El control de Rhizoctonia Damping-off de mostaza china mediante endomicorrícicos
Rhizoctonia spp. Aislado de orquídea micorrizas
Jr-Hau Jiang y Si-Loi Tam, Departamento de Patología Vegetal, Universidad Nacional Chung Hsing, Taichung, Taiwán; Takeshi Toda,
Facultad de bio-Ciencias, Universidad de la Prefectura de Akita, Shimo-Shinjo, Akita 010-0195, Japón; y Pulmón-Chung Chen, del
Departamento de Patología Vegetal, Universidad Nacional Chung Hsing, Taichung, Taiwán
Abstracto
Jiang, J.-H., Tam, S.-L., Toda, T., y Chen, L.-C. 2016. Control de Rhizoctonia de los almácigos de mostaza china utilizando endomicorrícico
Rhizoctonia spp. aislado de micorrizas de orquídeas. Plant Dis. 100: 85-91.
Inoculación de hipovirulento Rhizoctonia spp. ha sido reconocido como
una estrategia ef-fective para proteger plantas contra la podredumbre de
causada por path-ogenic Rhizoctonia spp. En este estudio,
endomicorrícicos Rhizoctonia spp. aislado de pelotones de hongos en
plantas de orquídeas fueron utilizados para el control de Rhizoctonia de los
almácigos de mostaza china. De acuerdo con el análisis filogenético y la
determinación del grupo de anastomosis (AG), la virulencia de tres
aislados de multinucleados Rhizoctonia solani en AG-6; ocho aislados de
bi-nucleada Rhizoctonia en AG-A, AG-B, AG-G, AG-P, y AG-R; y dos
aislados de binucleadas repens R. fueron evaluados utilizando plantas de
ensayo. Todas
Orchidaceae es una de las más grandes y diversas familias de plantas,
incluyendo un estimado de 20.000 a 35.000 especies en el reino de las
plantas (12). Varios investigadores han confirmado que los hongos
micorrícicos primarios asociados con la orquídea verde son
Ceratobasidiaceae, Tulasnellaceae y hongos Sebacinaceae(13,38); estos
hongos pueden ser reconocidos como la forma género Rhizoctonia
(33,40,49). Género Rhizoctonia fue primero des-Scribed por De Candolle
(1815) y se considera una assem-Blage heterogéneo de taxones de hongos
filamentosos(dieciséis). Aunque muchos informes han enumerado
diferentes taxones saprofitas y simbiótica, los organismos pertenecientes a
este género son típicamente patógenos, que están asociadas principalmente
con las raíces de acogida(39). Patogénica Rhizoctonia solani Kühn menudo
daña severamente los cultivos, plantas ornamentales y árboles(dieciséis).
Género Rhizoctonia comprende multinucleadas Rhizoctonia spp.
(MNR), binucleadas Rhizoctonia spp. (BNR), y uninucleate Rhizocto-
nia spp.(36). Most MNR and BNR are further divided into various
anastomosis groups (AGs). At present, the multinucleate R. solani
(teleomorph = Thanatephorus cucumeris (A. B. Frank) Donk) contains
14 AGs (AG-1 to AG-13 and AG-BI) (9,16), whereas BNR
(teleomorph = Ceratobasidium D. P. Rogers) are divided into at least
16 AGs (AG-A to AG-I, AG-K, AG-L, and AG-O to AG-S) (36).
Within the same AG, isolates may exhibit similar characteristics, such
as types of disease symptoms caused and host preferences (21).
Moreover, several studies have demonstrated that some BNR (e.g.,
isolates in AG-B(O), AG-G, and AG-P) are hypovirulent to crops and
can provide protection from damping-off (19,39). Alternative methods
of control such as using bio-control organisms have been considerably
investigated since soil fumi-gation was prohibited (35).
Varios BNR hipovirulento aislado del suelo han sido confirmados
para actuar contra patógeno Rhizoctonia spp., Y ciertos aislados han
dado 75 a 95% de protección (41). en soja(22,32), frijol (18,50),
Pepino (20), algodón (19), tomate (26), y espinacas (27), Se ha demostrado
que ciertos aislados de hipovirulento BNR para actuar como agentes de
inducción, lo que lleva a la resistencia sistémica contra hongos patógenos
tales como R. solani, Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici, y F
oxyspo-ron f. sp. spinaciae. Recientemente, los aislados de Ceratobasidium
de orquídeas se han utilizado para suprimir la enfermedad tizón de la vaina
del arroz causada por R. solani AG-1 IA(25). Además,
aislamientos, excepto que en AG-R, causó baja severidad de la enfermedad
en el rábano de 10 días de edad (0,10 a 0,61), pepino (0,28 a 0,54), y la
mostaza chino (0,18 a 0,65). Por el contrario, los aislados patogénicos en
AG-4 mataron casi todas las plantas de ensayo con síntomas de hipocotilo
colapsado y las hojas marchitas (0,88 a 0,96). De los 13 endomicorrÃzico
aislados de Rhizoctonia evaluó, AG-P aísla Cno10-3 y CalS1-2
proporcionado 91 y 100% de protección, re-respectivamente, contra R.
solani AG-4 en 26 días de edad, mostaza chino. Este estudio reveló que
endomicorrícico Rhizoctonia spp. en orquídeas tienen el potencial de
biológicamente control de la podredumbre de la mostaza china.
