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OpticaOptica deldel MicroscopioMicroscopio CompuestoCompuesto

Prof. Iván Rebolledo

El microscopio compuesto convencional está formado por dos sistemas de lentes de aumento ubicados en los extremos de un tubo: el ocular , en el extremo superior, cerca del ojo y el objetivo, en el extremo inferior, cerca del preparado. La imagen producida por estos sistemas de lentes es mejorada por el aparato de iluminación y un sistema de lentes llamado condensador , ubicados en la parte más inferior del microscopio.

Como el microscopio es un instrumento de óptica, debemos conocer algunos de los fenómenos físicos relacionados con la luz :

a) reflexión : es el fenómeno por el cual un rayo de luz que choca contra una superficie lisa es rechazado en el mismo plano. Si el rayo choca perpendicularmente a la superficie será rechazado en la misma dirección en que vino : este rayo será considerado la normal (N). Ahora bien, cualquier rayo que incida fuera de la normal, lo hará en un ángulo con respecto a aquella, este ángulo se llama ángulo de incidencia (<i) y este rayo será reflejado en otro ángulo llamado ángulo de reflexión (<r), que será igual al de incidencia. Por

tanto :

< i

= < r

N i r
N
i
r

b) refracción : es el fenómeno por el cual un rayo de luz que atraviesa oblicuamente un cuerpo transparente de distinta densidad,

sufre un cambio de dirección en su recorrido, tanto a su entrada como a la salida. Si llega perpendi- cularmente a la superficie no se refracta, es considerado la normal

sigue la misma

dirección de origen a través del

(N),

es

decir

medio transparente. N’ N i aire cristal aire r
medio transparente.
N’
N i
aire
cristal
aire
r

Considerando las densidades de los medios por los cuales pasa el rayo, tenemos que : (a) de un medio menos denso a otro más denso, el rayo se acerca a la normal, es el caso del rayo que pasa del aire al cristal.

Microscopio óptico

Microscopio óptico

(b) de un medio más denso a otro menos denso, el rayo de aleja de la normal, es el caso del rayo que pasa del cristal al aire.

La refracción de un rayo está en relación con la diferencia de densidades de los medios por los cuales atraviesa. Así, para dos

medios determinados, la relación entre el seno del Ëi y el seno del

Ë r es constante. Esta relación

constante se llama índice de refracción y se expresa :

seno Ë i n = ----------- seno Ë r

Cuando el índice de refracción es mayor, se dice que el medio es refringente , es decir, desvía el rayo. Algunos de los índices de refracción determinados son :

* aire

n = 1.00

* agua

n = 1.33

* aceite inmersión

n = 1.51

* vidrio

n = 1.52

Apertura numérica (AN)

Este valor corresponde a la capacidad de un lente objetivo de utilizar más o menos rayos luminosos para formar la imagen. Este valor se encuentra inscrito en la moldura de los lentes objetivos.

El objetivo seco de menor aumento tiene una AN igual a 0.25, el objetivo seco de mayor aumento tiene una AN igual a 0.65

y el objetivo de inmersión tiene AN

igual a 1.25 Este valor se calcula

por la fórmula :

AN = n * sen α

en donde n es el índice de refracción del medio y seno α es el ángulo limitado por los rayos más

periféricos que penetran al sistema

y el eje óptico. Ejemplo del cálculo :

el lente de inmersión tiene un ángulo a igual a 57 º, el aceite de

inmersión utilizado posee un n igual a 1.51, entonces :

AN = 1.51 * sen 57 AN = 1.51 * 0.838 AN = 1.253

Poder y límite de resolución

El poder de resolución (PR) es la capacidad de un instrumento para producir imágenes distintas de puntos situados muy cerca uno de otro en el objeto. Depende de la

longitud

de

onda

(λ)

de

la

luz

utilizada

y

de

la

apertura

numérica

(AN)

del

objetivo

utilizado.

Microscopio óptico

Microscopio óptico

El límite de resolución (LR) es la distancia mínima que debe existir entre dos puntos para que puedan ser discriminados como tales. Se expresa por fórmula :

0.61 * λ LR = --------------- AN

en donde 0.61 es una constante, l

es la longitud de onda de la luz utilizada y AN es la apertura numérica del objetivo en uso.

El límite de resolución (LR) es la inversa del poder de resolución, de manera que cuanto mayor sea el poder de resolución de un instrumento menor será el límite de resolución.

1

LR = ------- PR

Como AN aparece inscrito en la moldura de los objetivos, pueden hacerse algunos cálculos sencillos de LR, utilizando la fórmula anterior, para deducir la mínima distancia que separa a dos puntos para distinguir-los como independientes.

a) con luz visible (λ = 0.5 µm) :

1. objetivo menor aumento seco

0.61 * 0.5

LR = -------------- = 1.22 µm

0.25

2. objetivo mayor aumento seco

0.61 * 0.5

LR = -------------- = 0.47 µm

0.65

3. objetivo de inmersión

0.61 * 0.5

LR = -------------- = 0.24 µm

1.25

Estos resultados deducen que con aumento menor seco puede distin- guirse dos puntos nítidos que estén separados por una distancia de 1.22 mm. Con aumento mayor seco, a la distancia de 0.4 mm y con aceite de inmersión a la distancia

de 0.2 mm.

b)variando lambda y aumento menor

1. con luz violeta (λ = 0.4 µm)

0.61 * 0.4

LR = -------------- = 0.97 µm

0.25

2. con luz ultravioleta (λ = 0.3 µm)

0.61 * 0.3

LR = -------------- = 0.73 µm

0.25

Microscopio óptico

Microscopio óptico

c) con luz ultravioleta y objetivo de inmersión :

0.61 * 0.3

LR = -------------- = 0.15 mm

1.25

De este modo se demuestra que el máximo poder de resolución de un MO es casi 0.15 mm, con lo cual puede deducirse que para aumentar el PR de un instrumento o disminuir el LR, se puede :

1. disminuir lambda

2. aumentar AN

3. disponer de corpúsculos, que al

imprimirles grandes velocidades se

comporten como ondas. Este es el caso de los electrones en el ME, cuyos electrones tienen una lambda igual a 0.05 Å.

