R Peruvian Journal of

P
P Parasitology
Volumen 19 , Nmero 2 , Ao 2011
(Versin Electrnica)

Artculo Originales/Original Articles

Medio de cultivo alterno para el diagnstico de Blastocystis hominis

Alternative growth medium for Blastocystis hominis diagnosis

Sara Ortigoza Ga, Martha Cruz A b, Mara L. Hernndez Ha, Mercedes Castaeda La,
Martha Castro Ra, Mario Gonzlez Sa

a. Profesor de tiempo completo, Facultad de Bioanlisis, Universidad Veracruzana, Veracruz, Mxico.

b.Tcnico Acadmico, Facultad de Bioanlisis, Universidad Veracruzana, Veracruz, Mxico.

Resumen
Blastocystis hominis es un microorganismo que
constituye un problema de salud pblica, por lo
que es necesario un medio cultivo alterno por la
inaccesibilidad del medio de Boeck Drbohlav, el
cual no est autorizado para su importacin en
Mexico. Objetivo: elaborar un medio de cultivo
alterno para el diagnstico de Blastocystis hominis.
Material y mtodo: En este estudio exploratorio,
se tomaron y analizaron 24 muestras de heces
humanas frescas de las cuales 20 fueron positivas
para Blastocystis hominis por microscopia. Los
reactivos del cultivo alterno al Boeck-Drbohlav
modificado (BDM) fueron: solucin de Locke,
agua destilada, cloruro de sodio, cloruro de
potasio, cloruro de calcio, bicarbonato de sodio,
fosfato de sodio, fosfato de potasio y glucosa.
Resultados: Al sembrar las muestras positivas en
el BDM alterno, se observ crecimiento de este
parsito en un 100% en las primeras 24 y 48
horas, y con disminucin al 90% a las 72 horas.
Conclusiones: El medio de cultivo BDM alterno
propuesto en este trabajo constituye una opcin
viable, accesible y efectiva para la observacin
morfolgica del protozoario Blastocystis hominis.
Palabras clave: Amebozoarios |Blastocystis
hominis / parasitologa | Blastocystis hominis /
microbiologa |Medios de Cultivo |
Abstract
Blastocystis hominis is a microorganism that
represents a public health problem, so it is
necessary an alternative growth medium due to
the inaccessibility of Boeck Drbohlav medium,
which is not authorize for importation in Mexico.
Objective: To elaborate an alternative growth
medium for Blastocystis hominis diagnosis.
Material and method: In this exploratory study,
24 fresh stools human samples were obtained and
analyzed by microscopic examination. A total of
20 samples were found to have Blastocystis hominis.
The reagents of the modified Boeck-Drbohlav
medium (BDM) were solution of Locke, distilled
water, sodium chloride, potassium chloride,
calcium chloride, sodium bicarbonate, sodium
phosphate, potassium phosphate and glucose.
Results: After placing the specimens in the BDM
it was observed a growth of this parasite in 100%
during the first 24 to 48 hours, and a decrease to
90% after 72 hours. Conclusions:The alternative
growth medium BDM presented in this work is
viable, accessible and effective, for the
morphological observation of Blastocystis hominis.
Key words: Amoebozoa | Blastocystis hominis /
parasitology | Blastocystis hominis / microbiology |
Culture Media

