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Introduccin

Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseado diversos mtodos


que permiten cultivarlos bajo condicione artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo
condiciones experimentales y manejar un solo tipo de microorganismo. Una de las
tcnicas ms usadas en el laboratorio de microbiologa consiste en transferir una
muestra microbiolgica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que
permite obtener cultivos microbianos. Al efectuar este procedimiento, es necesario
considerar que en el rea de trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido a
esto, es necesario tomar precauciones para impedir que stos penetren y contaminen
los cultivos en estudio.
Por otra parte, para considerar no slo el aspecto nutricional, sino tambin las
condiciones ambientales de su hbitat natural, por lo que en el medio de cultivo se debe
ajustar el pH y concentracin de sales y durante la incubacin condiciones tales como
la temperatura, aireacin la luminosidad.
La aplicacin de estos procedimientos ha permitido propagar a los microorganismos en
cultivos mixtos, as como su aislamiento y la obtencin de cultivos puros, facilitando de
este modo, el estudio, caracterizacin, aplicacin y control de los mismos. La forma de
sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propsito especfico del
estudio.
En el presente informe se presentan los resultados obtenidos en los distintos medios de
cultivo y las discusiones respectivas.
El parmetro que se ha utilizado es la presencia del oxgeno que sirvi para distinguir a
las bacterias. Esto lo vamos a observar en los cultivos hechos en tubos de ensayos, si
crecen pegado a las paredes o base por ejemplo quiere decir que son muy sensibles al
oxigeno entonces lo clasificaramos como anaerobios estrictos, estos mueren a
presencia del oxgeno, lo cual puede deberse a que son incapaces de eliminar algunos
productos txicos que se originan por el metabolismo del oxgeno (Madigan, et al, 2003).

Objetivos

Observar caractersticas de crecimiento de los microorganismos al trasplante en


medios de cultivo lquido y slido.
Separar colonias individuales a partir de una mezcla de microorganismo
utilizando tcnicas de aislamiento.

Materiales

Tubo de caldo conteniendo una mezcla de microorganismos


Asa y aguja de Klle

Mechero
Tubos con 12 ml de agar nutritivo licuado y mantenido a 50 C

Placa Petri estriles

Placa con agar Mac Conkey


Placa con agar Manitol salado

Procedimiento

1. Aislamiento por estras:


a) Tome el tubo de caldo que contiene la mezcla de microorganismos y con
ayuda de la aguja de Klle previamente esterilizada a la llama, retire el
inculo. Considere rodad las recomendaciones antes dadas para el trabajo
en asepsia.
b) Tome la placa con agar Manitol salado con la mano izquierda y con ayuda
de los dedos pulgar e ndice levante hacia un lado la tapa, procurando que la
parte expuesta se encuentre bajo la influencia de la llama del mechero. No
descubra por completo la placa, as evitara mayor contaminacin. Con la
aguja cargada de inculo, haga estras sobre toda la superficie del medio,
procurando trazar una ltima estra en un espacio libre. Cierre la placa.
c) Esterilice el asa a la llama nuevamente.
d) Repita los pasos 2 y 3 para la placa con agar Mac Conkey.
e) Coloque las placas en incubacin a 37 C por 24 horas.
f) Observe el desarrollo de colonias individuales y describa sus caractersticas
de forma, elevacin, consistencia, bordes, etc. Diferencie las caractersticas
de las colonias desarrolladas en cada medio y (agar Manitol salado agar Mac
Conkey).

2. Aislamiento por diluciones:


a) Tome el tubo de caldo conteniendo la mezcla de microorganismos y con
ayuda del asa de Klle retire el inculo.
b) Tome un primer tubo de agar licuado y mantenido a 50 C y transfiera
aspticamente el inculo. Esterilice el asa a la llama del mechero. Con el tubo
cerrado mezcle el inculo con el medio, hacindolo girar entre las palmas de
las manos.
c) Transfiera una asada de agar mezclado con el inculo hacia un segundo tubo
de agar licuado. Repita la operacin anterior para obtener una mezcla
homognea.
d) Vierta el contenido de cada tubo por separado en dos placas petri estriles y
rtelas lentamente para distribuir el medio de manera uniforme. Identifique
cada dilucin.
e) Incube las placas a 37 C por 24 horas.
f) Examine el crecimiento de las colonias en las placas. Hagan un recuento de
colonias, si el estimado no es inferior a 30 ni superior a 300. Describa las
caractersticas diferenciales de las colonias observadas.

Resultados:

Agar inclinado Caldo Nutritivo Agar vertical

Hubo deseminacion de las Las colonias de bacterias se


Hubo crecimiento de
colonias de bacterias, desarrollaron en el agar,a
colonias de bacterias en la
distribuidas a lo largo del medida que se habia
superficie del agar.
caldo nutritivo. introducido el asa de kolle
Ejercicio 2: Aislamiento y recuentro en placas
A) Aislamiento por agotamiento de superficies

En agar Mac Conkey. Se logran ver colonias aisladas, son colonias medianas,
circulares, convexas, bordes redondeados, lactosa positivas lo que les da coloracin
rosada.

