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Espectrofotometría UV/VIS

Conceptos básicos

Diseño de
Instrumentos

Aplicaciones

Consejos y
Sugerencias

Verificación
del rendimiento

Espectrofotometría UV/VIS
Fundamentos y Aplicaciones
1. Introducción 3
Contenido

2. Espectroscopía UV / VIS 4
2.1 ¿Qué es la espectroscopia UV / VIS? 4
2.2 Principio de medición 6
2.3 Transmitancia y absorbancia 7
2.4 Ley de Lambert-Beer 9

3. Espectroscopía UV / VIS en Química Analítica 11


3.1 ¿Por qué medimos espectros UV / VIS? 11
3.2 Análisis cualitativo: Identificación 12
3.3 Análisis cuantitativo: Determinación de la concentración 14

4. Diseño del Espectrofotómetro 16


4.1 Comparación de diseño 16
4.2 Espectroscopía UV/VIS basada en cubeta 19
4.3 Espectroscopía UV/VIS basada en Micro-volumen 19

5. Aplicaciones 21
5.1 Longitud de onda fija 21
5.2 Determinación de la concentración mediante la cuantificación 22
5.3 Barrido 25
5.4 Cinética 27
5.5 Aplicaciones en química biológica 32

6. Consejos y Sugerencias para mediciones UV/VIS exactas y precisas 38


6.1 Espectroscopía UV/VIS basada en cubeta 38
6.2 Selección del solvente 39
6.3 Concentración de la muestra 40
6.4 Selección de la longitud de onda 40
6.5 Análisis de mezclas 41
6.6 Espectroscopía UV/VIS basada en Micro-volumen 41

7. Verificación del rendimiento 43


7.1 Requisitos regulatorios 43
7.2 Pruebas de verificación del rendimiento 44
7.3 Instrumental para auto-verificación 48
7.4 Materiales de referencia certificados para espectrofotometría 49

7.5 Pruebas de verificación del rendimiento con CertiRef 51

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1. Introducción
Introducción
Junto a los análisis químicos, la caracterización de sustancias puras, así como de mezclas, se logra con mé-
todos físicos. Entre otras técnicas, tales como la determinación del punto de fusión, el índice de refracción y la
densidad, la espectroscopia óptica en el rango de la luz visible y ultravioleta (UV/VIS) es ampliamente aplicada
en casi todos los segmentos de mercado y lugares de trabajo como en la investigación, producción y control de
calidad para la clasificación y el estudio de las sustancias. La espectroscopía de UV/VIS se basa en la absorción
de luz por una muestra. Dependiendo de la cantidad de luz y su longitud de onda absorbida por la muestra, se
puede obtener valiosa información, tal como la pureza de la muestra. Además, la cantidad de luz absorbida se
relaciona con la cantidad de muestra, y por lo tanto, el análisis cuantitativo es posible mediante espectroscopia
óptica.

Durante muchos años METTLER TOLEDO ha proporcionado soluciones con instrumentos innovadores para la
caracterización de muestras (por ejemplo, valores térmicos, pH, conductividad, índice de refracción, densidad),
así como para la determinación del contenido por valoración. Con la introducción de una nueva técnica analítica
y las posibilidades de los instrumentos de METTLER TOLEDO, el nuevo espectrofotómetro UV / VIS Excellence apo-
yará, adicionalmente, el flujo de trabajo del cliente con sus rápidos y confiables resultados. Esta guía proporciona
al lector los conocimientos fundamentales sobre esta técnica, así como consejos y sugerencias de aplicación
para obtener resultados exactos y precisos en el uso diario.

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2. Espectroscopía UV/VIS
Espectroscopía UV/VIS

2.1 ¿Qué es la espectroscopia UV / VIS?

La espectroscopia óptica se basa en la interacción de la luz con la materia. La siguiente figura ilustra lo que
sucede cuando la luz brilla sobre un objeto:

Luz blanca Luz blanca

e
ja

rd
ro

ve
z
Lu

z
Lu
Superficie roja Superficie verde

Figura 1 y 2: La luz que no es absorbida por el objeto se refleja y puede ser vista por el ojo

Ambos objetos son iluminados por la luz visible o blanca, que está representado por un arco iris: los diferentes
colores representan los diferentes componentes de la luz visible. Cuando los rayos de luz están brillando sobre un
objeto, ellos pueden ser absorbidos por el objeto - en particular, uno o más componentes de la luz (es decir,
sus colores) son específicamente absorbidos.

Los colores que no son absorbidas por los objetos se reflejan. En nuestro ejemplo, la luz roja se refleja en la piel roja
del tomate (Fig. 1), mientras que la luz verde se refleja en la piel verde del calabacín (Fig. 2). Todos los otros colores
son absorbidos por los dos objetos. La luz reflejada entonces es vista por los ojos: tomate es visto en rojo mientras el
calabacín en color verde.

En términos físicos, la luz es un tipo de energía se propaga en el espacio a una velocidad muy alta. Más específica-
mente, la luz se entiende como una onda electromagnética que viaja en el espacio - es energía radiante. La energía
de la luz oscila periódicamente entre un mínimo y un máximo en función del tiempo - como una onda. La distancia
entre dos máximos o dos mínimos, respectivamente, de la onda electromagnética se define como la longitud de
onda, dada en nanómetros (nm).

Aumento de energía
Longitud de onda

Aumento de longitud de onda

Figura 3: La energía de una onda electromagnética aumenta al disminuir la longitud de onda y viceversa

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Cada color tiene una longitud de onda específica, por ejemplo, la luz roja tiene una longitud de onda de 660 nm,
mientras que la luz verde tiene una longitud de onda de 520 nm. Por lo tanto, los diferentes componentes de la
luz se caracterizan por una longitud de onda específica. La suma de todos los componentes, es decir, de todas
las longitudes de onda, es llamada un espectro. Más específicamente, un espectro representa una distribución
de la energía radiante. Por ejemplo, el espectro electromagnético de la luz visible va desde aproximadamente
390 nm hasta aproximadamente 780 nm.

Aumento de frequencia (Hz)

Aumento de longitud de onda (m)

Espectro visible (390-780 nm)

Figura 4: El espectro visible (390 - 780 nm) representa sólo una pequeña parte de todo el espectro electromagnético

Tenga en cuenta que la energía de las ondas electromagnéticas se relaciona con sus longitudes de onda; a más
corta la longitud de onda, mayor es la energía. Por ejemplo, la luz violeta tiene una longitud de onda más corta
que la luz roja y, por tanto, un mayor nivel de energía, mientras que la luz infrarroja tiene menos energía que la luz
visible debido a su mayor longitud de onda.

La absorción de la luz como herramienta analítica


La absorción de luz se puede utilizar en la química analítica para la caracterización y determinación cuantitativa
de sustancias. La espectroscopía UV/VIS es una técnica basada en la absorción de la luz por una sustancia des-
conocida o una muestra desconocida. Aquí, la muestra se ilumina con los rayos electromagnéticos de diferentes
longitudes de onda en el visible (VIS, es decir, los diferentes colores) y rangos adyacentes, es decir, ultravioleta
(UV) y la parte inferior de la región del infrarrojo (IR cercano) del espectro. Dependiendo de la sustancia, la luz es
absorbida parcialmente. La luz restante, es decir, la luz transmitida, se registra como una función de la longitud de
onda por un detector adecuado, proporcionando el espectro UV/VIS de la muestra. Como resultado, debido a que
cada sustancia absorbe la luz de una manera diferente, una relación única y específica existe entre la sustancia y
su espectro UV/VIS. El espectro se puede entonces utilizar para identificar o cuantificar una sustancia.

Figura 5: La luz que pasa a través de una solución de muestra es parcialmente absorbida por los componentes

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Espectroscopía UV/VIS
La espectroscopía UV/VIS se aplica generalmente a moléculas orgánicas, iones inorgánicos o complejos
en soluciones, aunque los materiales sólidos, tales como películas o vidrio, pueden ser analizados también.
Los espectros UV/VIS obtenidos son muy útiles para mediciones cuantitativas de un compuesto específico.
De hecho, la concentración de un analito en solución puede ser determinada midiendo la absorbancia a
una longitud de onda específica. Desde el valor de la absorbancia de la muestra, su concentración puede
ser calculada, ver la descripción en el capítulo 2.4.

La espectroscopía es una técnica de medición en el que el registro de los espectros de absorción de las diferentes
muestras utilizando luz visible (VIS) y ultravioleta (UV) se obtiene mediante un espectrofotómetro, es decir, un ins-
trumento capaz de medir el espectro de una muestra en el rango UV/VIS.

2.2 Principio de Medición

Un espectrofotómetro UV/VIS mide la intensidad de la luz que pasa a través de una solución de muestra en una
cubeta, y la compara con la intensidad de la luz antes de que pase a través de la muestra. Los principales
componentes de un espectrofotómetro UV/VIS son una fuente de luz, un soporte de muestras, un dispositivo de
dispersión para separar las diferentes longitudes de onda de la luz (por ejemplo, un monocromador), y un
detector adecuado.

Sistema de detección Registrador

Fuente de luz Cubeta con solución de muestra

Figura 6: Principio de medición en espectroscopía UV/VIS

El principio de funcionamiento de un espectrofotómetro se basa en los siguientes pasos:

Blanco (medida de la intensidad de la luz transmitida a través del solvente):


1. El solvente (por ejemplo agua o alcohol) se añade en un recipiente de absorción adecuado, transparente y
no absorbente - una cubeta.
2. Un haz de luz emitido por la fuente de luz pasa a través de la cubeta con el solvente.
3. La intensidad de la luz transmitida a diferentes longitudes de onda es luego medida por un detector
posicionado después de la cubeta con el solvente y registrada.
Esto se conoce como blanco, lo que es necesario para la medición de la muestra.

Determinación de la muestra:
1. Una muestra es disuelta en el solvente y añadida a la cubeta.
2. Un haz de luz emitido por la fuente de luz pasa a través de la cubeta con la muestra.
3. Al pasar por la cubeta, la luz es parcialmente absorbida por las moléculas de la muestra en la solución.
4. La luz transmitida es luego medida por el detector.
5. El cambio de intensidad de luz en diferentes longitudes de onda es calculado dividiendo la intensidad
transmitida de la muestra por los valores correspondientes del blanco. Esta relación se almacena
finalmente por un registrador.

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2.3 Transmitancia y absorbancia

El detector en un espectrofotómetro UV / VIS mide la intensidad de la luz después de pasar por la solución de
muestra. Esta fracción de luz recogida por el detector es llamada la intensidad transmitida, I. La intensidad
de la luz transmitida es atenuada por la solución de muestra debido a, por ejemplo, la absorción de la luz
a específicas longitudes de onda. Por lo tanto, su valor es inferior a la intensidad original I0 de la fuente de luz.

Figura 7: Atenuación de la luz por absorción de las moléculas de la muestra en solución

La relación entre las dos intensidades I / I0 es definida como Transmitancia T, y su unidad es %.

I
T=
I0
Figura 8: Transmitancia es la relación entre la intensidad transmitida I y la intensidad original I0

La transmitancia es el principal valor determinado por espectroscopia UV/VIS, pero no es el único. De hecho, la
absorbancia A representa un resultado adicional ampliamente utilizado durante el registro de espectros UV/VIS.
Se define como el logaritmo negativo de la transmitancia y tiene una gran ventaja, que veremos en el próximo
capítulo.

A = −log(T)
Figura 9: La absorbancia es el logaritmo negativo del valor de la transmitancia

Tenga en cuenta que la absorbancia A no tiene ninguna unidad de medida. En otras palabras, es un valor
adimensional. Sin embargo, a menudo se representa mediante la letra “A” o como UA para unidades de
absorbancia. Por ejemplo, 0,3 A o 0,3 unidades de absorbancia, respectivamente.

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El resultado de una medición utilizando un UV/VIS instrumento UV/VIS se muestra en la siguiente figura:
Espectroscopía UV/VIS

100.0

90.0

80.0

70.0
Transmitancia

60.0

50.0

40.0

30.0

20.0 Holmium MeasureSample1

10.0
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100

Longitud de onda (nm)

Figura 10: Espectro de transmitancia de solución de holmio como una función de la longitud de onda.

El espectro de transmitancia de una muestra es registrado como una función de la longitud de onda. En este
ejemplo en particular, la muestra absorbe la luz en principalmente cuatro diferentes longitudes de onda, es
decir, a aprox. 370, 450, 480 y 540 nm. La absorción de la luz está marcada por una fuerte disminución de la
transmitancia en estas longitudes de onda

En la siguiente figura, el espectro de absorbancia de la misma muestra es dado como una función de la longi-
tud de onda. Note que los picos de absorción se encuentran en las mismas longitudes de onda. En este caso,
el grado de absorción de la luz se indica mediante los valores de absorbancia más altos.

1.0 Holmium MeasureSample1

0.8
Absorbancia

0.6

0.4

0.2

0.0
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100
Longitud de onda (nm)

Figura 11: Espectro de absorbancia de una solución de holmio como función de la longitud de onda.

En general, un espectro UV / VIS se representa gráficamente como la absorbancia como una función de longitud
de onda. La ventaja de esta representación es obvia; la altura de los picos de absorción es directamente propor-
cional a la concentración de la especie.

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2.4 Ley de Lambert-Beer

Al pasar por una cubeta transparente llena de solución de la muestra, la intensidad de la luz se atenúa propor-
cionalmente con la concentración de la muestra. En otras palabras, una solución de muestra más concentrada
va a absorber más luz. Además, la atenuación es también proporcional a la longitud de la cubeta; una cubeta
más larga conducirá a una mayor absorción de la luz.

