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FORMAS DE OBTENCIN DE LA INVERTASA:

Generalidades

Produccin de enzimas

Orgenes y caractersticas de las enzimas

Las enzimas comerciales utilizadas por la industria pueden surgir de fuentes animales, vegetales o
microbianas. La amilasa de la malta, las proteasas, la ficina y la bromelna proceden de vegetales,
mientras que las proteasas, la amilasa, las lipasas pancreticas, la pepsina y la renina de la mucosa
intestinal, etc. Hoy en da, los microorganismos se han convertido en la principal fuente de
enzimas comerciales. Las enzimas son muy importantes en la industria de la transformacin de
alimentos en la produccin de ingredientes y en la modificacin de la textura. Las ventajas de
emplear enzimas microbianas en procesos industriales son debidas a ventajas de usar enzimas
microbianas en procesos industriales son debidas a (1) la existencia de diferentes tipos de
actividad enzimtica, (2) la rapidez y estabilidad de produccin mediante un proceso barato de
fermentacin microbiana, reproducible y seguro, y (3) las mejoras en cuanto a rendimiento se
obtienen mucho ms fcilmente mediante ingeniera gentica o de protenas que por medio de la
mejora de cultivo de vegetales o la cra de animales. La capacidad de los microorganismos para
producir enzimas que sean estables y activas en condiciones extremas de pH y temperatura puede
ser la responsable de las mejoras observadas en rendimientos y parmetros econmicos de ciertos
procesos industriales.

Antes de elegir el microorganismo a partir del cual va a obtenerse una determinada enzima han de
considerarse varios aspectos:

La cepa debe ser capaz de producir altas cantidades de enzima en el tiempo de


fermentacin ms corto posible.
Si es posible, deberan utilizarse enzimas extracelulares porque son ms fciles de producir
y de aislar, mientras que las enzimas intracelulares deben atravesar un proceso de
purificacin caro en la mayora de ocasiones.
Se prefiere utilizar microorganismos de calidad alimentaria (GRAS) pues no produce
sustancias txicas y ello facilitar su aprobacin por el organismo regulador pertinente.
Una cepa de produccin debera crecer en un medio barato que contenga sustratos
econmicos, ya que los costes de las materias primas constituyen los costes principales de
la fermentacin

Por estos aspectos la mayora de las enzimas de uso alimentario son producidas por especies de
Bacillus y Aspergillus, que son capaces de secretar enzimas y crecer en medios baratos. Las
enzimas se venden en base a su actividad ms que por su peso o volumen, de modo que es crucial
importancia mantener la estabilidad de la preparacin de la enzima durante el almacenamiento.
Las enzimas de uso industrial, excepto las utilizadas en las industrias de produccin de
aminocidos y antibiticos, rara vez son puras, pero es necesario que las impurezas presentes no
interfieran con la actividad de la enzima. Aunque las enzimas entran en contacto con los
alimentos, la mayor parte de estos catalizadores son inactivados despus de realizar su funcin
durante los procesos de cocinado, horneado o pasteurizacin.
Procesos de fermentacin

Para producir enzimas microbianas se usan cultivos tanto en superficie (slidos) como sumergidos
(lquidos). El cultivo de los microorganismos se realiza sobre la superficie de un medio slido,
como por ejemplo sobre salvado de trigo, con un elevado contenido en nutrientes que incluye
minerales y sales. Esta tcnica todava se usa en la produccin de amilasa, proteasa y lipasas de
especies de Aspergillus y Mucor, as como la pectinasa y la celulasa de especies de Aspergillus y
Penicillium. El cultivo de los hongos se realiza en un proceso de placas, en el que el sustrato se
vuelca en forma de capa fina en salas de incubacin, o en el proceso de tambor, en tambores
horizontales rotatorios. Tras la siembra de los hongos de esporas, se extrae el micelio con una
solucin acuosa o salina en un circuito en contracorriente, y la solucin concentrada en enzima se
precipita. En este proceso la mayor dificultad radica en los elevados de manipulacin y control de
la contaminacin, temperatura, humedad y aireacin.

Actualmente los mtodos de cultivo sumergido que emplean fermentadores son los que dominan
la produccin de enzimas, ya que presentan menos riesgo de contaminacin y ofrecen menores
costes de manipulacin y mayores rendimientos. El cultivo sumergido normalmente se realiza en
un tanque con agitacin mecnica con una capacidad entre 10.000 y 100.000 litros y suele operar
de manera discontinua. Dependiendo de la enzima y del microorganismo empleado, la porcin
principal de fermentacin, especialmente para enzimas extracelulares, viene a durar entre 30 y
150 horas.

