Tecnolgico nacional de Mxico

INSTITUTO TECNOLOGICO DE LERMA

Ingeniera en acuacultura.
7 semestres

Sanidad Acucola
Unidad 2
Investigacin
Tcnicas de la investigacin sanitaria

Docente: ING. Rodrigo Ral Garca Torcuato

Alumno: Jonathan del Jesus Sanchez Lopez

Matricula: 141010085

Campeche, San Francisco de Campeche a 8 de

septiembre del 2017

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 ndice
Introduccin ........................................................................................................................................ 3

2.4. Anamnesis. ................................................................................................................................... 4

2.5. Tcnicas bacteriolgicas. ............................................................................................................. 4

2.6. Tcnicas histopatolgicas ............................................................................................................. 9

Fijacin de las muestras o cambio de fijador .................................................................................. 9

Preparacin de las muestras para su procesamiento. ..................................................................... 10

Deshidratacin e infiltracin de los tejidos. .................................................................................. 10

Corte de los tejidos ........................................................................................................................ 11

Conclusin......................................................................................................................................... 12

Bibliografa ....................................................................................................................................... 12

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 Introduccin
Los peces, al igual que todos los animales, son susceptibles a las enfermedades, dichos
padecimientos se presentan tanto en la produccin natural (ros, arroyos, lagos, etc) como en
la explotacin en cautiverio (piscigranjas). Las enfermedades tienen mayor incidencia en la
piscicultura que en las cuencas hdricas naturales, a consecuencia de la densidad a que son
sometidos los peces en la produccin. Es bien sabido que las enfermedades generan prdidas
econmicas importantes a los productores de peces, siendo responsables de mortalidades
masivas en la explotacin, ms aun considerando las fases de cra y alevinaje. Es por dicho
motivo que, dentro de la tecnologa de cultivo, la sanidad acucola ocupa un lugar
preponderante debido a la necesidad que existe de poner en prctica los procedimientos de
prevencin y control de las enfermedades que potencialmente limitan la produccin.

Los padecimientos en los peces se generan a consecuencia de un amplio espectro de causas

que terminan, alterando el estado corporal y fisiolgico normal, manifestndose en una serie
de sntomas caractersticos de cada enfermedad. Los agentes patgenos, al igual que otras
causas originadas en un mal manejo del cultivo, son responsables de mortalidad En las
granjas pisccolas, las enfermedades en la mayora de los casos estn asociadas a prcticas
sub-ptimas que generan estrs en los organismos; ya sea de tipo nutricional, ambiental o
social (densidad de cultivo); es decir, malas prcticas de manejo.

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2.4. Anamnesis.
A los efectos de llevar a cabo la inspeccin ictiosanitaria de un criadero, piscifactora u otro
establecimiento pisccola, se hace necesario efectuar una seleccin sistemtica de los peces
y proceder a la elaboracin de un informe detallado sobre el comportamiento de los mismos
en el ambiente en estudio, o sea: preparar una historia clnica detallada en la cual han de
anotarse todos los datos bsicos de posible inters al Ictiopatlogo. Para ello, es conveniente
utilizar un formulario nico, tal como se detalla en la table.

Con el propsito de permitir que el Inspector Ictiosanitario pueda efectuar un diagnstico

fidedigno frente a cualquier problema ictiopatolgico que se presente en el establecimiento
pisccola y sobre todo en relacin a las enfermedades infecto-contagiosas incluidas en la
Convencin Internacional FAO/OIE para Controlar la Propagacin de las Principales
Enfermedades Transmisibles de los Peces, es de fundamental importancia
completar in toto el formulario anamnsico, y remitirlo junto con las muestras al laboratorio
ictiopatolgico.

2.5. Tcnicas bacteriolgicas.

Con el fin de lograr un diagnstico confirmativo de las enfermedades bacterianas de los

salmnidos, es imprescindible que el agente etiolgico correspondiente sea aislado e

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identificado en el laboratorio, siendo la nica excepcin a esta regla la enfermedad bacteriana
del rin en donde el diagnstico se fundamenta en un examen de un extendido del rin y/o
de otros rganos para poner de manifiesto la presencia de numerosos diplobcilos Gram
positivos.