Objetivos

Los lentes objetivos generalmente están conformados por varios lentes, algunos de ellos son biconvexos. La formación de una imagen producida por una lente biconvexa se basa en que todos los rayos emanados desde un punto, al atravesarla, concurren al punto donde se cortan dos de ellos. La imagen producida por el objetivo es invertida, aumentada y real (puede ser recogida en una placa fotográfica o pantalla).

lente objetivo
lente
objetivo

objeto

imagen

Los objetivos en el MO están formados por lentes biconvexas y bicóncavas e incluso lentes de distintos índices de refracción, con la intención de corregir dos defectos comunes en los lentes complejos : la aberración cromática y la aberración esférica. En general, una aberración es una desigual refracción que sufren los rayos al propagarse a través de lentes complejos.

Oculares

Los lentes oculares son cilindros metálicos cortos que acomodan lentes en ambos extremos. Su finalidad es aumentar la imagen real e invertida proporcionada por el objetivo. Actúa como una lupa y su imagen tiene las características de ser derecha, aumentada y virtual.

Microscopio óptico

Microscopio óptico
lente ocular imagen objetivo
lente
ocular
imagen
objetivo

imagen

ocular

Aberración cromática

En el caso esquematizado antes se supone que los rayos de luz pertenecen todos a una luz monocromática o simple, es decir, rayos de una misma longitud de onda. sin embargo, la luz visible posee varios colores, cada uno con una longitud de onda diferente, siendo el color rojo (760 nm) el de mayor longitud de onda y el color violeta (400 nm) el de menor longitud de onda.

Ahora bien, cada rayo de luz visible al atravesar un lente es descompuesto en sus colores, ya que se considera que la lente es un conjunto de prismas. Entonces, el rayo de mayor longitud de onda se desvía menos y el rayo de menor longitud de onda se desvía más. Resultado : se forman dos puntos focales, uno con los rayos de menor longitud de onda (violeta) más cerca del lente y otro con los de mayor longitud de onda (rojo) más lejos.

Al producirse dos focos la imagen resulta borrosa y con contornos coloreados.

violeta

violeta Foco 1 Foco 2 menor mayor longitud longitud onda onda
violeta
Foco 1
Foco 2
menor
mayor
longitud
longitud
onda
onda

rojo

rojo

Aberración esférica

En el caso anterior, se supone que todos los rayos que inciden a la superficie del lente debieran refractarse en la misma proporción y concentrarse en un mismo punto detrás del lente. Sin embargo, ocurre que los rayos que inciden periféricamente en la lente son los que se refractan más que aquellos que inciden más cerca del centro de la lente. La razón es el ángulo de incidencia sobre la superficie de la lente. Resultado : se forman dos puntos focales, uno con los rayos periféricos más cerca del lente y otro con los rayos centrales más lejos del lente. Esto produce una imagen borrosa. Además, esta aberración se acentúa al aumentar la curvatura del lente.

Microscopio óptico

Microscopio óptico
Foco 1 Foco 2 rayos rayos periféricos centrales
Foco 1
Foco 2
rayos
rayos
periféricos
centrales

Eliminación de las aberraciones

La aberración esférica puede eliminarse, en parte, interceptando el paso de los rayos periféricos cerrando el diafragma. Esta maniobra tiene la desventaja de reducir la luminosidad del objeto y reducir el poder de resolución.

Para corregir esta aberración en forma permanente, se utilizan lentes de diferentes curvaturas, es decir, si hay un lente biconvexo se adiciona uno bicóncavo. Dibuje aquí estos dos lentes juntos :

uno bicóncavo. Dibuje aquí estos dos lentes juntos : a cromática, suelen utilizarse lentes de diferentes

a cromática, suelen utilizarse lentes de diferentes naturalezas quími- cas; por ejemplo, la lente Flint (silicato de K y Pb) es más refringente y de alto poder dispersivo y la lente Crown (silicato de K y Ca) es menos refringente que recompone la luz descompuesta por el lente anterior

la aberración

En

cuanto

Aumentos

Para determinar la magnitud del aumento de una imagen entregada por un microscopio, debe multi- plicarse el aumento del lente ocular por el aumento del lente objetivo. Ambos números están inscritos en su moldura. Por ejemplo :

Ocular

Objetivo

Aumento

10

x

10 x

100 x

10

x

63 x

630 x

8

x

40 x

320 x

6

x

63 x

378 x

multiplique

el aumento

del ocular

8 x 40 x 320 x 6 x 63 x 378 x multiplique el aumento del
8 x 40 x 320 x 6 x 63 x 378 x multiplique el aumento del
8 x 40 x 320 x 6 x 63 x 378 x multiplique el aumento del
8 x 40 x 320 x 6 x 63 x 378 x multiplique el aumento del
8 x 40 x 320 x 6 x 63 x 378 x multiplique el aumento del
8 x 40 x 320 x 6 x 63 x 378 x multiplique el aumento del
8 x 40 x 320 x 6 x 63 x 378 x multiplique el aumento del
8 x 40 x 320 x 6 x 63 x 378 x multiplique el aumento del

POR

el aumento

del objetivo