre\1ersfvel. Ca-
sos deste tipo englobam a síntese de nucleotldeos, polinucleotídeos e ligaçóes
de peptfdeos e a a tivaç,So de de-idos graxos.
8.3.4. t Qvônases
As quinases são enzimas que catalizam a transferência de fosfato do
ATP p.ara um a~ptor. São di\•ididas em duas grandes categorias, conforme
segue:
a) Quina.ses que catalisam transferênc,ias entre compostos cujo L\Gº' para
n )lidrólísc de cada um dclctS 6 da mesma grandeza. A trans ferência, portan10,
pode-se dar e1n a mbos os sentidos:

ADP+ loslocrealiruo ++ ATP+creatim (6G~• -1500cal;K' =10)


b) Quinases que c:iltalisltm transferência com formaç3o de compostos de
baixa energi\I de hidrólise. A reação, com todn probabilidade, ~ irreversível:

ATP +glicose++ ADP +glicosc • 6 · losfoto (LIC' ' s-4500cal e K' =4000)
De acordo com Lipman, a importância da formação de és.teres fosfóricos
reside no fato de o fosfato conferir estabilidade cinética "' moléculas termodi·
namicamente Jábeis. Assim, quanto maior a <."Stabilidadc cm água de um éstcr
fosfórico, maior será a sua \ltilidade bioquímica. Apesar de o L\Cº de hidrólise
de anidrido acético, acctilíosfa to e piroíos fato inorgânico ser du mesma gran·
dez.a para os três, a estabilidade dos m('SmOS é de poucos scgu1ldos, algumas
horas e .-lguns anos, respecti\•amente. O ATP é está\·el em 4igua. o que é de
considerâ\•el \•arttagem para a economia da célula.
O sistcm.1 ATP / ADP é n ligação obrigatória que une, como uma ponte,
os compostos fosfatados ricos de energia livre co1n os de baixo energia. Fosfo~
transferases cspec-ílicas atua1n nessa lransfcrência, tomo é o caso de q\1inasc
pirúvica(Eq. 8.38).

Fosfoenolpiruvaato + AOP-+ piruvato .... ATP (8.38)


O ATP íormado nessa rc.lção passa a ser um doador de grupo íosfnto em
uma outra rca~âo enzimática, fo rmando um co1nposto de baixa energia:
(8.39)

O resultado~ a transferi!ncia de um grtapo fosfato de um doador de alto


nível para tim aceptor de baixo nível de energia, produzindo a seguinte rea-
ção total:
Fosíocnolpiruvato +glicose-> piruvato +glicose -6 · fosfato (8.40)

Desu modo, o conteúdo de energia da nlolécula de glic:ose foi elevado


ao me-smo nível dos resíduos glicosil do glicogl!nio.
Como indica a Fig. S.S, na cadeia de reações que transfere energia na cé-
ltLla o grupo fosfato nt1nca é transferido diretame1,tc de um conjunto de alto
Ilível para ttm aceptor de baixo nível. Não se conhecem enzimas que catalisem
essas transferênci<:"is d iretas. Do mes1no modo, não existem nas células enzi-
mas que transferem grupos fosfato de um doador rico de energia como, por
exenlplo, ácido l,3·difosfoglicérico, para outro aceptor também rico de ener·
gia como o pirtlvato; ou, aiJlda, de um doador de baixo nível, como o glice-
rol-3-fosfato, par.\ um aceptor também de baixo nível, como a glicose. !'! qt1e
todas as reações de transferência de fosfato que ocorrem na céluJa devem ser
realizadas através do sistema ATP/ AOP.