Se permite solamente el uso de peces vivos o moribundos, dado que al morirse los peces
stos son rpidamente invadidos por organismos saprofticos presentes en el agua y sobre la
superficie de la piel, y de esa manera se complica o se dificulta el diagnstico. El primer paso
es el de hacer un examen macroscpico del pez para detectar cualquier lesin, abceso, o
fornculo. A partir de esas anormalidades se preparan extendidos los cuales se examinan
microscpicamente para detectar la presencia de mixobacterias, bacterias mviles o
inmviles, etc. El rea de la superficie de la lesin se cauteriza cuidadosamente mediante el
uso de un cuchillo o bistur caliente, y el material se toma a partir del tejido con una tasa de
platino flameada para su posterior siembra en el medio de cultivo. En casos en los cuales no
se detecta la presencia de lesiones externas, la superficie del pez se desinfecta
cuidadosamente con un trozo de algodn empapado en un producto aprobado en base a yodo
orgnico, y una vez seca la superficie (aproximadamente un minuto) se procede a abrir la
cavidad abdominal del pez con instrumentos esterilizados para exponer rganos
internos in situ. El material para los cultivos se toma con una tasa de platino flameada de los
rganos internos, y especialmente del rin, bazo, e hgado.

Los siguientes procedimientos representan las tcnicas mnimas aceptables para fines del
diagnstico bacteriolgico de enfermedades de salmnidos y deben ser utilizados para toda
muestra tomada a partir de lotes y/o poblaciones en los cuales se experimenta una apreciable
incidencia de seales clnicas anormales y/o mortalidades. En aquellas muestras procedentes
de lotes de peces aparentemente sanos, los mismos procedimientos pueden ser aplicados
solamente a peces cuya longitud estndar es de cuatro centmetros (4 cm) o ms.

A. Estriar material tomado aspticamente a partir del rin (al ser posible de reas con
un aspecto normal) en los siguientes medios de cultivo:
a. agar forunculosis (FA);
b. agar Cytophaga (CA);

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 c. agar tripticasa soya (TSA);
d. agar clera (CM);
e. agar Mueller-Hinton enriquecido con cocarboxilasa;

La composicin y modus operandi de la preparacin de los diferentes medios de

cultivo.

B. Preparar extendidos del mismo material, colorear segn el mtodo de Gram, y

examinar microscpicamente para detectar la presencia de bacterias. La presencia de
pequeos diplobcilos Gram positivos, a menudo en forma intracelular, constituye
evidencia presuntiva para el diagnstico preliminar de Renibacterium salmoninarum,
agente etiolgico de la enfermedad bacteriana del rin.
C. Las placas inoculadas se incuban a los 2025C durante diez (10) das, y se examinan
diariamente para detectar la presencia de colonias de microorganismos. Una placa
duplicada de agar Cytophaga se incuba a los 10C para detectar la presencia
de Cytophaga psychrophila.
D. Seleccionar colonias juveniles representativas de las placas de agar Cytophaga y
hacer extendidos de las mismas. Colorear segn el mtodo de Gram y examinar
microscpicamente. La presencia de bastones largos y delgados, Gram negativos, los
cuales estn dotados de un movimiento de deslizamiento, constituye evidencia para
el diagnstico presuntivo de casos de mixobacteriosis.
E. Seleccionar colonias juveniles representativas de las placas de agar forunculosis, agar
tripticasa soya y agar clera. Proceder a la identificacin preliminar de las bacterias
en base a los siguientes caracteres:
a. Si las clulas son Gram negativas, en forma de bastn, citocromoxidasa
positivas y mviles, el organismo posiblemente sea una especie de los
gneros Aeromonas, Pseudomonas o Vibrio.
b. Si el organismo se diferencia de los mencionados en el rengln anterior por
ser citocromoxidasa negativo, posiblemente se trata de Yersinia ruckeri,
agente etiolgico de la enfermedad de la boca roja.
c. Si el organismo se diferencia de los mencionados en los renglones (a) y (b)
arriba por ser inmvil y en la produccin de un pigmento marrn oscuro

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 hidrosoluble en placas de agar forunculosis y de agar tripticasa soya,
posiblemente sea Aeromonas salmonicida, agente etiolgico de la
forunculosis.
d. Si el organismo se desarrolla solamente en agar Mueller-Hinton enriquecido
con cocarboxilasa, y no en los dems medios de cultivo, y tiene forma de
bastn Gram negativo e inmvil, es casi seguro que se trata de Haemophilus
piscium, agente etiolgico de la enfermedad de la lcera.

Cualquier diagnstico presuntivo de la presencia de los agentes etiolgicos de

enfermedades bacterianas de los salmnidos de inters para la certificacin
ictiosanitaria debe ser confirmado en el laboratorio mediante la realizacin de las
pruebas bacteriolgicas, serolgicas y/o inmunolgicas correspondientes. Las
caractersticas ms importantes de estas bacterias ictiopatgenas. La identifican
taxonmica precisa de estas bacterias ha de efectuarse en base a sus caracteres
morfolgicos, bioqumicos y, cuando eso corresponde, inmuno-serolgicos.

