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Protocolodeelectroforesisengelesdeagarosa

La electroforesis en geles de agarosa es una de las tcnicas ms utilizadas para analizar y


caracterizar los cidos nucleicos. Los geles de agarosa se comportan como un tamiz
molecular y permiten separar molculas cargadas en funcin de su tamao y forma. Los
cidos nucleicos son macromolculas cargadas negativamente debido a la presencia de
grupos fosfato en su estructura. As, molculas de ADN de diferente tamao migran de
formadistintaenunaelectroforesisengeldeagarosa.Adems,siendichaelectroforesisse
utilizanmarcadoresdepesomolecular(fragmentosdeADNdetamaoconocido)sepuede
calculareltamaoaproximadodelADNenestudio.

Reactivos

Marcadoresdepesomolecular
Tampndecarga
TampndeelectroforesisTAE(40mMTrisacetato,1mMEDTA)
Agarosa
Bromurodeetidio

Materiales

Micropipetasypuntas
TubosEppendorfde1,5mL
MatrazErlenmeyerde200mL
Probetade50mL

Equipamiento

Equipodeelectroforesis(cubeta,molde,peine,fuentedealimentacin)
Microcentrfuga
Balanza
Microondas
Transiluminador
Agitador

Objetivos

1. Conocer el mtodo de separacin de cidos nucleicos mediante electroforesis en


gelesdeagarosa.
2. Comprobar la integridad del ADN extrado mediante electroforesis en geles de
agarosa.
3. Estimar el tamao molecular de un cido nucleico mediante electroforesis en geles
deagarosaapartirdelacomparacinconunpatrn.

Protocolo

1.Preparacindelasmuestras

1.1.Semezcla1Ldetampndecargacon1LdelmarcadordeADN(0,5g)ocon
1 L de la muestra de ADN y se lleva hasta un volumen final de 5 L con agua
destilada.
1.2. Se centrifugan las muestras en una microcentrfuga para bajar la muestra al
fondodeltubo.

2.Preparacindeungeldeagarosaal0,8%

2.1.Semideenunaprobeta50mLdeltampndeelectroforesisTAE1xyseaadena
unmatrazErlenmeyer.
2.2.Sepesan0,4gdeagarosaenunabalanzayseaadenalmatrazErlenmeyer.
2.3.Sellevaaebullicinlasolucindeagarosaenunmicroondasysedejaenfriarla
suspensinhastaquealcanceunos50Caproximadamente.
2.4.Sevierteenelmoldeysedejagelificarduranteunos30minutos.

3.Electroforesis

3.1.Seretiraelgeldeagarosadelmolde.
3.2.Secolocaelgeldeagarosaenlacubetadeelectroforesis.

3.3. Se aade tampn TAE 1x en la cubeta de electroforesis hasta cubrir el gel de


agarosa.
3.4.Secarganlasmuestrasenlospocillosdelgeldeagarosa.
3.5. Se tapa la cubeta de electroforesis y se conectan los electrodos a la fuente de
alimentacin.
3.6.Seprogramalafuentea110voltiosysecomienzaacorrerlaelectroforesisque
durarunos3045minutos.

4.Tincindelgeldeagarosaconbromurodeetidio

4.1. Una vez finalizada la electroforesis se retira el gel de agarosa y se tie en una
solucinconbromurodeetidioa1g/mL.
4.2.Seponeenagitacindurante20minutos.

5.Visualizacindelgel

5.1.Secolocaelgeldeagarosasobrelabandejadeltransiluminador.
5.2.Sevisualizaelgeldeagarosaconluzultravioleta.
5.3.Seobtieneunafotografa.

6.Interpretacindelosresultados

6.1.SedeterminasielADNgenmicodeguisanteesmayorquelasbandasdelADN
marcadorysuintegridad.