Aislamiento y purificacin de enzimas

En el caso de enzimas extracelulares, la mayor parte de la enzima se encuentra el sobrenadante


del cultivo, de modo que los mtodos de recuperacin suelen ser operaciones unitarias de
centrifugacin, o filtracin, o evaporacin a vaco y precipitacin de las protenas. Para recuperar
enzimas intracelulares, que estn concentradas en el interior de la biomasa, deben utilizarse
mtodos fsicos y mecnicos para desintegrar las paredes celulares intactas. Se puede utilizar la
autlisis, pero a escala industrial se prefieren mtodos fsicos como el homogeneizador a alta
presin o el molino de agitacin de bolas. Una vez rotas las clulas, la enzima puede purificarse
como en el caso de las enzimas extracelulares; pero normalmente el proceso es ms difcil por la
presencia de restos celulares y cidos nucleicos procedentes de clulas rotas. Las protenas
pueden precipitarse con sulfato amnico o sulfato sdico. Cuando se trata de enzimas
termorresistentes, pueden desnaturalizarse las protenas a elevadas temperaturas, centrifugarse y
tomar el sobrenadante pues la protena termorresistente se habr mantenido soluble. A escala
industrial los principales agentes precipitantes son solventes orgnicos como los alcoholes (etanol,
metanol, isoprenol). Tambin se han utilizado varios polmeros como agentes precipitantes (por
ej., el polietilenglicol, polietilenimina).

Los cidos nucleicos confieren una alta viscosidad a la solucin de enzimas e interfieren en el
fraccionamiento de protenas y en las separaciones cromatogrficas; por ello es deseable eliminar
estos componentes antes de intentar la purificacin de enzimas intracelulares. Las sales de
magnesio, el sulfato de estreptomicina, el sulfato de protamina y el polietilenimina son algunos de
los compuestos utilizados como precipitantes de cidos nucleicos. Se pueden emplear la
ultrafiltracin para concentrar la solucin enzimtica antes de la evaporacin al vaco, pero las
membranas se ocluyen fcilmente con precipitados. Existen muchos procedimientos
cromatogrficos y de particin para una posterior purificacin, pero pocas enzimas industriales se
someten a purificacin cromatogrfica. Dependiendo de la termoestabilidad de la enzima, el
precipitado puede deshidratarse por liofilizacin, por desecacin al vaco, o por atomizacin.
Durante la deshidratacin, se aaden estabilizantes como azcares, sustratos de la enzima,
cofactores o agentes reductores para estabilizar la enzima.

Cultivo microbiano

Propagacin

Fermentacin

Separacin

Productos extracelulares Productos intracelulares


(biomasa celular)
Evaporacin a vaco o
Solubilizacin o
ultrafiltracin
desintegracin
Concentracin de la enzima Separacin (lquido/ slido)

-NaSO4
(NH4)2SO4

Precipitacin Concentracin Restos


de la enzima celulares

Filtro prensa Precipitacin

Estabilizantes en lquido

Secado a vaco o por atomizacin Purificacin y estabilizacin

Envasado Secado

Envasado
Pasos en la purificacin de una enzima

Centrifugacin o tcnicas de Remocin de restos


Purificacin inicial
filtracin celulares y cidos
nucleicos
Separacin de slidos y
lquidos
Concentracin Precipitacin:
Remocin de
Sulfato de amonio contaminantes
Solventes orgnicos orgnicos e inorgnicos
Polmeros orgnicos

Tcnicas de membrana

Dilisis
Ultrafiltracin

Final purificacin Mtodos cromatogrficos Alta purificacin y


separacin
Intercambio inico
Interaccin
hidrofbica

Prueba de pureza Espectrofotometra, electroforesis, espectrometra de masas, etc.

