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UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE

FACULTAD DE QUÍMICA Y BIOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

"ENZIMOLOGÍA I. EFECTO DEL PH Y LA


TEMPERATURA EN LA ACTIVIDAD
ENZIMATICA"

INTEGRANTES : Francis González


Lawrence Lackey
PROFESORA : Alejandra Saavedra
AYUDANTE : Catalina Rodríguez
FECHA EXPERIENCIA : 6 de Noviembre del 2017
FECHA DE ENTREGA : 20 de Noviembre del 2017
1.- INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS

La catálisis en sistemas biológicos es crucial para la vida, muchas de las reacciones


termodinámicamente espontaneas ocurren a velocidades muy bajas. Las enzimas son
catalizadores biológicos de carácter proteico que les permiten a las células acelerar la
velocidad de las reacciones químicas según lo indicado por Solomonet al. (1). La actividad
catalítica dependerá de la integridad de la conformación tridimensional, es decir, si estas
sufren desnaturalización y pierden su estructura, cuaternaria, terciaria o secundaria no
presentaran actividad catalítica como indica Nelson & Cox (2). En general las enzimas
operan de manera más eficiente cuando se encuentran en las condiciones óptimas. Todas
presentan una temperatura y pH óptimo al cual aceleran más la reacción. En humanos la
temperatura óptima ronda la temperatura corporal, o sea, 35[ºC] a 40[ºC] (1, 2). A
temperaturas menores las reacciones ocurren a menor velocidad o no ocurren, mientras que
a mayores pueden acelerarse hasta ciertos límites donde la enzima se ve afectada
negativamente comenzando el proceso de desnaturalización. Otro factor determinante en la
actividad enzimática es el pH y al igual que la temperatura permite que las enzimas operen
a un nivel óptimo. Para las enzimas humanas el pH óptimo se encuentra entre 6 y 8 (2).

Esta experiencia busca conocer y manejar los procedimientos básicos con muestras
biológicas y determinar los efectos del pH y temperatura sobre la catálisis enzimática de la
amilasa salival en la hidrólisis del almidón.

2.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Se comenzó por rotular el material utilizado, en total 17 tubos de ensayo, 4 para las seriesA,
B y C y 5 para la serie D, enumerados del 1 al 4 y hasta 5 en el caso de la serie D. Una vez
rotulados el material fue dispuesto sobre una gradilla de plástico.

2.1 Extracción y tratamiento de la enzima α-amilasa salival (Preparación


enzimática).

Se continuó con la preparación de la mezcla enzimática, para esto se dispuso de 60[mL] de


una solución deNaCl 0,9% p/v en un vaso precipitado de 100[mL]. Un integrante realizó el
enjuague bucal, dividiendo en dos el volumenpara cubrir la totalidad. En ambas ocasiones
el volumen del enjuague fue recibido en un mismo vaso precipitado de 150[mL].
Posteriormente se montó un embudo cónico sobre un atril con algodón como medio
filtrante, en donde el filtrado fue recibido en el mismo vaso precipitado de 100[mL]
utilizado al comienzo. Se presionó el algodón para enriquecer la preparación enzimática.

Luego se procedió a preparar las muestras como indica la tabla 2.1, trasvasando 10[mL] de
preparación enzimática en una probeta de 25[mL] en cada caso y siendo llevados a sus
respectivos tubos de ensayo. Con cada tubo de la serie A listo con su volumen de
preparación enzimática la ayudante agregó las gotas de ácido clorhídrico (HCl) según la

1
tabla 2.1. Luego se homogenizaron los tubos con ácido A2 y A3 y se dejaron incubar
durante 5 minutos a temperatura ambiente para finalmente medir la acidez con papel pH
reportando estos resultados en la tabla 3.1.

Tabla 2.1:Preparación enzimática y ácido en la serie A de tubos de ensayo.


Solución/Tubo A1 A2 A3 A4
Preparación enzimática[mL] 10 10 10 10
HCl 0,5[M] --- 1 gota 5 gotas ---

2.2 Efecto de la disminución del pH en la catálisis de la α-amilasa salival.

Para medir los efectos del pH se preparó la serie B de tubos. Mediante pipetas Pasteur se
tomaron los volúmenes de preparación enzimática, solución de NaCl y almidón según
como se indica en la tabla 2.2. La solución de NaCl y almidón previamente fueron
trasvasadas a vasos precipitados 250[mL] y 150[mL] respectivamente para no extraer
directamente de los frascos contenedores.

Tabla 2.2: Volúmenes añadidos a la serie B de tubos de ensayo.


