30 20 _p-Nitrofonol (ol/mal de enaima) 1 2 ‘Tiempo (min) 7, rola nO PNitrofenilacctato “7 —_p-Nitratenol / tke S208 Stem oo™N i CHy—C-on ‘ido aestico FIOURA 6-19 Pruebas exstencia de un intermediarioaciLenzima, La hid del pro fenilacetato pola quienouipsina ce mide por la bora dl p-itro- fen producto coloreado). nicialment, se observa una liberacion ‘pila burst de una cantidd de p-itrofenal que es cai estequionn- ttca con la camtdad de enzima presente, Fo es consecuencia de la fase rip de acilacién de la reaccién. La velocidad posterior es me- ‘ar porque el recambio del enzima viene linitado por la velocidad de a fase més lonia de desacilaci, Se han deducido otras caracteristieas del mecanisma de la ‘qumotripsina mediante el smilie de la dependeneia de a eae ion det pH. La veloc de Ia hidrslisis entaizadla por Ia que :motripsina reprosontada frente al pH suele tener forma de ccampana (Fig, 6-20), Las voloeidades representacdas en lt Fi- ura 6-20a se obtuvieron a concentraciones de sustrato baja (Por debajo dela saturacién) y son indicativas por tanto del a lor de fu /K. La grafic se puede disecelonar mediante la ob- tencidn en primer lugar de las velocidades mésximas a cada pl ‘ora representar a continuacién los valores dex Soka. con res ecto al pH (Fig, 6-200); despues de obtener Ia Aya cada pt ¢s posible representar los Valores de L/K, (Fig. 6-20e). Bstue dos einéticos y enzimétices han demostrado que los carubios ng eflejan el estado de ionizacion dela His™, El descenso de Kea DH bajo es el resultado dela protons de ka His (que no puede en esta situacién extraer un proton de la Ser™® en el paso @)de la reaceiéin; vase Pig 6-21). sta reduccién fen la velocidad ihistra la importanea 1a caldliss cido base 64 Elemplos de reacciones enzimaticas 218 deneral en el meranismo de la quimotsipsina. Los cambios en ky refejan Ia ionizacion del grupo a-amino dle la Te" (en el ‘extreme amino-terminal densa de las tres cadens polieptii- cas de la quimotripsina), Este grupo Forma un puente salino cont Asp", estabilizando la eonformsicién activa del enzit Cuando este grupo pierde su provin a pH elevado, desaparcee «1 puente salino y se procluce un cambio conformacional que @ [a e ¢ 7 8 8 Ww pat Oo) thaw EE «7 8 ® Wo pH © FIGURA 6-20 Dependencia del pH dela resecincataizada por Ia quimotripsina (a) La velocidad dela reaeci6n eatalzads por la qui ‘motrpsinarepresentada fente al pH genera una curva en forma de ‘ampana con un pH dptimo a 8,0. La velocidad iv) que se representa se ha obtenido a bujas cancentraciones de sustao, por lo que rete ino hear a ica se puede descomponer usando mods O > N > C=S>P =H, Por ejemplo, os dos pares de electrones que forman 1m enlace C=O (carbonilo) no se encuentran repartidos, ‘uniformemente; el carbomo es reativamente electrodefieiente, rniertras que el oxigeno atrae ms alos electrones. Muchas reacciones entrafan la actuacion de tn atom reo en electrones an nuclesfiio) que reacciona com un atomo deficiente en tlectrones (un electréfilo), A a derecha se muestran algunos nuclesflos y electrilos comunes en bioguitnica. En general, una reacci6n se inicia en un par electrénico no ccompartido de un nucleéfilo, En los diagramas de mecanismos, la hase dela fecha de empuje electénico eta stada ceca de os Nuclestilos Electréfios ros del par de eleetonesy Ta caleza apuna dreetanente a unt eleetrofles que eta siendoatacado. Al dande un par de =e ® fears no compara contr una cars negara fala of £ nuclec, el mismo sl negative puede represent l par Origen cargado nege- electrones no compartido y servir de base de la lech, En el tivamante (como on el > ‘mecanismo de la quimotripsina, el par de electranes nucleofilico ‘grupo hidroxilo no pro- __Atomo de earone de un del complejo BS entre los pasos (Dy @) es aportado por el ‘tanado o en un dcido grupo carbonilo (el oxigeno ‘oxigeno del grupo hidroxilo de la Ser!