Figura 12: la atenuación de la intensidad de luz es proporcional a la concentración de la muestra así como de la longitud de la cubeta.

Ambos factores se pueden resumir mediante la expresión de la absorbancia A como una función de la con-
centración y de la longitud de la cubeta. En particular, la absorbancia A es igual al producto del coeficiente de
extinción ε, la concentración c y el recorrido del camino d :

Esta relación se llama la ley de Lambert-Beer, donde:


1. La concentración de la muestra c se da en mol / L o g / mL, respectivamente
2. La longitud del camino d de la cubeta se da en cm,
3. El coeficiente de extinción ε (épsilon) es una constante específica de la muestra la cual describe
cuánto la muestra es absorbente a una longitud de onda dada (en L / (cm*mol) o ml / (cm*g),
respectivamente).

Cuando la longitud del camino es de 1 cm y la concentración es del 1% p/v, el coeficiente de extinción se


denomina absorbancia específica (E )

La ley de Lambert-Beer permite la determinación de la concentración de la muestra a partir del valor absorban-
cia medida. Si se conocen el coeficiente de extinción ε y la longitud del camino d, a continuación, la concentra-
ción de c puede calcularse a partir de absorbancia A como se indica a continuación:

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Espectroscopía UV/VIS en Química Analítica Chemistry
Para obtener resultados óptimos de medición y para cumplir con la Ley de Lambert-Beer, la absorción estará
en el rango lineal del instrumento. El rango adecuado para mediciones óptimas, es decir, el rango de medición,
donde la absorbancia es directamente proporcional a la concentración es dado como 0.3 < A < 2,5.
Es recomendado evitar valores muy altos de absorbancia (A> 2,5), así como valores muy bajos de absorbancia
(A <0,3) que pueden conducir a un comportamiento no lineal de la línea de calibración. Esto se muestra en la
figura siguiente, donde los valores medidos por encima de A = 2,5 y por debajo de A = 0,3 (línea roja punteada)
se desvían de la línea de calibración teórica (verde):

Figura 13: No linealidad: Los valores medidos en rojo fuera del rango lineal se desvían de la línea de calibración teórica verde.

La resolución del instrumento, la relación señal-ruido y la interferencia luz difusa son las principales
contribuciones que pueden limitar la linealidad del instrumento. Por otra parte, las limitaciones se
pueden derivar de la propia muestra como sigue:

• Soluciones de muestra altamente concentradas:


→ Use concentraciones de uso en el orden de 0,01 M para las medidas óptimas
• Alta concentración de sal en la muestra:
→ diluir la muestra para evitar una concentración demasiado alta de sal
• Interacciones entre las moléculas en solución puede dar lugar a la no linealidad, especialmente a altas
concentraciones y en presencia de enlace de hidrógeno
• El índice de refracción puede cambiar en el caso de grandes cambios de concentración, reduciendo la
linealidad
• Desplazamiento del equilibrio químico puede tener lugar como disociaciones y asociaciones de moléculas,
o debido a reacciones químicas.

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3. Espectroscopía UV/VIS en Química Analítica

3.1 ¿Por qué medimos espectros UV/VIS?

Hay cinco razones principales para medir espectros UV/VIS:

• Los espectros UV/VIS permiten identificar los componentes presentes en la solución de la muestra. Más
precisamente, la posición y en cierta medida el perfil de los picos de absorción permiten a los compuestos
específicos a ser identificados. Por ejemplo, los compuestos orgánicos pueden ser identificados por sus
espectros, o la pureza disolvente puede verificarse fácilmente mediante espectroscopía de UV/VIS.
• Los picos de absorción pueden usarse para cuantificar la muestra investigada. Por ejemplo, la concen-
tración de la muestra puede calcularse a partir del valor de la absorbancia del pico:
c5 > c4 > c3 > c2 > c1
c = concentración
1.0

c5
c4
0.5 c3
A

c2
c1

0.0 λ/nm
Figura 14: Una mayor concentración conduce a un mayor valor de la absorbancia.

• Sobre la base de la relación entre la absorbancia y la concentración de la muestra, la espectroscopia


UV/ VIS es aplicada como una técnica analítica cuantitativa en segmentos de mercado como,
por ejemplo, análisis de agua, alimentos y bebidas, farmacéutico, químico e industria de biotecnología.
• La posición de los picos en el espectro revela información acerca de la estructura molecular de la muestra.
• Por ejemplo, los grupos funcionales específicos de una estructura molecular, tales como el carbono
oxígeno, C = O, o dobles enlaces carbono-carbono, C = C, absorben a longitudes de onda características
específicas.
• El espectro puede revelar propiedades físicas específicas de las moléculas de la muestra. Por ejemplo,
desde el espectro UV/VIS se puede:
– Calcular el coeficiente de extinción de la muestra
– Calcular el punto de fusión de proteínas y ácidos nucleicos mediante la medición
de espectros UV/VIS a diferentes temperaturas
– Determinar la velocidad de una reacción mediante el monitoreo de los espectros
de absorción como una función del tiempo (también conocidas como mediciones cinéticas).
• Por último, la posición y el perfil de los picos en el espectro puede dar información sobre el ambiente mi-
croscópico de las moléculas de la muestra. Como ejemplo, la presencia de impurezas u otros disolventes
en la solución de muestra tiene un efecto sobre la posición y del perfil de los picos. En otras palabras, los
picos pueden ser más amplios o se han desplazado debido a las impurezas.

Las aplicaciones de la espectroscopía UV/VIS se centran principalmente en el análisis cualitativo y cuantitativo,


que se abordará con más detalle en el próximo capítulo.

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3.2 Análisis Cualitativo: Identificación
Espectroscopía UV/VIS en Química Analítica Chemistry

En el análisis cualitativo, la espectroscopia UV / VIS se puede utilizar como una herramienta para identificar si el
analito es puro y no se sometió a descomposición. Por ejemplo, esta técnica se utiliza para el control de calidad
de la materia prima entrante, y para el control de pureza de los compuestos biológicamente relevantes tales
como los ácidos nucleicos, ADN y ARN. Además, el punto de fusión del ADN se puede determinar mediante el
registro de su espectro UV/VIS a diferentes temperaturas. Finalmente, por medio de UV / VIS, es posible diferen-
ciar entre ácidos grasos saturados e insaturados presentes en el aceite de oliva, y de esta forma, monitorear su
calidad.

El análisis cualitativo se basa en la especificidad de la espectroscopía UV/VIS. De hecho, las muestras absorben
la luz de una o más longitudes de onda distintas, con valores de absorbancia máximos específicos. Por esta
razón, cada muestra tiene un espectro UV/VIS característico y único que se puede utilizar para su identificación.
En particular, esto se logra mediante la comparación del espectro de la muestra con espectros de compuestos
puros conocidos. Como un ejemplo del espectro UV/VIS, se muestra a continuación el espectro de la clorofila.
Esta molécula, responsable del color verde de las hojas y la hierba, característicamente tiene bandas de absor-
ción fuertes en las regiones del violeta, azul y rojo de su espectro UV/VIS.

Molécula
de Clorofila

CHLOROPHYLL MeasureSample1
Absorbancia

Longitud de onda (nm)

Figura 15: Espectro UV/VIS de la clorofila a.

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Como un segundo ejemplo, el espectro de absorción de beta caroteno es dado como una función de la longitud
de onda. El beta caroteno, un pigmento natural de fuerte color rojo-naranja abundante en plantas y frutas tales
zanahorias, calabazas y batatas, se caracteriza por una banda de absorción única, amplia y fuerte en la región
azul-violeta del espectro. De acuerdo con USP, la muestra presenta un hombro a aproximadamente 427 nm, un
máximo de absorción a aproximadamente 455 nm, y un segundo máximo de absorción a 483 nm aproximada-
mente, mientras que la relación de absorbancia a 455 y 483 nm A (455) / A (483) está entre 1,14 y 1,18. Tenga
en cuenta que estas tres bandas de absorción y la relación A (455) / A (483) permite una clara identificación del
beta caroteno como la molécula presente en la solución. Como resultado de la absorción a estas longitudes de
onda, de un color rojo-naranja intenso es visto cuando el beta caroteno está presente.

Molécula de Caroteno

BETA CAROTENE MeasureSample1


Absorbancia

Longitud de onda (nm)

Figura 16: Espectro UV/VIS del beta caroteno –un compuesto presente en zanahorias

Por último, los espectros UV/VIS de tres compuestos diferentes se dan en la siguiente figura. Todos ellos tienen
un espectro característico debido a que en estas moléculas todos tienen una estructura química diferente. Esto
permite la identificación de las muestras mediante espectroscopía UV / VIS.

T434, CHLOROPHYLL B MeasureSample1


T439, MALVIDIN MeasureSample1
T452, CHLOROPHYLL A MeasureSample1
Absorbancia

Longitud de onda (nm)

Figura 17: Cada muestra tiene un espectro específico UV/VIS. Esta relación única permite la caracterización de la muestra. En este caso, los
compuestos malvidina, clorofila a y clorofila b pueden ser fácilmente reconocidos por sus espectros individuales.

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3.3 Análisis Cuantitativo: Determinación de la Concentración
Espectroscopía UV/VIS en Química Analítica Chemistry

Basados en la ley de Lambert-Beer, la concentración de un compuesto en una solución se puede determinar


cuantitativamente mediante espectroscopía UV/VIS. Para realizar esto, una línea de calibración es primero de-
terminada midiendo la absorción de varias soluciones estándar de concentración conocida. De esta forma, la
concentración de muestras tales como ADN, ARN, proteínas, carbohidratos o compuestos orgánicos pueden ser
determinados.

Figura 18: La atenuación del rayo de luz permite la determinación de la concentración de la muestra.

La relación lineal entre la absorbancia y la concentración de una muestra abre la puerta para una variedad de
análisis cuantitativo. En la siguiente tabla, se dan tres aplicaciones principales de la ley de Lambert-Beer:

Analito / Parámetro Segmento de Mercado


Determinación – Iones de metales ej. hierro, cobre, níquel – Farma
de la Concentración
– Iones Inorgánicos, ej. nitrato – Agua
– Demanda Química de Oxígeno (DQO) – Alimentos y Bebidas
– Electro platinado

Monitoreo de analito Cinética enzimática: determinación de relación de catálisis – Farma (Cinética)


concentración vs.
tiempo – Glucosa oxidase cataliza la oxidación de la
β-D-Glucosa por el oxígeno (725 and 415 nm)
– Oxidación y reducción de nucleótidos piridínicos
– (NAD+/NADH, 340 nm).
– Velocidad de la Oxidación del Colesterol por catálisis con
Colesterol Oxidasa (500 nm)
– Test cinética colorimétrica GPO por triglicéridos (520 nm)

Parámetros – Constante de disociación de ácido pKa – Farma


Físico Químicos
– Constante de Formación de Complejos Kf – Investigación
– Coeficiente de Partición/Distribución logP / logD
– Test de Disolución

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3.3.1 Recta de Calibración
Para determinar una concentración desconocida de una solución de muestra mediante espectroscopía UV/VIS, se
debe crear primero una recta de calibración. Esta se hace mediante la medición de la absorción de luz de varias so-
luciones estándar de diferentes concentraciones conocidas a una longitud de onda fija predefinida. En el siguiente
ejemplo, se midieron 5 soluciones patrón de concentraciones crecientes a una longitud de onda predefinida:

Figura 19: La etapa de calibración y la lista de estándar para determinar la recta de calibración se indican en la pantalla del instrumento.

Una recta de calibración se obtuvo representando gráficamente los valores de absorbancia en función de
la concentración. Por último, una regresión lineal de los valores medidos da la recta de calibración:
Absorbancia

concentración (mg/L)

Figura 20: Los valores de absorbancia de las soluciones estándar son determinados. Una regresión lineal de los puntos de datos da la
línea de calibración.

3.3.2 Determinación de la muestra


Usando la línea de calibración, una muestra desconocida puede ahora determinarse a partir de su absorbancia:
Absorbancia

concentración (mg/L)

Figura 21: Determinación de la Concentración: La absorbancia de una solución de muestra desconocida se mide y se compara con la recta
de calibración para determinar su concentración.

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4. Diseño del Espectrofotómetro
Diseño del Espectrofotómetro

Un espectrofotómetro generalmente consta de cuatro componentes:

1. Una fuente de luz adecuada que cubre el espectro UV/VIS de intereses. En general, se utiliza una lám-
para que contiene un gas tal como xenón, o una combinación de dos lámparas diferentes, tales como de
tungsteno / deuterio.
2. Es necesario un soporte de muestra adecuado para sostener la muestra.
– Las muestras líquidas se colocan en cubetas, que pueden ser de cuarzo, vidrio de borosilicato o
plástico acrílico. Sin embargo, el vidrio y plástico acrílico no transmiten la luz UV y sólo deben usarse
para mediciones en el rango de la luz visible
– Las muestras sólidas se pueden montar en un soporte adecuado para ser posicionado en el trayecto
óptico del espectrofotómetro para la medición de la luz transmitida.
3. Es necesario un elemento de dispersión para distribuir la luz en longitudes de onda separadas.
Puede ser un prisma de cuarzo o una rejilla de difracción, es decir, un componente óptico con
una estructura periódica capaz de difractar la luz.
4. Por último, la intensidad de la luz transmitida es registrada por un detector adecuado, tal como fotomulti-
plicador, una matriz multicanal (por ejemplo, una matriz de fotodiodos, o PDA), o un dispositivo acoplado
de carga (CCD), de manera similar a una cámara digital. Ambos detectores PDA y CCD utilizan un material
semiconductor fotosensibles para convertir la luz en una señal electrónica que luego es registrada por el
instrumento.