. ciertas especies MNR y BNR son simbiontes de micorrizas de orquídeas,
cuya semilla minutos pase a través de una fase nonphotosyn-tético en las
que dependen de un suministro externo de nutrientes y requieren una
asociación con un hongo compatible para obtener una nutrición suficiente
para la germinación(3). Según la clasificación de AG deter-minación,
ciertos aislados en tres AGs de MNR (AG-5, AG-6, y AG-12) y cuatro
AGs de BNR (AG-A, AG-C, AG-E, y AG-I) se han descrito la formación
de micorrizas de orquídeas con la orquídea salvaje(10,31,40,47).
Mosquera-Espinosa et al.(25) se indica que aísla de BNR (teleomorfo =
Ceratobasidium) que se originó a partir de una asociación con la orquídea
terrestre son más probabilidades de sobrevivir en ambientes de suelos y
proporcionar un control eficaz bio-lógica en comparación con los hongos
Rhizoctonia aislados de especies de orquídeas epifitas adaptadas a vivir en
corteza de árbol.
No hay estudios han implicado el uso de hongos Rhizoctonia
endomicorrícicos para controlar vegetal amortiguación-off causado por
patógenos R. solani AG-4, un patógeno importante en una amplia variedad
de huéspedes (por ejemplo, rábano, coliflor, cab-Bage, la zanahoria y
pepino) (46). La compensación de amortiguación causada por R. solani
AG-4 es particularmente grave en charolas si los supervivientes toques de
inóculo plántulas de mostaza china (Brassica rapa var. Chinensis)
emergentes. Los aislados de Rhizoctonia spp endomicorrÃzico. en nuestro
estudio fueron obtenidos de pelotones de hongos en las raíces o rizomas de
orquídea silvestre. Poco se sabe sobre la patogenicidad, virulencia, y la
simbiosis de micorrizas de hongos micorrícicos orquídea, particularmente
endomicorrÃzico Rhizoctonia spp. Por lo tanto, los objetivos de este
estudio fueron (i) identificar los aislados de endo-micorrizas Rhizoctonia
muestreados de pelotones fúngicas en orquídea salvaje en Taiwán de
acuerdo con la morfología, la determinación AG, y el análisis filogenético
del espaciador interno transcrito (ITS) región con 5.8S ribo-Somal ADN
(rDNA-ITS); (Ii) analizar la virulencia de endomicorrÃzico aislados de
Rhizoctonia en rábano, pepino y mostaza china; y
determinan qué endomicorrÃzico los aislados de Rhizoctonia
pueden controlar vegetal amortiguación-off causada por R. solani
AG-4.
Materiales y métodos
Rhizoctonia endomycorrhizal spp. Las secciones de los córtices de las
raíces de orquídeas silvestres que exhibían pelotones de hongos se
escindieron, se esterilizaron superficialmente en una solución de
hipoclorito de sodio al 1% durante 1 min, se aclararon en agua estéril y la causante de damping-off fueron identificados como Rhizoctonia solani
se transfirieron al agar de agua de grifo y al agar dextrose de papa AG-4 y se utiliza como un control positivo. Cinco repeticiones de cada
(PDA) Acidificado con ácido láctico al 0,2% para inhibir el tratamiento se mantuvieron durante 8 días(9) y el experimento se repitió
crecimiento de bacterias. Después de la incubación durante 48 h a 24 ° dos veces. Exper-iments para determinar la virulencia de rábano, pepino,
C, las puntas hifas de Rhizoc-tonia spp. Fueron seleccionados de mostaza china y se llevaron a cabo de acuerdo con un diseño
acuerdo con el género Rhizoctonia; La ramificación y la constricción completamente al azar.
eran aparentes cerca del septo distal de las células en las hifas Durante 10 días de edad, las plántulas de rábano y mostaza china
vegetativas jóvenes; Y los conidios, las conexiones de la abrazadera y (9), gravedad de la enfermedad se determinó utilizando la siguiente
los rhizomorfos, y los sclerotia sin diferenciar en la corteza y medula
escala de 5 puntos: 0 = sana, exhibiendo no hay lesiones en el
estaban ausentes (40)
hipocótilo; 1 = menor decoloración de la hipocótilo; 2 = decoloración
Número nuclear y AGs. Trece cepas representativas de Rhizoctonia
además de pequeñas lesiones necróticas (<1 mm) en el hipocotilo o
endomycorrhizal de micorrizas de orquídeas fueron inicialmente
raíz primaria; más grandes lesiones 3 = decoloración necróticas (> 1
identificadas como MNR o BNR después de tinción con 0,1% de azul
de tripán en lac-tophenol (6) o 3% de KOH y safranina O (4) y mm) en el hipocotilo o raíz primaria; y 4 = colapsaron hipocotilo
observando el crecimiento de hifas después de 4 a 7 días De exhibiendo hojas marchitas o plántulas muertas. Para el pepino, se
incubación en PDA a 25ºC. Para determinar el AGs de requiere una clasificación modificada para evaluar la gravedad de la
endomycorrhizal Rhizoctonia spp., Un endomycorrhizal Rhizoctonia enfermedad(20), en la que 0 = no hay lesiones en el hipocotilo, 1 =
aislados de AG desconocido y un representante tester cepa de AG uno o dos lesiones de color amarillo-marrón (<0,25 mm), 2 = lesiones
conocido se cultivaron en PDA durante 2 a 3 días. Los tapones de color amarillo-marrón (<0,5 mm) o zonas acuosas que cubre <10%
miceliales obtenidos a partir de los márgenes de avance de cultivos del hipocotilo, 3 = amarillo-marrón a lesiones de color marrón oscuro
puros de cada aislamiento se emparejaron con cepas de ensayo en (> 0,5 mm) que se unen con otras lesiones o áreas empapadas de agua
TWA y se dejaron crecer a 25ºC. Las porciones solapadas de las hifas que cubren> 10% del hipocotilo, y 4 = colapsaron hipocotilo
se transfirieron a una diapositiva, se tiñeron con azul de tripán al 0,1% exhibiendo hojas marchitas o plántulas muertas.
