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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL

Para qué Producto: Células, metabolitos

Cómo Procesos
Qué microbio: Producción, biomasa, rendimiento, recuperación de
costos, estabilidad a gran escala, fácil de manipulación
genética.

Clasificación de muestras; uso de diluyentes; usos


Cómo Procedimientos
de medios de selección, de enrriquecimiento;
De aislamiento
aislamiento por método capilar; modificaciones o
creación de procedimientos, personal calificado.

De dónde? Naturaleza: Nichos: realizando descripción como listado de


substratos, evaluación de parámetros como pH,
salinidad, Eh, Tº.
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL

CONSIDERACIONES:
 El aislamiento de los microorganismos desde la naturaleza es el primer pasa del
microbiólogo en la selección para productos naturales tales como metabolitos
secundarios y enzimas.
 En el aislamiento implica técnicas de enrriquecimiento, aislamiento
monocelulares por uso del método capilar, modificaciones de procedimientos de
ensayo de selección para adecuar el desarrollo y metabolismo de varios generos
diferentes, personal calificado.
 En el aislamiento se de acuerdo a ciertos productos a desear se debe considerar
las características del producto deseado y el desarrollo del proceso; y los datos
ecológicos. Esto ayuda a responder la pregunta ¿Qué aislo y de dónde?.
 La elección de los microorganismos puede estar influenciado por la existencia de
capacidades para la producción, biomasa, rendimiento del producto,
recuperación de costos, estabilidad de los microorganismos en fermentadores de
gran escala, y fácil de manipulación genética.
 El muestreo sistemático en diferentes nichos dentro de un ecosistema específico
permite que pueda ser aislado una diversidad más grande de tipos microbianos.
 El medio de selección, diluyente, condiciones de incubación, y manejo de
muestra, determina determina el número y tipos de microorganismos aislados
desde plantas, suelos y aguas.
 Constituyen reglas generales de aplicación ecológica para el aislamiento los
siguientes:

1. Listar los grupos de microorganismos que serán aislados.


2. Describir el ecosistema o hábitat desde donde las muestras serán
colectadas.
3. Agrupar las muestras en tipos, ejemplo: plantas y partes de plantas, suelos
(tipos y horizontes), rocas, aguas, insectos, etc.
4. Listar los parámetros ambientales a ser considerados y medidos tales como
el pH, salinidad, Eh , y temperatura.
5. Listar los sustratos naturales disponibles en el ecosistema, ejemplo: quitina
en suelos forestales.
6. Diseñar técnicas de aislamiento alrededor de datos obtenidos desde los
pasos 1 al 5 , ejemplo: diluyentes, substratos, extractos naturales, y
condiciones de incubación.
7. Evaluar métodos de aislamiento ecológico usando métodos standard como
controles.
8. Modificar procedimientos conocidos tan requeridos por los parámetros
ecológicos del material a ser examinado.
9. Emplear procedimientos de enrriquecimiento específico para grupos
microbianos que pueden ser de interés en la selección.

AISLAMIENTO DE ACTINOMICETOS:

Métodos de muestreo y colección:


 Las muestras deben ser colectadas asépticamente.
 Las muestras deben ser representativas de un sitio.
 Las muestras totalmente deben ser marcadas.
 Las muestras una vez que están dentro del laboratorio ellos deben ser ya sea
examinados inmediatamente o guardados toda la noche a 4ºC dentro de una
área separada.

Parámetros ecológicos y medios:


 Se deben considerar como parámetros ecológicos la baja o elevada temperatura
y pH, concentración iónica, potenciales E h , y concentración de substrato.
Estos generalmente la mayoría son medidos en el campo y en el laboratorio.
 Se debe modificar el medio de aislamiento de acuerdo a el ecosistema o hábitat
que está siendo examinado.
 Una pequeña cantidad (1 a 5 ml ) de extracto natural (planta, roca, compost )
puede ser añadida como un factor de crecimiento para el aislamiento inicial.
 Como los actinomicetos son muy eficientes en utilizar substratos disponibles en
muy baja concentración también como substratos complejos tales como la
quitina, ellos en su mayoría son aislados en agar complejo o pobre más que en
medio de crecimiento ricos.
 El desarrollo es lento, a excepción de termofílicos, aparecen en las placas dentro
de 4 a 20 días.
 Usualmente en el medio es incorporado como agente antifúngico Nistatina y la
Cicloheximida para retardar el desarrollo fúngico.
 Las placas de agar de aislamiento son secadas al aire por 3 días para minimizar
el desarrollo bacteriano.