4.1 Comparación de Diseño

Los espectrofotómetros UV/VIS pueden ser clasificados de acuerdo a la geometría de los componentes de la
construcción del sistema óptico para el registro de espectros. Las dos configuraciones siguientes son utilizadas
generalmente en la espectroscopia UV/VIS:
• Espectrofotómetro de barrido
• Espectrofotómetro de matriz

4.1.1 Espectrofotómetro de barrido


El principio de funcionamiento de un espectrofotómetro de barrido convencional se basa en la medición del
valor de transmitancia en cada longitud de onda única. La luz se dispersa primero en longitudes de onda indi-
viduales usando una rejilla de la reflexión. La rejilla se hace girar con el fin de seleccionar individualmente cada
longitud de onda que se envía a continuación a través de una cubeta. La transmitancia a esta longitud de onda
específica es registrada. Todo el espectro se obtiene cambiando continuamente la longitud de onda de la luz
(es decir, barrido) entrante en la solución de la muestra mediante la rotación de la rejilla:

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Rejilla de reflexión
Cóncava

Rejilla de salida
Lámpara de descarga
de Xenón Cubeta

CPU

Sensor CCD

Terminal tacto-sensible

Figura 22: Espectrofotómetro de barrido: Los rayos de luz de longitudes de onda específicas son dirigidos a la cubeta.

Tenga en cuenta que los espectrofotómetros de barrido toman algún tiempo para una exploración de espectro
completo, porque la rejilla tiene que ser rotada mecánicamente por un motor. El proceso de exploración también
puede conducir a la disminución de la precisión y de la reproducibilidad en la selección de longitud de onda,
dependiendo de la velocidad de exploración del espectrofotómetro.

4.1.2 Espectrofotómetro de Matriz


En esta configuración, la muestra es iluminada por un haz de luz que consta de todos los componentes
espectrales del rango continuo UV/VIS. En otras palabras, la muestra en la cubeta absorbe simultáneamente
diferentes longitudes de onda de la luz. La luz transmitida es entonces difractada por una rejilla de reflexión
situada después de la cubeta, como se muestra en el siguiente diagrama.

Rejilla de reflexión cóncava

Rejilla de entrada

Cubeta

Sensor CCD CPU


Lámpara de descarga
de Xenón

Terminal tacto sensible

Figura 23: Espectrofotómetro de Matriz: Luz de todo el rango espectral es dirigida sobre la cubeta de muestra.

Este diseño también es conocido como “óptica inversa”; sólo después de pasar a través de la muestra de la
luz es difractada por la rejilla. Posteriormente, la luz difractada de varias longitudes de onda se dirige sobre el
detector. El detector, con su larga gama de material semiconductores fotosensibles, permite la medición simultá-
nea de todas las longitudes de onda del haz de luz transmitida. Con esta configuración, la medición de la
totalidad espectro UV/VIS es generalmente más rápida que usando un espectrofotómetro de barrido convencio-
nal ya que el espectro se registra simultáneamente en todas las longitudes de onda. Por otra parte, un detector
de matriz tiene una función integradora que acumula mediciones individuales para mejorar la señal, lo que lleva
a un aumento de la fuerza de relación señal a ruido, y por lo tanto, a una mejor calidad de señal del espectro
medido. Los espectrofotómetros de matriz presentan un enfoque innovador para acelerar la exploración del
espectro completo basado en tecnología de óptica inversa. El diseño robusto sin partes ópticas móviles asegura
un rendimiento óptico muy bueno.

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Diseño del Espectrofotómetro
4.1.3 Caminos Ópticos
Los espectrofotómetros UV/VIS pueden tener ya sea un solo haz o doble vía óptica del haz, es decir, la forma en
que un haz de luz de la lámpara pasa a través de la cubeta de análisis para alcanzar el detector.

• Configuración de un solo haz


La configuración de un solo haz es la configuración más simple y más fácil para la espectroscopia UV/VIS. El
haz de luz es directamente guiado a través de la muestra sobre el detector. Una cubeta que contiene sólo el
solvente tiene que ser medida primero con el fin de determinar el valor en blanco (véase el capítulo anterior.).
Después de medir el valor en blanco, la cubeta con el solvente se sustituye por una cubeta que contiene la
muestra. La última se mide para obtener el espectro de absorción de la muestra.

Fuente de Luz Detector

Figura 24: Vía óptica de haz único.

• Configuración de doble haz


En una configuración de doble haz, el haz de luz se divide en una referencia y un haz de muestra.
Dos opciones diferentes están disponibles para la vía óptica:

– Simultánea en el tiempo :
El haz de luz de la lámpara se divide en dos haces de intensidades iguales. Cada haz pasa a través
de una cubeta diferente; la cubeta de referencia, que se llena con único solvente, mientras que
la segunda cubeta contiene la solución de muestra. Las intensidades de ambos haces se miden
simultáneamente por dos detectores.
– Alternada en el tiempo:
Cette Esta configuración se consigue mediante el direccionamiento de la trayectoria de la luz con
1.
un divisor óptico (DO), que es un espejo sección giratoria. La luz se dirige alternativamente a través
de una muestra y una celda de referencia. Un único detector mide dos haces de luz, uno tras otro.

1.

2.

DO

Figura 25: Vía óptica de doble haz: 1. simultánea en el tiempo, y 2. alternada en el tiempo con un divisor óptica (DO).

2.

DO
18 METTLER TOLEDO GmbH, Analytical UV/VIS Fundamentos y Aplicaciones
4.2 Espectroscopía UV/VIS basada en cubeta

Mettler-Toledo desarrolló un espectrofotómetro de matriz de haz simple que permite realizar mediciones rápidas
y precisas en el rango UV/VIS. La fuente de luz consiste en una lámpara de destellos de xenón para el ultra-
violeta (UV), así como para las regiones de longitud de onda del visible (VIS) y el infrarrojo cercano cubriendo
rango espectral de 190 hasta 1100 nm. Los destellos de la lámpara se centran en una fibra de vidrio que con-
duce el rayo de luz a una cubeta que contiene la muestra de la solución. El haz pasa a través de la muestra y
las longitudes de onda específicas son absorbidas por los componentes de la muestra.

Generador del Orientación del Muestra Detector Dispersión Computación y


haz de luz haz de luz del haz de visualización
luz

Reejo
Emparrillado

Haz de luz parcialmente


absorbido
Fibra de vidrio

Haz de luz
policromático

Haz de luz
dispersado CPU
Rendija de
entrada Sensor
CCD
Terminal
Lámpara Xenon Lentes
de descarga
Cubeta
conteniendo
la muestra

Figura 26: Espectrofotómetro de matriz de haz simple basado en cubeta:


El haz de luz de la lámpara está pasando a través de la muestra, es difractado por la rejilla y dirigido sobre la detector de matriz.

La luz remanente se recoge después de la cubeta por una fibra de vidrio y es conducida a un espectrógrafo.
El espectrógrafo consiste en una rejilla de difracción que separa la luz en las diferentes longitudes de onda, y un
sensor CCD para registrar los espectros, respectivamente. Todo el espectro es entonces simultáneamente medido,
lo que permite un registro rápido.

4.3 Espectroscopía UV/VIS Micro-volumen

Mettler-Toledo ofrece un espectrofotómetro capaz de realizar medición UV/VIS en micro-volumen. Este instrumento
es capaz de medir volúmenes muy pequeños y muestras altamente concentradas. El método es bastante senci-
llo. La muestra se pipetea directamente sobre la plataforma de medición, sin dilución adicional. Por lo tanto, se
evitan los errores de manipulación. Por otra parte, la selección de una longitud de trayectoria específica permite
la medición sobre un gran rango de concentración con tan poco como 1 µL de muestra. Las mediciones se
llevan a cabo en la plataforma de micro-volumen cubierta por un brazo móvil montado en la parte superior del
instrumento. Posee tanto una plataforma de micro-volumen, así como un soporte de cubeta.

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Aplicaciones
Dependiendo de la aplicación seleccionada, la luz puede ser dirigida ya sea a la plataforma o a la cubeta de
1 cm. La luz transmitida es enfocada en la rejilla donde se produce la difracción. Los haces de luz difractados de
diferentes longitudes de onda son luego dirigidos al detector.

Generador del Orientación del Muestra Detector Dispersión Computación y


haz de luz haz de luz del haz de visualización
luz

Espejo
Ajuste de la distancia
de muestreo
MAN o AUTO

Muestra
(gota) Reejo
Emparrillado

Haz de luz parcialmente


absorbido

Fibra de vidrio

Haz de luz
policromático
Haz de luz
dispersado
Rendija de
entrada Sensor
CCD CPU
Obturador Lentes
Terminal
Lámpara Xenon Separador
Cubeta
de descarga
conteniendo
la muestra

Figura 27: Espectrofotómetro de matriz para Micro-volumen:


El haz de luz es dirigida a la muestra en la plataforma de micro-volumen. Alternativamente, el haz puede direccionarse a una cubeta de 1 cm.

Cuando el brazo está en posición abierta, a la plataforma de micro-volumen se puede acceder fácilmente del
lado izquierdo o derecho con una pipeta. La tapa curvada en la parte superior del instrumento permite la coloca-
ción conveniente de la mano del operador para guiar con seguridad la punta de la pipeta. Durante la medición,
el brazo está bloqueado de forma segura a una longitud de trayectoria definida con precisión y no se puede abrir
hasta que se complete la medición.

Forma de gota
aprox. 1 – 5 µL

Figura 28: Espectrofotómetro de matriz para Micro-volumen:


La muestra es añadida con una pipeta en la plataforma de micro-volumen. El brazo móvil se cierra luego para la medición.

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5. Aplicaciones

5.1 Longitud de onda fija

La medición de longitud de onda fija (FW, por sus siglas en inglés) fija es la aplicación más simple de un
espectrofotómetro. Es una medida de longitud de onda única o múltiple y, como para todos los demás tipos
de medición, el resultado puede ser reportado en absorbancia o transmitancia. Cálculos posteriores pueden
realizarse para obtener el resultado final, por ejemplo, una concentración de una sustancia.

5.1.1 Aplicaciones de FW en alimentos y bebidas


En la industria de alimentos y bebidas, la espectrofotometría UV/VIS se utiliza para controlar y mejorar la calidad
y consistencia del producto. Por otra parte, la influencia del material de embalaje y estabilizadores, así como
los procesos de deterioro y la degradación químicos, también se puede observar con este método. Una aplica-
ción típica en este segmento de mercado es la verificación de la pureza del aceite de oliva, que permite que el
producto sea clasificado como “Virgen Extra”, “Virgen”, o simplemente “aceite de oliva”. Hay normas estableci-
das para la evaluación de aceite de oliva sobre la base de las características de absorbancia de ciertas molécu-
las en el UV/ VIS espectro. El aceite de oliva contiene aproximadamente 98% de triglicéridos. Los ácidos grasos
insaturados en el aceite son susceptibles a la descomposición y la oxidación. La oxidación de los ácidos gra-
sos libres provoca la formación de peróxidos. Esto conduce a la ranciedad y la degradación del aceite de oliva
en el tiempo. Junto a otros parámetros, este efecto se evalúa por los di-enos y tri-enos conjugados de ácidos
grasos insaturados (dobles enlaces conjugados C = C) que absorben en el intervalo de 230 a 270 nm.

Los estándares de aceite de oliva del Comité Oleícola Internacional (COI) especifica exactamente el umbral de
medición que tiene que cumplir para los aceites con el fin de ser calificado como virgen extra, virgen, y así
sucesivamente. La calidad del aceite se determina observando el comportamiento absorbancia de una solución
al 1% en isopropanol entre 200 y 400 nm. Los niveles elevados de absorbancia en el rango espectral de 200 a
400 nm indican aceite oxidado (peor calidad). La absorbancia a K232 nm, K270 nm y ΔK se correlaciona con
el estado de oxidación mediante la detección de compuestos oxidados específicos y también detectar posible
adulteración con aceites refinados. En la siguiente figura podemos ver el espectro ultravioleta del Aceite de Oliva
Extra Virgen de buena calidad que no muestran picos, en comparación con los picos evidentes de un aceite de
oliva la calidad pobre, presentada como muestra de aceite de oliva 4 y 5.

Extra virgin
Virgin
Absorbancia

Figura 29: Absorción medida en una solución al 1%, de aceite


de oliva extra virgen (azul) y aceite de oliva virgen (verde).
Longitud de onda (nm)

METTLER TOLEDO GmbH, Analytical UV/VIS Fundamentos y Aplicaciones 21


Aplicaciones

Figura 30: Aceite de oliva.

Valores bajos correlacionan con aceite de alta calidad, la absorbancia UV detecta estados tempranos y tardíos
de la oxidación. Esto se puede observar según la siguiente tabla, que está regulada según las normas CEE
(Comunidad Económica Europea, el Consejo de las Comunidades Europeas):

K232 K270 ΔK
Extra virgen ≤2.5 ≤0.22 ≤0.01
Virgen ≤2.6 ≤0.25 ≤0.01

5.1.2 Aplicaciones FW en la industria química


La espectroscopía de absorción UV es uno de los mejores métodos para la determinación de la pureza de solucio-
nes orgánicas. Picos adicionales que aparecen en longitudes de onda específicas pueden ser observados debido
a impurezas en la muestra.
Un ejemplo en la industria química es el control de la pureza en alcohol. El alcohol puede estar contaminado con
benceno, que absorbe la luz a 280 nm, mientras que el alcohol absorbe a 210 nm. La medición del espectro
UV/VIS puede revelar fácilmente si la muestra está contaminada si un pico adicional está presente en 280 nm.