en lactofenol y se evaluaron para la fusión de hifas Evaluación de los tratamientos fitosanitarios. El inóculo se pre-
(9). Se usaron tres placas de petri para cada tratamiento, y los recortaba por el crecimiento de cada aislamiento de endomicorrÃzico
experimentos se repitieron dos veces. Las reacciones de anastomosis y patógena Rhi-zoctonia en PDA durante 3 días y la transferencia de
se agruparon en cuatro categorías (C0 a C3) según la descripción de tres discos miceliales a 200 g de grano de cebada tratada en autoclave
Carling (8). (1: 1 grano de cebada seco / agua destilada [peso / vol]) en 500 ml
determinación de la virulencia. Rábano (Raphanus sativus L.) y cu- matraces Erlenmeyer. Los cultivos se incubaron a 25 ° C durante 10
cumber (Cucumis sativus L.) fueron utilizados como los cultivos de días y se agitaron cada 2 días para asegurar un uniforme dis-tribución
prueba porque Juan-Abgona et al. (20) hipovirulento filtrada de inóculo. mostaza china fue plantado en charolas de ocho células,
Rhizoctonia spp. mediante el uso de estos cultivos. La semilla se con una planta de semillero de 10 días de edad, en cada célula, y un
desinfecta con etanol al 70% durante 1 min, empapado en hipoclorito grano de cebada colonizado con un aislado de endomicorrÃzico
de sodio al 2% durante 5 min, luego se enjuagaron tres veces con agua Rhizoctonia fue colocado en cada celda. Las plántulas se regaron
destilada estéril. La semilla se pregerminada durante 2 días a 25 ° C, y regularmente y se incubaron en una cámara de crecimiento a 25 ° C
cinco plantas de semillero se transfirieron a 2% TWA. Posteriormente, con un 16-h fotoperíodo de luz visible. Seis días después de la
un disco micelial 9-mm obtenida a partir del margen en un micelio 5 siembra, cada plántula fue desafiado con un solo grano de cebada que
días de edad, de un aislado Rhizoctonia endomicorrÃzico se centra en fue colonizado con la virulenta R. solani AG-4 aislar Cabl2 o Chcab4;
el TWA y se mantuvo en una cámara de crecimiento (16-h fotoperíodo los granos se colocaron a una distancia igual (2 cm) de cada planta de
y durante el día iluminancia de aproximadamente 10.000 lux) a 25 ° C. semillero, excepto para el control no inoculado. Se registró el número
Dos cepas patógenas de las plantas de semillero de la col (B. oleracea de plantas surviv-ing después de otros 10 días de cultivo y se calculó
var. Capitata) y la col china (B. rapa var. Pekinensis) el por-centaje de protección de las plantas como sigue(41): Protection
(%) = [(A − B)/(C − B)] × 100, where A is the percentage of surviving
Table 1. Isolates of endomycorrhizal Rhizoctonia from fungal pelotons in wild orchid z
Isolate/accession number Orchid habitat, locality Highest Blast hita Similarity (%)
ANOF0/KJ495962 Anoectochilus formosanus AF354102, isolate 70Rs 97
Terrestrial, Yangmingshan T. cucumeris strain AG6-HG-I …
ANOF4/KJ495966 Anoectochilus formosanus AF354102, isolate 70Rs 97
Terrestrial, Hsinchu T. cucumeris strain AG6-HG-I …
ANOFD1/KJ495967 Anoectochilus formosanus AF354104, isolate 75Rs 97
Terrestrial, Wufong T. cucumeris strain AG6-GV …
Cno3-2/JX514374 Zeuxine sp. AY927362, isolate R78 98
Terrestrial, Wulai, Sansia Ceratobasidium sp. AG-A …
Sno5-12/JX514386 Cleisostoma paniculatum JQ859885/isolate WUF-ST-RhT4-3 93
epiphytic, Wulai, Sansia Ceratobasidium sp. AG-B …
Eno3-3/JX514377 Goodyera procera AY927348, isolate R56 92
Terrestrial, Wulai, Sansia Ceratobasidiumsp. AG-G …
ZeuS1-1/KJ573103 Zeuxine strateumatica DQ102402, isolate Str14 99
Terrestrial, Tainan Ceratobasidium sp. AG-G ...
ANOF2 / KJ495964 formosanus Anoectochilus DQ102402, aislar Str14 99
Terrestre, Nantou Ceratobasidium sp. AG-G ...
Cno10-3 / JX514376 hungyehensis cheirostylis AB286938, aislar: C-584 100
Terrestre, Wulai, Sansia Ceratobasidium sp. AG-P ...
CalS1-2 / JX514384 calanthe sylvatica AB286941, aislar: C-578 95
Terrestre, Wulai, Sansia Ceratobasidium sp. AG-P ...
ANOF3 / KJ495965 formosanus Anoectochilus AB286942, aislar: X4-3 99
Terrestre, Wulai, Sansia Ceratobasidium sp. AG-R ...
Sno3-3 / JX514385 Liparis nakaharai GU166403, aislar Ps-KT-0-1 99
epifita, Wulai, Sansia calospora Tulasnella ...
