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ESTECTROFOTOMETRIA

Definición:

La espectroscopia es el estudio del espectro de la luz que emiten los cuerpos, sustancias y
elementos.

De este estudio se puede conocer la composición, temperatura, densidad, velocidad de


desplazamiento y otros factores que les son propios y componen a estos cuerpos, sustancias o
elementos.

Características de la luz:

– La luz tiene una naturaleza dual:


– Como onda
– Como una corriente de partículas o paquetes de energía (fotones)

Albert Einstein desarrolló en 1905 la


teoría de que la luz estaba compuesta de
unas partículas denominadas fotones, cuya
energía era inversamente proporcional a la
longitud de onda de la luz.

Maxwell: La perturbación que se propaga


como ondas de luz está formada por fuerzas
eléctricas y magnéticas, y la perturbación se
produce en cargas eléctricas en movimiento.
“Efecto de la emisión electromagnética”

La naturaleza corpuscular de la luz se observa en fotos de objetos iluminados muy


débilmente.

La imagen se forma punto a punto, y muestra que la luz llega a la película fotográfica por
unidades separadas que los producen.

Colores:

Los seres humanos (y algunos animales) apreciamos una amplia gama de colores que, por lo
general, se deben a la mezcla de luces de diferentes longitudes de onda. Se conoce como
color puro al color de la luz con una única longitud de onda o una banda estrecha de ellas.

Hay varios tipos de espectros, los más comunes son los espectros continuos, espectros de
emisión y los espectros de absorción.

Si es colocado frente al espectroscopio se podrá ver, un elemento:

– En situaciones en las que se le somete altas temperaturas y presiones y no se


presentan líneas obscuras se trata de un espectro continuo.
– En situaciones normales y se observan unas líneas de colores frente a un fondo
negro, se trata de un espectro de emisión.
– Y por último si sucede la primer situación y entre el elemento afectado y el
espectroscopio se coloca un elemento a menor temperatura que el primero, se
obtiene el espectro de absorción
La luz blanca: produce al descomponerla lo que se llama un espectro continuo, que contiene
el conjunto de colores que corresponde a la gama de longitudes de onda que la integran.

Todos los elementos poseen un espectro propio, que se puede medir al someterse a
temperaturas elevadas ya que producen espectros discontinuos.

Longitud de onda:

La distancia entre dos picos (o dos valles) de una onda se llama longitud de onda (λ =
lambda).

La longitud y la frecuencia de onda son inversamente proporcionales y se relacionan


mediante la siguiente ecuación.

no
La luz visible: es sólo una pequeña parte del espectro
electromagnético con longitudes de onda que van
aproximadamente de 350 nanómetros hasta unos 750
nanómetros

<nanómetro, nm = milmillonésimas de metro>.

La luz blanca está compuesta de ondas de diversas frecuencias. Cuando un rayo de luz blanca
pasa por un prisma se separa en sus componentes de acuerdo a la longitud de onda.

Así la luz blanca es una mezcla de todas las longitudes de onda visibles.

En el espectro visible, las diferencias en longitud de onda se manifiestan como diferencias de


color

Frecuencia natural

Cualquier objeto oscilante tiene una 'frecuencia natural', (vibración en ausencia de


perturbación).

– Frecuencia es el Número de vibraciones por segundo


– Así Frecuencia, es número de veces que la onda se repite por segundo.
– La Frecuencia se mide en Hertz (Hz)

HEINRICH HERTZ (1857-1894), Investigador alemán que construyó un dispositivo para


generar y detectar en un laboratorio ondas electromagnéticas, demostrando su existencia
así como, se reflejan estas ondas, se refractan y se comportan como las ondas de luz
Estimó que la frecuencia f de la onda era de alrededor de 3 x 107 Hz. Y determinó que su
longitud l era de 10 m. Con estos valores estableció que la velocidad v de la onda es

v = f l = (3 X 107 Hz) X (10 m)

= 3 X 108 m/s = 300 000 km/s

O sea, la velocidad de la luz.

– 1 Hz (o hercio) es igual a 1 ciclo u oscilación por segundo. (1 Hertz = 1 ciclo/seg)


– Un kilohercio (kHz) = mil de ciclos por segundo
– Un megahercio (MHz) = un millón de ciclos por segundo
– Un gigahercio (GHz) = mil millones de ciclos por segundo
Relación entre Medidas en valores Hertz y Metros

Las ondas electromagnéticas de frecuencias extremadamente elevadas, como la luz o los rayos X,
suelen describirse mediante sus longitudes de onda, que frecuentemente se expresan en nanómetros.

Un ejemplo es: Una onda electromagnética con una longitud de onda de 1


nm tiene, aproximadamente una frecuencia de 300 millones de GHz.