FOSfOELPU:tUVATO

16
14
~
~ro
DOADORES OE FOSFATO
RICOS OE ENERGIA

12 ~ •P
RESERVATÓRIO OE
10 .-,p , / ' FOSFOCREATINA

8 ~ Jt'•P
ATP'-.
~•P-· .............
6

• ACEPTORES OE FOSFATO
OE BAIXO NNEL OE ENERGIA
"'-...... - GLICOSE-6-FOSFATO
...........
4
GLICEROL~OSFATO

01..L~~~~~~~~~~~~~

'"""ª·ª - """""~""""<-•>
8.3.S - Acoplamento de reações
Às ve-zcs uma reação endergônica, que não se processa por si mesma de·
vido a um aumento na energia livre, pode ser acoplada co1n un\a reação exer-
gônica e,. asshn,. o sistema todo se proc~rá. Para que isso ocorra, deve h(lvcr
um infennedi'íirio comum a ambas as rea~s. Assim..

A+B--+C +D (llC 1 •t{cndergonka)J (8.41)

D + L --+M+N IACi • -(cxergonka)J (8.42)

A+B+L---+C+M+N 111c~ • t{cndergonica)J (8.43)

D, formado (Eq.8.41) é um reagente para a reação seguinte (Eq.8.42) e, des·


se modo, C será formad o 1.1 pnrti r de A e 8 (Eq. 8.43). Esse coso pode ser co1\·
siderado como um exenlplo do princípio de Le Chatelicr,. segu1\do o qual
uma re1(Jo pode complet•r·se pela remO(.\o de um dos produtos. O com·
posto D é aquele que é removido pelo seu acoplamento com uma segunda
reação.
Nem scn1pre uma rcaçAo espontânca necessariamente ocorre. Assim, a
oxidaçlo de glicose, que é u1na reação conl .ó.C negativo, 1\~0 se efetua pela
simples exposição de glicose ao 0 2 atmosférico; pelo contr~rio, é preciso que
ambas as moléculas reagentes se choquem rom energia suficiente para que
haja ínteraç.lo entre suas estruturas eletrônicas.. Para tanto, essa reação, tomo
toda reação exergônica, somente ocorrerá se os reagentes tiverem um excesso
de energi3 para romper sua estabilidade. Esse excesso de energia para que
uma reaç4o te1\ha início~ denominado e11t•rgia de ntivaç4o.No f.ig. 8.9, pode-se
notar que a molécula se encontra em um nivcl energético est.ivel.Dando-sc <l
ela energia adicional (energia de ati\•açlo), a molécula passa a um estado
energético mais ele\•ado, a ~rtir do qual a reôlçAo ~ espontànea. Ourante a re--
ação libertan\-se tanto a energia livre como a energia de ativ1(3o; esta última,
pois, apesar de scc co1ldiç3o para que a rcaçllo tenha infcio e ocorra, é recupe·
rada no final da reação.
A hidrólise da uréia pode ser realizada tanto pela açlo de um áe:ido,
como catalisada enzimatic.imente através da urease. Na prC">tnça dessa ~~i·
ma a energia de ativação n~ria ~ signific.tt1v.tmente diminufda:

C02 +2NH,

Ea =24,6kcal /mol

CO(NH 2)z +H 20 ...- 1 C02 +2NH 3

En • 6,8kcal / nlol
Estado de
transição
EnerQia livre de Energia Hwe de ativação
311v;)Cto da da reaç.ão reversa
tt~não­ nào<.atallsada
eatal~