Sno6-1 / JX514393 ensifolium Cymbidium AJ313437, SP1A 99
Terrestre, Wulai, Sansia Epulorhiza sp. ...
z
Ribosomal secuencias de espaciador transcrito de ADN-interno se obtuvieron de GenBank y se seleccionó la secuencia de referencia con la más alta
explosión hit basado en un grupo anastomosis conocido (AG).
plantas después de la colonización con un aislado hipovirulento y la
inoculación reto con un aislado virulento, B es el porcentaje de sobrevivir a
las plantas después de la inoculación con solamente un aislado virulento, y
C es el porcentaje de sobrevivir a las plantas no inoculadas. Los
experimentos para determinar la protección de las plantas de mostaza china
crecido en el suelo se llevaron a cabo de acuerdo con un diseño
completamente al azar y se repitieron dos veces. gravedad de la
enfermedad en 26 días de edad, mostaza china se evaluó en el hipocotilo de
acuerdo con una escala de cuatro puntos (Figura S1), en la que 0 = no hay
lesiones en el hipocótilo; 1 = menor decoloración de la hipocótilo; 2 =
DISCOL-oración y lesiones grandes, marrón oscuro necróticas en el
hipocotilo, y no hay síntomas vástago de alambre; y 3 = vástago de
alambre en el hipocótilo.
Análisis filogenético. Se extrajo el ADN utilizando el DNeasy Plant
mini kit (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con la fabr-
turer'instrucciones s. El ADN total se recuperó en 50metrol de agua
destilada desionizada y se mantuvo a -80 ° C. La secuencia de ADNr-
ITS se amplificó usando el cebador ITS1 y el cebador inverso
ITS4(51). Una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se llevó a
cabo en un Sistema GeneAmp PCR 2700 (Applied Biosystems, Foster
City, CA) usando el siguiente perfil térmico: desnaturalización inicial
a 94 ° C durante 2 min; seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 94
° C durante 40 s, hibridación a 55 ° C durante 60 s y extensión a 72 °
C durante 60 s; y extensión final a 72 ° C durante 5 min. Los
productos de PCR fueron-puri ficado usando el kit de purificación
MinElute PCR (Qiagen). muestras limpias
se eluyeron con 50 metrol de agua estéril y cuantificada para llevar a
cabo reacciones se-Quencing. Ciclo de secuenciación se llevó a cabo
usando la versión 3.1 BigDye química, y la secuenciación se realizó
utilizando un ABI 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Se
secuenciaron ambas hebras de ADN. Las secuencias obtenidas en este
estudio están disponibles en GenBank bajo los números de acceso
enumerados enMesa 1.
Los rDNA secuencias de ITS se sometieron a una búsqueda
BLAST lote (1) En el Centro Nacional de Información sobre
Biotecnología página web
(Http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Resultados que fueron
muy similares se descargaron y se añaden al conjunto de datos.
Una alineación de secuencias múltiples de cada SU secuencia se
generó usando Clustal W para la alineación múltiple(45),
embalado por el Sequence Alignment Editor Bioedit (17). Árboles
filogenéticos se obtuvieron de las secuencias analizadas usando el
software Molecular Evolutionary Análisis Genética versión
5.0(44) con un método de unión de vecinos que implica la Kimura
algoritmo distancia de dos parámetros. En total, se realizaron
1.000 repeticiones de arranque para estimar el nodo RELI-
capacidad de los árboles filogenéticos. Bootstrap apoyo valores>
70% se consideraron significativos. Ramas que exhibieron valores
de apoyo bajo de arranque (<70%) se retiraron.
Análisis estadístico. Todos los análisis se realizaron utilizando SAS
9.4 (SAS Institute, Inc., Cary, NC). Los datos ordinales de una escala
de calificación se calcularon mediante la aplicación de una
metodología no paramétrica(34). El rango

Higo. 1. endomicorrÃzico Rhizoctonia aislado de pelotones fúngicas en las células corticales de las raíces o rizomas en orquídea salvaje A,
formosanus Anoectochilus; B, Goodyera procera; y lancifolium C, Cymbidium. D a F, pelotones fúngicas (flechas blancas). G, para I, tipos culturales
de endomicorrÃzico aislados de Rhizoctonia. J a L, multinucleadas y aislados de Rhizoctonia binucleados están identificados por el concepto de
género Rhizoctonia y el número de núcleos por célula en joven hifas vegetativas (flechas negras). La barra de escala representa 3 cm (A), 10 cm (B y
C), 1,000 mm (D), 400 mm (E y F) y 20 mm (J a L).
asignado a cada observación se determinó a través de la RANK PROC
y el procedimiento PROC MIXED utilizado para calcular las
estadísticas de prueba y niveles de significación. los efectos del
tratamiento relativo estimado para dis-
segundo
aliviar la gravedad se calcularon usando pyo = 1 / N (Ryo - 1/2), en que los
valores
están entre 0 y 1, donde i es el tratamiento, N es el número de obser-
vations, y R es el rango medio. Además, el 95% de intervalo de
confianza (IC) se generó utilizando LD_CI macro(5). Un valor más
pequeño desegundopagyoindi-cates un valor inferior de gravedad de
la enfermedad después de un tratamiento. Valores desegundopagyo
durante dos tratamientos difirieron significativamente cuando el IC
para cada segundopagyono se superponían. Los datos sobre
protección de las plantas se analizaron utilizando una sola vía anal-
Ysis de la varianza. La media de separación se evaluó mediante un
post-hoc de Tukey protegido'se determinaron s de prueba (P = 0,05)
después de los resultados significativos de una prueba F en SAS 9.4.