B) Aislamiento por diluciones

1era dilucin 2da dilucin

Primera asada del agar mezclado Segunda asada del agar


con el inculo. mezclado con el inculo.
Se observ colonias muy juntas y Se observ que las colonias
abundantes presentes estaban an juntas
pero si se podan contabilizar

Discusiones:
En la primera experiencia se observaron 2 tubos con agar nutritivo; uno inclinado y otro
vertical y un tubo con caldo nutritivo. Lo que se busca al sembrar el material
bacteriolgico es promover su crecimiento y desarrollo. Se utiliz agar nutritivo y caldo
nutritivo porque son medios usados para el cultivo de microorganismos poco exigentes
en sus requerimientos nutricionales y no contiene inhibidores del desarrollo bacteriano
(Garca, 2006), conveniente para la Escherichia coli. Segn Collins (1989) es este un
gran genero de bacilos esporulados Gram positivos que son aerobios, anaerobios
facultativos y catalasa positivos. Muchas especies estn presentes normalmente en el
suelo y en la materia animal y vegetal en descomposicin.
Segn Granados y Villaverde (1998) los medios slidos en tubo corresponden a tubos
con agar inclinado y solidificado con el fin de aumentar la superficie donde se va a
producir el crecimiento microbiano una vez sembrado. Las colonias se desarrollan mejor
en la superficie del medio que en su profundidad. Estos tipos de medios son tiles para
observar el crecimiento aerobio microbiano si se ha sembrado por estra, el crecimiento
anaerobio microbiano si se ha sembrado por picadura (anaerobiosis facultativa) y para
la conservacin de cepas, porque la desecacin es menor en medios slidos en tubo
que en placas Petri.
Escherichia coli en el crecimiento por estras sobre agar inclinado, las estras no son
muy amplias pero tampoco muy estrechas para poder observar con claridad la cantidad,
distribucin de la superficie, forma de crecimiento, consistencia y pigmentacin segn
Walter y Macbee, (1965).En el caso de agar vertical por picadura profunda la
Escherichia coli se pudo observar la movilidad de la bacteria ya que no solo se desarroll
en donde se propaga el oxgeno (lnea de inoculacin). En el Caldo Nutritivo se observ
turbidez moderada ya que la Escherichia coli quedaba suspendida en todo el medio de
cultivo pudindose desarrollar en cualquier nivel del tubo por su carcter anaerobio
facultativo probablemente.
Por estras o por agotamiento en superficie
Para esta tcnica se usa una mezcla de bacterias (E.coli, Staphylococcus sp. y Bacillus
sp.); segn Gamazo, Lpez y Daz (2005) los microorganismos se encuentran en
comunidades complejas en la naturaleza; por ello la tcnica ms utilizada en los
laboratorios de microbiologa que permite que cada bacteria viable (viva) sea aislada en
la superficie del medio slido es esta.
En el aislamiento por estras en el Agar Mac Conkey la Escherichia coli segn Bell y
Kyriakides. (1998) puede fermentar la lactosa provocando el viraje del rojo fenol por ello
las colonias son de color rojo; as mismo, el contorno tena un halo turbio probablemente
porque al fermentar la lactosa produca gas y este cambiaba la constitucin del medio;
as pues se inhibe el crecimiento del Bacillus sp y del Staphylococcus sp. Debido a que
el medio no es el adecuado para su; por otro lado, el Agar Manitol Salado, inhibe el
crecimiento del Bacillus sp y la Escherichia coli porque el nico que puede crecer en ese
medio es Staphylococcus sp, segn Sagrado y Mandolesi (2004) ya que crece en un
medio con alta concentracin de sal y fermenta o no el manitol. Se presume por la
informacin de Laboratorios Britania que es un estafilococo coagulasa positiva ya que
fermenta el manitol y se visualizan como colonias amarillas rodeadas de una zona del
mismo color por que producen cidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el
indicador de pH del color rojo al amarillo.
Rodriguez (2007) menciona que el Agar Manitol es un medio de cultivo altamente
selectivo pues al contener cloruro de sodio NaCl (7.5%), aumenta la presin osmtica,
originando la proliferacin de bacterias osmoresistentes, y la presencia de manitol
evidencia la fermentacin que hubo, es por ello la coloracin amarilla que presento,
como consecuencia solo creci las cepas de genero Staphylococcus sp, pues son las
nicas que cumplen estas dos condiciones, (Garca, Paredes y Fernndez, 1994).
Aislamiento por dilucin
El aislamiento por diluciones es una tcnica que se usa para obtener el nmero de
clulas viables, el recuento de viables se expresa a menudo como unidades formadoras
de colonias obtenidas, en vez de como nmero real de clulas viables, ya que una
unidad formadora de colonias puede contener una o ms clulas iniciales (Madigan et
al, 2009), es por esto que el recuento de viables es una estimacin mnima.
Se quiere hacer el recuento de bacterias para determinar el nmero de bacterias
existentes en una muestra o cultivo, puede ser en un determinado volumen o
determinando el nmero de bacterias vivas existente, ya que cada bacteria da lugar a
una colonia diferente, y luego se cuenta el nmero de colonias que se han desarrollado
(recuento viable), segn De la Rosa (2003).
En la primera dilucin las colonias eran pequeas y estaban muy juntas lo cual se haca
difcil de contar, en la segunda dilucin eran pocas colonias y de aspecto brilloso. Esta
tcnica sirve para diferenciar que tipo de microorganismos estamos trabajando y
mantenerlo fresco.
En la segunda dilucin la cantidad de colonias disminuy, aunque el tamao de cada
colonia aument, esto seguramente porque al ser menos colonias la disponibilidad de
nutrientes para cada una es mayor que en la primera placa.
En ambos casos es importante considerar que el nmero de colonias no solo depende
del tamao del inculo, sino tambin de lo adecuado que sea el medio de cultivo y de
las condiciones de incubacin (Madigan et al, 2009). En este caso tambin es importante
sealar que al ser un cultivo mixto, no todas las clulas depositadas en la placa
desarrollarn colonias a la misma velocidad, y que si se emple un corto tiempo de
incubacin se pudieron obtener menos colonias de las posibles, siendo en este caso
perjudiciales ambos factores, ya que el nmero de viables solo aumentara, indicando
de que es necesario incrementar an ms el nmero de diluciones.