-1--·
_
Enorgia livre de
_;~a reação

variação tõt31 d3
energia livre da
reaçao

- ---- ,,.,_,.
....
;:,.,
_
ES1\!lclo

Sentido da reaçêo
Figura 8.9 ... ~dienzima.no~do~di ~de'~de t.rna reaç.10~

A necessidade de energia de ativação pode ser explicada pela distribui-


ção estatística de Max\vell-Boltzma1ln: quando se diz que uma população de
moléculas está en\ um nível de energia, quer-se dizer que a maioria das molé-
culas está nesse nível e que, portanto, algumas estarão em um nível energético
mais elevado e ot1tras em tim mais baixo. As primeiras podem t·e r energia su·
ficiente para ultrapassar a barreira energética c reagir. Na reação libertam
energia que será utilizada para ativar outras molé<:ll las. t quando então liber·
ta ·se energia senl que necessário se torne introduzir energ·i a externa ao siste-
ma. Há contudo outras reações exergônicas que não se processam_,. uma vez
que as n1oléculas mais energéticas não têm suficiente energia para reagir, na
temperatura em que o sistema se enco1ltra. É o que acontece com a glicose,
que necessita de energia calórica para reagir. O que se observa é qt1e, com um
ligeiro aquecimento, há um grande aunlento na \ 1elocidade da r(>ação, devido
ao lato de que tim maior número de moléculas passa a ter energia superior à
de ativaçlío.
Quase todas as reações metabólicas se processam atra,1és da mediação
de u1n intermediário com\lm. Quando a energia. é transferida em reações con-
secutivas via ATP, a energia química é transferida de un\ doador de alto 1\fvel
energético pé'lra o AOP, e é conservada como ATP, que é um dos produtos da
reaç.ã o. Na reação subseqüente, o ATP passa a atuar como substrato, transfe-
rindo seu grupo fosfato terminal para \lln aceptor, o qual aumenta seu conteú-
do energético. Entretanto, muitas reações consecutivas não requerem grupos
fosfato ou o ATP como intermediários comltns. Outros grupos func ionais são
r

246 ,~ .. l'frl(Õlf'I~

tamWm enzimaticol.mente tr;insíeridos, como amino, acctil, átomos de hid~


gênio e outros, em reações cujo ttatamt'nto termodinlimico é o mesmo que até
agora c.-studanloS pora a tr<\nsferência de grupos fosfa to.
Ainda no caso específico da transíer~ncia de grupos fosfato, além do
sistema ATP/ ADP, os S'·di e trifosfatos de outros ribonucleosideos e
2·desoxirribonucleosfdeos t.1mbfm participam nas transferênci.lS de energia
na ct11ula . Esses compostos íosforilados nl'\o servem s6 como precu rsores de
ácidos nucléicos, n1as atuam nas cadeias de reações que transfcrc1n energia
química. Essa tr;1ru.ferência, contudo, é feita através d<.> reaç-ões ronwadas
com o ATP atr.l\'és da media(àO da enzima difosfoqui_nase de nucleosídeo,
encontrada nos n1itocôndrias e no citoplasma solúvel das célula:,. As reações
por ela cata l i~dns são revcnl\reis, e sAo rcla tivanlcntc não·espcc(íicas cm
rcht(IO ao substrato. Há transferência de fosfato de qualquer XTP para qual·
quer XDP. Sua. K'•J,0 em pH 7,0 independe da natureza dos reagentes, uma
vez que a energin livre de hidrólise do grupo fosfato terminal de todos os
5'-t rl(osíatos é nproxi1n adan\ente a mcsn\a, A Fig. 8. 10 mostra con10 os grt1-
pos fosfato ricos de energia entram nas várias vins de biossí1l tcsc, a través
dos s· -trifosfatos.

_,, .• :::1
(",..

Upldooe 1
~--~ .~


Fip<tt.10 - ~ccmo••~esde~ "*°'ncosdeet'llfllil
...
8.4 - Energética dos sistemas abertos
A .ln"11ise dos sistemas fechJdos é «!lativamente simples, porque s.lo
ronsider.ldos somente os estados inicial e íin..11 de um sistema após alcanç.lr o
e
equilíbrio. o caso das reações enzi1náticas individuais. Entretanto, quando
se tenta aplicar esses conhecimentos às cf.11ulns intactas, as dificuldades tor-
na1n-st grandes, pois as células vivas sl'io sislt'11ns alh!rtos. Como tais, e las tro·
cn 1n 1nfltérla co1n seu 1neio e, a lén' dis:,o, nu1\ca entram totalnlcntc c 1n
equilíbrio. Ot1 seja. em nenhum 1non\Cnto, unla célula vi\•a existe c1n regi·
me estacionário, no qual a intensidade de entrada de matéria é igual à in-
tensidade de saída de matéria.
O., sistemas abertos em n.:l~uilfbrio slo estudados através da trrmodt-
n6"1i€• dM proa:ssos i"etYTSí~is 011 di'-nAo-niutlfbrio, que não di5cutircmos
~qu1. De\'emos lembrar, entretanto, que um sístema aberto em regime estttc10-
nário é C.lp.iz de produzir trab;Jlho ju~t;imcntc porque está longe do cquilí·
brio. Jd s;.1bemos que sistemas no ponto de equilíbrio são íncapa ..cs de
produ1ir tr.lb<'llho. E, por e:st<'lrcm longe do equilíbrio, os sistemas abertos po·
dcm :,.er controlados e regulados. Alt1111do1nais, conlo bem lembra Lchningcr,
Nno forn1rtl isn10 da Termodinâmica do 11l1o·cquilíbrio, a condiçtl.o de reginle
estaciondrlo, que é característica de toda nldquina que está fu1lcionando bem.
pode ser considerada como o tstado ordt'undo de u111 sistema aberto, ou seja, o
estado no qual há um mínimo de produçAo de entropia". Ainda mais: todo o
pr0ttsso de biossíntese de macromoléculas e do d~vol\•imcnto celular é
uma poder0So1 força antientrópica. Como ress.ilta Katchalsky, *desde que n~o
~ podt escapar do destino cntr6pito de todos os fenômenos, O!> organismos vi·
\•os. mantendo um regime estacionário. produzem entropia com um mínimo
de intensidade ...