5.2 Determinación de la concentración mediante la cuantificación

La determinación o cuantificación de la concentración de una sustancia por espectroscopia UV/VIS se basa en


la Ley de Lambert-Beer, descrita en el capítulo 2.4, que establece que la absorbancia de una solución es direc-
tamente proporcional a la concentración de la sustancia en la solución absorbente y la longitud del camino de
la cubeta. Así, para una longitud de camino fijo, la espectroscopia UV/VIS se puede utilizar para determinar la
concentración de la sustancia absorbente en una solución. Sin embargo, es necesario saber cuánto cambia la
absorbancia con la concentración. Esto puede ser tomado de referencias, tales como tablas de coeficientes de
extinción, o más fácilmente, determinado a partir de una curva de calibración.

El primer paso en un análisis cuantitativo es seleccionar una longitud de onda adecuada. La longitud de onda se
elige normalmente en un máximo de pico, es decir, en el pico de la banda de absorción, debido a que el cambio
en la absorbancia para un cambio dado de concentración es máximo, lo que lleva a una mayor sensibilidad y
precisión en las mediciones. El efecto relativo de otras sustancias o impurezas es, pues, más pequeño. Además,
la velocidad de cambio de absorbancia con la longitud de onda es más pequeña, y la medición no es tan seve-
ramente afectada por los pequeños errores en el ajuste de longitud de onda.

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El siguiente paso de cuantificación es la medición de estándares conocidos en la longitud de onda elegida.
La absorbancia de los estándares es luego graficada versus la concentración como se muestra en la figura del
capítulo 3.3.1. La curva de calibración para un análisis espectrofotométrico debería aproximar la muestra tan
cerca como sea posible y abarcar un intervalo adecuado de concentraciones de la sustancia. Lo ideal sería que
se necesiten al menos tres concentraciones diferentes de la sustancia, aunque con uno solo se puede aplicar.
En la práctica, cinco concentraciones diferentes producirán una curva de calibración más precisa. La absorban-
cia presenta una relación lineal con la concentración y una curva de regresión lineal de primer orden puede ser
ajustada en los puntos de datos.

Una muestra de una concentración desconocida puede ser determinada utilizando la curva de calibración..

5.2.1 Determinación de la concentración en los institutos de salud

La espectroscopia UV/VIS ha sido utilizada efectivamente en la ciencia médica para el análisis de rutina de
muestras de sangre y orina. Las diferencias espectrales entre la sangre saludable y de enfermos se pueden
comparar fácilmente. La cuantificación de la hemoglobina en sangre ha sido un parámetro de diagnóstico clave
para diversas enfermedades tales como anemia, policitemia y la deshidratación. La hemoglobina está com-
puesta de cuatro cadenas peptídicas y cada una lleva un grupo hemo. Es transportada por los glóbulos rojos
de la sangre y lleva el oxígeno desde los pulmones a los tejidos periféricos para mantener la viabilidad de las
células.
Absorbancia

400 nm

Longitud de onda (nm)

Figura 31: Curva estándar con hemoglobina recién preparada

Con el fin de comprobar el contenido total de hemoglobina en la sangre, el plasma es removido de la sangre
anticoagulada y los eritrocitos se suspenden en solución isotónica de sodio. La eritrosis se realiza antes para
que la absorbancia se pueda medir a una longitud de onda de 400 nm. La hemoglobina también se controla en
muestras de orina.

5.2.2 Determinación colorimétrica de fosfato


El fósforo es el undécimo elemento más abundante en la superficie de la tierra y se encuentra más comúnmente
en forma de fosfato. Desempeña un papel importante en los procesos bioquímicos y es un factor clave en el agua
superficial. El aumento de las concentraciones de fosfato están vinculados con el aumento de las tasas de cre-
cimiento de las plantas. Por lo tanto, el análisis de fósforo es muy importante en muchos campos, incluyendo la
ciencia médica y clínica, la agricultura, la metalurgia y la ciencia ambiental. Por otra parte, en los últimos años se

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Aplicaciones
han utilizado grandes cantidades de fosfato en bebidas, detergentes, fertilizantes y también en industrias azucare-
ras. En este contexto, la determinación colorimétrica de fosfato en diversas muestras de los diferentes segmentos
de mercado se realiza mediante espectrofotometría UV/VIS. La base de la técnica colorimétrica es la relación di-
recta entre la intensidad del color de una solución y la concentración del componente coloreado (las especies de
analito) que lo está contenido. El fosfato reaccionará fácilmente con molibdato de amonio en presencia de agen-
tes reductores adecuados para formar un complejo de color azul, cuya intensidad es directamente proporcional a
la concentración de fosfato en la solución. El contenido de fosfato de una muestra desconocida se puede obtener
primero mediante el gráfico de las absorbancias de una serie de soluciones estándar versus las concentraciones
correspondientes, dando así una curva de calibración. La concentración desconocida de fosfato en la muestra
puede entonces determinarse a partir del gráfico.

Figura 32: Serie preparada de soluciones estándar de fosfato. 


1.4

1.2

1.0
Absorbancia

0.8

0.6

0.4

0.2 ppm
0.2
0.4 ppm
0.6 ppm
0.0
0.8 ppm
1.0 ppm
−0.2

400 500 600 700 800 900

Longitud de onda (nm)

Figura 33: Espectro de absorbancia graficado de las correspondientes concentraciones.


Absorbancia

880 nm

concentración (ppm)

Figura 34: Valores de absorbancia a 880 nm versus la concentración de cada solución estándar que conduce a la curva de calibración.
La concentración desconocida de fosfato en la muestra puede determinarse a partir de la curva de regresión lineal.

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5.3 Barrido

En contraste con la medición de longitud de onda fija, las mediciones espectrales de barrido determinan la ab-
sorbancia o transmitancia de una muestra en un rango de longitud de onda específico o en el rango del espectro
completo, típicamente de 190 a 1100 nm. Luego de la medición del barrido, el análisis que más a menudo se
aplica es la detección de picos y valles en el espectro. Un pico es donde la absorbancia alcanza un máximo y
un valle es donde la absorbancia es lo menor entre dos picos. La altura y la ubicación de los picos y valles es de
interés ya que dan una indicación de la composición de la muestra y de la pureza. Por ejemplo, por la ubicación
de los picos y la combinación de picos, puede deducirse si el compuesto está saturado o insaturado. Además,
la identificación de un compuesto puede ser asegurado por comparación de su espectro con el espectro de un
compuesto conocido a partir de una base de datos. El barrido de métodos UV/VIS se pueden utilizar para la
caracterización de compuestos aromáticos y olefinas aromáticas.

5.3.1 Aplicación de barrido de nicotinamida en alimentos y bebidas


Como un ejemplo, se muestra a continuación el espectro de nicotinamida adenina di nucleótido (NAD+).
La NAD+ es una coenzima importante que se encuentra en todas las células vivas. Debido a la presencia de
varios anillos aromáticos en la base de adenina, absorbe luz en el rango UV. Corriendo un análisis de barrido
con una muestra de NAD+ se muestra que la absorbancia máxima se produce a 260 nm. El valor de la absor-
bancia en el máximo en el siguiente ejemplo es 1.

= 260 nm
Absorbancia

Longitud de onda (nm)

Figura 35: Espectro de NAD+ que muestra el máximo de absorbancia a 260 nm y la absorbancia resultante de aproximadamente uno.

Típicamente, dos parámetros son de importancia y se registran a partir de un espectro UV/VIS:


- Lambda máx.: la longitud de onda del analito, donde se alcanza el máximo de absorbancia.
- La cantidad de luz absorbida en unidades de absorbancia, detectado en lambda máx.

5.3.2 Análisis de protector solar en la industria cosmética


La creciente conciencia de los riesgos de cáncer de piel con la exposición al sol requiere que los productos de
protección solar están debidamente probados y etiquetados. Las diversas formulaciones de filtro solar disponi-
bles en el mercado requieren un método de análisis sofisticado.

METTLER TOLEDO GmbH, Analytical UV/VIS Fundamentos y Aplicaciones 25


Aplicaciones
Los protectores solares o bien reflejan o absorben la radiación ultravioleta (UV) antes de que alcancen la piel.
La región espectral que debe ser bloqueada en productos de protección solar es el UV-A y la región UV-B,
que está entre 280–400 nm. La luz UV-C con más energía ya está bloqueada por el oxígeno di-atómico
(100–200 nm) o por el ozono (oxígeno tri-atómico) (200–280 nm) en la atmósfera. El ingrediente activo de
filtro solar que protege la piel de la luz solar debe estar presente en cantidad y uniformidad suficientes para
asegurar el bloqueo de los UV-A y la luz UV-B para que la piel no sea quemada por el sol. El método tradicional
para el análisis de la eficacia del protección solar se basa en un análisis cuantitativo de una muestra diluida.
Una serie de estándares basados en diferentes concentraciones del ingrediente activo son medidos y un método
cuantitativo basado en la ley de Lambert-Beer es desarrollado. Espectros representativos de dos formulaciones
de filtro solar diferentes se presentan en la siguiente figura.
Absorbancia

Longitud de onda (nm)

Figura 36: Barrido espectral de protector solar. Formulación A (azul) con mayor absorbancia de luz UV comparada con la formulación B
(verde) en el rango de 280 nm hasta 350 nm.

La primera formulación, visualizada en azul, absorbe la mayor parte de la radiación UV entre 280 y 350 nm, lo
que indicaría que esta formulación de filtro solar sería una fuerte protector. En contraste, la segunda, represen-
tada en verde en el espectro, absorbe sólo alrededor del 60% de la radiación entre 280 y 350 nm. La formula-
ción final de protección solar puede medirse directamente utilizando dos placas de vidrio transparente UV entre
las cuales se extiende una capa delgada del producto. Las placas de vidrio apretadas se colocan en un soporte
de muestra sólida en el compartimento de la muestra antes de la medición del espectro.

5.3.3 Identificación de cianocobalamina (vitamina B12) en la industria farmacéutica


Espectroscopia de absorción ultravioleta y visible es una técnica útil para la identificación de compuestos
farmacéuticos. Varios ejemplos de ensayo espectroscópico de un solo componente de vitaminas tales como
cianocobalamina (vitamina B12), riboflavina, ácido fólico y la vitamina A son incluidos en la US Pharmacopoeia
(2015). La cianocobalamina es a menudo identificado mediante espectrofotometría UV/VIS por el modo de ba-
rrido de longitud de onda. Además, la determinación de la concentración por cuantificación utilizando el están-
dar de referencia USP de cianocobalamina se realiza a 361 nm. El contenido de la misma se calcula teniendo
en cuenta la absorbancia específica (E = 207), el coeficiente de extinción para una solución al 1% medido en
una cubeta de 1 cm. Para la identificación y caracterización de cianocobalamina el rango espectral entre 200 y
700 nm es seleccionado y los picos son identificados. La solución estándar muestra 3 máximos de absorción,
a 278, 361 y 550 nm.

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Los criterios de aceptación del espectro de absorción se da de la siguiente manera: 278 ± 1 nm, 361 nm ± 1,
y 550 nm ± 2. La relación de absorbancia A361 / A278 es 1.70 – 1,90, y la relación de absorbancia
A361 / A550 es 3,15 - 3,40 con el fin de cumplir con los criterios de aceptación.

Absorbancia

Longitud de onda (nm)

Figura 37: El espectro de 3 mg / 100 ml cianocobalamina es presentado. Tres máximos de absorción a 278,5 nm, 361,5 nm y 550,9 nm
pueden ser observados.

5.4 Cinética

La espectrofotometría UV/Vis se utiliza a menudo con el fin de supervisar el cambio de la concentración de


cualquiera del reactivo o los productos por absorbancia a una longitud de onda específica en el tiempo. Esta es
una reacción como una función del tiempo y, por tanto, a menudo llamadas mediciones de la velocidad. Las
mediciones cinéticas se utilizan para investigar la actividad enzimática o velocidades de reacción, así como la
afinidad de la interacción enzima-sustrato. Este tipo de análisis es especialmente frecuente en el campo de la
biotecnología, medicina y alimentos, así como en la química. Los métodos cinéticos son particularmente útiles
para muestras en las que algunos componentes interferentes están presentes en concentración variable de
muestra a muestra. Por ejemplo, la espectroscopia de absorción UV/VIS se aplica en las muestras de colores tal
como sangre completa, bebidas embotelladas / enlatadas blandas y zumos. Un análisis específico se puede rea-
lizar mediante la medición de la velocidad de cambio en la absorbancia de una muestra sin tener que hacer una
química complicada y lenta para eliminar el fondo de color interferente o aplicar algún método de separación.

La aplicación más ampliamente encontrada de mediciones de velocidad en espectrometría es estudiar enzimas


(proteínas que funcionan como catalizadores). Mediciones de enzimas directas y determinación de la concen-
tración se pueden realizar, pero puesto que esto es muy trabajoso y los productos químicos son caros, las
enzimas se analizan en preferencia por sus propiedades catalíticas y la reacción que catalizan. La detección
y la medición indirecta de las enzimas pueden ser realizadas por moléculas que son modificados por las
enzimas o sustratos, así como por las moléculas que cooperan con las enzimas, también referidas como
coenzimas. Las enzimas son altamente específicos y sensibles, permitiendo el análisis cuantitativo con poca o
ninguna preparación de la muestra.

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5.4.1 Determinación enzimática de la glucosa en los productos alimenticios
Aplicaciones
Las aplicaciones típicas en el segmento de alimentos y bebidas son la determinación enzimática cuantitativa de
hidratos de carbono como sacarosa, glucosa, fructosa, almidón y fibra dietética total. Puesto que las enzimas son
altamente específicas para una molécula en particular, las mediciones son reproducibles, rápidas y son adecuados
para el análisis cuantitativo sin necesidad de ninguna preparación de muestra tal como la purificación.