™. Este par de electrones (2 ‘carboxilieo ionizado) eee ction eae de Jo 8 electrones de valencia del oxigeno hidraxsico)eonstibuye oe hese ene lace de a lecha curvada. El centro elctrofiio que esta -s Siero ataado ese eartono carbonic del enlace peptidico que Sulhidrl careado R Se vaa hidrolizar. Los étomas de C, Oy Ntienen unmiximo de8 _negativamente P Los Loe antieuerpos cataiticas no se acerean genenalmente ‘la eficaca eatalitica de los ensias, pero a pesar de eso es ‘an emergiendo aplicaciones médlieas © industriales para ‘ellos, Por ejemplo, se est investigando silos anticuerpos ca talitions disenados para deradar cacaina podrian ser ities fenel tratamiento de a adiion ala coca, Hidrélisis de ésteres a no Aniilogo (ésterfosfonato) Hidrélisis de carbonatos on i L Se 5 20, BN i " o NO, 2, Productos Bstado de transicion o Ht of 9. WN b 4 b Now Anslogo (6sterfoefonato) FIGURA 2. fads de tanscion esperads pare las reactiones de ides de stones y de carbonate. Los compuestoséser fost rato y ster fsfato consttuyen, respectivamente, bends andlogos del estado de tansicin de esas reneciones.222° Capitulo Enzimas Gtu*"” actiia como un catalizador dcido general, cedienda un rot6n al grupo —OH salient Bl proton en C-2 del 2-fosfoglicerato no es muy aefdieo por lo que no se extrae fécimente, Sin embargo, en el ito ae {iyo del enzima, el 2-osfoslicerato esta sometido a interaccio- nes ignicas fuertes con dos iones Mg"* unidos (Fig. 6-23), ‘que convierten al protén C-2 en més actica (disminuyendo su PK,), haciondo ms féeil sx extraceidn, Enlaces de hidrégeno ‘con otras resiciuos aminodicidos de! sitio active también conti- Duyen al mecanismo global. Las diversas interacciones estabi- lizan efectivamente tanto el intermediario enolate como el ‘estado de transicién que precede a su formacién. El lisozima utiliza dos reacclones de desplazamiento nucleofilice sucesivas Elisozima es un agente antibacteriano natural que se encuen twa en las Lagrimas y en la clara del huevo. Bl isozima de elara de huevo de galina (M, 14.296) es un mondémero de 129 ami- nodcides. Fue el primer enzima para el que se determing la estructura tridimensional, a cargo de David Philips y colabo- radotes en 1965. En la estructura se observan cuatro enlaces isulfaro estabilizadores y una hendidura que contiene el sitio activo (Fig, &-24a; véase también Fig, 4-18), Mas de cinco dé- cadlas de investigacidn sobre ol lisosima han permitido obtener una imagen detallada sobre la estructura y la actividad del en. ‘ima, ademis de una interesante historia sobre las vias de pro- _greso de la ciencia bioguimica Bl sustrato del lisozima es una molécula de peptidoslu- ‘ano, un polisacarido que se encuentra en muchas paredes Dacterianas (véase Fig, 7-22). El isorima rompe el enlace glue cosittico C—O (B14) entre dos tipos de axiicares de la ‘molécula, el Acido N-acetiimurdmico (Mur2Ae) y la N-acetil lucosamina (GleNAc), frecuentemente denaminades NAM y NAG, respectivamente, en la bibliografla elentifia sobre enzi- mologia (Fig. 6-240), Seis residuos altemnas de Mur2Ac y GleNAc del peptidoglucano se uen al sitio active en Tos sitios de unidn marcados con las letras A a F. La construecion de modelos rioleculares ha mostratio que la eadlena lateral lactilo de Mur2Ac no puede acomodarse en los sitios C y B, por lo ‘que su ubicaciGn se restringe a los sitios B, D y F. Sélo se rompe uno de los enlaces glucosidieos unidos, el que se en- ‘cuenta entre un residuo de Mur2Ac en el sitio D y un residuo de GleNAc en el sitio E. Los aminodetdos catalitics clave del sitio activo son Glu” y Asp™ (Pig, 6-25a). La reaeeién es una sustitueisn nucleofiica en la que un —OH del agua reemplaza a GlcNAc en la posicién C-1 de Mur2Ae. Después dela identificacién de los residues del sitio ac- tivoy de ia obtencién de la estructura detallada del enzima, en la década de 1960 parecia que el camino