El color de un cuerpo depende de la luz


que recibe, refleja o transmite. Por
ejemplo, el color rojo se dá cuando
absorbe en casi su totalidad, todas las
radiaciones menos las rojas, las cuales
refleja o deja pasar dependiendo su
estructura (sólida o transparente).
La energía UV es mayor que, cualquier color del
espectro visible. Sin embargo los rayos X son más
energéticos que la luz UV, como se puede apreciar
por su longitud de onda.

Con base a lo anterior se puede entender que existe


una relación inversa entre la longitud de onda y la
energía del fotón correspondiente.

Absorción:

La energía de excitación a una molécula proveniente de un fotón durante el proceso


de absorción se representa así:

A + hn  A*  A + calor

Dónde:

A es el absorbente en su estado de energía bajo,

A* es el absorbente en su nuevo estado de excitación energética

hn representan a la constante de Planck y la frecuencia respectivamente

– La energía del fotón incidente posee una longitud de onda (l)

– A* es inestable y rápidamente revierte a su estado energético más bajo,


perdiendo así la energía térmica correspondiente.

– La absorción de determinadas longitudes de onda depende de la estructura


de la molécula absorbente (absortividad, “a”)

Absortividad (a)

a es una constante de proporcionalidad que comprende las características químicas de cada


compuesto, o molécula y su magnitud depende de las unidades utilizadas para b y c.

Cuando se expresa la concentración en moles por litro y la trayectoria a través de la celda en


centímetros, la absortividad se denomina absortividad molar y se representa con el símbolo e.

En consecuencia cuando b se expresa en centímetros y c en moles por litro.


A = e bc

Donde A representa la absorbancia del compuesto

Ley de Lambert: cuando un rayo de luz monocromática (I0) pasa a través de un medio
absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente (I) a medida que la longitud del
medio absorbente aumenta

I = I0e-ab

Ley de Beer: Cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio absorbente,
su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la concentración del medio
absorbente aumenta

I = I0e-ac

Lo que significa que combinando ambas leyes se crea la Ley de Beer-Lambert donde la
fracción de luz incidente que es absorbida por una solución es proporcional a la
concentración de soluto y al espesor de la sustancia atravesada por la luz. La relación entre la
luz incidente (I0) y la reflejada (I) dará una idea de la cantidad de radiación que ha sido
absorbida por la muestra.
Al cociente de las intensidades se denomina Transmitancia

T = I/I0 = e-abc

Sacando logaritmos:

Loge I/I0 = abc

Convirtiendo a log10:

Log10 I/I0 = 2.303 abc

Log10 I/I0 = abc

Absorbancia = Log10 I/I0 = abc

La Transmitancia (T) es la relación entre la intensidad de luz transmitida por una muestra problema
(I) con la intensidad de luz incidente sobre la muestra (Io):

T = I / I0

Se expresa como % T

La absorbancia es directamente proporcional a la longitud del recorrido b a través de la solución y la


concentración c del color absorbente. Estas relaciones se dan como:

A = a·b·c

A menudo b es dada en términos de cm. y c en gramos por litro, entonces la absortividad tiene
unidades de l·g–1·cm–1.

Por lo tanto la absorbancia es reciproca de la transmitancia

Absorbancia contra concentración (comportamiento lineal

Absorbancia

Concentración
% Transmitancia contra concentración (pendiente con signo negativo y comportamiento
exponencial)

% Transmitancia

Concentración
Absorbancia:

De lo anterior se desprende que la Absorbancia (A) o luz que es absorbida por la muestra es igual al
logaritmo en base diez del recíproco de la transmitancia (T) o bien al -log10 de la transmitancia, en el
que el disolvente puro o (“blanco”) es el material de referencia; esto es:

A = log10 1/T = log101- log10 T = 0 – log10 T = – log10 T

La representación gráfica correspondiente a absorbancia y transmitancia en un gradiente de concentraciones es la


siguiente:

Con
Obtención de transmitancia utilizando valores de absorbancia:

Con base en la relación: T = 10-abc

y considerando que T se menciona en porcentaje (%)

%T = 10-abc x 100.

Aplicando logaritmos a la expresión anterior

log10 %T = -abc log 10 10 + log10 100

Invirtiendo términos

log %T = log10 100 -abc log 10 10 = 2 – abc * 1

log10 %T = 2 – abc

Como abc = Absorbancia = A

log10 %T = 2 – A.

ESPECTROFOTOMETRIA:

Se le llama espectrofotometría a la medición de la cantidad de energía radiante que absorbe un


conjunto de elementos o un elemento en su estado puro, en función de la longitud de onda de la
radiación lumínica y a las mediciones a una determinada longitud de onda.