Muchas reacciones enzimáticas se producen simultáneamente con el siguiente sistema de enzima:


un sistema de dinucleótido coenzima nicotinamida adenina en el que la forma reducida del nicotinamida adenina
dinucleótido, abreviado como NADH, muestra el máximo de absorción a 340 nm con un coeficiente de
extinción de 6’220 mol/(L*cm). La forma oxidada de la molécula, NAD+, no absorbe a esta longitud de onda,
pero ambos, NAD+ y NADH, presentan un pico de absorbancia a 260 nm. NAD+ tiene un coeficiente de extinción
de 16’900 mol/ (L*cm). La siguiente figura muestra el espectro de ambos compuestos con el espectro de NADH en
azul y el sustrato NAD+ en azul.

NAD+
NADH
Absorbancia

Longitud de onda (nm)

Figura 38: Espectro de absorbancia de NAD+ y NADH

Los hidratos de carbono pueden ser determinados por una reacción enzimática en un enfoque de cinética. Para
el análisis enzimático de glucosa, se utilizan típicamente dos enzimas del proceso de glucólisis. La glucólisis
es la degradación de la glucosa y un proceso importante en todos los seres vivos. La primera etapa de la glu-
cólisis es la fosforilación de la glucosa por la enzima hexoquinasa, donde el ATP es usado y convertido en ADP.

Hexokinasa
Glucose + ATP Glucose-6-phosphate + ADP

G6PDH
G6P + NAD+ 6-Phosphogluconate + NADH

A partir de entonces, la glucosa-6-fosfato se oxida a 6-fosfogluconato en presencia de NAD+ oxidado en una


reacción catalizada por la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. Durante esta oxidación, una cantidad equimolar
de NAD+ se reduce a NADH. El consiguiente aumento de la absorbancia a 340 nm es directamente proporcional
a la concentración de glucosa original en la muestra.

Esta detección indirecta enzimática de la glucosa puede aplicarse igualmente para la detección de ATP.
Ambas sustancias se pueden determinar a través de esta reacción acoplada de la hexoquinasa y
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.

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5.4.2 Actividad de la enzima fosfatasa alcalina
Fosfatasas alcalinas son un grupo de enzimas de la clase hidrolasa que se separó un grupo fosfato terminal
desde un éster orgánico en solución alcalina. Su pH óptimo es generalmente alrededor de pH 10, pero esto
varía con el sustrato y la isoenzima particular. Estas enzimas difieren en secuencia de aminoácidos pero
catalizan la misma reacción química y por lo general muestran diferentes parámetros cinéticos o diferentes
propiedades reguladoras. Fosfatasas alcalinas están disponibles en casi todos los tejidos en el cuerpo y los
niveles séricos de esta enzima son de interés en el diagnóstico de varias enfermedades.

La fosfatasa alcalina cataliza la hidrólisis de ρ-nitrofenil fosfato (pNPP) a p-nitrofenol. Cuando la enzima fos-
fatasa alcalina reacciona con pNPP, se producen el fosfato inorgánico y ρ-nitrofenol. pNPP es incoloro, pero
ρ-nitrofenol tiene una fuerte absorbancia a 405 nm, presentando un color amarillo estable en solución alcalina.
En el máximo de absorción, la concentración de sustrato [S] y la velocidad [v] se pueden medir. La velocidad
de formación de ρ-nitrofenol se mide como un aumento en la absorbancia a 405 nm, que es proporcional a la
actividad de la enzima en la muestra.

El procedimiento es estandarizado bajo las condiciones especificadas por el coeficiente de extinción molar de
ρ-nitrofenol 18,75 mol / (L*cm) a 405 nm. Los resultados se basan en el cambio en la absorbancia por unidad
de tiempo. La Unidad Internacional UI / L se define como la cantidad de enzima que cataliza la transformación
de un micromol de sustrato por minuto bajo las condiciones especificadas.

Esta aplicación se utiliza principalmente en el diagnóstico médico. La fosfatasa alcalina se encuentra en altas
concentraciones en el hígado, en el epitelio de la vía biliar y en los huesos. Los niveles normales son depen-
dientes de la edad y el incremento durante el desarrollo de los huesos. Aumento de los niveles en comparación
con los niveles normales se asocian principalmente con el hígado y enfermedad ósea. Muestras típicas son
plasma heparinizado y suero, que está libre de hemólisis..

5.4.3 Oxidación de yoduro mediante peróxido de hidrógeno


La cinética de la reacción, la evolución de una reacción química en función del tiempo, es descrito por leyes de
velocidad y constantes de velocidad. Con el fin de aplicar la ley y las constantes correctas a una reacción química
específica, hay que conocer su orden, es decir, la relación entre la concentración y la velocidad de la reacción.
Cuando la velocidad de reacción es directamente proporcional a la concentración de reactivo, la reacción es de
primer orden con respecto a este reactivo. Del mismo modo, cuando la concentración de un reactivo no tiene
influencia sobre la velocidad de reacción, es de orden cero con respecto a este reactivo. Reacciones de segundo
orden tienen una velocidad de reacción que es proporcional al cuadrado de la concentración de un reactivo y así
sucesivamente.

El objetivo de este estudio es determinar el orden de reacción de la oxidación del yoduro de peróxido de hidrógeno
en solución ácida. El curso de la reacción se controla a través de la formación de tri-yoduro (I3−):

H 202(aq) + 3I −(aq) + 2H30+(aq) = I3−(aq) + 4H20

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Aplicaciones
La determinación de los órdenes de reacción de los reactivos se consigue mediante la realización de una serie
de experimentos en los que la concentración de uno de los reactivos es variada mientras que las concentracio-
nes de los otros reactivos se mantienen constantes. La cinética de la reacción se siguió mediante la medición
de la intensidad de la banda de absorción a 353 nm que se relaciona con la formación de tri-yoduro.
La siguiente figura muestra el aumento de la absorbancia a 353 nm que se relaciona con la formación de
tri-yoduro. La siguiente figura muestra el aumento de la absorbancia a 353 nm como una función del tiempo
para cuatro muestras con concentraciones crecientes de peróxido.

4.50

4.00

3.50

3.00
Absorbancia

2.50

2.00

1.50

1.00

0.50

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180


Tiempo (segundos)

Figura 39: Valores de absorbancia a una longitud de onda fija de 353 nm como una función del tiempo para el aumento de concentraciones de peróxi-
do de: luz azul = 0,004 M, azul oscuro = 0,006 M, verde = 0,008 M y naranja = 0,01 M de peróxido.

Mediciones similares tienen que ser realizadas variando la cantidad de los otros dos reactivos, el yoduro y el
ácido. Los órdenes de reacción pueden ser determinados a partir de la medición de las velocidades de reacción
iniciales. Si la velocidad de reacción es proporcional a la concentración de la sustancia reaccionante, un gráfico
de la tasa inicial (V0) como una función de la concentración será lineal.

30 METTLER TOLEDO GmbH, Analytical UV/VIS Fundamentos y Aplicaciones


800

600
Vox10-9

400

200

0
1.000 2.000
Volumen
Peroxidedevolume
peróxido

800

600
Vox10-9

400

200

0
10.00 20.00
Volumen
Iodidede loduro
volume

800

600
Vox10-9

400

200

0
0.00 20.00 20.00 60.00
Volumen de ácido
Acid volume

Figura 40: Velocidades iniciales como una función del volumen de reactivo para los tres reactivos; peróxido (parte superior), yoduro (medio)
e iones hidronio para diversas concentraciones de ácido (inferior).

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La figura anterior muestra gráficos de velocidades iniciales como una función del volumen de reactivo para los
Aplicaciones
tres reactivos: peróxido H2O2, yoduro I− e ion H3O+:

(a) la velocidad inicial aumenta linealmente con la concentración de peróxido


(b) la velocidad inicial aumenta linealmente con la concentración de yoduro
(c) la velocidad inicial aumenta linealmente con la concentración de ácido pero a concentración
cero la velocidad inicial no es cero.

A partir de estas observaciones, la relación experimental entre la velocidad de reacción inicial y las concentra-
ciones de reactivos (concentración se expresa con los corchetes) se puede definir como sigue:

Velocidad = x[H2O2][I −](y + [H+])

Esto también puede ser escrito en una forma química cinética más común:

Velocidad = k[H2O2][I −] + k’[H2O2][I −][H+]

k y k’ ‘son las constantes de velocidad o coeficientes.

La ley de velocidad en este caso consta de dos términos: El primer término es de primer orden con respecto
al peróxido de hidrógeno y la concentración de yoduro, mientras que es de orden cero con respecto a la
concentración de ácido y es por lo tanto de segundo orden general. El segundo término es de primer orden con
respecto a la concentración de todos los reactivos y por tanto es de tercer orden general. Por último, la ley de
velocidad indica que el ácido actúa como un catalizador en la oxidación de yoduro por peróxido de hidrógeno.
Sabiendo esta ley de velocidad, la correcta descripción ley de velocidad se puede aplicar para adaptarse a las
mediciones y determinar las constantes de velocidad de la reacción.

5.5 Bio Aplicaciones

5.5.1 Aplicaciones de longitud de onda fija en ciencias de la vida


La espectroscopia de absorbancia UV/VIS es el método preferido para estimar la concentración de ácido nucleico
tal como ADN o ARN y analizar la pureza de una preparación debido a su facilidad de uso. Las purinas y piri-
midinas en ácidos nucleicos absorben naturalmente la luz al máximo de 260 nm. En el uso rutinario, para las
muestras puras, en general se acepta que el uso de una longitud de trayectoria de 10 mm y una absorción de 1
unidad de A es igual a una concentración de 50 mg/ml de ADN y 40 mg/ml de ARN. Para los oligonucleótidos, la
concentración es de alrededor de 33 mg/ml, pero esto puede variar con la longitud de la secuencia de la cadena y
la base. Por lo tanto se recomienda un cálculo oligo para obtener un resultado más preciso para la concentración.

Un indicador de la pureza de la muestra de ácido nucleico es la relación de la absorbancia a 260 nm con la


absorbancia a 280 nm. Las proteínas absorben a 280 nm y por lo tanto ADN contaminado con proteína redu-
cirán el valor de la relación de 260 / 280. Las fuentes típicas de contaminación en la preparación de ácidos
nucleicos son de etilen-diamin-tetra-acético (abreviado como EDTA), sales caotrópicas y fenol, que producen
picos en el intervalo de 220-230 nm. Por esta razón, la relación de la absorbancia a 260 nm con 230 nm se
aplica a menudo.

32 METTLER TOLEDO GmbH, Analytical UV/VIS Fundamentos y Aplicaciones


Como podemos ver en el siguiente gráfico, las proteínas muestran su pico máximo a 280 nm. Ni las proteínas
ni ácidos nucleicos absorben luz a una longitud de onda de 320 nm y por lo tanto, la absorbancia a 320 nm se
utiliza para aplicar una corrección de fondo.

DNA
protein
Absorbancia

Longitud de onda (nm)

Figura 41: Espectro de absorción de ADN (azul) a 260 nm y la proteína BSA (verde) a 280 nm

5.5.2 Determinación de la concentración de ácido nucleico y la pureza según Christian Warburg


El método Christian Warburg se utiliza para determinar la concentración de ácido nucleico en presencia de con-
taminación de proteínas. El método se basa en el hecho de que los ácidos nucleicos muestran su máximo de
absorbancia a 260 nm mientras que las proteínas a 280 nm. Una solución de ácido nucleico contaminada por
proteínas mostrará una lectura más alta a 260 nm, que puede ser compensada por la lectura a 280 nm. Origi-
nalmente, Warburg y Christian desarrollaron un método para determinar la concentración de proteína utilizando la
relación 260 / 280 para la compensación de la contaminación de ácido nucleico.

Generalmente aceptados los coeficientes de extinción de 1 mg / ml de la doble cadena de ADN y 1 mg / ml de


proteína se dan en la tabla siguiente considerando 1 cm de longitud de recorrido para ambas longitudes de onda
a A260, así como A280 nm:

1 mg/mL A260 A280


Ácido Nucleico 20 10
Proteína 0.57 1.0

Por lo tanto, se espera para los ácidos nucleicos tener una absorbancia mayor a 260 nm que a 280 nm, las
proteínas, por otra parte, muestran el comportamiento opuesto. Se espera para las muestras de ácido nucleico
puro tener una relación de 2,0, mientras que las proteínas tienen una relación de 0,57 respectivamente. Las
mezclas que contienen proteínas y ácidos nucleicos diferirán de estas relaciones. Teóricamente, la relación
260 / 280 de una solución que contiene proteínas y ácidos nucleicos se puede calcular de la siguiente manera:

%P: porcentaje de proteína,


%N: porcentaje of ácido nucleico
Los subíndices p y n son los coeficientes de extinción para las moléculas correspondientes.

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Aplicaciones
Se ha de señalar que la absorbancia de la proteína a 280 nm sólo depende de los aminoácidos aromáticos
triptófano, tirosina y fenilalanina. Por lo tanto, la lectura puede ser inexacta y depende altamente de la composi-
ción de aminoácidos de la proteína

La fórmula Crhristina Warburg se utiliza para muestras que contienen ambos, proteínas y ácidos nucleicos. En
el siguiente ejemplo, la cantidad total de concentración de ácido nucleico se determina restando la concentra-
ción de la interferencia de proteína:

C [mg/mL] = 62.9 × A260 – 36.0 × A280

Las constantes de 62.9 y 36.0 refieren a coeficientes de extinción específicas utilizadas por Warburg y
Christian. Para una mayor precisión, los factores deben ser determinados para la particular proteína afectando
el análisis.