Las principales tcnicas utilizadas en la identificacin de las bacterias asociadas con las ms
importantes enfermedades infecto-contagiosas de los peces son las que se detallan a
continuacin:

i. Prueba de movilidad: se remueve una colonia juvenil de la superficie de una placa del
medio de cultivo debidamente sembrado, y se efecta su emulsin en una gota de
agua sobre un portaobjeto; la suspensin bacteriana se cubre cuidadosamente con un
cubreobjeto, asegurando que no queden atrapadas burbujas de aire; la suspensin se
examina microscpicamente con un aumento de 40 y de 100; los organismos
mviles muestran un movimiento activo en el campo microscpico, el cual no debe
confundirse con el movimiento browniano; la presencia de bastones delgados y largos
que muestran un deslizamiento evidencia la presencia de mixobacterias en el material
en estudio.
ii. Coloracin de Gram: se prepara un extendido del material a ser examinado sobre un
portaobjeto, fijndolo por el calor; se agrega una solucin acuosa al 1% de violeta de
genciana durante treinta (30) segundos; se lava con agua y se agrega yodo de Lugol

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 durante treinta (30) segundos como mordiente; se elimina el yodo de Lugol y se lava
el extendido con agua; se agrega alcohol etlico al 95% hasta que el extendido est
decolorado, y se lava bien con agua; se contracolorea con fucsina de Ziehl diluida con
agua 1:10 durante treinta (30) segundos; se lava con agua, se seca con papel secante
o de filtro, y se examina microscpicamente usando un objetivo de inmersin en
aceite. Las bacterias Gram positivas se colorean de un azul purpurado profundo,
mientras que las bacterias Gram negativas se colorean de un rojo rosado. La fuscina
de Ziehl tiene la siguiente composicin:

fucsina bsica 300 mg

alcohol etlico 10,0 ml
fenol 5,0 g
agua destilada 95,0 ml

iii. Prueba de citocromoxidasa: se remueve una colonia juvenil de la superficie de una

placa de agar sembrada, y se transfiere la masa de bacterias al rea de prueba de una
tirita de papel impregnado con una solucin acuosa al 1% de clorhidrato de tetra-
metil-p-fenilenodiamina, rocindola cuidadosamente. La formacin de un color azul
profundo dentro de un perodo de sesenta (60) segundos se interpreta como una
reaccin positiva de citocromoxidasa.
iv. Prueba de oxidacin y fermentacin de la glucosa: se calientan dos (2) tubos de medio
O/F con glucosa al 1% para eliminar aire disuelto, y se dejan enfriar a la temperatura
ambiente. Cada tubo se inocula con un cultivo de la bacteria en investigacin. Uno
de los tubos inoculados se cubre con una mezcla de aceite mineral y parafina estril
para evitar la entrada de aire, hasta una profundidad no menor de 1 cm. Los dos tubos
se incuban a los 2025C durante cuarenta y ocho (48) horas. La formacin de una
coloracin amarillenta en uno o en ambos tubos indica la produccin de cido. La
presencia de cido en los dos tubos significa que la glucosa ha sido metabolizada por
va fermentativa, mientras que la presencia de cido en el tubo cuya superficie ha
estado en contacto con el aire, y no en el tubo cuya superficie ha sido cubierta con la
mezcla de aceite mineral y parafina estril, indica que la glucosa ha sido metabolizada
por va oxidativa. Si no ha habido cambio en el color azul de ninguno de los dos tubos,

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 eso indica que no ha tenido lugar reaccin alguna. Es importante detectar la presencia
de cido con gas o de cido sin gas en los tubos, dado que eso indica si la fermentacin
es aerognica o anaerognica respectivamente. Para ello se procede a la inoculacin
de agua peptonada con glucosa en un recipiente que contenga una campanita de
Durham. En casos donde se sospecha que el agente etiolgico aislado es un vibrio,
debe emplearse el agar clera para su diagnstico presuntivo.

2.6. Tcnicas histopatolgicas

Dependiendo del organismo y sus caractersticas morfolgicas se debe aplicar una tcnica de
sedacin o anestesia, fijacin y conservacin ms adecuada para evitar la sensacin de dolor
y estrs. Existen diferentes agentes o substancias narcticas, mtodos fsicos como el
aturdimiento elctrico, la hipotermia o por percusin, en la mayora de los casos, la muerte
sucede tan rpidamente que los cambios electro-microscpicos son inexistentes o
minsculos, sin embargo, debern respetarse las consideraciones ticas para el uso de
organismos acuticos (UAM, 2010). La gua de animales en experimentacin (US Public
Health Services, 1996) sugiere que el investigador debe considerar que los procedimientos
que causan dolor y estrs en los humanos son los mismos que causan dolor y estrs en los
animales.