¿Cómo se puede medir la radiación que emiten o absorben los cuerpos?

Un aparato capaz de obtener el espectro de una radiación, es decir, de separar la radiación en sus
componentes, se llama un espectroscopio.

Si el aparato es capaz de fotografiarla se llama un espectrógrafo, y

Si es capaz de medirla diremos que se trata de un espectrómetro.

Cuando es capaz de medir también la intensidad de la radiación, se llama espectrofotómetro

ESPECTROSCOPIO
ESPECTOGRAFO

ESPECTROMETRO

Colorimetría y Espectrofotometría como procedimientos analíticos

Las técnicas colorimétricas se fundamentan con la medición de la absorción de radiación


visible por sustancias coloreadas.

Sin embargo, cuando una muestra a determinar no posee coloración, es necesario llevar a cabo un
tratamiento de color empleando substancias que que reaccionen de forma proporcional con
el compuesto de interés
La diferencia entre colorimetría y espectrofotometría consiste en el tipo de instrumental
empleado:

El colorímetro es un aparato en los que la longitud de onda se selecciona por medio de filtros
ópticos que son insertados en este.

En el espectrofotómetro la longitud de onda es seleccionada mediante dispositivos


monocromadores los cuales están integrados a la máquina.

Algunos de los procedimientos colorimétricos o espectrofotométricos con los que se cuenta para precisar la
concentración de una sustancia en solución son los siguientes:

– Referencia de color

– Colorímetro Klett

– Espectrofotómetro

Una solución que absorbe el rojo pero no el amarillo y el azul con la combinación de estos
dará un color verde.
Por lo anterior podemos aplicar un sencillo método para precisar con cual filtro podríamos
leer una solución dependiendo el color de esta

Cuando la solución sea roja no se deberá utilizar un filtro de color rojo porque justamente
ese es el color que no absorbe.

En relación a esto, en el manual del fotocolorimetro Klett aparece la siguiente tabla que se
puede utilizar para determinar que filtro se debe emplear de acuerdo al color de la solución a
estudiar:

Color del filtro Rango espectral Soluciones coloreadas

Azul 400-465 Roja, Naranja,


Amarilla, Verde, Turbias

Verde 500-570 Roja, Amarilla, Violeta, Naranja, Azul

Rojo 640-700 Azul, Verde, Amarilla

A menudo se hace referencia a la “estrella de colores” para facilitar el recordar la elección del
color de filtro para lectura colorimétrica. Para soluciones de color azul verde y amarilla
correspondería un filtro rojo. Para soluciones de color rojo, naranja o amarrillo
seleccionaríamos un filtro color azul. Finalmente para soluciones con color verde, azul o
amarilla elegiríamos un filtro rojo.
Manejo del Fotocolorímetro

1. Confirmar, que el filtro (A) adecuado se encuentre dentro del portafiltros (B) y este
en su lugar (C)

2. Compruebe que la aguja indicadora (D) este en el centro, en cero; si no es así ajuste a
cero con la perilla (E) que se localiza en la parte superior; siempre y cuando la
lámpara se encuentre apagada

D E C

M.C.

3. La lámpara (F) se enciende con el apagador (G), deje calentar entre 5 y 10 minutos.

4. Ajuste la escala del potenciómetro (H) con la perilla correspondiente (I) a cero

5. Coloque la cubeta (limpia) (J) con el “blanco”, en su sitio (K) y encienda con el
interruptor (L)

6. Mediante la perilla (M) del galvanómetro , se acopla la lectura a cero , lo que implica
que la aguja (D) y la escala (H) deben estar en cero.

7. Para leer las soluciones problema : Hay que retirar de la cubeta el “blanco” y colocar
la solución problema, la aguja (D) se desviará de su posición , es necesario
nuevamente ajustar (con I) a cero, la lectura que proporcione la escala (H) es la
correspondiente al “problema “

Las lecturas se realizan en U.K. (unidades Klett)

Las lecturas que se mayores a 500 U.K y las menores a 25 U.K., no se usaran para calcular
concentraciones

– U.K / 500 = Absorbancia

– U.K. X 500 = Transmitancia


Cuidados:

– Las muestras no deben tener burbujas, encontrarse turbias o con precipitados.

– El volumen de la muestra no debe ser excesivo para evitar que se desborde, en caso de
que sucediera, se debe limpiar con un paño limpio o papel absorbente suave, para
evitar rayarla.

– La cantidad a adicionar es, máximo, hasta ¾ partes de la cubeta

– No se deben derramar líquidos, sobre todo solventes, ácidos o álcalis; dentro del
contenedor de la cubeta, se puede dañar parte del mecanismo

– El fotocolorímetro nunca se debe encender sin filtro.

