TCNICAS

DE

TINCIN
TCNICAS DE TINCIN AcuaNatura

NDICE

1. Introduccin 3
2. Tipos de tinciones 4
2.1. Tincin de Gram 4
2.2. Tincin cido alcohol resistencia 5
2.3. Tincin de esporas 5
2.4. Tincin negativa 6
3. Precauciones 7

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1. Introduccin

El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de

ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la
clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste
entre la clula y el medio que la rodea es la utilizacin de colorantes. Estos pueden
emplearse tambin para localizar estructuras especficas en la clula o para
distinguir entre tipos diferentes de clulas.

Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de

teirlas, proceso llamado fijacin. Para las bacterias la fijacin por el calos es lo
ms corriente, aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como
formaldehdo, cidos y alcoholes. Despus de la fijacin se realiza habitualmente en
clulas que han sido secadas sobre un portaobjetos, tratando despus ste con el
agente fijador y siguiendo inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin
produce generalmente el encogimiento de las clulas, la tincin, por el contrario,
hace que las clulas aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que
las medidas de las clulas que han sido fijadas o teidas no pueden realizarse con
mucha precisin.

La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad
especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia
son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con
los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos
nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el azul
de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas
cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares
cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la
eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias
liposolubles. Los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipdicos
de la clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de las gotculas o
depsitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudn.

Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada
con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se
denomina mordiente. Un mordiente habitual es el cido tnico. El mordiente se
combina con un constituyente celular y lo altera de modo que ahora s podr atacar
el colorante.

Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopia

son suficientes los procedimientos simples de tincin. El azul de metileno es un
buen colorante simple que acta sobre todas las clulas bacterianas rpidamente y
que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es
especialmente til para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales,
puesto que la mayor parte del material no celular no se tie.

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2. Tipos de tinciones

2.1. Tincin de Gram

Tambin puede utilizarse a menudo un mtodo que no tie igualmente todas las
clulas, un proceso denominado tincin diferencial. La tincin de este tipo ms
extensamente utilizada es la tincin de Gram, denominada as por el bacterilogo
dans Hans Christian Gram, quien la desarrollo. Sobre la base de su reaccin a la
tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y
gramnegativas.

Debido a su importancia en taxonoma bacteriana y a que indica diferencias

fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aqu con
cierto detalle la tincin de Gram. Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos
se tien primero con una solucin de cristal violeta (otros colorantes bsicos no son
tan efectivos) y son lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este
estado todas las clulas, tanto las gramnegativas como las grampositivas, estn
teidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo (I2)
yoduro potsico (KI). El ingrediente activo es aqu el yodo, el yoduro potsico
simplemente hace soluble el yodo en agua. El yodo entra en las clulas y forma un
complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las clulas
grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situacin. Se
lleva a cabo despus de la decoloracin, usando bien alcohol o bien acetona,
sustancias en las que es soluble el complejo yodo cristal violeta. Algunos
organismos (grampositivos) no se decoloran mientras que otros (gramnegativos) lo
hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas est, por lo tanto, en la
resistencia a la decoloracin. Despus de la decoloracin las clulas grampositivas
son todava azules, pero las gramnegativas son incoloras. Para poner de manifiesto
las clulas gramnegativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es
un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica. Despus de la
coloracin de contraste las clulas gramnegativas son rojas mientras que las
grampositivas permanecen azules.

Figura 13: La tincin de Gram.

Deben destacarse dos aspectos cruciales de la tincin de Gram:

1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento de yodo. El

yodo por s solo tiene poca afinidad con las clulas.
2) La decoloracin debe realizarse con poco agua para evitar que pierdan la
tincin las clulas grampositivas. El proceso de decoloracin debe ser corto y
es esencial un clculo preciso del tiempo para obtener resultados
satisfactorios.

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Finalmente, el carcter de grampositivo no es siempre un fenmeno del todo o

nada. Algunos organismos son ms grampositivos que otros y algunos son
gramvariables, es decir, unas veces grampositivos y otras gramnegativos. La
tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el laboratorio
bacteriolgico.

2.2. Tincin cido alcohol resistencia

Esta tincin sirve principalmente para clasificar micobacterias y actinomicetos, que

tienen un alto contenido en lpidos y en cidos miclicos y que no pueden ser
calificadas por la tincin de Gram. Para empezar se hecha sobre el portaobjetos una
mezcla de fucsina fenol, en la que la fucsina hace de colorante rosa y el fenol de
mordiente. Las clulas se tien de rosa, tanto las cido alcohol sensibles como las
resistentes. Despus se usa un decolorante orgnico que hace que las bacterias
cido alcohol sensibles se decoloren mientras que las cido alcohol resistentes
se quedan rosa. Como en la tincin de Gram se utiliza un colorante de contraste
que en este caso es el azul de metileno que tie las clulas cido alcohol
sensibles de color azul quedando las clulas cido alcohol resistentes de color
rosa.

Figura 14: La tincin cido alcohol resistencia.

2.3. Tincin de esporas

Se utiliza para teir las estructuras de resistencia llamadas endosporas bacterianas.

Sobre el portaobjetos con la preparacin se echa verde malaquita que tie las
clulas de verde. Luego se lava con agua destilada con lo que las clulas se quedan
incoloras y las endosporas permanecen verde. Finalmente se usa la safranina para
obtener bacterias de color rosa mientras que las endosporas continan con su color
verde del verde malaquita.

Figura 15: La tincin de esporas.

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2.4. Tincin negativa

Es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se dejan sin teir pero
se colorea un cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de
las clulas. La sustancia utilizada para la tincin negativa es un material opaco que
no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las
clulas, tal como la tinta china (que es una suspensin de partculas de carbono
coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tincin negativa
es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas en microscopia
ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la presencia de cpsulas alrededor
de las clulas bacterianas.

Figura 16: La tincin negativa, bacterifago T4.

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3. Precauciones

Se dispone de otras tcnicas de tincin que pueden utilizarse para revelar la

presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, paredes
celulares, centros de actividad respiratoria, etc. Los mtodos de tincin son de gran
utilidad, pero deben usarse siempre con precaucin ya que pueden conducir a
errores. Las molculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados
que parecen estructuras celulares autnticas, pero que son formaciones
completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se
denominan artefactos y deben tomarse muchas precauciones para tener la
seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una
estructura realmente existente.

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