5.5.3 Mediciones directas de la concentración de proteínas a A280 nm


Al igual que con el ADN, las proteínas absorben la luz ultravioleta a una longitud de onda específica, lo que
permite la medición directa utilizando un espectrofotómetro. Los aminoácidos aromáticos tirosina y triptófano
muestran una absorción específica a A280 nm, lo que permite la medición directa de las concentraciones de
proteína. Esto se visualiza en la figura siguiente.

Tryptophan
Tyrosine
Absorbancia

Longitud de onda (nm)

Figura 42:Espectro de absorbancia de la tirosina (verde) y triptófano (azul)

La composición química de la proteína afectará la absorción, el número, así como el tipo de aminoácidos cau-
sarán variación.

Si el coeficiente de extinción para la proteína de interés está disponible, la absorbancia de la solución de pro-
teína se puede medir directamente usando una medición de longitud de onda fija en la absorbcia a 280 nm.
Las ventajas de esta técnica son que no se requieren reactivos especiales, por lo tanto, la proteína no es mo-
dificada o inactivada durante el proceso. No se requiere período de incubación, por lo que las mediciones son
rápidas y altamente reproducibles, haciendo de esta una técnica muy simple.

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La desventaja es que este método se basa en tener un coeficiente de extinción preciso para la proteína medida.
Al igual que con los ácidos nucleicos, cada proteína tiene su propio factor de conversión. El estándar común,
proteína albúmina de suero bovino (BSA), tiene un factor de 1.552. La concentración se puede calcular me-
diante la siguiente (de acuerdo con la ley del Lambert-Beer en el capítulo 2.4):

Concentración (μg/mL) = Abs280 × Factor / Longitud de la trayectoria

La relación A260 / A280 se puede utilizar como una guía para la pureza de la muestra de proteína.

5.5.4 Determinación del ácido nucleico usando el colorante fluorescente PicoGreen®


Como hemos visto, la medición directa de ácidos nucleicos y proteínas depende en gran medida del coeficiente
de extinción para la sustancia particular, haciendo de estas mediciones más una aproximación rápida en lugar
de que un resultado preciso. Todos los tipos de ácidos nucleicos, dsDNA, ssDNA y RNA, muestran un máximo
de absorbancia a 260 nm y pueden, por tanto, apenas ser distinguidos por métodos fotométricos, porque la
única diferencia entre ellos es que los ácidos nucleicos de cadena sencilla muestran absorbancias más altas
que los ácidos nucleicos de doble cadena (ver figura siguiente). Este efecto también se conoce como hipercro-
micidad. Sin embargo, no permite la distinción entre las moléculas. En los casos en que no se alcanza un cierto
umbral, la cantidad de moléculas de la muestra puede a veces no ser distinguida por instrumentos. En el caso
de altas concentraciones, así como bajas, la cuantificación específica de la molécula de interés es difícil si otras
moléculas de ácido nucleico están presentes. Otros métodos fotométricos disponibles utilizan moléculas de
colorante y dan como resultado una mayor precisión.

dsDNA
RNA
ssDNA
Absorbancia

Longitud de onda (nm)

Figura 43: Hipercromicidad para diferentes ácidos nucleicos; dsDNA en azul, ssDNA en naranja y el ARN en verde.

Los ácidos nucleicos pueden ser determinadas por moléculas colorantes que se unen específicamente a la mo-
lécula de interés antes de la determinación, por ejemplo, la unión a dsDNA, pero no a ssDNA. Como ejemplo,
la cuantificación de ADN de doble cadena se puede realizar utilizando el tinte fluorescente PicoGreen. PicoGreen
detecta casi exclusivamente dsDNA.

La preparación de la muestra es muy simple; la solución de tinte PicoGreen se añade a la muestra y después
de un tiempo de espera de 5 minutos la muestra marcada se puede leer.

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Aplicaciones
5.5.5 Cuantificación de proteínas en la biotecnología
Las proteínas se componen de bloques de construcción de aminoácidos. La absorbancia de proteína se
mide a aproximadamente 280 nm debido a sus aminoácidos aromáticos como se discutió anteriormente.
Como la cantidad de cadenas laterales aromáticas varía en gran medida de proteína a proteína, las téc-
nicas más precisas se utilizan a menudo para determinar la concentración de proteína, que son basadas
en colorantes. El colorante unido a la proteína forma un complejo coloreado que puede ser ensayado en
la región visible. Los tres procedimientos más comunes para el análisis de proteínas son biuret, Bradford
y ensayos de ácido bicinconínico (BCA).

Figura 44: Estructura de proteína BSA, Fuente: http://www.rcsb.org/pdb/images/3v09_bio_r_500.jpg

La prueba de Bradford es una aplicación típica en el segmento de mercado de la biotecnología.


Este ensayo es uno de los más aplicados métodos colorimétricos utilizados para determinar la con-
centración de proteínas. El ensayo de Bradford se basa en la de cambio de color de un reactivo de Azul
Brillante de Coomassie cuando se une a una proteína. El color comienza como rojo con un máximo de
absorbancia a 470 nm, y termina en azul con el máximo de absorbancia a 595 nm. Este cambio de
color se produce porque la unión de proteína tiene lugar en medio ácido. La reacción depende de la con-
centración de aminoácidos básicos (principalmente arginina, lisina e histidina). El número de ligantes del
colorante Coomassie unido a cada molécula de proteína es aproximadamente proporcional al número de
cargas positivas se encuentran en la proteína. La concentración de proteínas de muestras desconocidas
se puede cuantificar, utilizando una curva de calibración típicamente creada a partir de muestras de albú-
mina de suero bovino (BSA). Esta cuantificación da como resultado una aproximación, ya que la propor-
ción de aminoácidos cargados positivamente difiere de proteína a proteína.

El reactivo de Bradford en sí mismo, conteniendo el colorante en una solución ácida, es marrón y cambia
a color azul cuando se une a una proteína.

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Figura 45: La estructura molecular del reactivo Coomassie Brilliant Blue Dye¨.

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6. Consejos y Sugerencias para Mediciones UV/VIS Exactas y Precisas
Consejos y Sugerencias

El siguiente capítulo le proporcionará consejos y sugerencias desde el punto de vista aplicativo para asegurar
mediciones UV/VIS exactas y precisas.

Junto al rendimiento del instrumento que se discutirá en el capítulo 7, las mayores fuentes de error en espectro-
fotometría están relacionadas con el manejo de la muestra. El espectro de absorción de una sustancia puede
estar influenciado por el disolvente, el pH de la solución, la temperatura, las concentraciones altas de electro-
litos, y la presencia de sustancias interferentes. Los efectos de estas variables deben ser conocidas y las con-
diciones para el análisis elegidas de modo que la absorción no se verá afectada por pequeñas variaciones, no
controlados en sus magnitudes. Los efectos más importantes se describen en los siguientes párrafos.

6.1 Espectroscopía UV/VIS basada en cubeta

La cubeta utilizada para medir una muestra es una parte del sistema óptico del espectrofotómetro. Por lo tanto,
la posición y la geometría de la cubeta pueden tener una influencia en la exactitud y precisión de las medicio-
nes de absorbancia y deben ser cuidadosamente controladas

Para las mejores prácticas de medición, la cubeta debe permanecer en el soporte entre las mediciones. Si es
removida, se debe tener cuidado para posicionar siempre la cubeta en la misma dirección en el soporte, es de-
cir, con la etiqueta hacia la fuente de luz. Esto asegura que los efectos ópticos son idénticos para la referencia y
para las mediciones de muestras.

Además, para obtener mejores resultados, las mediciones de referencia y de muestra se debe hacer utilizando
el mismo tipo de cubeta. Las cubetas deben tener ventanas fabricadas a partir de un material que es transpa-
rente en la región espectral de interés. Para obtener los mejores resultados de las mediciones en el rango UV,
vidrio transparente a UV necesita ser utilizado, tal como vidrio de cuarzo o vidrio Suprasil. Cubetas desechables,
hechas de poli-metil-metacrilato, absorben en el rango UV y actúan como un filtro de corte, haciendo medicio-
nes en el rango UV inexactas y sólo deben ser consideradas para mediciones en el rango visible.

En los sistemas ópticos, tales como espectroscopia de UV/VIS, la limpieza de las cubetas tiene un efecto impor-
tante sobre los resultados. Las ventanas de la cubeta, a través de la cual pasa la luz, tienen que ser limpiadas
antes de cada uso con tejidos sin pelusa (para evitar arañazos de pelusa en la superficie). Absorbancias su-
periores son medidas si los residuos, tales como marcas de dedos o grasa, se depositan en las ventanas de
las cubetas debido a que hay componentes adicionales que absorben. Esto se puede evitar con una limpieza a
fondo antes y después de su uso. Cuidado adicional se debe tomar para evitar tocar las ventanas después que
la limpieza se haya completado.

Por último, las partículas que flotan en la celda harán desviar el haz de luz y conducir a una absorbancia de
fondo. Esta desviación de la luz también se conoce como dispersión de la luz.

38 METTLER TOLEDO GmbH, Analytical UV/VIS Fundamentos y Aplicaciones


6.2 Selección del solvente

Un disolvente para espectroscopia UV/VIS debe ser transparente en toda la región aplicada y debería disolver
una cantidad suficiente de la muestra para dar picos bien definidos. Cada disolvente tiene una longitud de
onda de corte en absorbancia UV/VIS, que es la longitud de onda por debajo del cual el propio disolvente ab-
sorbe toda la luz. Así que cuando se elige un disolvente, es importante ser consciente de su absorbancia de
corte, así como de dónde se espera que absorba el compuesto bajo investigación. Si están cerca, un disolvente
diferente debería ser elegido.

Se debe tener cuidado cuando se trabaja por debajo de 300 nm donde la absorción del disolvente puede ser
tan alta que la absorción incremental debido a la muestra es pequeña en comparación con absorción total. La
siguiente tabla muestra los disolventes comunes y el límite inferior de su rango de longitudes de onda útiles.

Solvente Absorbancia UV de corte (nm)


Acetona 329
Benceno 278
Dimetilformamida 267
Etanol 205
Tolueno 285
Agua 180

En general, los disolventes no polares y las moléculas no polares tienen el menor efecto el uno sobre el otro.
Sin embargo, las moléculas polares exhiben diferencias bastante drásticas cuando interactúan con un disol-
vente polar tal como agua, alcoholes, ésteres y cetonas. Interacción entre soluto y disolvente conduce a la
ampliación de banda de absorción y a una consecuente reducción en la resolución estructural y máximo coefi-
ciente de extinción. Ellos tienden a destruir las estructuras de vibración y por lo tanto deben evitarse cuando el
detalle espectral es deseado. La siguiente figura ilustra el efecto de iso-octano y etanol en el espectro de fenol.
Al cambiar de un disolvente no polar (iso-octano) a uno polar (etanol), la estructura fina debido a las vibracio-
nes de fenol se atenúan. En general, los espectros registrados en disolventes no polares están más cerca de
los obtenidos a partir de muestras de gas.
Absorbancia

Longitud de onda

Figura 46: Espectro de fenol en iso-octano y etanol. Disolventes polares tales como etanol muestran una resolución espectral mucho menor.

METTLER TOLEDO GmbH, Analytical UV/VIS Fundamentos y Aplicaciones 39


6.3 Concentración de la muestra
Consejos y Sugerencias

Para obtener resultados óptimos de medición y para cumplir con la Ley de Lambert-Beer, la absorción se deter-
minará en el rango lineal del instrumento. Por lo tanto, es mejor evitar muy altos (> 2,5 UA) y muy bajos valores
de absorbancia (<0,3 UA) que pueden conducir a la no linealidad.

Sin embargo, a diferencia de otras técnicas de análisis, muestras con concentraciones bajas, tales como
0,01 mol / L, pueden ser medidas mediante UV/VIS. Un ejemplo común de esto se ve en la analítica del agua
donde concentraciones muy bajas necesitan ser determinados.

Cuando un analito interactúa (asociación, disociación) o reacciona con el disolvente, nuevas especies químicas
son creadas conduciendo a un cambio de comportamiento de absorción. Por tanto, se recomienda utilizar un
disolvente que no interactúe y una baja concentración de analito para evitar cualquier reacción secundaria.

6.4 Selección de longitud de onda

A fin de obtener la máxima sensibilidad, las mediciones de absorbancia espectrofotométrica se realizan a una
longitud de onda correspondiente a un pico de absorción. La importancia de medir la absorbancia de forma pre-
cisa en la longitud de onda situada en lambda max se demuestra en la figura siguiente. El ajuste de la longitud
de onda dentro de la banda estrecha indicado en el pico no tendría ningún efecto significativo en la absorbancia
medida en el pico. Sin embargo, una banda con el mismo ancho desplazado a menor longitud de onda intro-
duciría la posibilidad de error importante, dependiendo del punto preciso dentro de la banda a la que se toma
la medición. Errores debidos a tanto al ajuste de longitud de onda o la calibración del instrumento estarán al
mínimo, cuando las mediciones se hacen en la longitud de onda de máxima absorción..

Amplio cambio en la absorban- Mínimo cambio en la absorban-


cia por unidad de cambio en la cia por unidad de cambio en la
longitud de onda longitud de onda

Banda A

Banda A
Banda B
Absorbancia
Absorbancia

Banda B

Longitud de onda Concentración

Figura 47: Izquierda: Cambio en la absorbancia por el cambio de longitud de onda tiene un efecto significativo en la Banda B, mientras que en la Banda
A el cambio es muy pequeño y despreciable.
Derecha: El cambio afecta a la concentración calculada de una muestra en el caso B.