Cita sugerida: Ortigosa GS, Cruz AM, Hernndez HLM, Castaeda LM, Castro RM, Gonzlez SM. Medio de cultivo alterno para el diagnstico de
Blastocystis hominis. Peru J Parasitol. 19(2): e52- e59.
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Introduccin
B
lastocystis hominis es un protozoario
unicelular anaerobio perteneciente al
reino protista y reclasificado por
Silberman dentro del reino Cromista o
Stramenopila, el cual se encuentra en el tracto
intestinal en los seres humanos y animales
donde puede causar patologa intestinal
aunque esto es controversial.(1) Algunos
investigadores han reportado la relacin de
infecciones con sntomas especficos
produciendo una reaccin txica alergnica no
especfica de la mucosa del colon provocando
sndrome diarreico y colitis ulcerativa.
(2)
En el 2002, se report una prevalencia de
Blastocystis hominis entre 30 y 50% en pases en
vas de desarrollo, mientras que para el 2008 se
increment entre 27 y 60 %.(3-4) En adultos de
Latinoamrica, se ha reportado una prevalencia
de Blastocystis en aquellos con sintomas de hasta
61,6 %, mientras que aquellos sin sntomas la
prevalencia disminuy a 41,6 % y en la
poblacin infantil indgena la prevalencia fue
(1)
de 51,6 %. En Villa El Salvador (poblacin
marginal de Lima, Per) en 39 nios de 5 a 13
aos, se report B. hominis en 92,3 % con
(5)
sntomas digestivos y 7,6 % asintomticos.
Asimismo, este protozoario se encuentra
distribuido en ms del 60 % en zonas tropicales
y subtropicales del mundo.(6-7)
Los medios de cultivo son de gran ayuda para
realizar el diagnstico confirmatorio de certeza
de B. hominis.(8) Diversos investigadores han
descrito varios procedimientos para cultivar B.
hominis. Los estudios iniciales realizados por
Zierdt y colaboradores en 1967 demostraron
que B.hominis no creca en los medios utilizados
de manera rutinaria en el cultivo de hongos; sin
embargo, a travs de los medios de Boeck-
Drbohlav y el de Nelson y Jones, demostraron el
crecimiento de ste parsito. Ambos medios
son utilizados para el aislamiento y crecimiento
de Entamoeba histolytica. Mientras que B. hominis
crece en el 67,9 % en los cultivos in vitro
teniendo un xito en la axenizacin del 47,4
( 9 - 10 )
%. Posteriormente, se realiz una
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Artculo Original
Medio de cultivo alterno para el diagnstico de Blastocystis hominis
modificacin del medio de cultivo en 1997,
reportando un crecimiento ptimo del parsito
comparado con otros mtodos y estudios
moleculares. (12, 13, 14) En el 2000, Zerpa y cols
publicaron un mtodo simplificado para el
cultivo de B. hominis, sustituyendo el suero de
caballo por plasma humano y cultivado sin el
sistema convencional de anaerobiosis.(15)
Guzmn De Rendon C. y cols, reportaron que
el examen directo en heces es sensible para el
diagnstico de B. hominis; sin embargo, se ha
demostrado que este mtodo pierde eficacia
cuando se examinan las muestras de heces
despus del tratamiento con una dosis de
secnidazol ya que existe una disminucin del
nmero de microorganismos lo que dificulta su
comprobacin. Es as, que se ha empleado
como prueba diagnstica el medio de cultivo
B o e ck- D r b o h l av m o d i f i c a d o . ( 16 ,17 )
Lamentablemente, este medio de cultivo es
inaccesible en nuestro medio por la falta de
autorizacin por medio del sistema de salud a la
importacin de este producto en Mxico. Dado
la dificultad en la identificacin del parsito y a
la falta de un medio de cultivo accesible en la
prctica clnica diaria, el propsito de este
estudio es elaborar un mtodo alternativo
accesible y efectivo para la identificacin y
diagnstico de Blastocystis hominis.
Material y mtodos
Tipo de estudio.
Estudio exploratorio, descriptivo, realizado
entre mayo - diciembre 2012 en la Facultad de
Bioanlisis de la Universidad Veracruzana,
Campus Veracruz. Se obtuvieron 24 muestras
de heces, de las cuales 10 con diagnstico de
colitis severa (2 muestras lquidas y 8
semilquidas) y las otras 14 presentaron
caracteristicas normales (formadas). Al examen
coproparasitocoscpico, 20 fueron positivas a
B. hominis.
Variables, materiales, reactivos y equipos. Las
variables estudiadas fueron tensin de oxgeno,
tiempo de incubacin, cantidad de inculo y
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nutrientes del medio. Los materiales que