Uteratura recomendada

llltAY. lf.C. • \VHITE. K.. Cinltlc.a y ttnnodinlimic..a f'n bioqu(mi<• Z.r-.t.gou. Ed


A<rlbt•. 19S&.
DA\\l'ES, E.A Qu.a.ntit..ltivt probltms I" lllochf'mlttty. Edimburgo. E.$. Li\'t"""tonf
Ltd, 19'67.
INCR.AJ.IA)l.1, L.L. &. PARDEE, A.8. Frçe \"f\CfíÇ)' olnd t'ntrop)' in mel.tboll:!im l n: "°ltl•·
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SECEL, J.E. Bioch emic:il coalculoation s. Nov.i York. John \.\li.ll'Y & Sons, lnc., 1968.
PROCESSO ,
BIO~ECNOLOGICO,
INDUSTRIAL GENERICO
Walter Borzani

Umll vez completado o exame de /11ndan1entos ind ispensáveis ao ~tudo


de problemas de c,,geultaria (prirlcipal objetivo do Vol\tme 2) e de aspectos dé
trc,,ologin (reunidos nos volumes 3 e 4) Inerentes aos processos biotec1lológi-
cos industriais, parece-nos aconselhável apresentar, aos alunos que cst3o se
inici3ndo no campo da Biotecnologia Industrial, uma repr~ntação esqucmá·
tica de um prc><esso biotecnológico industrial genérico, procurando destacar
as princi~i.s etapas que o constituem.
O aluno poderá assim, quando do estudo de um tópico especffico, situar
a posiç:to desse tópico no contexto gcr.ll do processo que esteja sendo cx.imi-
nado.
Em qualquer processo biotecnológico industrial, o elemento central é o
rt·ntor, pois nele se desenvolvem, dcvldl'lnlentc controladas, as trl.lnsfor1nações
que nos lntcrcssanl.
Isso não quer dizer que o reJtor constitua a etapa mais inlporll'lntc do
processo. Para que o resultado que se t~m cm vista seja alcançado, dois outros
conjuntos de operações devem ser também cuidadosamente con.slderados, a
saber:
1) Os trat11mtnlos initiai! ("'Upstream processes'"),. que antecedem a o~
raç:tio no re;11or e cuja finalidade: é COIO(ar o sistema nas condições previa-
mente escolhidas, para que as tran:.formações, no reator, se desenvolvam a
contento;
2) Os lrntatt1tntos finais ("Do,vnstrcam processes''), que englob;im a sepa-
ração e a p\1ríficação dos prodt1tos e subprodutos obtidos, bem como o tra ta~
mcnto dos rcsfd\10$ formados.
A Fig. 9.1 representa, esquemática e resunlidamente, o que (oi dito até
este momento.