hacia la comprensién del mecanismo de reaccién quedaba expedito, Sin embargo, ‘durante décadas no fue posible obtener pruebas definitivas a favor de ningiin mecanismo determinatlo, Bxisten dos meca- nnismos quimticamente razonables que podrian dar lugar a los productos observados en la rotura de enlaces glucosidicos fa- eilitada por el lisozima, Philips y colaboradores propusiexon tn mecanisto dtacativo (de tipo 1) (Pie. 6-25, iz ends), mediante el cual se preshice en primer lara dio. ciacién de GleNAc en el paso (D), dejando un intermediario de catién glcosilo (un earbocalin). En este mecenlsm, la GleNAesalente es protonada mediante cats cid general por el Glu, localizado en una bolsa hidrofébica que confiere tn pk, excepcionalmente elevade a su grupo carboxy, El carbocatin se etal por reonancta con el oxigen aaya- cente ene nll y medarueinteraccin elestonttica oon la carga negativa del Asp cereano. Bel paso @), na motécula de agua ata el C-1 de Mur2Ae para dare producto, Hl me- canismo alternativo (Fig. 6-26a, derecha) supone dos pasos de despacamenta directo (de tipo 82) conaecutece Bn paso (D, of Asp™ staca el C1 de MuraAe y despleza la GleNAc. Al igual que en el primer mecanismo, el Glu® actia camo un éeldo general y protona la GleNAe sallente. En el paso @) una moléeia de agua atacaelC-1 de Mur2Ac, des- plazando el Asp™ y generando el producto. El mecanisma de Philips (8,1), basido en consderacio nes estrucimlesyspoyado por ua varledad de estudio de Ajacién con sustratosartfclales ue aceptado durante muds de tres décadas. Sin embargo, sgu6cxistondo lela contro- ‘versiay continuaron los experiments. A vees, el arance del todo cientSo es lento en algunos temas y puede ser dill dlvenar un experimento realmente eslarecedor.Algunos de tos primorosargimentos dsfovorables al mecariam de Phi lps eran sugerenias pero no totalmente persuasive. Por elempln, se esimaba que a vida media del earboralion pro ‘puesto en el mecanismo era de 10~" segundos, justo un paco mayor que ura vibracén molecular yno lo sufcientemente larga como para permitir la necesaria difusién de otras molé- cul. Mas importante todavia isoaima es un miembro de a familia de enzimas que actian con “retencién de la configura- clon yeatalzan recciones en is que el product tlene la misma cnfiguracén anomica que sustrato (las configure clones anomérias de los glides se examinarén en el Cap vulo 7); 9¢ sabe que estos enzimas presenta intermediarios covalentesreatios como el propuest en el macanism Se alternative, Por todo ello, el mecanisin de Philips contrade: cin lo datas experimentles de enzmasestrecharente rela: ctonados cone ‘Unexperimento cargo de Stephen Withers y claborado- res en 2001 incline la discusion decidiamente &tavor dela ruta Sy2. Utilizando un enzima mutante (con el residuo 35. cambiado de Ghu a Gin) y sustratos artificiales para que, combi- ‘dos, eran ga aun descenso en a velocidad de los paso lave dea reacin, eto ivetigadores fueron eapaces dee tabilarel eluivo intermediaiocovalene. El les peels a suveeotservar el intermediaro dieclamente mediante espe trometria de masas y cristalografia de rayos X (Pig. 6-25b). ‘Puede considearse que el mecanisro del Istria esi sya dernostrado? No. Un aspect clave del méiodo entific, como arguments Albert Binsin en una ocasn, es "No puede haber experinentonsufcentes para demostrar qu esty en Jo cierto; en cambio, un solo experimento puede demostrar tue estoy enutvocad, En el caso del mecanlame del Heoima6.4 Ejomplos de reacelones enzimétlcas 223 « on hvac onié\ \sesvow |@ Medutador positive co} ® Enolima menos activa Enzima mds netivo Complejo cenzima svstrato ‘clive FIGURA 6-26 Inteacciones entre subunidades en un enzima alosté rico interaciones con inhibidores y activadores. En muchos ena ‘mas alostéicas el sitio de fijaciéin del sustata ye! sitio, 0 sitios, de fjacién do! modulador se encuentian