usaron fueron gasas, guantes, cubre boca, tubos
de ensayo de 15x125, 12x75, gradilla, mechero,
aplicador, pipetas de Pasteur, pipeta de 5 mL y
10 mL cubre y porta objetos, algodn con
alcohol, matraz Erlenmeyer de 250 mL, matraz
Erlenmeyer con tapa roscada de 1000 mL,
probeta de 50 mL, 10 perlas de vidrio, 2 vasos de
precipitado de 500 mL, embudo, varilla de
vidrio y papel filtro. Los reactivos utilizados
fueron cloruro de sodio, cloruro de calcio,
cloruro de potasio, fosfato de sodio, fosfato de
potasio, bicarbonato de sodio, agua destilada;
nutrientes: dextrosa y huevos. Los equipos
utilizados fueron microscopio binocular de luz,
bao mara, balanza analtica, estufa
bacteriolgica, auto clave, horno de secado.
Criterios de inclusin. Estos fueron muestras
de heces frescas. Se eliminaron muestras
contaminadas o que hayan tenido un
inadecuado manejo durante el estudio.
Cultivo modificado. El medio Boeck-Drbohlav
modificado (BDM) es un medio bifsico, con
una fase slida constituida por 4 huevos y
sangre humana desfibrinada, que se esteriliza
mediante tindalizacin a 80 C, y 50 mL de la
fase lquida constituida por un Ringer (solucion
de locke)(18-19) se han reportado diferentes
metodologas para la composicin y
elaboracin del medio (BDM), ninguna fue
factible por su inaccesibilidad en nuestro
mbito, por lo que el propsito de la presente
investigacin fue elaborar un medio alterno
disponible para estudios posteriores en nuestra
institucin, con los siguientes componentes:
Solucin de Locke; en 1000 mL de agua
destilada se disolvieron 9 g de cloruro de sodio,
0,4 g de cloruro de potasio, 0,2 g de cloruro de
calcio, 0,2 g de bicarbonato de sodio, 2 g fosfato
de sodio, 0,3 g de fosfato de potasio y se
adicion 2,5 g de glucosa, hirvindose durante
10 minutos, se form un precipitado el cual se
filtr con papel filtro despus de enfriarlo a
temperatura ambiente. Posteriormente, se
esteriliz en autoclave 15 minutos a 15 libras.
En la preparacin de la fase slida se utilizaron
250 mL de huevo con 100 mL de solucin de
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Medio de cultivo alterno para el diagnstico de Blastocystis hominis
Locke (stas cantidades fueron modificadas y
estandarizadas en este trabajo despus de varios
ensayos con 100, 150, 200 mL de huevo y al
mismo tiempo se duplic la solucin de Locke
de 50 mL a 100 mL hasta obtener la cantidad
efectiva sealada), se depositaron en un vaso de
precipitado de 500 mL con perlas de vidrio para
realizar una desfibrinacin. Se filtr la mezcla y
se dispens 5 mL en tubos de 15 x 125, a
continuacin los tubos se colocaron en forma
inclinada en el horno a 70C por 15 minutos,
luego se dejaron enfriar a temperatura
ambiente, posteriormente, se cubrieron con 6
mL de solucin de locke estril. La inoculacin
de los medios se realiz preparando una
suspensin con 1 mL de solucin salina al 0.9 %
y 2 g de heces, de la cual se tom 100 L como
mnimo en razn de que se comprob que
menor a 100 L de la suspensin el parsito no
crece. Se incubaron los medios en anaerobiosis
a 37 C durante 24, 48 y 72 h. La observacin de
resultados se realiz en el microscopio de luz a
400 x de la parte lquida del medio de cultivo
por el mtodo directo colocando una gota entre
porta y cubre objetos.
Anlisis estadstico. El anlisis se realiz con
estadstica descriptiva para la determinacin de
porcentajes (%). Se utiliz el paquete estadstico
IBM SPSS, Versin 20,0
Resultados
Se inocularon 20 medios de cultivo con
muestras positivas a B. hominis y 4 negativas.
Todos los medios de cultivo se incubaron a 37
C en diferentes tiempos 24, 48 y 72 h en
anaerobiosis. Para verificar que el desarrollo del
parsito slo se lleva a cabo en un medio
anaerobio, se incub un duplicado de las
mismas muestras en forma aerobia, sin xito
alguno de crecimiento de B. hominis.
De las 20 muestras con B.hominis, se observ un
crecimiento de este protozoario en todos los
cultivos alternosen las primeras 24 y 48 horas
(100 %). Sin embargo, a las 72 horas 18 casos
(90 %) fueron positivos. Las 4 muetras
controles o negativas no se observo crecimiento
de B. hominis a las 24, 48 y 72 h (Tabla 1).
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Tabla 1. Crecimiento de B. hominis en el medio BDM alternativo