Aislamiento no selectivo desde el suelo:

 Lodos y suelos primero son secados a temperatura de cuarto por 3 a10 días y
pulverizados. Este polvo con un estampador de 16 mm de diámetro es
impregnado y sacudido. El estampador entonces es presionado suavemente
sobre la superficie del agar de aislamiento para actinomicetos en 13 veces
continua ( 10 en el perímetro y dos en el centro) para conseguir un efecto de
dilución. Finalmente las placas se incuban sin invertir entre 4 a 15ºC para
Psicrófilos, entre 22 a 35 ºC para mesófilos, y entre 55ºC a más para termófilos.

Aislamiento selectivo desde el suelo:

 Implica pretratamiento del suelo conjuntamente con medios selectivos adecuados


sobre todo para favorecer el crecimiento de géneros específicos Ejemplo: para
aislar Thermoactinomyces el pretratamiento es: mezcla de suelo con agua
destilada, calentamiento por una hora entre 50 a 55ºC; el medio : CYC; los
antibióticos incorporados (ug/ml): Cycloheximide (50) y Novobiocina (25); y la
incubación: 1 día a 50-55ºC .

Aislamiento desde plantas y material de plantas:

 El número y variedad de actinomicetos varía según la zona de la planta y de


acuerdo a la edad.
 La partes de la planta es tomada asépticamente y secadas en placas Petri (2 a 7
días).
 La partes de las plantas es sembrada introduciéndola en la superficie del agar,
rodándola suavemente sobre la superficie del agar describiendo estrías, o
sometiéndola a una agitación por 20 minutos (150rpm) en Buffer fosfato o
extracto de planta diluído al cuarto, luego a diluciones y finalmente a un
extendido sobre la superficie del medio que contiene 1 a 5 ml de extracto de
planta

Aislamiento desde aguas:

 Se hace con centrifugación (a 6000 g) o filtración (con filtro de 0.45 um) de


muestras de agua, seguido de diluciones y el plaqueo

Subcultivo y purificacion:

 Tiene en cuenta que una vez que las colonias desarrollan, ellos tentativamente
pueden ser identificadas por diferencias en la morfología tales como forma de
colonia, color de esporas aéreas, y pigmentos difusibles y reversos
 Las colonias son cogidas con el aza a agar de mantenimiento apropiado o a
plaqueados de réplica para selección.

AISLAMIENTO DE ALGAS:

Métodos de muestreo y colección:

 Desde el el punto de vista de la selección industrial se recomienda limitar el


número de muestreo por hábitat a sólo dos o tres los cuales rendirán la más
grande diversidad.
 Se debe tener en cuenta todas las características ecológicas.
 Las muestras pueden ser divididas dentro de cuatro categorías: a) aguas, b)
suelos y lodos, c) florecimientos, matas y desechos algales; y d) miscelaneas:
rocas, ramas, musgos y otros materiales de plantas.
 La clasificación y división de muestras , también como la examinación
microscópica determinará que técnicas y meidos deben ser usados para el
aislamiento de las algas.
 Generalmente tubos de polipropileno y botellas son usados para la colección de
muestras. Los contenedores pueden contener una cantidad medida de
diluyente.

Medio y parametros ecológicos:

 Se tiene en cuenta los parametros ecologicos que a menudo varían: tales como
temperatura , salinidad, pH proporción superficie/volumen y fuentes de
nitrógeno.
 Existen medios sintéticos y naturales según el tipo de muestra y propósito.
 Los medios básicos pueden ser ajustados según la necesidad, ejemplo: en el
medio se puede omitir fuente de nitrógeno (NaNO3, KNO3, etc.)para aislar
algas fijadoras de nitrógeno.

