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B) Purificación de Proteínas Electroforésis de Proteínas Electroforésis en Gel de Poliacrilamida
B) Purificación de Proteínas
Electroforésis de Proteínas
Electroforésis en Gel de Poliacrilamida
Electroforésis Capilar (Capillary Electrophoresis; CE)

SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate – PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) SDS interrumpe interacciones no covalentes entre polipéptidos, SDS-PAGE nos da las masas moleculares de las subunidades de proteínas multisubunidades. La posibilidad que subunidades estén unidas por puentes disulfuro puede ser probado mediante la preparación de muestras en la presencia y ausencia de agentes reductores, tales como 2-mercaptoetanol = β-mercaptoetanol (HS-CH 2 - CH 2 -OH), el cual rompe estos enlaces.

Electroforésis en gel requiere de hasta varias horas y es difícil de cuantizar y automatizar.

http://www.ceandcec.com/cetheory.htm

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B) Purificación de Proteínas Electroforésis de Proteínas Electroforésis Capilar (Capillary Electrophoresis; CE)
B) Purificación de Proteínas
Electroforésis de Proteínas
Electroforésis Capilar (Capillary Electrophoresis; CE)
Ultracentrifugación

Electroforesis capilar (CE) supera grandemente estas desventajas. Una técnica en la cual la electroforesis es llevada a cabo en tubos capilares muy delgados (20 – 75 µm en diámetro interno). Tales capilares estrechos disipan rápidamente el calor y así permite el uso de campos eléctricos muy altos, lo cual reduce el tiempo de separación a unos pocos minutos. Usa cantidades pequeñas de muestras.

Si un envase de tierra y agua se agita y se deja reposar, la tierra se sedimentará rápidamente en el fondo debido a la influencia de la gravedad de la tierra.

B) Purificación de Proteínas Ultracentrifugación
B) Purificación de Proteínas
Ultracentrifugación

Macromoléculas en solución, las cuales experimentan el mismo campo gravitacional, no exhiben ninguna sedimentación perceptible porque su movimiento termal al azar las mantiene distribuidas uniformemente a través de la solución. Sólo cuando se someten a enormes aceleraciones las moléculas comienzan a sedimentarse como lo hacen los granos de arena. Ultracentrífuga (desarrollada alrededor de 1923 por el bioquímico sueco Svedverg) puede lograr velocidades rotacionales tan altas como 80,000 rpm para generar campos centrifúgales en exceso de 600,000 x g. La tasa a la cual una partícula sedimenta en la ultracentrífuga se relaciona a su masa (la densidad de la solución y la forma de la partícula también afecta la tasa de sedimentación).

B) Purificación de Proteínas Ultracentrifugación
B) Purificación de Proteínas
Ultracentrifugación

El coeficiente de sedimentación de una proteína (s, velocidad de sedimentación por unidad de fuerza centrífuga) es usualmente expresado en unidades de 10 -13 s, los cuales son conocidos como suedbergs (s). En ultracentrifugación preparativa, sedimentación es llevada a cabo en una solución de una sustancia inerte en la cual la [] y por ende la densidad de la solución aumenta de la cima al fondo del tubo de centrifugación. El uso de tales gradientes de densidad mejora el poder de resolución de la ultracentrífuga. En ultracentrifugación por zona, una solución macromolecular es aplicada en la cima de un gradiente de densidad preformado, usualmente hecho con sucrosa.

B) Purificación de Proteínas Ultracentrifugación Después de centrifugación los tubos son
B) Purificación de Proteínas
Ultracentrifugación
Después
de
centrifugación
los
tubos
son

Durante centrifugación, cada especie de macromolécula se mueve a través del gradiente a una tasa determinada grandemente por su coeficiente de sedimentación y por lo tanto viaja como una zona que puede ser separada de otras zonas (Figura 5-12).

para

colectar fracciones con las macromoléculas separadas. En centrifugación por equilibrio de gradiente de densidad, la muestra se disuelve en una solución relativamente concentrada de una sustancia densa y de difusión rápida tal como CsCl (Cloruro de Cesio).

perforados

Bajo el gran campo gravitacional producido, el CsCl forma un gradiente de densidad. Los componentes de la muestra forman bandas en posiciones donde sus densidades son iguales a la de la solución y las bandas pueden ser separadas.