en subunidades diferentes, Ie subunidades cataltica (Cy la reguladora(),respectivamente La f jacisn del modulador postiva (estimulador, M) a su sito especticn fen la subuniad reguladora se comunica a la subunidad caaltica mediante un cambio conformacional Este cambio hace que la suet dad catalitica sea activa y capaz de jar el sustato (8) con mayor afinidad. Al separarse el madulador de la subunidad eegutador, ef ‘enim welve a su forma inativa, 0 menos ata. ‘mas activas ¢ inactivas, por lo que los efectes cinéticns son de indole distintas, Las propiedadtes de los enzimasalostérleas son significa vamente diferentes a in de los enzimas no reguladores senei los. Algunas de las diferencias son estructurales, Adems de sitios activos, los enizimas alostéricos enen generalmente mo ‘o mids sitios reguladores o alostéricos para Ta fjacién del mo: ‘dulador (Fig. 6-26), Del mistuo modo que el sitio activo de un ‘encima es especifico para su sustrato, enda sitio regulador es ‘especifico para su modulador. Los enzimas con varios modula ores tlenen generalmente diferentes sitios de fijacion espec ‘cos para cada imo de ellos. En los enziias homotr6picos el, sitio activo y et sitio regutador son el miso. Generalmente los enzimas alostériens también son mayores {¥ ms complejos que los enzimas sencillos. La mayoria tienen ‘dos 0 mis cadenos polipeptidicas 0 subunidades, La aspartato transcarbarailasa, que calaliza la primera reaceisn de la bio sintesis de nucleotidos pibimidinicos (véase Fig. 22-36), tiene 12 eadenas polipeptidicas organizaas en subunidares eatalit cas y regulardoras. La Figura 6-27 muestra la estructura cu ‘emaria de este encima cleducida a partir de anslss de raves. En muchas rutas las etapas reguladoras estan catalizadas por enzimas alostéricos En algunos sistemas muitienzimiticos el enzima regulador es Ithibido de forma especifien por el producto final de la ruta siempre que e! proclucto final se acumule en exceso a las ne ccesidades de la echula, Cuando la reaceién del enema regula dor se hace mis lenta, todos ls entimas posteriores operant a velocidad reducida, ya que sus sustratos se encuentran en me FIGURA 6-27 Dos perspectivas del enzima regulador aspartato twanscarbamilasa. (De PDB 10 2AT2.) Este enzima regulador alost® rico tiene dos agrupaciones calaiicas apiladas, cada una de as eu les contene es cadenas poipeptidicas caalticas fen tones de azul y ptpuraly wes agrupaciones reguladora, cada una con clos cadmas polipepiicas eguladoras (en rojo y amare). Los agropamientos re kguladores formar los vétices de un ring que rade la subi {es catalticas. Ls stios de faci de los meslladosesalentéricos se lencuontran en las subunidades reguladaras La fijcién del modula dor produce grandes cambios en la eoniormaciny actividad del en ima. Enel Capitulo 22 se tatan el papel de este enzima en la sinks {de nuclesidos y los detalles de sa regulaciénnor concentraciOn. De este modo se equlibra la velocidad de {formaci6n cel produeto final cam las necesidades de la celal, Este tipo de regulacién se denomina retroinhibicién. La acu- ‘mulacién del producto fal de la ruta hace que, en ttimo tér- ‘mino, toda la ruta funcione ms lentamente, Uno de los primeros ejemplos descubiertos de retroinhibi- cidn alostéria fue el sistema enzimtico bacteriano que cata- liza Ia conversi6n en cinco pasos de 1-treonina en Lisoleucina (Pig. 628). Bl primer enzima de este sistema, la treonina des- hhdratsa, os inhtbido por i isoleucina, que es el producto dela lima reaccién de la sorie. Bste es un ejemplo de inkibicién Alosterica heterotrdpica. La isoleucina es muy especifica como inkibidor. Ning otro intermediario de esta secuencla de eac- clones inibe i treonina deshidratasa, ni ningiin otro enzima, de la secuencia os inibido por la isoleucira. La isoleucina no 5 fija a sitio activo, sina a otto sitio especifien de la molécula cerwimtica