40 METTLER TOLEDO GmbH, Analytical UV/VIS Fundamentos y Aplicaciones


6.5 Análisis de mezclas

La absorbancia total de una solución en cualquier longitud de onda dada es igual a la suma de las absorban-
cias de los componentes individuales en la solución. Esta relación hace que sea posible, en principio, determi-
nar las concentraciones de los componentes individuales de una mezcla, incluso si existe superposición total
de en sus espectros. Para el análisis de la mezcla, los coeficientes de extinción molar de los componentes in-
dividuales tienen primero que ser determinados en longitudes de onda específicas, óptimamente las longitudes
de onda se seleccionan de manera que los coeficientes de los componentes difieren significativamente.
Por ejemplo, en una mezcla de dos componentes, el coeficiente de extinción del componente A en la longitud
de onda λ1 es mucho mayor que el coeficiente de extinción del componente B en la longitud de onda λ1.
Para una segunda longitud de onda λ2 esto debería ser todo lo contrario. Las concentraciones estándar de los
componentes A y B deberán abarcar el rango de absorbancia de la mezcla con el fin de cumplir con la ley de
Lambert-Beer y abarcan la mezcla de la muestra.

Para completar el análisis, la mezcla se mide a las longitudes de onda λ1 y λ2. Con los valores de absor-
bancia conocidos, coeficientes de extinción y la longitud del camino utilizado, la concentración puede ser
calculada.

6.6 Espectroscopía UV/VIS basada en micro-volumen

En una plataforma de micro-volumen, las muestras con volúmenes muy pequeños, tales como microlitros,
pueden ser medidas. Muestras altamente concentradas también se pueden medir fácilmente sin ninguna dilu-
ción adicional debido a la disponibilidad longitud de la trayectoria en 0,1 o 1 mm. Esta técnica de medición se
aplica primariamente para las muestras de ADN y proteínas.

Una limpieza inicial de ambas superficies de medición con agua destilada se recomienda antes de realizar la
medición en blanco con el fin de evitar interferencias con las mediciones. NO utilice un pulverizador para aplicar
agua o cualquier otro líquido a la superficie del instrumento.

Recomendaciones adicionales de limpieza son:

• Entre las medidas, se recomienda limpiar la muestra de las plataformas superior e inferior con un paño de
laboratorio limpio, seco y sin pelusa.
• Una limpieza final de ambas superficies de medición de la plataforma de micro-volumen con agua
destilada se recomienda después de la última medición de la muestra. Dependiendo de la muestra,
una solución de isopropanol 60%, etanol o agua ultrapura se puede utilizar para limpiar la plataforma
de micro-volumen. Si es necesario, el disolvente utilizado para disolver la muestra puede ser aplicado.
Cuando las muestras se secaron en la plataforma, limpieza adicional puede realizarse utilizando 3 µL de

METTLER TOLEDO GmbH, Analytical UV/VIS Fundamentos y Aplicaciones 41


Verificación del funcionamiento
HCl 0.5M. Por último, una vez aplicadas todas las demás soluciones de limpieza, la plataforma se limpia
con una alícuota de 3 µL de agua destilada.
• Si se utilizan detergentes o 100% de alcohol isopropílico, siga con 3 µL de agua destilada como fase final.
• La superficie pulida permite la aplicación de gotas de soluciones acuosas con ángulo de
contacto alto. Si la gota se aplana, es posible que después de cerrar el brazo de micro
volumen la medición se lleve a cabo a través del aire, lo que conducirá a resultados
de medición erróneos. Esto se visualiza en las siguientes imágenes:

Figura 48: Gotita aperlada arriba (izquierda). Gotita aplanada (derecha).

• Para la descontaminación, una solución tal como hipoclorito de sodio 0,5% (lejía comercial 1:10 diluida) se
puede aplicar a la plataforma de micro-volumen. Una limpieza adicional con agua desionizada debe seguir.

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7. Verificación del funcionamiento

El desempeño instrumental es el principal factor que afecta directamente a la exactitud y reproducibilidad de


las mediciones. Para medidas UV/VIS críticas, especialmente en el control de calidad industrial clínico o far-
macéutico, es crucial que el instrumento esté funcionando de acuerdo con las especificaciones. En los labo-
ratorios que trabajan de acuerdo con la farmacopea, es importante que el funcionamiento del instrumento se
controle periódicamente y la evidencia documental tiene que estar presente. Por otra parte, esto es obligatorio
para los laboratorios que ofrecen un servicio de medición acreditado (por ejemplo, de acuerdo con la norma
ISO 17025). La validación es también un requisito clave para los laboratorios que trabajan de acuerdo con las
Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL). Los siguientes párrafos describen los requisitos de las principales regu-
laciones y los procedimientos para la medición de los parámetros de desempeño instrumental calves.

7.1 Requerimientos regulatorios

Los requisitos de calidad se han vuelto más influyentes en los últimos años. Con el fin de obtener mediciones
precisas de calidad consistente, es crucial que los instrumentos de análisis midan de acuerdo a las especi-
ficaciones. Algunas industrias requieren aún un seguimiento regular y la documentación del desempeño del
instrumento. En diversos cuerpos normativos, se describen las pruebas de verificación de rendimiento para
espectrofotómetros UV/VIS. Especialmente dentro de las principales farmacopeas, que exigen la verificación de
calificación de los espectrofotómetros utilizados, así como las pruebas sobre la manera de llevarlas a cabo.
También recomiendan el uso de materiales de referencia certificados (CRM) de los proveedores acreditados.
Tales instrumentos calificados satisfacen entonces las demandas para el análisis de las sustancias químicas
farmacéuticas descritas en las monografías de las farmacopeas.

Las diferentes farmacopeas comparten muchas de las mismas pruebas, pero también contienen algunas dife-
rencias, al exigir pruebas y límites adicionales.

7.1.1 United States Pharmacopeia (USP)


La Farmacopea de los Estados Unidos (USP), 38ª edición, en la sección 857 de UV/VIS describe la verificación
del rendimiento en el contexto de Calificación de Instalación (IQ), Calificación Operacional (OQ) y Calificación
del Desempeño (PQ). En el capítulo “Calificación Operacional” se describe la verificación del rendimiento, como
la preparación de un instrumento para ser “adecuado a los objetivos”, o en otras palabras, para estar listo para
realizar mediciones fiables. La farmacopea lista y describe las pruebas a realizar y da límites que tienen que ser
cumplidos.

El cambio más importante en esa versión de la USP es un cambio fundamental de la prueba para medir la luz
difusa (energía radiante difusa).

7.1.2 Pharmacopée européenne (EP)


Los requisitos que rigen los espectrofotómetros UV/VIS utilizados para los análisis farmacéuticos en Europa
están contenidas en la Farmacopea Europea (EP). Comparable a la USP, la EP en la versión EP8 da algunas

METTLER TOLEDO GmbH, Analytical UV/VIS Fundamentos y Aplicaciones 43


Verificación del funcionamiento
definiciones que son importantes para las mediciones y listas las pruebas y límites que se deben cumplir.
Muchas de estas pruebas son idénticas a los de la USP. Las mayores diferencias entre los dos son una prueba
adicional de la exactitud fotométrica en el rango visible (430 nm), así como la prueba de difusión de la luz.

7.1.3 Otras regulaciones


Muchos otros países tienen regulaciones nacionales específicas, las cuales a menudo se basan y son
parcialmente idénticas, tanto a USP o EP. Algunos de ellas son:

- Reino Unido: British Pharmacopoeia (BP)


- Alemania: Deutsches Arzneimittelbuch (DAB)
- Suiza: Pharmacopoeia Helvetica (Ph. Helv.)
- Australia: Therapeutic Goods Administration (TGA)
- China: Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (PPRC)

Asimismo, la Organización Mundial de la Salud (OMS) emite una farmacopea que es la Farmacopea Internacional (Ph. Int.).

7.1.4 American Standard Testing Method


American Standard Testing Methods (ASTM) International, es una de las mayores organizaciones internacionales
de desarrollo de estándares. Mejoran el rendimiento y ayudan a todos a tener confianza en las cosas que com-
pramos y utilizamos.

7.1.5 National Institute of Standards and Technology (NIST)


US National institute of standards and technology (ex National Bureau of Standards, NBS) es un laboratorio de
estándares de medición. La preparación de muchos CRM empleados para las pruebas de rendimiento se descri-
ben por NIST. También producen materiales basados en CRM para la producción de cubetas CRM para UV/VIS.

7.2 Pruebas de verificación del rendimiento

Las pruebas de verificación de rendimiento evalúan la calidad de las mediciones. Para las mediciones UV/VIS en
concreto, se trata del espectro. Las pruebas tienen que garantizar:

• que las posiciones de longitud de onda (eje x) son correctas (Exactitud de longitud de onda) y estables
(Repetitividad de longitud de onda)
• que las intensidades, absorbancias o transmitancias (eje y) son medidas correctamente (Precisión fotométrica)
y son estables (Repetitividad fotométrica)
• que la forma de medición del espectro es correcta y no distorsionada (Resolución de Tolueno, la luz perdida)

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7.2.1 Exactitud de longitud de onda
La exactitud de longitud de onda es un parámetro de rendimiento importante, especialmente cuando se compa-
ran las mediciones en diferentes instrumentos. Normalmente se comprueba utilizando un patrón de referencia
certificado que tiene una serie de líneas de transmitancia estrechas en toda la gama ultravioleta y visible. Un
estándar usado comúnmente es perclorato de holmio que se disuelto en ácido perclórico. En el rango de longi-
tud de onda 200 a 700 nm una serie de líneas estrechas permite una comprobación de la exactitud de longitud
de onda en el UV, así como en la gama espectral visible. Para los instrumentos de diodos, sólo se requiere una
longitud de onda de medición de precisión y ninguna determinación de precisión necesita ser realizada, ya no
tiene partes móviles ópticamente disponibles. Instrumentos de matriz de diodos son extremadamente reproduci-
bles y estables y sin partes móviles, no hay componentes mecánicos para ajustar o recalibrar.

La diferencia entre el valor medido y certificado del CRM no debe exceder de ± 1 nm en la región UV
(200– 400 nm), y en la región visible (400–700 nm) no debe exceder de ± 2 nm.

La precisión de longitud de onda se define como la desviación de la lectura de longitud de onda leída de una
banda de absorción en comparación con la longitud de onda conocida de la banda. Una desviación de la longi-
tud de onda puede causar errores en los resultados cualitativos y cuantitativos de la medición UV/VIS.
Es bastante obvio que si el espectrofotómetro no es capaz de mantener una escala de longitud de onda precisa,
el espectro de la muestra medida por el instrumento será inexacto y el verdadero λmax del analito no se puede
caracterizar con precisión.

7.2.2 Precisión fotométrica


La precisión fotométrica es el criterio más importante para el análisis cuantitativo cuando los coeficientes de extin-
ción o factores son utilizados, así como para la identificación espectral y control pureza. La precisión fotométrica es
determinada por la diferencia entre la absorbancia medida y el valor estándar establecido. Una solución de dicro-
mato de potasio (60 mg / L) en ácido sulfúrico (0,01 N) es lo más comúnmente utilizado para el control de preci-
sión de la absorbancia. El método prueba la absorbancia a cuatro longitudes de onda; 235, 257, 313 y 350 nm.

7.2.3 Luz parásita


La luz parásita es la radiación que emerge de las imperfecciones en el elemento dispersante o en otras super-
ficies ópticas, de los efectos de difracción, otras aberraciones ópticas o de componentes dañados o desgas-
tados. La luz parásita causará desviaciones de la ley de Lambert-Beer. A valores altos de absorbancia de la
relación lineal entre la absorbancia y la concentración es fuertemente afectada por el factor de la luz parásita.
Ella introduce un sesgo sistemático para absorbancias inferiores a concentraciones crecientes. La luz parásita
es también la principal influencia en el límite superior del rango dinámico lineal para un análisis. Ver las figuras
abajo con algunos efectos de luz parásita visualizados.

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Verificación del funcionamiento
3
Curva hipotética
(Absorción verdadera)

Absorción observada
2
6 (1% luz parásita)
Absorbancia

Absorbancia
4
0.1 % 1
2 0.3 %

1 2 3 4 5
Absorbancia (verdadera) Longitud de onda (nominal)

Figura 49A: Factor limitante luz parásita B: Efecto de luz parásita visualizada en el pico máximo

Para detectar la luz dispersa a longitudes de onda específicas, se aplican soluciones de nitrito de sodio (340 nm),
yoduro de sodio (220 nm) y cloruro de potasio (200 nm) en agua. Estas soluciones tienen un corte muy abrupto en la
región UV. Esto significa que si se detecta la luz en una longitud de onda donde se supone que la muestra debe ser com-
pletamente absorbente, esto es debido a la desviación de la luz que llega al detector de otra fuente sin pasar a través de
la muestra. Estos filtros se aplican principalmente en la gama ultravioleta debido al hecho de que la luz externa es más
intensiva en este rango.

7.2.4 Resolución
El rendimiento de un espectrofotómetro depende principalmente de la potencia de resolución del instrumento,
en otras palabras, de su resolución. La resolución es un factor crítico en la determinación de dos picos situados
cerca. Se requiere una resolución del instrumento suficiente para ser capaz de distinguir entre los diferentes pi-
cos de absorbancia en el espectro UV/VIS de una muestra. Si la resolución espectral no es suficiente, entonces
las bandas de absorción se convierten en “no resuelto” y no pueden distinguirse claramente uno de otro. Por lo
tanto, la identificación de los picos de absorbancia se hace muy difícil y el valor de la absorbancia será más
bajo que el valor verdadero. El efecto de la alta y baja resolución se ilustra en los siguientes dos gráficos:

Alta resolución: Baja resolución:


A Dos picos de absorbancia A Picos de absorbancia no claramente resueltos

1 o 2 picos ?