Fijacin de las muestras o cambio de fijador

La fijacin es el proceso mediante el cual los elementos constitutivos de las clulas, y por
tanto de los tejidos, son fijados en su estado fsico y parcialmente en su estado qumico, lo
cual permite resistir el tratamiento sucesivo con diversos reactivos sin que ocurra prdida,
distorsin o descomposicin significativas. El objetivo es detener el proceso autoltico de las
clulas y conservarlas, lo mejor posible, en el estado en que se encontraban durante la vida.
Existen diversos fijadores, sus cualidades deben de ser consideradas, ya que la fijacin de las
muestras es el paso ms importante para la obtencin de buenos cortes histolgicos.

En trminos generales se recomienda para tinciones de rutina, que las muestras deben haber
sido fijadas con formalina al 10% (apndice) por 24 h para evitar su deterioro y porque est
solucin no endurece los tejidos. La formalina penetra 2 mm en 4 h y 10 mm en 24 h, por lo
que se recomienda que para una buena fijacin las muestras no excedan los 3 mm de espesor

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y que la muestra tenga la proporcin adecuada de formol (5 a 1). Una segunda opcin es el
uso del fijador de Davidson, el cual contiene cido actico, sin embargo, esta causa
descalcificacin y cierta hinchazn de los tejidos y no debe ser usado si se pretende analizar
la morfologa de las clulas rojas de la sangre.

Preparacin de las muestras para su procesamiento.

Las muestras fijadas son transferidas utilizando pinzas de diseccin a los casetes, esto debe
hacerse con mucho cuidado para no romper los tejidos. Tambin se debe cuidar de no
amontonar las muestras, estas deben quedar con buen espacio entre ellas como se muestra en
la figura.

Deshidratacin e infiltracin de los tejidos.

El objetivo de los siguientes pasos es proveer a los tejidos con una matriz que les de soporte
durante el corte. Los tejidos son deshidratados con alcoholes de diferente concentracin, y
aclarados (se hacen translucidos) para su mejor observacin bajo el microscopio una vez
teidos. Para la deshidratacin, aclarado e infiltrado de los tejidos se utiliza un procesador de
tejidos marca Leica modelo TP1020 o similar.

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Las muestras se pasan por una serie de mezclas de alcohol/agua, para acabar solo en alcohol.
Posteriormente se pasan por un aclarador, que es el Xileno o algn otro substituto, para
finalmente ser incluidos en parafina derretida. El colado de bloques se realiza en un centro
de inclusin de Leica modelo EG1140H o similar acoplado a una placa de enfriamiento
(Leica modelo EG1140C) para que la parafina solidifique.

Corte de los tejidos

Una vez que los bloques de parafina se han endurecido, estos pueden ser cortados con un
micrtomo (Fig. 5). El tcnico debe asegurarse que la cuchilla este en buen estado y bien
afilada antes de comenzar el proceso. Los tejidos deben ser orientados en el bloque respecto
a la cuchilla del microtomo para no desgarrar los tejidos. Los cortes se realizan en series de
3, de 5 a 9 m los cuales se observan como listones, que flotan sobre agua.

Los cortes obtenidos y que se encuentran en el bao de flotacin o en el STT son levantados
con ayuda de un portaobjetos en el cual permanecern por el resto del procedimiento. El corte
deber colocarse de manera centrada cuidando que el portaobjetos lo cubra adecuadamente,
si el corte quedo mal orientado este se puede mover con ayuda de un pincel fino o de unas
pinzas, teniendo cuidado de no daarlo.

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Conclusin
En la recopilacin de informaciones es importante elaborar un historial lo ms completo
posible de la finca y de la produccin, ya que esto nos ser de mucha ayuda para poder
identificar cual es el problema, por lo que el encargado o propietario de la granja debera
contar con una bitcora o libro de registro donde anote todas las actividades fuera de rutina,
situaciones anmalas (descensos bruscos de temperatura, lluvias prolongadas, floraciones de
algas anormales, datos del clima, ingreso de nuevos organismos a la granja, comportamiento
anormal de los organismos, etc). Esto permitir, en conjunto con la descripcin de las
actividades de manejo, con un panorama claro de eventos ambientales o de rutina, que
pudiesen estar relacionados con la aparicin de una enfermedad.

Bibliografa
http://www.fao.org/3/a-as830s.pdf

http://www.parasitosypatogenos.com.ar/parasitosDePeces/Archivos/Tecnicas/Histopatologi
a.pdf

http://www.fao.org/docrep/field/003/AB469S/AB469S06.htm#ch6.1

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