denominado sitio regulador. Esta fjacién es de tipo no covalente, por lo que es ficilmente reversible; si disminuye Ja concentracién de isoleucina, aumenta la actividad de ceshi ‘ratacion de la treonina. De este modo la actividad de la treo nina deshidratasa responde répida y reversiblemente a las fuctuaciones en la concentracin celular de isoleucina. Las propiedades cinéticas de los enzimas alostéricos differen del comportamiento de Michaelis-Menten {Los enzimas alostéricos muestran una relacidn entre ¥,y [S] {que difiere del comportamiento cinética de Michaelis-Menten, Aunque se saturan con el sustrato cuando [8] es suficiente- mente elevada, la mayoria de enzimas alostéricos dan lugar a una curva de saturacisn sigmotdea cuando se representa Vy frente a(S] (Fig. 6-29), en ugar de la curva hiperbolieatipien de los encimas no reguladores, Bn la curva de saturaci6n sig- moidea podemios encontrar un valor de [S} ala que Vi es la rl- tad de la maxima, pero no nos paderos refer al mismo com la esignacin Kp, ya que el enzima no sigue larelacién hipecb6- lica de Michaelis-Menten, En su Iigar se uilizan a menudo los simbolos [S]y5.0 Kp para representar la coneentracin de su5- trato que da a mitad de la velocidad maxima de Ia reacsion ea talizada por un enaima alostérico (Fig. 6-29), Bl comportamiento cinético sigmoiden es generalmente el reflejo de interacciones cooperativas entre las subunidades proteicas.Dicho de otro modo, los cambios en la estructura de ‘una subunidad se tradueen en cambios estructurales en las subunidacles adyacentes, efecto que es faciftaco por interac clones no covalentes en la interfase entre subunidades. Los principios son similares a los discutios para la cooperatividad, cen a fijactin de O, ala hemoglobina, Bl comportamiento ciné= tico sigmoidal se explica mediante los modelos concertado y secuencinl de interaceisn de subunidades (véase Fig, 5-15) Los enzimas alostéricos homotrépicos suelen ser protot- ‘nas multisubunidad y, como se ha visto antes, el mismo sitio de fjacion de cada subunidad funciona ala vea eomo sitio ac tivo ¥ como sitio regulador. Normalmente, el sustrato puede funcionar como modulador positive (activador) porque las su bbunidades actian de forma cooperativa: Ja fjacién de una mo- FIGURA 6-28 Retroinhibicidn. La conversién de la L-reonina en ‘soleucina ets catalzada por una seeuencia de cincaenzimas (Ea Ep. La teonina deshiiatas (,) s inhibid aloséicamente de ma- neta especica por la \-isoleucna, producto final dela secuencia, ero 90 poe ningun de los custo intermedi (Aa D) La retin hibicin se inden por la linea a tazos y por elsimbolo & en la fle- ‘cha de la reaceién de la teonina deshdratasa, un recurso que se utiliza en to ese lib, Iecula de sustrato a un sitio de Ajacién altera la conformacion, del enzitra, facilitando ta fliacion de otras moléeutlas de sus- trato,Bsto expla el inerementosigmodeo en hugar de hiper- Dlico de Val aumentar[], Una caracterfstca de las einéticas sigmoideas consiste en que peauenios cambios en la concen- tracin de un modulador se pueden asociar con grancles eam- bios en la actividad. Como es evidente en Ja Figura 6-29, un Ineremenio relativamente pequeio en (S| en la parte de mayor pendiente de la curva provoca un incremento comparativa: mente grande en Vo. En el easo de los enzimas heterotrépicos, en les que el modalador es un metabolite diferente del sustrato, es dificil, _generalizar acerca de la forma de la curva de saturacién con el sustrato, Un activador puede hacer que la curva de saturacicn, con el susirato sea mes préixima a la hiperbélica, conn des- ccensa de Ko,, pero sin cambios en Vay 10 que se traduce en lun Incremento de la velocidad de reaceién a una concentra cidn de sustrato fja (V, es superior para cualquier valor de [8];228 capitulo Enzimas Fig. 629), curva superior). Otros enziinas alostérieos luctero- trépicos