-'Qent.oi da&
lrans~

Reator


Tratamento
dO<
tesldU05

Quando os agentes das transforrnaç-ões que ocorrem i\o rcotor são ou


uma enzima (purificada ou tu'io). ou u1na mistura de enzimas (também mais
ou menos purificadas). ou ainda células inativadas ou mortas (que. neste caso,.
(uncionam como simples suportes da) <'nzimas), o processo recebe 01 denomi-
nação genérica d<' procnso etrzi,nático.
f>or outro lado, se os age1ltes das tr;_ins(ormaç-õcs são microrganlsmos vi·
\'OS,. de modo que as reações que se desen\'Ol\'em no reator são conseqüências
da atividadt ' 'ilal das células microbianas, o pTOC'e':tSO é denominado pr-ocdSO
ferr1tt11tat1vo. Nesse caso, o reator é, muito freqüentemente, também chamado
ferruentador ou dornn.
Cuntprc não esquecer q ue a a tividade vital dos microrganismos respon-
~\'eis por um processo fcnnentati\•O é sempre o re~ultado de considerável
número de reações enzimJtica.s. A rigor. portanto, quer nos processos chama-
dos en::inuft;cqs, quer nos denominados frrm~ntatit105, enzimas sJo, em última
onálise, os cntalisadores da:, transíormnc;ões que ocorrem no reator.
Dois casos import<tttt(.'S, que alguns autores englobant tantbóm na cate-
goria de prOtt':SSOS fermentati,•os, são aqueles em que os agentes das lransfor·
mações sAo ou células de tecidos (animais ou "1ege1ais), ou vírus.
Em que pese o fato de a Fig. 9. 1 poder representar, em suas linhas gern·
Is, tanto processos eniÍll\áticos quanto proceSSO$ fer mentativos. parece-nos
conveniente, com relaç-Ao a estes últimos, aprescnta.r 1na is porn\enorizada-
mente as etapas que os constituem. é. o que nos mostra a Fig. 9.2. Cumpre,
('()f'ltudo, informar que n<'m todos os processos fennentati\•OS industriais com·
,
251

preendem todas as etapas indicadas na Fig. 9.2. Dependendo do processo con·


siderado, un\a ou 1nais dessas etapas podem não existir, co1no será visto no
Vol\tme 3 desta série Oiotecnologia Industrial.

.....
Cultura

MCiOde
termentaçêo
(mc>SIO)

ln<>cuk> EsteriliZaÇllo E~o


(labota!órlo)

Cultivo
Industrial

ln<>cuk>

Esterilização Fermentador
(reator. dorna)