Métodos de aislamiento basados en dilución:

 Permite que después de diluir la muestra hasta 10 4 cel / ml. esta pueda ser
usada para ser sembrada.
 La siembra puede hacerse por placa vertida, extensión en placa, estriamiento,
en caldo.
 La incubación se hace en presencia de luz cíclica ( 12 horas) a una temperatura
adecuada.

Métodos de aislamiento estampado / filtración :

 El agua es filtrada (10 a 20 ml) y el filtro es luego estampado en el medio de agar


con transferencias equivalente a 10 veces de dilución y al último el filtro es
colocado en el agar y cubierto con agar sobrecapa (a 45ºC) e incubado con luz
cíclica.
 Muestras como rocas, ramas, suelo se siembran directamente por implante,
estampado o por rotación de estas sobre el agar.

Subcultivo y purificación:

 Se trabaja con micromanipulador para coger la primera colonia que aparezca ,


sobre todo en medios líquidos, y trasladarla a otro medio para obtenerla sola.

AISLAMIENTO DE BACTERIAS

Métodos de muestreo y colección :


 Similar a actinomicetos.

Parámetros ecológicos y medios:

 Tiene en cuenta incorporación de extractos naturales (algunos deben estar en la


concentración de 10 a 50 % del volumen total del líquido) o de determinados
sustratos, parámetros biofísicos y ambientales dentro del medio.
 En los agares de aislamiento se utiliza los agentes antifúngicos cicloheximida y
nistatina (50 ug/ml) para retardar el crecimiento fúngico.
 Los medios se deben secar con aire seco por 1 a 2 días antes de su uso.

Aislamiento desde el suelo:

 Se puede realizar por aislamiento directo, mezclando 5 g de suelo con 99 ml de


un extracto o infusión de suelo con una concentración al cuarto en un matraz y
agitandolo a 150 a 200 rpm por 25 min a 26ºC , para luego diluirlo y extenderlo
sobre la superficie del medio de aislamiento. La incubación se hace con las
placas volteadas entre 22 y 26ºC por 4 a 10 días.
 Por simple enrriquecimiento de suelo para favorecer a la bacteria activa en el
suelo y no a los microorganismos en latencia. Para esto se mezcla 1 gramo de
suelo con 2 a 10 ml de un sustrato esteril suspendido en un extracto de suelo
concentración al cuarto o solución de Ringer concentración a la mitad, o agua
destilada. Luego a esto se agrega substratos según el caso y se ajusta el pH al
del suelo. Posteriormente se cubre la mezcla con hierba desecada
desmenuzada y esterilizada con oxido de etileno. Enseguida se cubre el beaker
con papel estéril se incuba por 2 a 12 días en una jarra sellada al vacío dentro
del cual 200 ml de agua a sido añadida. Finalmente las muestras deben ser
removidas periódicamente , diluídas, y plaqueadas por esparcimiento (0.1 ml)
sobre placas con extractos de suelo con y sin el substrato de enrriquecimiento.

Aislamiento desde rizósfera :

 Las especies a aislar varían el tipo de planta.


 Considera que extractos de planta, raíz y suelo deben ser incorporados dentro
del agar de aislamiento.
 Se puede aislar muchas bacterias bacilos gramnegativas, y formas pleomórficas.

Aislamiento desde plantas:

 Por aislamiento directo, mezclando 1gramo de parte cortada de planta con 99


ml de diluyente apropiado y perlas de vidrio (opcional) a 150 rpm por 15 a 20
minutos, y luego diluir 1 ml de esta muestra hasta una dilucion apropiada (3 o 4)
y sembrar por esparcimiento sobre el medio 0.1 ml.
 Por simple enrriquecimiento, que se hace similar al correspondiente para suelo.

Aislamiento desde aguas:

 Emplea botellas de plástico de 100 ml limpias, estériles y de boca ancha para


colectar el agua muestra.
 El agua muestra se colecta muy por debajo de la superficie (a 30 cm debajo ).
Cuando hay corriente orientar la boca hacia ella.
 El frasco no debe ser llenado hasta el tope.
 La muestra debe ser analizada inmediatamente o almacenada a 5ºC no más de
24 horas.
 Para el aislamiento directo se filtra 50 ml en filtro de 0.22 um.
 Para el aislamiento por enrriquecimiento concentraciones bajas de agentes
antifúngicos (15 a 35 ug/ml) pueden ser añadidas.