responden a la presencia de un aelivador con wn in- {eremento de Vaux Per0 Con poco catnbio €Nt Ky (Fig. 6-296). Un modulador negative (inhibidor) puede producir una curva @ Voss isco & i Ki, Kos ca 1} aa © q 2 2 FIGURA 6-29 Curvas de actividad en funcién de la concentracién de sustrato de enzimas alostéricos representatives. Tes ejemplos de respuestas complejas de enzimas alostéicos » sue mesduladoves (@) Curva sigoidea producida por un enzima homatSpico el ave el sustato también aetéa como moriladar posi festimulad) o c= tivador. Obsérvaso ol parecido con lacuna de saturacién por oxigene te la hemoglobina Fi. 5-12). (b) Elecios de un medulador posi (+) ‘yun modular negativo (~) sobre un enzima alostéica eno que Kas sn cambio en Vy La curva central musta la relacign suse ‘wato-actvidad sin modulador.() Un caso de moduleién menos eo iin eel que se altera Vj mentas Ko 5 mantiene constants de saturacién de sustrata ms sigmoidea, con tn ineremento dle Kos (Fig, 6-20, curva inferior). Los enzimas alostérices he- terotrdpicos muestran, por consiguienta, diferentes clases de respuesta ent sus eurvas de actividad frente a sustrabo debido 2 que algunos tienen moduladores inhibidores, etxos tienen ‘moduladores actividiores y olsos tienen modtuladores de pas clases. Algunos enzimas reguladores experimentan modificaciones covalentes reversibles En otra clase importante de enzimas reguladores se modula la activitlad por modificacién covalonte de la moléoula env lca, Entre los grupos modificadores se cucnian el fosforilo, ‘adenililo, uridililo, metilo y adenosina difesfato ribosilo (Fig, 6-80). Generalmente estos grupos se unen y se eliminan del cenaima regulator por la accion de otros exuzimas. Un ejemplo de enzima regulado por mueilacion es el de la proteina aceptora de metilos de kt quimiotaxis de las bacte- ras, Esta protesna forma parte de un sistema que permite a ‘un bacteria nadar hacia una sustancia atrayente en salucién (por ejemplo un aziiear) y alejarse de las sustancias quimicas repelentes. B] agente metilante es la S-adenositmetionina (adoMet) (wéase Fig. 18-18b), La ADP-ribosilacién es una reaccin especialmente interesante, observada s6lo en uns pocas proteinas; la ADP-ritosa proviene del nicotinarida ladenina dinucledtido (véase Fig. 8.41). Este tipo de modi- ficacién se da on la dinitrogesasa reduetasa bacterians, que regula el importante proceso dle la fijeitin biolégiea del n= trogeno. Las toxinas diflérica y del e6lera son enzimas que catalizan la ADP-ribosilacion (¢ inactivaci6n) de enimas o proteinas celulares clave, La losing diftériea actiia sobre el factor 2 ce elongacién, que es la protetna implleada en ta bio- sinesis de proteinas, producieneo su inhibiciin, La voxina del cera acta sobre una proteins G que forma parte de una ruta, de senalizacién (wéase Pig, 12-90), que conduce a varias res- ‘ueslas fisiokigicas, como ln pérdida masiva de fhuides compo- rales ¥, a veces, la muerte La fosforilacién es la modificacién reguladara mas fre- ‘cuente; entre un tercio y is mila de Lodas las provetnas de la ccélula eucaridtiea se fosforilan, Alguias protesnas tlene 619 lun residuo fosforlable, otras presentan varios y unas pocas tienen dovenas de sitios fosforilables. Este tipo de modifica ‘ign covalente juega m papel central en un gran miimero de rulas reguladoras, por lo que se trata detaladamente, Los grupos fosforilo afectan a ta estructura y la actividad catalitica de las proteinas Las proteinas quinasa catalan la unién de grupos fosforilo, a resichuos auninoscides especificos de una proteda; la elimina ion de los grupos fosforilo esta catalizada por las proteinas fosfatasa. La unién de un grupo fostorile a un zeskduo de Sex, ‘Thr, o Tyr introduce un grupo cargado ¥ voluminoss en una ‘region que era silo moderadiamente polar, Las atoms de os sgeno de un grupo fosforilo pueden formar enlaces de hidré-