resultados
Análisis filogenético. Los aislados de Rhizoctonia endomicorrícico
muestreados de pelotones fúngicas en orquídea(Higo. 1) situado en
seis ciudades locales en Taiwán fueron identificados (Mesa 1). Los
aislamientos seleccionados fueron pieles-Ther identificados como
BNR MNR y de acuerdo con el número de núcleos por célula en los
jóvenes hifas vegetativas(Fig. 1J a L). Un aislado representativo de
cada orquídea se analizó adicionalmente. En total, 3 aislamientos de
MNR y 10 aislados de BNR se obtuvieron en este estudio y se asignan
a multinucleadas R. solani (teleomorfo = T. cucumeris),
Higo. 2. Filogenia de endomicorrÃzico Rhizoctonia aislados de orquídeas y hongos relacionados basados en ADN-interno ribosomal espaciador transcrito (ITS) secuencias
utilizando el método de unión de vecinos. Una SU secuencia de Sebacina vermifera (AF20272) se definió como un grupo afuera. Los números en los nodos muestran los
valores de arranque (1000 repeticiones; únicos valores por encima de 70% se muestran) desde el correspondiente árbol vecino a participar. MNR=multinucleadas
Rhizoctonia spp. y BNR= binucleadas Rhizoctonia spp.
BNR (teleomorfo = Ceratobasidium), y binucleadas R. repens
(teleomorfo = Tulasnella calospora) de acuerdo con los resultados
de BLAST (Mesa 1).
El análisis filogenético se llevó a cabo con el grupo de aislamientos
en tres grandes clados (Higo. 2), etiquetado Thanatephorus (MNR),
Ceratobasidium (BNR), y Tulasnella (BNR). Los primeros dos clados
se clasificaron en diferentes AGs. Los aislados en clade Thanatephorus
(MNR) formado una clade AG-6 que presenta el apoyo de arranque
88% y se incluyen secuencias referirse-ENCE de R. solani AG-6
(Asociación de micorrizas, Japón; AF153780, AF153787, AF153790
y)(37) y AG-6 GV (suelo, Japón, AF354104) (15). Tres cepas de
putativo AG-6 (ANOF0, ANOF4, y ANOFD1) se emparejaron con un
conocido cepa TES-ter representante de R. solani AG-6 GV (aislar
NKN-2-1, Japón, proporcionado por Ogoshi) y exhibió C2 reacciones
con el probador.
En clado Ceratobasidium (BNR), cinco subclades se clasificaron de
acuerdo con aislamientos de AG-A (99% de apoyo bootstrap), AG-B
(98% de apoyo bootstrap), AG-G (85% de apoyo bootstrap), AG-P (77
% apoyo de arranque), y AG-R (100% apoyo de arranque). Iso-lates de
AG-P y AG-T se agruparon en el mismo subclade, ser causa
anastomosis se confirmó entre ciertos aislados de AG-P y AG-U(36).
Cada aislado de un putativo AG fue emparejado con un conocido cepa
de ensayo representativa de AG-A (aislar AH-1), AG-G (aislar AH-9),
y AG-P (cepa C-578) (Japón, proporcionado por ogoshi).
Todos los aislamientos obtenidos de las plantas de orquídeas
mostraron reacciones de C2 con sus aislados de prueba. De acuerdo
con la alta similitud de secuencias de rDNA-ITS y el análisis
filogenético (36, 37), los aislamientos ANOF3 y Sno5-12 se
reconocieron como AG-R y AG-B, respectivamente. El ANOF3 fue
altamente homólogo con los aislados de Rhizoctonia AG-R en
GenBank (números de acceso HQ269823 y AB286942), con 98 y 99%
de identidades (11, 36). Sno5-12 se agrupó con Rhizoctonia AG-B
(número de acceso JQ859885), con 93% de identidad (14), formando
un grupo con AG-B (O) (números de acceso AB219143 y DQ102430)
y apoyado por un 98% de valor de arranque.
El clado de Tulasnella (BNR), que exhibía un soporte de arranque de
100%, incluía secuencias de referencia de T. calospora (de o-chid,
Tailandia, GU166403; GU166407) (28) y Epulorhiza spp. (De Orchid,
Singapur, AJ313439; AJ313437) (23). El aislamiento Sno3-3 de la
orquídea Liparis nakaharai compartió una identidad de secuencia del
99% con T. calospora (GU166403, R. repens teleomórfico) y el
aislamiento Sno6-1 de la orquídea Cymbidium ensifolium compartió
una identidad de secuencia del 98% con Epulorhiza sp. (AJ313437)
(99% de soporte de arranque).
Tabla 3. Casi todas las plantas murieron al ser inoculadas con el
aislamiento Cabl2 de R. solani AG-4 (bpi = 0,96), lo que sugiere que
Cabl2 expresó virulencia estable a la mostaza china cultivada en suelo
en comparación con el aislado patogénico Chcab4 (bpi = 0,85). La
mayoría de los aislamientos de endomycor-rhizal Rhizoctonia, a
excepción de dos aislados de Tulasnella (Sno6-1 y Sno3-3) y un
aislado de Ceratobasidium (Sno5-12), protegieron la mostaza Chi-
Nese contra R. solani AG-4 aislado Cabl2 (Tabla 3). Los aislados de
R. solani AG-6 (ANOF0, ANOF4 y ANOFD1) redujeron la severidad
de la enfermedad y proporcionaron protección vegetal moderada (45,8
a 52,4%). Respecto a los tratamientos con BNR endomicorrízicos
(Ceratobasidium), todos los aislamientos excepto el Sno5-12 redujeron
significativamente los efectos relativos del tratamiento (bpi = 0,14 a
0,57), dando varios niveles de protección fitosanitaria (41,1 a 100%).