Solución/Tubo B1 B2 B3 B4
NaCl 0,9% p/v[mL] 4,0 2,0 2,0 2,0
Preparación enzimática 2[mL] (preparado en a) --- Tubo A1 Tubo A2 Tubo A3
Almidón 1% p/v[mL] 2,0 2,0 2,0 2,0

Una vez agregadas todas las soluciones en los tubos de ensayo se homogenizaron con
pipetas Pasteur y se les midió la acidez con papel pH.

Se dejaron incubar las muestras durante 15 minutos y se agregaron dos gotas de lugol para
evaluar su actividad catalítica, tomando un registro fotográfico de los resultados.

2.3 Determinación de la actividad remanente de la enzima α-amilasa salival luego


de sertratada con ácidos y posterior amortiguación a pH 7.

Se continuó con la serie C de tubos, utilizando el mismo procedimiento de preparación de


la serie B con diferencia en que los volúmenes utilizados son los indicados en la tabla 2.3.

Tabla 2.3: Volúmenes añadidos a la serie C de tubos de ensayo.


Solución/Tubo C1 C2 C3 C4
Buffer fosfato 0,1[mM] pH 7,0[mL] 2,0 2,0 2,0 2,0
NaCl 0,9% p/v[mL] 2,0 --- --- ---
Preparación amilasa salival 2[mL] --- Tubo A1 Tubo A2 Tubo A3
Almidón 1% p/v[mL] 2,0 2,0 2,0 2,0

2
2.4 Determinación de las condiciones óptimas de temperatura en la actividad de la
amilasa salival.
Finalmente, para la determinación de la temperatura óptima se preparó la serie D de tubos,
los cuales siguieron el mismo procedimiento que en las series anteriores con diferencia que
la incubación durante 15 minutos fue realizada en un baño termorregulado para las
temperaturas mayores a la ambiental y en una tineta con hielo para la temperatura de 0[ºC].
Las preparaciones siguieron los volúmenes presentados en la tabla 2.4.

Tabla 2.4: Volúmenes añadidos a la serie D de tubos de ensayo.


Solución / Tubo D1 D2 D3 D4 D5
Buffer fosfato 0,1[mM] pH 7,0[mL] 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0
NaCl 0,9% p/v [mL] --- --- --- 2,0 ---
Preparación enzimática Tubo 4[mL] 2,0 2,0 2,0 --- 2,0
Almidón 1% p/v[mL] 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0
Temperatura incubación[ºC] 0 TA1 37 37 90

3.- RESULTADOS

Tabla 3.1: pH de las muestras preparadas en serie A.


Tubo 1 2 3 4
pH 6 2 1 6

Tabla 3.2: pH e identificación de control de muestras preparadas en serie B.


Tubo 1 2 3 4
pH 6 6 4 2
Control - + Experimental Experimental

Figura 3.1: Resultados luego de aplicar 2 gotas de lugol a las muestras preparadas en serie
B.

1
TA: Temperatura ambiente.

3
Tabla 3.3: pH y control de las muestras preparadas en serie C.
Tubo 1 2 3 4
pH 7 7 7 2
Control - + Experimental Experimental

Figura 3.2: Resultados luego de aplicar 2 gotas de lugol a las muestras preparadas en serie
C.

Tabla 3.4: Control de las muestras preparadas en serie D.


Tubo 1 2 3 4 5
Control Experimental Experimental + - Experimental

Figura 3.2: Resultados luego de aplicar 2 gotas de lugol a las muestras preparadas en serie
D.