Tiempo (horas)
Medios
24 48 72

+ % - % + % - % + % - %
Medio BDMM alterno
20 100 0 0 20 100 0 0 18 90 2 10
Muestras no
sospechosas 0 0 4 100 0 0 4 100 0 0 4 100
(+) = Positivo, (-) = Negativo.

La observacin al microscopio a partir de qustica y contaminacin por levaduras

muestras obtenidas del medio de cultivo impidiendo de este modo la sobrevivencia del
confirm el marcado polimorfismo del protozoario despus de dicho tiempo.
microorganismo, la ms frecuente fue la forma
granulosa y ameboide, tambin se observaron a La forma con cuerpo central presenta aspecto
las 24 y 48 h las formas de cuerpo central y forma redondeado u oval de 4 um o ms
globulosa, tal como fue descrito por aproximadamente y se denota as por un
Arrechedera. (20) Asimismo, a las 48 h se observ organelo membranoso en el interior de la clula
mayor cantidad de parsitos por campo y la que ocupa aproximadamente el 75 % del
reproduccin de B. hominis por biparticin. A las tamao total y muy refringente, esta forma fue la
72 h se encontr crecimiento en su forma ms pequea observada. Figura A y B.

CC

Fig. A
Fig. B

Figura A. Sedimento del medio de cultivo Figura. B. Sedimento del medio de cultivo
BDMM alternativo. Forma cuerpo central de BDMM alternativo. Formas cuerpo
Blastocystis hominis a 400x. La flecha seala el central de Blastocystis hominis diferentes
cuerpo central (CC). tamaos y aspecto a 400x.

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La forma globulosa tiene vesculas en el citoplasma y su cubierta es ms gruesa. Figura C.

Figura. C. Sedimento del medio de cultivo

BDM alternativo. Forma globulosa de
Blastocystis hominis con vesculas fuera y
dentro del citoplasma a 400x.

La morfologa granulosa es similar a la forma con de grnulos y su tamao es ligeramente mayor 10

cuerpo central, pero tiene el cuerpo central lleno m, aproximadamente. Figura D.

Figura. D. Sedimento del medio de cultivo

BDM alternativo. Forma Granular de
Blastocystis hominis a 400x

La forma ameboidea de B. hominis en fresco preparacin se fija y se observa de forma

tiene aspecto irregular, se pueden observar los redondeada, Figura E.
seudpodos, despus de 10 minutos la

CC

Figura E. Sedimento del medio de cultivo

BDM alternativo. Forma ameboide con
cuerpo central (cc), citoplasma abundante
de Blastocystis hominis a 400 x.