Los aislados de Ceratobasidium AG-P CalS1-2 y Cno10-3
proporcionaron la mayor protección de 91 y 100% con el menor efecto
relativo del tratamiento (bpi = 0,14 y 0,20), respectivamente, frente a
R. solani AG-4 (Cabl2) .
Discusión

Determinación de virulencia in vitro. Todos los aislamientos de o-chid,
excepto el aislado ANOF3 (AG-R), fueron ligeramente virulentos al
rábano de 10 días de edad, pepino y mostaza china, con efectos de
tratamiento rela- tivos (bpi) según la gravedad de la enfermedad De
0,1 a 0,61 en el rábano (control no inoculado, bpi = 0,1), 0,28 a 0,54
en el cuenco (control no inoculado, bpi = 0,28) y de 0,18 a 0,65 en la
mostaza china (control no inoculado, bpi = 0,18); Sin embargo, el
aislamiento ANOF3 fue altamente virulento a las plantas de ensayo
(particularmente a cu- bun, bpi = 0,89) (Tabla 2). Entre los
aislamientos de endomycorrhizal Rhizoctonia, tanto Sno3-1 como
Sno6-1 no causaron que las plantas de prueba se enfermaran. Sin
embargo, ambos aislados patógenos de R. solani AG-4 Cabl2 y
Chcab4 fueron altamente virulentos al rábano, al cuenco y a la
mostaza china, matando casi todas las plantas de prueba que exhibían
cotiledones marchitados y hipocótilo colapsado (bpi = 0.88 a 0.96). En
este estudio, los síntomas leves se clasificaron como <2 según una
escala de 0 a 4.
Evaluación de la protección de las plantas. La gravedad relativa de la
enfermedad de aislamientos hipovirulentos y de aislamientos
hipovirulentos desafiados por aislamientos virulentos en la mostaza
china, así como el porcentaje de protección vegetal proporcionado por
el aislado hipovirulento, se muestran en
La identificación de la forma anamórfica del género Rhizoctonia en la
taxonomía a nivel de especie es difícil porque el teleomorfo de Rhi-
zoctonia rara vez se induce en condiciones de laboratorio (37). La
diversidad de los aislados de Rhizoctonia endomycorrhizal de la
orquídea refleja varios AGs. Además, los aislados de R. solani AG-6
forman una relación estrecha con BNR (AG-P, AG-R, AG-S y AG-U).
Se ha reportado que R. solani AG-6 y AG-12 presentan asociaciones
micorrícicas con orquídeas silvestres (10,31). El análisis filogenético
de rDNA-ITS secuencias ha demostrado que algunos BNR son
parafiléticos con MNR (15, 24, 48]. En el presente estudio,
encontramos que los aislados de BNR se aclararon como hongos
micorrízicos asociándose con orquídeas. Aunque estos AG contienen
aislamientos patógenos (40), se ha informado que ciertos aislamientos
son aislamientos hipovirulentos o no patógenos que protegen a los
huéspedes de las plantas frente a patógenos (19,20,22,39).
Varios investigadores han sugerido que la determinación de la
virulencia debe involucrar la evaluación de las enfermedades de
acuerdo con un continuo entre la virulencia más alta y más baja (39) y
nos han recomendado el uso de huéspedes adecuados para identificar
aislados hipovirulentos de Rhizoctonia que pudieran controlar los
patógenos (19,20). Juan-Abgona et al. (20) indicaron que los cultivares
de pepino eran más susceptibles que los cultivares de rábano cuando se
ensayaron in vitro contra aislamientos de Rhizoctonia y

Tabla 2. Clasificación relativa de la gravedad de la enfermedad en las plántulas de 10 días de rábano, pepino y mostaza china que fueron
inoculadas con aislados individuales de endomicorrízicos y patogénicos Rhizoctonia sppy

Radish Cucumber Chinese mustard

Isolate AG
z b b b b b b
pi CI for pi pi CI for pi pi CI for pi

Thanatephorus
Cabl2 4 0.88 0.86–0.90 0.91 0.90–0.92 0.93 0.92–0.93
Chcab4 4 0.96 0.95–0.96 0.92 0.91–0.92 0.93 0.92–0.93
ANOF0 6 0.40 0.35–0.46 0.38 0.32–0.45 0.43 0.36–0.48
ANOF4 6 0.61 0.54–0.67 0.41 0.34–0.49 0.63 0.58–0.69
ANOFD1 6 0.56 0.49–0.62 0.35 0.29–0.41 0.65 0.61–0.70
Ceratobasidium
Cno3-2 A 0.55 0.49–0.60 0.51 0.44–0.59 0.34 0.28–0.41
Sno5-12 B 0.47 0.43–0.51 0.32 0.27–0.36 0.38 0.32–0.47
Eno3-3 G 0.51 0.46–0.56 0.40 0.33–0.47 0.61 0.55–0.66
ZeuS1-1 G 0.48 0.44–0.52 0.54 0.47–0.62 0.61 0.53–0.68
ANOF2 G 0.50 0.45–0.54 0.50 0.42–0.57 0.35 0.28–0.44
Cno10-3 P 0.48 0.44–0.52 0.48 0.40–0.56 0.41 0.35–0.47
CalS1-2 P 0.55 0.49–0.60 0.54 0.47–0.62 0.39 0.33–0.46
ANOF3 R 0.77 0.71–0.82 0.89 0.88–0.90 0.82 0.77–0.85
Tulasnella
Sno3-3 … 0.10 0.09–0.11 0.28 0.27–0.30 0.18 0.16–0.19
Sno6-1 … 0.10 0.09–0.11 0.28 0.27–0.30 0.18 0.16–0.19
Control … 0.10 0.09–0.11 0.28 0.27–0.30 0.18 0.16–0.19
Se obtuvieron secuencias espaciadoras transcritas internas de ADN ribosómico a partir de GenBank y se seleccionó la secuencia de referencia con
el mayor éxito de explosión basándose en
Un grupo conocido de anastomosis (AG).