Figura 5.12 – Zonal Centrifugation Voet D., Voet J. G., & Pratt C. W; Fundamentals

Figura 5.12 – Zonal Centrifugation

Voet D., Voet J. G., & Pratt C. W; Fundamentals of Biochemistry; 1 st Ed;
Voet D., Voet J. G., & Pratt C. W; Fundamentals of Biochemistry; 1 st Ed; John Wiley & Sons, Inc; U.S.A; 1999; p.
Nelson D. L. & Cox M. M; Lehninger Principles of Biochemistry, 3 rd Ed; Worth
Nelson D. L. & Cox M. M; Lehninger Principles of Biochemistry, 3 rd Ed; Worth Publishers ; U.S.A; 2000; p. 133
C) Secuenciación de Proteínas Importancia de la secuenciación
C) Secuenciación de Proteínas
Importancia de la secuenciación

1) Conocer la secuencia de amino ácidos de una proteína es un pre-requisito para determinar su estructura 3D y es esencial para entender su mecanismo macromolecular de acción. 2) Comparación de secuencias entre proteínas análogas de diferentes especies produce conocimiento profundo en función de proteínas y revela relaciones evolucionarias entre las proteínas y los organismos que las producen. 3) Muchas enfermedades heredadas son causadas por mutaciones que conducen a un de amino ácido en una proteína. Secuencias de análisis de amino ácidos pueden asistir en el desarrollo de pruebas diagnósticas y terapias efectivas.

C) Secuenciación de Proteínas Método de Sanger La proteína debe ser Pasos preliminares
C) Secuenciación de Proteínas
Método de Sanger
La proteína debe ser
Pasos preliminares

fragmentada lo suficientemente

pequeño para ser secuenciadas individualmente. La estructura primaria de la proteína intacta es entonces reconstruida de las secuencias de los fragmentos que se solapan.

Análisis de grupo terminal revela el número de diferentes tipos de subunidades Cada cadena polipeptídica (si no está bloqueada químicamente) tiene un residuo N-terminal y un C- terminal. Identificar estos grupos terminales puede establecer el número de polipéptidos químicamente distintos en una proteína.

C) Secuenciación de Proteínas Pasos preliminares 1) El compuesto fluorescente Dansyl reacciona con aminas
C) Secuenciación de Proteínas
Pasos preliminares
1)
El
compuesto
fluorescente
Dansyl
reacciona
con
aminas
primarias
para

Análisis de grupo terminal revela el número de diferentes tipos de subunidades Ejemplo: Insulina tiene cantidades iguales de los residuos N-terminal Gly y Phe, lo cual indica que esta posee igual número de 2 cadenas polipeptídicas no idénticas. Métodos para determinar el N-terminal

Chloride

producir

polipéptidos dansilados (Figura 5-13). Hidrólisis ácida libera el residuo N-terminal modificado, el cual es separado cromatográficamente e identificado por su fluorescencia amarilla intensa.

Nelson D. L. & Cox M. M; Lehninger Principles of Biochemistry, 3 rd Ed; Worth
Nelson D. L. & Cox M. M; Lehninger Principles of Biochemistry, 3 rd Ed; Worth
Nelson D. L. & Cox M. M; Lehninger Principles of Biochemistry, 3 rd Ed; Worth Publishers ; U.S.A; 2000; p. 142
Figura 5-13. Reacción Dansyl Chloride N(CH 3 ) 2 R O R O R 3
Figura 5-13. Reacción Dansyl Chloride
N(CH 3 ) 2
R
O
R
O
R 3
O
1
2
Dansyl
+ H 2 N
CH
C
NH
CH
C
NH
CH
C
Chloride
Polipéptido
-
OH
O
S
O
HCl
Cl
N(CH 3 ) 2
SO 2
R 1
O
R
2 O
R 3
O
NH
CH
C NH
CH
C NH
CH
C