Subcultivo y purificación:

 Las colonias elegidas son transferidas ya sea a placas master para la selección o
para agares de mantenimiento inclinados que tienen una pequeña cantidad (50
ml/ L) de extractos naturales incorporados.

AISLAMIENTO DE HONGOS:

Métodos de muestreo y colección:

 Las muestras pueden proceder de todos los ambientes.


 Colectadas las muestras deben ser usadas inmediatamente o almacenadas toda
la noche a 5ºC.
 En el caso de agua el volumen de muestra debe ser por lo menos 50 ml en
botellas estériles.

Parámetros ecológicos y medios :

 Se anotan todos los parámetros del ambiente y estos se consideran para el


aislamiento.
 El uso de medios con baja proporción de C/N rinde más colonias contables
 Las placas con medio son incubada en pilas y no deben ser invertidas, y la
temperatura es: para psicrófilos, 5 a 15 ºC; para mesófilos, 20 a 35 ºC; y para
termófilos sobre 45 a 50ºC. Aquí la luz es importante induce fructificación.
 Los medios usualmente son del tipo selectivo enrriquecimiento ejemplo para
separar organismos celulolíticos.
 En el medio selectivo están incorporados antibióticos para bacterias como
cloranfenicol, kanamicina, penicilina, estretomicina y tetraciclina. Otras
inhibiciones de bacterias son : el secado de las placas 3 a 4 días antes de usar,
la disminución del pH, el agregado de rosa de bengala (1:30000) al medio.
 En el medio se han usado otros antifúngicos como nistatina, cicloheximida,
pimaricina, altos niveles de CO2, sales de propionato de calcio, oxgall, cristal
violeta y fungicidas comerciales como Benlate, Botran y captan; considerando
que no todos los hongos son afectados por estos agentes.

Aislamiento desde el suelo:

 Por método de Warcup en el cual una pequeña cantidad de suelo se coloca en la


placa y esta es dispersada con pequeña cantidad de agua destilada esteril, y
luego sobre esta dispersión es colocado agar fundido enfriado . Esto es útil para
aislar a los de lento crecimiento.
 Se aplican otros métodos similares ya descritos como el método del implante, de
dilución en placa, del estampado, etc..

Aislamiento de material de plantas:


 Se aplican los métodos ya descritos como : método de implante, método de
impresión, método de lavado (emplea 0.05% Tween y agua para lavar ), método
de maceración (la planta es macerada y luego empleado en los otros métodos,
aquí se pueden liberar sustancias inhibitorias).

Aislamiento desde aguas:

 La muestra se diluye para líquidos a 10 -1 , para ricos en lodo a 10 -2 , para lodos


con 4 a 6% de materia seca a 10 -4 , y para lodos con 30 a 60% de materia seca
10-4 .
 Colocando materiales dentro del agua como pelos para keratinofílicos.

Aislamiento de Basidiomicetos desde esporocarpos :

 Puede ser en medios de agar papa dextrosa, agar malta levadura, y medio
selectivo de basidiomiceto.
 La muestra debe ser de especimenes frescos puede ser tomada desde el tejido
del esporocarpo o de las basidiosporas.

Aislamiento de basidiomicetos desde estructuras vegetativas :

 Puede ser de rizomorfos, micorrizas, esclerocios los cuales se colectan em


bolsas de papel y se esterilizan su superficie con blanqueador diluido cloruro de
mercurio, o peróxido de hidrógeno (1:1). Luego lavar con agua destilada estéril
varias veces. Enseguida sembrar.
Subcultivo y purificación:

 Son preludios necesarios para el screening del aislamiento fungico.

NOTA: Algunos basidiomicetos pueden tomar 4 a 6 semanas para emerger de


muestras de madera.