Los aislados identificados como hipovirulentos deben presentar En diversos cultivos, tales como el grano (por ejemplo, AG-G y AG-R)
consistentemente una reacción hipovarulenta en otros cultivos cuando se (18,39,50), Pepino (Por ejemplo, AG-G, AG-P y AG-B (O)) (20, 39) y
prueban in vitro y en el suelo. En este estudio, los aislados de Rhizoctonia algodón (por ejemplo, AG-G y AG-R) (19). Encontramos que Rhizoctonia
endomicorrízicos causaron leve discoloración en el sitio basal del
endomycorrhizal Los aislamientos están relacionados con los aislados
hipocótilo y una baja gravedad de la enfermedad en rábano de 10 días,
pepino y mostaza china bajo condiciones in vitro. Una excepción fue el hipovirulentos de AGs antes mencionados. Aunque ciertas especies de
aislado ANOF3 (AG-R), que fue más virulento a las plantas probadas. Los Rhizoctonia spp. Son patógenos de plantas, los requerimientos nucleares de
resultados revelaron que casi todas las especies endo-micorrízicas de Rhizoctonia spp de endomycorrhizal. Siguen siendo desconocidas (25, 48).
Rhizoctonia spp. Aislados de orquídeas silvestres ejercieron baja virulencia
en las plantas de ensayo. Sin embargo, algunos AG de los géneros En experimentos llevados a cabo utilizando platos enchufables, los aislados
Thanatephorus y Ceratobasidium son patógenos en una serie de huéspedes. de la especie de orquídea ter-restrial Cheirostylis hungyehensis (Cno10-3)
Por lo tanto, la virulencia de los aislados de Rhizoctonia endomycorrhizal
y Cal-anthe sylvatica (CalS1-2) produjeron la protección vegetal más
debe ser evaluada usando varias plantas en la investigación adicional.
eficaz. Ambos aislamientos pertenecieron a AG-P y mostraron efectos de
Estudios previos han puesto de manifiesto que R. solani AG-4 es un tratamiento relativamente suaves en la severidad de la enfermedad en
patógeno vegetal vital en el suelo que afecta a varios huéspedes (2,46). En plantas de ensayo de 10 días de edad y altos niveles de protección
el presente estudio, se redujo significativamente el amortiguamiento de la fitosanitaria con efectos de tratamiento relativos moderados en mostaza
mostaza china cuando las plántulas cultivadas en el suelo fueron protegidas china de 26 días cultivada en suelo. Ciertos aislamientos de Rhizoctonia
antes de la inoculación con R. solani AG 4. Sin embargo, los porcentajes hipovirulenta presentan habilidades para proteger las plántulas contra los
de protección de las plantas causados por aislados de Rhizoctonia aislados patógenos de Rhizoctonia a través de la competencia de nutrientes
endomicorrízica variaron. Los hongos Rhizoctonia pueden presentar
características similares, tales como los tipos de síntomas de la enfermedad (9) y la colonización de sitios de infección (42), por ejemplo. La protección
causados o las preferencias del huésped dentro de la misma AG (21). La de las plantas es algunas veces eficaz cuando el agente de control está
capacidad de Rhizoctonia spp de endomycorrhizal. Para estimular la relacionado con el patógeno porque sus requerimientos son probablemente
germinación y el crecimiento de la semilla de orquídeas se ha predicho de similares (43). Los isoilatos evaluados de AG-6 y AG-P produjeron
acuerdo a las relaciones filogenéticas (29). Por lo tanto, esperábamos que micelio abundante y rápidamente colonizaron sobre el hipocótilo de las
los aislamientos estrechamente relacionados o AGs pudieran ser similares plántulas, al igual que el patógeno R. solani AG 4. La colonización extensa
en la capacidad protectora de las plantas. De acuerdo con la determinación es típicamente considerada un signo favorable cuando se intenta controlar
de AG, ciertos aislados de BNR del suelo se han utilizado en ensayos en el
Patógenos (39). Sneh e Ichielevich-Auster (41) demostraron que los
invernadero o de campo para mejorar el amortiguamiento
aislamientos en AG-B (O) y AG-P inducen resistencias vegetales y
Tabla 3. Clasificación relativa de la gravedad de la enfermedad en la plántulas de pepino protegidas. Por otra parte, la fenilalanina amoniaco-
mostaza china de 26 días cultivada en el suelo inoculado con aislados liasa, la peroxidasa, la patogénesis relacionada (RP) -2 familia de
individuales de Rhizoctonia spp. Endomicorrízicos y patógenos. Y se proteínas, la quitinasa (PR-3 familia), ácido salicílico, pectic sustancias, y
inocularon con aislamientos protectores en plantas de 10 días de edad que suberin han participado en la resistencia respuestas (7, 18]. En el presente
se desafiaron con aislados de Rhizoctonia patogénicos 6 días más tarde estudio, las plantas colonizadas por aislados AG-P acumularon sustancias
Challenging with pécticas y compuestos fenólicos en el hipocótilo que no fueron evidentes
pathogenic Cabl2 after en controles no inoculados. Los aislamientos de AG-P mostraron la fuerte