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Los quistes se observaron con una capa
redondeada delgada que los cubre. Otros
presentaron estructuras traslucidas esfricas
muy grandes, por lo que se coloc una gota de
F G
Sedimento del medio de cultivo BDM alternativo. Figura F.- Quiste de Blastocystis hominis con cubierta
externa fina 400x. Figura G.- Quiste de Blastocystis hominis sin cubierta 400x. Figura H.- Quiste de
Blastocystis hominis con cubierta.
Los quistes se observaron con una capa
redondeada delgada que los cubre. Otros
presentaron estructuras translucidas esfricas
muy grandes, por lo que se coloc una gota de
Discusin
En el medio de cultivo alterno obtenido en este
estudio se observ B. hominis en el 100 % de las
muestras (n=20) a las 24 y 48 h, mientras que
90% (n=18) fueron positivas a las 72 h. Las
fases morfolgicas de B. hominis en el medio de
cultivo alterno coinciden con los reportes
(15,20)
previos. , donde describen clulas activas
con una membrana celular, citoplasma y
organelos. De la misma manera, se observaron
quistes con y sin cubierta externa, tal como ha
20
sido descrito previamente. El parsito sintetiza
componentes de la pared de las formas
vegetativas (ameboide, granular y cuerpo
central) y los deposita justo entre la membrana
plasmtica y la cubierta externa, esta ltima se
separa a medida que el quiste madura y
finalmente puede ser eliminada para dejar el
(20)
quiste desnudo. Se observ un 80 % de
clulas vegetativas como: cuerpo central,
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solucin yodo-lugol, colorendose el centro del
quiste de color mbar (Figura F, G y H). No se
observaron organelos especficos ya que solo se
utiliz microscopia de luz.
H
solucin yodo-lugol, colorendose el centro del
quiste de color mbar (Figura F, G y H). No se
observaron organelos especficos ya que solo se
utiliz microscopia de luz.
granulosa, ameboide y globulosa, cifras
similares a reportes previos.(20, 21, 22) En este
estudio se observ que a las 24 h la nica forma
de reproduccin de dicho protozoario fue por
biparticin2 coincidiendo con Guzmn de
Rondn16. El ciclo biolgico y el crecimiento en
los medios de cultivos estn relacionados ya que
la morfologa en los distintos tiempos (24, 48 y
72 h) coincide con la explicacin de dicho
(7, 23)
proceso, tal como ha sido descrito. Por
ltimo la observacin del protozoario solo se
realiz hasta las 72 h esto debido al
enquistamiento del parsito y/o
contaminacin de los medios de cultivo por
levaduras, lo que hace ineficaz la observacin.
Se recomienda resembrar B. hominis a otro
medio de cultivo a las 48 h asegurando as la
continuidad del crecimiento, por lo que se
sugiere traspasar el sobrenadante a un tubo de
ensaye, centrifugar a 1500 rpm durante 5
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minutos, desechar el sobrenadante y
resuspender el sedimento con solucin salina al
0,9 % e inocular el nuevo medio. No se realiz
el cultivo (BDM) por la inaccesibilidad del
medio en Mxico. Por otra parte se utiliz el
medio de cultivo de Pavlova modificado con
plasma humano en lugar del suero de caballo,
esto present dificultad a la observacin de las
caractersticas de la clulas vegetativas con
posibles resultados de falsos positivos o
negativos a B. hominis. No se determin la
efectividad del (BDM) contra el medio alterno
propuesto, por la falta de disponibilidad del
medio antes sealado.
El medio de cultivo BDM alterno propuesto en
este trabajo, constituye una opcin viable,
accesible, y efectiva, porque mejora la
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observacin morfolgica del parasito.
Agradecimientos
A los revisores del presente estudio por sus
valiosos comentarios y sugerencias para mejorar
este manuscrito.
Conflicto de intereses:
Los autores del presente trabajo declaran no
tener ningn conflicto de inters.
Contribucin de los autores:
falta, no se ha considerado en el articulo
Financiamiento: Autofinanciado.
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Author's addresses: Dra. Sara Ortigoza Gutirrez. Facultad de Bioanlisis, Universidad Veracruzana, Veracruz, Mxico. Telfono: +5212291263307 Correo
electrnico: sortigoza@uv.mx, saryorti17@hotmail.com

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