4
4.- DISCUSIÓN

La saliva contiene una enzima llamada amilasa salival, la cual cataliza la degradación de
almidón y glucógeno hidrolizando los enlaces α1-4, actividad que se logra en humanos a
pH óptimo cercano a 7 y una temperatura próxima a los 37[ºC] según Enemchukwu B et al.
(3). Para evaluar la presencia de almidón se utiliza lugol, ya que este polisacárido absorbe
al yodo, tiñéndose en un rango de colores entre el azul, violeta y negro dependiendo de la
concentración a la que se encuentre, como afirman Martín-Sánchez y Pinto (4).
Se observa en la tabla 3.1 correspondiente a la acidez dela serie A que se obtienen los pH
esperados, es decir, más acido para el tubo con más gotas de HCl y cercano a la neutralidad
para los tubos sin ácido añadido, cabe destacar que el pH de la saliva fluctúa en rangos
ligeramente ácidos y cercanos al 7, lo que explica que en los tubos 1 y 4 el pH medido sea
de 6 (5).
En la serie B se esperaba que el tubo 2 o control positivo fuera el con menor tinción debido
a que su composición era preparación enzimática sin cambio de pH y por ende aseguraría la
hidrolización del almidón, mientras que el tubo 1 o control negativo el de color más oscuro
por la ausencia de enzima y por lo tanto mayor presencia de almidón no hidrolizado. En la
figura 3.1 se observa que se consiguieron los resultados esperados y además se aprecia que
tanto en el tubo 3 como en el 4 hay alta presencia de almidón no hidrolizado. Estos tubos
correspondían a los preparados con gotas de HCl, por lo tanto, es posible afirmar que el pH
ácido desnaturó las enzimas por la alteración de su carga neta, generándose repulsiones
electrostáticas y destrucción de puentes de hidrógeno.
En la serie C, el buffer utilizado no fue suficiente para alterar en gran medida el pH de la
solución del tubo 4 como se observa en la tabla 3.3, ya que el pH medido es cercano a 2. Al
no contrarrestar la alta acidez y así impedir la desnaturación de la enzima se observa que
color del tubo 4 en la figura 3.2 es oscuro al igual que el tubo 1, el cual no contenía enzima,
es decir, en estos tubos hay alta presencia de almidón no hidrolizado. En el tubo 3 se
aprecia un color café no tan oscuro como los tubos mencionados anteriormente, puesto que
hubo una catálisis parcial de la degradación, esto quiere decir que la presencia del buffer y
por ende la reconstitución del pH cercano al de operación de la enzima permitió que esta se
reconstituyera y con esto recuperar su actividad catalítica perdida como se observó en el
tubo 3B.
Finalmente, la serie D tubo degradación en todos los casos, sólo un tubo se observó color
oscuro y es el 4D o control negativo, ya que no poseía amilasa salival. Como se mencionó
anteriormente, las altas temperaturas afectan las interacciones débiles produciendo
desplegamiento de proteínas (2), sin embargo, el tubo 5D tiene baja presencia de almidón
no degradado, hecho que se puede explicar por la hidrolización debido a la temperatura y
no a la catálisis enzimática, puesto que corresponde al tubo incubado a 90[ºC]. Por otro
lado, a bajas temperaturas como en el tubo 1D el cual fue incubado a 0[ºC] igual presentó
hidrólisis del almidón a un nivel comparable al de las otras muestras, por lo que no se

5
observó efecto negativo en la disminución de la temperatura sobre la catálisis enzimática
mediante esta metodología.

5.- CONCLUSIONES

Se determinó que el pH afecta en la catálisis enzimática de la amilasa salival, en donde


ligeras modificaciones del pH natural de la enzima permiten mantener la acción enzimática,
no obstante, altas variaciones de la acidez provocan desnaturación y acaban completamente
con la actividad catalítica. Además mediante la serie C de tubos se logró determinar que el
efecto de la desnaturalización por pH puede ser reversible cuando se reconstituye el pH
natural de operación de la enzima.

En general el estudio cualitativo mediante lugol de la actividad enzimática de la amilasa


salival ante cambios de temperatura no permitió determinar la temperatura óptima de
catálisis, puesto que no se observó diferencia significativa entre la intensidad del color
presente en los tubos de la serie D para poder afirmar que alguno de estos presentara mayor
actividad enzimática.

6.- REFERENCIAS

[1] Solomon E., Berg L. & Martin D. (2013). Biología. Rodríguez R. (ed). Energía y
Metabolismo, Enzimas (9ª ed., pp: 162-166). Santa Fe, México: Cengage
Learing,S.A.

[2] Nelson D. L. & Cox M. M. (2009). Lehninger Principios de Bioquímica. Cuchillo


C. M. (ed), Enzimas (5a ed., pp:184, 204). España, Barcelona: Ediciones Omega.

[3] Enemchukwu B., Ubaoji K., Igwilo I. &Udedi S. (2013). Effects of Temperature, pH
and Substrate Concentration on the Kinetics of Salivary Alpha Amylase Activity
among Cigarette Smokers in Awka, AnambraState, Nigeria. Departamento de
bioquímica aplicada, Universidad de Azikiwe. Akwa, Nigeria.

[4] Martín- Sánchez M. & Pinto G. (2012). Reactivo de lugol: Historia de su


descubrimiento y aplicaciones didácticas. España. Disponible en:
<http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0187-
893X2013000100006> Visitado el 19 de noviembre del 2017.

[5] Muñoz S. & Narvaéz C. (2012). pH salival, capacidad buffer, proteínas totales y
flujo salival en pacientes hipertensos controlados usuarios de diuréticos. Facultad
de odontología, Universidad del desarrollo. Concepción, Chile.