Inoculating with inoculating putatively capacidad de colonizar las regiones de base de las plántulas, produciendo
each isolate protective isolate cojines sueltos y pequeños de infección que pueden no ser efectivos en la
b b b b
y z penetración y colonización (inédito). Recientemente, la colonización de
Isolate AG pi CI for pi pi CI for pi PP (%)
Arabidopsis thaliana con aislados hipovirulentos de BNR de genes
Thanatephorus
inducidos por AG-A y AG-B (O) implicados en la resistencia adquirida
Cabl2 4 0.96 0.95–0.96 … … …
sistémica, indujeron resistencia sistémica y vías de producción de
Chcab4 4 0.85 0.77–0.90 … … …
fitoalexina (35). La protección de las plantas proporcionada por aislados de
ANOF0 6 0.46 0.41–0.51 0.50 0.40–0.61 45.8 cd
AG-P muestreados de o-chid puede implicar competencia fúngica en
ANOF4 6 0.42 0.41–0.43 0.48 0.38–0.57 48.7 cd
cuanto al espacio y la nutrición e inducir respuestas innatas del sistema
ANOFD1 6 0.42 0.41–0.43 0.49 0.40–0.59 52.4 cd
inmune en las plantas. La combinación de altos niveles de protección y una
Ceratobasidium
baja tendencia a la gravedad de la enfermedad sugiere que los aislamientos
Cno3-2 A 0.42 0.41–0.43 0.51 0.40–0.62 41.1 de
de AG-P son los candidatos más prometedores para controlar el
Sno5-12 B 0.44 0.40–0.47 0.65 0.56–0.72 17.9 ef
amortiguamiento de Rhizoctonia en la mostaza china. Aunque ciertos iso-
Eno3-3 G 0.52 0.45–0.59 0.48 0.38–0.58 54.8 cd
lates de AG-P fueron reconocidos como patógenos de las plantas, algunos
ZeuS1-1 G 0.44 0.40–0.47 0.39 0.30–0.49 75.4 bc
aislados se consideraron BNR hipovirulentos que podrían controlar el
ANOF2 G 0.42 0.41–0.43 0.57 0.50–0.64 44.6 de
amortiguamiento (39). La aplicación de AG-P a las plantas huésped, como
Cno10-3 P 0.46 0.41–0.51 0.20 0.14–0.29 91.1 ab
se informó anteriormente, requiere una investigación adicional. Un estudio
CalS1-2 P 0.42 0.41–0.43 0.14 0.11–0.18 100 a
reciente de Veldre et al. (48) indicaron que los hongos Rhi-zoctonia
ANOF3 R 0.51 0.44–0.58 0.44 0.35–0.53 60.7 cd
aislados del suelo y del simbionte generalmente exhibían una baja
Tulasnella
capacidad de causar enfermedad de la planta en comparación con hongos
Sno3-3 … 0.42 0.41–0.43 0.71 0.65–0.75 4.8 f
Rhizoc-tonia patogénicos aislados del huésped.
Sno6-1 … 0.42 0.41–0.43 0.71 0.65–0.75 8.9 f
Control … 0.42 0.41–0.43 0.73 0.69–0.77 0f
Los aislados de Rhizoctonia endomicorrízica descritos en este estudio se
x La gravedad de la enfermedad se clasificó originalmente en una escala de 0 a
obtuvieron de los pelotones de hongos en las células corticales de las raíces
3 y la variable única Clasificado mediante el procedimiento PROC RANK. Una de las orquídeas o rizomas, lo que sugiere que los hongos tenían
gravedad relativa de la enfermedad[bpi =1/N (_Ri – 1/2)] se calculó usando asociaciones micorrícicas funcionales con plantas de orquídeas. Nuestros
una fórmula de rango medio (_Ri = 1/ni+nik =1Rik) e intervalos de confianza hallazgos revelaron que los aislados hipovirulentos de Rhizoctonia pueden
(IC) generados utilizando la macro LD_CI.Los valores de bpi entre dos
ser identificados en orquídeas. Además, los aislados de Rhizoctonia
accesiones son significativamente diferentes de cada uno Otro si el IC del 95%
para cada bpi no se superpone.. endomycorrhizal pueden ser eficaces en el control de la Rhizoctonia
y amortiguamiento de mostaza china cultivada en el suelo y el rendimiento
Grupo de anastomosis.
z Porcentaje de protección fitosanitaria (PP) se calculó utilizando la fórmula Protección bajos niveles de virulencia en rábano, pepino y mostaza china en
(%)=[(A - B) / (C - B)] × 100, donde A = el porcentaje de plantas supervivientes después de condiciones in vitro. Tales aislados pueden ser aplicables para el
la colonización Con un aislamiento hipovirulento y la inoculación con un virus virulento tratamiento de cultivos hortícolas. Por lo tanto, podemos justificar que dos
Aislar, B = el porcentaje de plantas supervivientes después de la inoculación con sólo un aislados endomycorrhizal de AG-P son útiles para el control biológico. Sin
virulento Aislar y C = el porcentaje de plantas no inoculadas supervivientes. Valores
embargo, la comprensión del modo de protección fitosanitaria
Seguido por la misma letra no fueron significativamente diferentes de acuerdo con post hoc
Prueba de Tukey (P = 0,05) mediante el análisis unidireccional del procedimiento de proporcionado por aislados de AG-P es necesaria para desarrollar
varianza. procedimientos y preparaciones eficientes y para mejorar la eficacia de las
prácticas de aplicación.
Expresiones de gratitud
Damos las gracias a Y. I. Lee (Departamento de Botánica, Museo Nacional
de Ciencias Naturales,Taichung, Taiwán) y J. F. Xu (Universidad Nacional
Chung Hsing, Taichung, Taiwán)Para proporcionar las plantas de
orquídeas nativas utilizadas en este estudio.
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