– No deje que se sobrecaliente, mantenga apagado si no lo utiliza.

¿Qué es espectrofotómetro?

Un espectrofotómetro es un instrumento que descompone un haz de luz (haz de radiación


electromagnético), separándolo en bandas de longitudes de onda específicas, formando un
espectro atravesado por numerosas líneas oscuras y claras, semejante a un código de barras
del objeto, con el propósito de identificar, calificar y cuantificar su energía

Mecanismo interno:
¿Porque leer a diferentes l (longitudes de onda) compuestos parecidos pero diferentes?

La explicación radica en el hecho de que cada producto químico se caracteriza por


zonas del espectro visible o no visible en el cual absorbe con mayor o menor intensidad
conformando en su conjunto el espectro de absorción de tal sustancia.

– Cada compuesto (de complejo a simple) presenta un espectro de absorción


característico.

Absorbancia


– Las longitudes de onda con mayor absorción (picos) corresponderán de forma
general a aquellas con las que se leerá la muestra para determinar su
concentración.

Absorbancia


– La relación entre la absorbancia por una sustancia a una l determinada y su
concentración es directamente proporcional es decir: a mayor concentración
mayor proporción de luz absorbida.

Absorbancia
Conc.
Imagines relacionadas:
Se asume que el tubo, celda o “cubeta” en la cual se vierte la solución a leer no debe desviar
la trayectoria de la luz como requisito para el cumplimiento de la ley de Beer

Como el cuarzo aparte de ser muy transparente presenta un comportamiento constante ante
la variación de la longitud de onda es común que las celdas del espectrofotómetro o
colorímetro sean de este material

Cuarzo patrón:

El razonamiento para el proceso de determinación de una concentración desconocida es:

A partir de concentraciones conocidas de las cuales también se sabe su absorbancia (curva


patrón), es posible interpolar (intercalar) la concentración del problema sabiendo su
absorbancia (línea roja en figura siguiente)

CURVA PATRÓN

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0
0 2 4 6 8 10 12

Concentración mg/lt
Con base en que la Absorbancia guarda una relación lineal con la concentración, se
comprende la existencia de una relación de proporcionalidad entre la Absorbancia y la
concentración:

A1 / A2 = C1 / C2

Donde:

A1 = Absorbancia del problema.

A2 = Absorbancia de un estándar de concentración conocida.

C1 = Concentración del problema.

C2 = Concentración del estándar.

Si despejamos C1 = Conc del problema

A1 (problema) * Conc estándar


Conc. (Problema) =
A2 (estándar)
Ejemplo:

En este ejemplo de determinación de Glucosa, en la preparación de los tubos para la lectura


de la curva patrón, se incluyen más elementos y por lo cual el tubo “blanco” (0) contiene
todos los componentes excepto la glucosa con el fin de de poder calibrar la absorbancia del
equipo a cero.

Compuesto 1 (blanco) 2 3 4 5 6 7

Glucosa 0,1 mg/ml (mL) 0.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Agua destilada (mL) 1.0 0.4 0.9 0.8 0.2 0.6 0.0

Fenol al 5% (mL) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

Ácido sulfúrico (mL) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
Resultado de la curva patrón anterior

Tubos Absorbancia

1 0

2 0.135

3 0.253

4 0.417

5 0.658

6 0.574

7 0.768

Un aspecto importante de la evaluación espectrofotométrica, es que muchas moléculas


orgánicas no absorben en el intervalo del espectro visible sino en el rango de longitudes de
onda acordes al ultravioleta o al infrarrojo

Por lo que es común, actualmente, que la mayoría de los espectrofotómetros, actuales, se


encuentren provistos con lo necesario para leer en de tales intervalos

Así, los grupos carbonilo presentes en los aldehídos (RCHO), cetonas (RCOR), ácidos
carboxílicos (RCOOH), l ésteres (RCOOR´) y amidas (RCONHR´) dan lugar a absorciones
intensas en la región del espectro de infrarrojo situada entre 1780-1640 cm-1.

Manejo de espectrofotómetro:

– Prender el aparato (a)10 minutos antes de utilizarse, se activará la luz roja de


encendido (b).

– Seleccionar la longitud de onda con el botón (c).

– Ajuste (con a) a 0% de transmitancia, con la tapa cerrada y sin muestra.

– Insertar la cubeta con el blanco en su sección (d).

– Ajustar (con e) a 100% transmitancia (0 absorbancia)


– Retirar el blanco de la cubeta, agregarle la muestra problema, e insertar en su espacio,
bajar la tapa.

– La aguja (d) del lector se deslizará sobre la escala (f) , se lee en % de transmitancia ó
en unidades de absorbancia

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