1 1

λ1 λ2 λ/nm λ/nm

Figura 50A: Instrumento de alta resolución con picos claramente resueltos B: Baja resolución donde los picos no pueden ser resueltos.

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En el gráfico de la izquierda, un ejemplo de un instrumento con alta resolución se presenta en la que dos picos
de absorbancia son claramente visibles a lo largo del espectro. La resolución del instrumento es lo suficiente-
mente alta como para separar fácilmente las dos bandas de absorción diferentes. A la derecha, el instrumento
tiene una resolución demasiado baja y los dos picos de absorción no se pueden resolver. El instrumento no
puede diferenciar las dos bandas de absorción diferentes. La capacidad para diferenciar entre los picos está
indicada por la resolución espectral. La resolución espectral de un instrumento es la medida de la capacidad
de un instrumento para diferenciar entre dos longitudes de onda adyacentes en el espectro registrado. Para lo-
grar espectros donde las bandas de absorción se encuentren claramente definidos, un ajuste de parámetro alta
resolución debe seleccionarse. En el siguiente ejemplo, el espectro de benceno en la fase de gas se muestra
en tres configuraciones diferentes de resolución en el espectrofotómetro. Este parámetro se denomina ancho de
banda espectral. En el espectro de alta resolución sobre la izquierda, con el ancho de banda más bajo, varios
picos de absorción están claramente definidos. En los espectros de resolución medio y bajo a la derecha, con
el aumento de ancho de banda, se pierde progresivamente el detalle. En el gráfico de la derecha, con la resolu-
ción más baja, sólo se muestra una sola banda de absorción ancha.

1.6 nm 4 nm 10 nm
Absorbancia

Absorbancia

Absorbancia

270 230 270 230 270 230


Longitud de onda Longitud de onda Longitud de onda

Figura 51: El mismo espectro es presentado utilizando un ancho de banda diferente. Izquierda: picos están claramente definidos, con un ancho de
banda bajo. Incrementado el ancho de banda la resolución se pierde y menos detalles espectrales son visibles. Derecha: Una gran ancho de banda de
10 nm presenta una sola banda de absorción de los 5 picos que eran visibles utilizando el ancho de banda 1.6nm.

Este ejemplo ilustra claramente la importancia de la selección correcta de la resolución del instrumento para la
medición precisa de un espectro de UV/VIS.

Por lo tanto, la resolución es un factor crítico en la determinación de la forma de los picos medidos. Si la reso-
lución no es suficiente, el valor de absorbancia será más bajo que el valor verdadero.
Las pruebas de resolución farmacopea US y UE consisten en la medición de una solución de tolueno en hexano
0,02% p/v. La relación de la absorbancia máxima alrededor de 269 nm a la de la mínima alrededor de 266
nm es calculada. Cuanto mayor sea la relación, mejor es la resolución. El siguiente cuadro muestra la relación
para una temperatura de 25 °C:

Relación 2.3 – 2.4 1.9 – 2.0 1.6 – 1.7 1.3 – 1.4 1.0 – 1.1
Ancho de banda 0.5 nm 1.0 nm 1.5 nm 2.0 nm 3.0 nm

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Verificación del funcionamiento
7.2.5 Ruido fotométrico
El ruido se mide a través del detector de luz CCD y se deriva de las fluctuaciones a corto plazo causado por la
fuente de luz y componentes electrónicos. El ruido es el factor principal que afecta a la precisión de las medidas
de absorbancia. La cantidad de ruido fotométrico definirá la precisión y el límite de detección mínimo del espec-
trofotómetro. El ruido de fotones de la fuente de luz es especialmente evidente en los niveles bajos de absorban-
cia, mientras que el ruido electrónico de componentes electrónicos afecta a la exactitud de las mediciones a alta
absorbancia El ruido se mide típicamente a absorbancia cero, es decir, sin ninguna muestra de la trayectoria de
la luz. Un método común para calcular el ruido es tomando la Media Cuadrática (RMS) de múltiples mediciones
a una longitud de onda definida. El ruido aumenta con tiempos de medición más cortos y disminuye con tiem-
pos de medición más largos. Además, el ruido varía de longitud de onda a longitud de onda. Esto es debido al
hecho de que la intensidad de las fuentes de luz y las características del detector varía con la longitud de onda.

7.2.6 Deriva fotométrica


Se espera que la señal medida sea estable en una escala de tiempo largo. Esto es medido con la prueba de la de-
riva fotométrica. La deriva instrumento se mide comúnmente en el cero de absorbancia con ninguna muestra en el
camino de la luz. Una medida se toma a cada minuto durante una hora a una longitud de onda definida. Idealmente
sería que dé una línea horizontal. Las desviaciones son caracterizadas por un ajuste lineal de la curva que da una
pendiente como una indicación de la dirección de la deriva.

7.2.7 Lisura de línea de base


Idealmente, para una correcta caracterización de un instrumento, sus características de ruido deben ser medi-
dos en todas las longitudes de onda. Sin embargo, esto sería extremadamente lento. Una forma de obtener una
visión general del nivel de ruido con respecto a todas las longitudes de onda es medir la lisura de línea de base.
Esto también revela longitudes de onda con problemas instrumentales resultantes de filtros de conmutación o
intercambios de fuente de luz.

El instrumento es puesto a cero automáticamente con nada en el compartimento de la muestra a través de su


rango de trabajo y el aire entonces es simplemente medido como la muestra para la medición de la lisura de
línea de base. La Media cuadrática del espectro de la línea de base en el rango definido da una indicación de la
lisura de la línea de base.

7.3 Pruebas instrumentales automáticas

La verificación del rendimiento total requerido para el cumplimiento de la farmacopea de un espectrofotómetro


se lleva a cabo normalmente a intervalos determinados. Estos intervalos se determinan de acuerdo a la estabi-
lidad del instrumento. Para asegurar la detección de cualquier desviación del desempeño ocurrido entre estas
verificaciones, el instrumento debe proporcionar pruebas automáticas. Dichas pruebas son para el análisis
de rutina del funcionamiento de los instrumentos que se pueden llevar a cabo en una base diaria. Estas prue-
bas deben incluir una comprobación del funcionamiento electrónico y óptico del espectrofotómetro, así como
las pruebas de exactitud de longitud de onda con la línea de xenón con el fin de verificar el rendimiento de la

48 METTLER TOLEDO GmbH, Analytical UV/VIS Fundamentos y Aplicaciones


lámpara instalada. Por lo tanto, la deriva de la estabilidad, la precisión y la repetitividad de longitud de onda
utilizando la lámpara de xenón se aplican adicionalmente al ruido y las pruebas fotométricas de lisura de línea
de base, que ya se describieron. Por favor, encuentre más detalles acerca de la prueba automática en los docu-
mentos de servicio.

7.4 Materiales de referencia certificados para espectrofotometría

Los materiales de referencia certificados o patrones de calibración cumplen con los requisitos de las principa-
les farmacopeas (EP, USP). Estos permiten realizar la calificación instrumento de acuerdo con los requisitos
reglamentarios y de garantizar que el instrumento cumple con las exigencias de calidad. Estos materiales están
certificados por el valor de la absorbancia a una serie de longitudes de onda en el UV y regiones espectrales
visibles. Los materiales de referencia son clasificados en líquidos y filtros (vidrio) sólidos.

7.4.1 Filtros de vidrio


Los filtros de vidrio son los materiales de referencia certificados hechos de un vidrio específico y fabricados
específicamente para su calibración. Estos filtros son robustos y sólidos que hacen que el manejo sea fácil y
sencillo. Además, son relativamente insensibles a la temperatura y tienen una buena estabilidad en el tiempo.
Sin embargo, para los estándares sólidos, la homogeneidad no puede garantizarse de lote a lote. Por lo tanto
cada estándar debe ser calibrado en un espectrofotómetro de referencia. Debido a este paso que consume
tiempo, los estándares sólidos tienden a ser caros.

Los filtros de vidrio pueden ser montados simplemente en un soporte de cubeta única. Tales filtros sólidos
permiten la calificación del espectrofotómetro para la exactitud fotométrica (absorbancia) y también para la
exactitud de longitud de onda.

Figura 52: Filtros de vidrio de densidad neutra de Starna Scientific Ltd.

Los filtros disponibles son filtro de vidrio de densidad neutra para comprobar la exactitud fotométrica,
como muestra el ejemplo anterior. El certificado de Starna, uno de los fabricantes acreditados de materiales

METTLER TOLEDO GmbH, Analytical UV/VIS Fundamentos y Aplicaciones 49


Verificación del funcionamiento
de referencia, se entrega en el dispositivo de memoria USB. Además, los filtros de vidrio Didymium están dispo-
nibles para la prueba de exactitud de longitud de onda. Hay filtros de vidrio de holmio para evaluar la precisión
de la escala de longitud de onda del UV y de la región visible de los espectrofotómetros. Estos producen picos
característicos al igual que su contraparte líquida.

Estos filtros son trazables a los patrones primarios del National Institute of Standards and Technology (NIST).

7.4.2 Filtros líquidos


Los filtros líquidos son materiales certificados de referencia, que son estrictamente preparados usando materia-
les primarios sólidos NIST y fabricados a concentraciones de solución de acuerdo a las publicaciones del NIST.
El llenado de estas referencias es realizado bajo condiciones controladas con todas las células herméticamente
y permanentemente sellados por fusión por calor y con los valores certificados. Los filtros líquidos tienen la ven-
taja de ser equivalente a aplicaciones de medición reales.

Con un filtro líquido certificado, los siguientes parámetros del espectrofotómetro se pueden calificar de acuerdo
con los requisitos de la farmacopea:

• Precisión fotométrica
• Exactitud de longitud de onda
• Resolución
• Luz parásita

Figura 53: Filtros líquidos de Starna Scientific Ltd

Los filtros para líquidos se insertan en el soporte de la cubeta del espectrofotómetro donde luego se mide la
absorbancia en la longitud de onda indicada en el certificado de calibración. Los valores de las mediciones
resultantes se compararon con cualquiera de los valores de referencia publicados en la Farmacopea o dados en
el correspondiente certificado del filtro. La prueba luego se considerará ya sea como pasada o no, de acuerdo
con los criterios de aceptación .Filtros líquidos son menos estables que los estándares sólidos: tienen ser recali-
brados con más frecuencia, lo que incrementa los costes de este tipo de material estándar.

50 METTLER TOLEDO GmbH, Analytical UV/VIS Fundamentos y Aplicaciones


7.5 Pruebas de verificación del rendimiento con CertiRef™

CertiRef™ es un accesorio compatible EUP y USP Farmacopea, lo que permite una automática de pruebas de
calibración y de rendimiento de los instrumentos UV7, UV5 y UV5Bio de METTLER TOLEDO. El CertiRef con-
siste de un cambiador de cubeta de 8 posiciones que contienen materiales de referencia certificados (CRM)
en cubetas selladas. EUP Dos conjuntos diferentes de módulos se ofrecen para los usuarios que trabajan de
acuerdo tanto para la Farmacopea Europea EUP como la Farmacopea Americana USP. Todos los CRM son
fabricados y certificados por Starna Scientific Ltd (Inglaterra). Los datos de los certificados necesarios para las
pruebas son accesibles desde un chip en el módulo CertiRef.

Los datos en el chip contiene información sobre el tipo de CertiRef, es decir, si se trata de un CertiRef acuerdo
con EUP o USP, el CRM establece el número de serie para remontarlo al certificado, la fecha de certificación y
la fecha de caducidad e información de cada una de las pruebas CRM. El certificado expedido es válido por un
período de dos años a partir de la fecha de emisión. Aunque las referencias están cubiertos por una garantía
de por vida esto está sujeto a una recertificación periódica. Cuando los materiales CertiRef necesitan ser recer-
tificados o inspeccionados por cualquier motivo, después de 2 años de certificación a más tardar, por favor,
póngase en contacto con su representante local de Mettler-Toledo.

La siguiente lista muestra los CRM, junto con su posición en el módulo CertiRef:

Prueba CertiRef™ Material de Referencia EUP USP


Ruido fotométrico
Deriva fotométrica
Precision de longitud de onda con lámpara
interna de xenón
(Aire) • •
Repetividad de longitud de onda con lám-
para interna de xenón
Precisión fotométrica
Lisura de línea de base
Blanco de Tolueno • •
Resolución
Tolueno • •
Precision de longitud de onda
Óxido de Holmio • •
Repetividad de longitud de onda
Precisión fotométrica Blanco de dicromato de potasio dichromate • •
Repetividad fotométrica Dicromato de potasio • •
Blanco de cloruro de Potasio • −
Luz parásita Ph.Eur.
Cloruro de Potasio • −
Cloruro de Potasio 0.5 cm − •
Luz parásita USP
Cloruro de Potasio 1 cm − •

EUP = European pharmacopeia


USP = United States pharmacopeia

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Good Measuring Practices
Cinco pasos para la medición
de resultados mejorados
Los cinco pasos de todas las directrices de Buenas Prácticas de Medición comienzan
con una evaluación de las necesidades de medición de sus procesos y sus riesgos
asociados. Con esta información, las buenas prácticas de medición proporcionan
recomendaciones sencillas para la selección, instalación, calibración y operación de
los equipos y dispositivos de laboratorio.

• Calidad garantizada
• Cumplimiento con regulaciones, auditorías seguras
• Productividad incrementada, costos reducidos
• Profesional calificado y entrenado

Good UV/VIS Spectroscopy Practice™


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Para más información

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Sonnenbergstrasse 74
CH-8603 Schwerzenbach, Suiza

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