,_ielo Reslduos
fennentado

Tratal'O&l\IO
do<
reslduos

Produtos

- ALGUMAS
1]_ ® APLICAÇÕES
- INDUSTRIAIS
W alter Borzani

Os dois ú1timos volumes desta Cole\'30 tratam de exanlinar, com os por·


menores cab(veis em cada caso, vários processos biotecnológicos de interesse
industrial.
Parece-nos recomendável, contudo, a aprcsentaçlo de uma enumeração
sucinta de aplk:.ações da Biotecnologia no setor industrial, para que o aluno
possa, desde já, fater uma idéia geral da import3ncia da Biotecnologia lndus-
trial e m nossos dias.
Convém destacar, porém, que a relação de exemplos co1'1Síderada nes te
capítulo não só nlo é completa, como também nitio pretende est;ibclccer qual-
quer ordem de importância rrlati\'a dos processos que serJo apontados. ~1es­
mo porque a dinâmica inerente aos complexos sistemas sócio-«0nômicos,
tanto em OÍ\'CI regional como em nível mundial, pode fazer com que um dado
processo, hoje pouco relevante enl uma deternlinada região, passe a ser, às \'C-
zes a prazo rclativa1nente curto, de fundame1\tal importâncin 1\C'Sta mesma re-
gi4o, e vice-vers..i.
Processos (c-nnerttati\'05 sAo utiliz.ados industTialmente na produção de
bebidas alcoólic.11.s (cen·ejas, vinhos, sidras, aguardentes), vinagres, etanol,
ácidos org.lnicos (cítrico, lático, fumárico, gibcrélico). SOJ\•entl"S (butano), ace-
ton\\, isopropanol), vitaminas (ribo(Javina, ácido <.'lscórbico, cobala1ni1\as, er~
gosterol), antibióticos (penicilinas, estreptomicinn, tetraciclinas, griseofulvin),
polissacarídcos (dextrdnios), amh\oácidos (lisina, ~cido glut.lmico), esteróides
modificados (por hidroxilaçAo, hidrogenação, desidrogenaçAo, hidrólise, este-
rificaçJo, isomeri1..ação, aminaç.lo, ruptura de cadeia lateral), leites fermenta-
dos (iogurte, leites acidófilos), manteigas, q\1eijos, picles, chucrute, azeitonas,
plo,. cacau, lipídl"OS, ensilagcm, várias proteínas. Metais diversos (cobre, zin-
co, prata, ouro, urti1\io) podc1n ser obtidos por (cr1ncntação, a pnrtir de m in~-
rios de baixo teor. Os processos de tratamento biológico de resíduos (águas
residuárias, lixo) são, tan1bém, processos fe rmentativos. Nâo podem deixar de
ser citados, para encerrar esta relação, os processos fern1entativos que têm por
objetivo a produção indl1strial de microrganismos qlte, por sua ''eZ, podem
ser utilizados:
1) Como agentes de Ol1tros processos fermentati\1os (le\1eduras para pa·
nificaç-ão, levedltras para produção de e tttno1, bactérias para tratamento bioló·
gico de efluentes);
2) Na alimentação do homem e de anin1ais, quer na forma de concc11tra·
dos protéico·vitaminicos (algas, le,red\1ras do gênero Candida), quer no enri·
quecin1ento protéico, principalmente pe-la ação de bolores, de vários materiais
(farinhas, farelos, resíduos da i11dustrialização de frt1tas);
3) Como fixadores de nitrogênio do ar na agricultura (bactérias do gê11e·
ro Rllizobiun1);
4) No cor'ltrolc biológico de pragas (bactérias do gênero 8ncill11s);
.S) Na prodl1ção de \1acinas (bactérias dos gêneros Cory1rehacteri1111r, Bor·
detella, Neisseria, Mycobncteriu1u).
Quanto à utilização de c11zinlas, principalme11te em meio aquoso, con10
ttgentes de transíorn1ações em escala ii1dustrial, Cltmpre ressaltar qlre sua lnl·
portãncia ven1 crescendo acentuadamente. Citemos, senlpre de n1aneira rest1·
nl.ida, algl1n1as indústrias em que são utilizados preparados enzimáticos para
fins específicos: cer, ejaria (amilast?S, anliloglicosidase, papaí11a), pa11ificaçâo
1

(amilases, pepsi11a, lipascs), produção de edulcora.n tes (alfaa1l1ilase, i11,1crtase,


glicosc-isomcrase), indústria têxtil (alfaamilase, celulases), produção de ''inhos
e sucos (pectinases), indtístria do leite (lact.lse, catalase, lipases), indústria far·
macêutica (celulases, bromelina, penicilina·acilasc, pancreatina), indústria de
carnes (papaína), fabricação de queijos (reninas), produção de detergentes (prop
teases), indústria do pescado (proteases), curtt1me (pancreatina).

Literatura recomendada

1) ILLANES, A. 6iotecnologia de Enzimas. Ediciones UnivtNiit'1ri<15 de V<1lpar-aiso de


ltl Universidad Ca16lica de Valparaiso, Valparaiso (1994).
2) PRESCOTT, S.C. & DUNI\\ C.G. Industrial Mi<robiology. r...1cGra"··HHI, Novn Yotk
(1959).
3) R..EEO, C. Prts<OU & Dun1\'S lndust ri.tl l\1ic-robiology. The AVI Publishing Com·
p.1ny, Westport (19$2).
4) REHM.. H.j . & REED, C. Biotechnology (Coleção de oito volumt>S public.1dos a p.1rtir
de 1981). Verias Chen,ie, Weinheim.