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL


(RESUMEN)

Para qué Producto: Células, metabolitos

Cómo Procesos
Qué microbio: Producción, biomasa, rendimiento, recuperación de
costos, estabilidad a gran escala, fácil de manipulación
genética.

Clasificación de muestras; uso de diluyentes; usos


Cómo Procedimientos
de medios de selección, de enrriquecimiento;
De aislamiento
aislamiento por método capilar; modificaciones o
creación de procedimientos, personal calificado.

De dónde? Naturaleza: Nichos: realizando descripción como listado de


substratos, evaluación de parámetros como pH,
salinidad, Eh, Tº.
AISLAMIENTO DE ACTINOMICETOS

METODOS DE MUESTREO Y COLECCIÓN:


1. Asepcia
2. Representatividad
3. Rotulación
4. Mantención a 4ºC(en exámen no inmediato)

PARAMETROS ECOLOGICOS Y MEDIOS:


1. Tº, pH, [iónica], Eh, [substrato]: en campo y laboratorio
2. Modificación del medio: según ecosistema
- agregado de extracto natural: en aislamiento inicial
- uso de agar con substrato complejo o pobre: ejemplo quitina
- incorporación de antifúngicos: nistatina, cicloheximida
3. secado de placas x 3 días: evita bacterias
4. tiempo de incubación: 4-20 días: son lentos excepto termofílicos.

AISLAMIENTO NO SELECTIVO DESDE EL SUELO:


1. pretratamiento del suelo
2. uso de medio selectivo
ejemplo:
- mezcla de suelo y agua
- calentamiento a 50-55ºC x 1 h
- uso dedel medio CYC con antibióticos (ug/mL): cycloheximida (50),
novobiocina (25)
- incubación a 50-55ºC x 1 día
- crecimiento de Thermoactinomyces

AISLAMIENTO DESDE PLANTAS Y MATERIAL DE PLANTAS:


1. Toma aséptica de partes de plantas
2. Secado (2-7 días)
3. Sembrado en medio con agar con extracto de planta (1-5mL): Por introducción,
rodamiento o estrías, uso de su diluyente previo agitado en buffer fosfato o
extracto de planta diluído 1/4 y de diluciones menores.

AISLAMIENTO DESDE AGUAS:


1. Centrifugación (6000g) o filtración (filtro: poro 0,54um).
2. Diluciones
3. Plaqueo.

SUBCULTIVO Y PURIFICACION:
1. transplante de colonias a agares de mantenimiento y de réplica para selección.

AISLAMIENTO DE ALGAS

METODOS DE MUESTREO Y COLECCIÓN:


1. Muestras: aguas, suelos y lodos, rocas, matas, musgos, ramas
2. Número de muestreo por hábitat: 2-3 (en botellas o tubos de polipropileno).
3. Examinación microscópica
4. Técnicas y medios de aislamiento según muestra y observac. Microsc.

MEDIOS Y PARAMETROS ECOLOGICOS:


1. Parámetros ecológicos: Tº, salinidad, pH, proporción superficie/ volumen, fuente
de nitrógeno
2. Medios:
- sintéticos y naturales
- básicos: con ajuste según necesidad, Ejm: en fijadores de nitrógeno se omite
fuente de nitrógeno (NaNO3, KNO3, etc.)

METODOS DE AISLAMIENTO BASADOS EN DILUCION:


1. Dilución de muestras hasta 104 cel/mL
2. Siembra: placa vertida, extensión, estriamiento, en caldo
3. Incubación: a Tº adecuada con luz cíclica (12 horas)

METODOS DE AISLAMIENTO SIN DILUCION:


1. Filtración/estampado:
- Filtración de muestra de agua (10-20 mL)
- Estampados del filtro sobre la superficie del medio con equivalencias a 10
veces de dilución con retención del filtro en el último estampado.
- Agregado de agar sobrecapa (a 45ºC)
- Incubación con luz cíclica.
2. estampado, implante, rotación: muestras de rocas, ramas, suelo

SUBCULTIVO Y PURIFICACION:
1. Transferencia
2. Micromanipulación (uso de micromanipulador): para trasladar colonias solas
desde medio líquido.