Polipéptido Dansyl

N(CH 3 ) 2 Polipéptido Dansyl SO 2 R 1 O R 2 O R
N(CH 3 ) 2
Polipéptido Dansyl
SO 2
R 1
O
R
2 O
R 3
O
NH
CH
C NH
CH
C NH
CH
C
N(CH 3 ) 2
H 2 O
H +
SO 2
O
R 2
O
R 1
R 3
O
NH
CH
C
OH
+ H
3 N
CH
C
OH
+
H
N CH
C
OH
+
3

Amino

Acido

Dansyl

Amino Acidos Libres

Figura 5-13. Reacción Dansyl Chloride

C) Secuenciación de Proteínas Pasos preliminares Métodos para determinar el N-terminal 2) Método para
C) Secuenciación de Proteínas
Pasos preliminares
Métodos para determinar el N-terminal
2)
Método para determinar el C-terminal

El

amino

ácido

liberado

puede

ser

El residuo N-terminal puede también ser

identificado llevando a cabo el primer paso de la degradación Edman (Sección 5-3C).

No hay un procedimiento químico confiable para identificar el residuo C-terminal de un polipéptido. Sin embargo, esto puede a menudo ser hecho usando Carboxipeptidasas, enzimas que catalizan la excisión hidrolítica del residuo C-terminal de un polipéptido.

e

aislado

identificado.

Carboxipeptidasa R O O O 2 R 1 R 0 … NH CH C NH
Carboxipeptidasa
R
O
O
O
2
R 1
R 0
NH
CH
C
NH
CH
C
NH
CH
C
O -
H 2 O
Carboxipeptidasa
R
O
R
O
R 0
O
2
1
-
NH
CH
C
NH
CH
C
O
+ H
3 N
CH
C

O -

C) Secuenciación de Proteínas Pasos preliminares Aminopeptidasas: Similarmente cortan los residuos N- terminales de
C) Secuenciación de Proteínas
Pasos preliminares
Aminopeptidasas: Similarmente cortan los residuos N-
terminales de polipéptidos.
Aminopeptidasas
y
Carboxipeptidasas
son
llamadas
colectivamente como exopeptidasas.
Carboxipeptidasa
Selectividad en su diana
A
No corta C-terminal de Arg o Lys
o residuos cerca de Pro.
Hidroliza
el
C-terminal
de
residuos
de
Arg
y
Lys
pero
B
solamente si estos
precedidos por Pro.
no
están
C) Secuenciación de Proteínas Pasos preliminares
C) Secuenciación de Proteínas
Pasos preliminares

Tales especificidades requiere que los resultados de análisis de grupos terminales sean tratados con precaución. Puentes disulfuro entre y dentro de porlipéptidos son cortados Puentes disulfuro entre residuos de Cys deben ser cortados para separar cadenas polipeptídicas (si ellas están unidas por disulfuro) y para asegurar que cadenas polipeptídicas son completamente lineales (residuos en polipéptidos son “anudados” con puentes disulfuro pueden no ser accecibles a todas las enzimas y reactivos usados para secuenciación). Puentes disulfuro pueden ser cortados oxidativamente por ácido perfórmico o reducido por mercaptans.

Rompimiento de Puentes Disulfuro en Proteínas Nelson D. L. & Cox M. M; Lehninger Principles
Rompimiento de Puentes Disulfuro en Proteínas
Nelson D. L. & Cox M. M; Lehninger Principles of Biochemistry, 3 rd Ed; Worth Publishers ; U.S.A; 2000; p. 143
C) Secuenciación de Proteínas Pasos preliminares Desventaja: También oxida residuos de
C) Secuenciación de Proteínas
Pasos preliminares
Desventaja:
También
oxida
residuos
de

Puentes disulfuro entre y dentro de porlipéptidos son cortados Mercaptans son compuestos que contiene grupos – SH. Oxidación por ácido perfórmico (iniciado por Sanger): Convierte todas los residuos Cys, si está unido por puentes S-S o no, a residuos de ácido cisteico.

y

Met

destruye parcialmente la cadena lateral indol de Trp.