Obtencin de la invertasa por Aspergillus

Los hongos filamentosos sintetizan y secretan en grandes cantidades slo las enzimas hidrolasas
necesarias para degradar algunos componentes del medio en el cual se desarrollan. De acuerdo
con Pel et al. (2007) citado por Veana et al. (2011), A. niger secreta el 77% de enzimas al medio de
cultivo, seguido de A.oryzae, A.nidulans y A. fumigatus. El mecanismo de induccin de invertasa de
A.niger es diferente al de las levaduras, e las cuales la sntesis de la enzima es constitutiva y los
niveles de secrecin de la enzima al medio de cultivo son muy bajos en comparacin con los nivles
que secreta A.niger. Por lo cual a continuacin se presenta el mecanismo de regulacin de sntesis
de invertasa de ese microorganismo.

Rubio & Navarro (2006) citados por Veana et al. (2011) describen un mecanismo de regulacin de
la sntesis de la enzima A.niger, en el cual existe interaccin de molculas de sacarosa con el
receptor de la membrana celular generando seales qumicas que podran ser trasladadas y
amplificadas por monofosfato de adenina cclico (cAMP) en el ncleo celular comenzando la
induccin de la sntesis de invertasa a nivel de ADN. El ARNm podra trasladar la informacin de la
sntesis de invertasa a los ribosomas, para despus ser sintetizada y secretada al espacio
periplsmico, o bien en la pared celular. La secrecin de protenas por A.niger involucra transporte
va retculo endoplsmico, aparato de Golgi y vesculas de la membrana celular (Pel et al., 2007).

Aprovechamiento de residuos agroindustriales parala produccin de invertasa

Actualmente se han empleado residuos agroindustriales como sustratos en fermentacin en


estado slido y en cultivo sumergido, para la obtencin de enzimas de inters biotecnolgico.
Ashokkumar et al. (2001) citado por Veana et al. (2011) emplea el uso de bagazo de caa de
azcar como soporte para la fermentacin en estado slido para la optimizacin de la produccin
de invertasa por Aspergilllus niger, se obtuvo una actividad enzimtica de 10735 U/l.

As mismo,Vargas et al. (2004) citado por Veana et al. (2011) evaluaron el efecto del ultrasonido
sobe la produccin de invertasa de A.niger, con el aprovechamiento de melaza de caa de azcar
como sustrato. El objetivo de usar el ultrasonido fue la extraccin y liberacin de la enzima
intracelular.
Ms tarde Rajoka & Yasmeen (2005) citados por Veana et al. (2011) emplearon una cepa mutante
de A. niger NIA 280 para la obtencin de la enzima, empelando mazorcas de maz, arroz pulido,
cscara del mismo y salvado de trigo. Se obtuvo que el mejor residuo lignocelulsico es el salvado
de trigo, alcanzando una productividad de 516 U/l.l, cifra que supera 2 veces la productividad que
se obtiene con la cepa nativa.

Recientemente Reddy et al. (2010) citados por Veana et al. (2011) emplearon residuos
agroindusriales para la expresin de invertasa de A. niger, dentro de estos reisuos se encuentran
el salvado de trigo y arroz, hojas y cscaras de pltano, achicoria, aserrn y melaza de caa de
azcar.

Por otra parte, Uma etl al. (2010) utilizaron cscaras de naranja, pia y granda como sustratos,
para la produccin de invertasa de A. flavus. Se encontr que la mejor actividad enzimtica
obtenida por la cepa es de 25,8 U/ml empleando un 3% de inculo en las 96 horas de cultivo.

Purificacin de la enzima

La purificacin de protenas es en s la separacin de las protenas de inters de una mezcla


compleja para su posterior caracterizacin. Existen diferentes mtodos para separar y purificar las
enzimas de la mezcla de restos celulares en lo que se encuentra.

La precipitacin selectiva es un procedimiento que induce un cambio en la solucin para que la


protena de inters o los contaminantes alcancen su punto isoelctrico ( el valor de pH en el que la
sustancia tiene una carga neta de cero) y precipiten. Esta tcnica implica el uso de sales, solventes
orgnicos y polmeros, considerndose ms empleada la precipitacin salina con sulfato de
amonio. La alta solubilidad de la sal causa una competencia por el agua de la solucin, causando
que las protenas menos hidrfilas pierdan agua en su entorno y precipiten en orden de
solubilidad. (Prado-Barragn et al., 1999)

As mismo el empleo de tcnicas cromatogrficas ha beneficiado la purificacin de enzimas.


Dentro de las tcnicas empleadas se encuentra la filtracin en gel, tambin conocida como
cromatografa en gel y cromatografa de exclusin molecular (Molecular Exclusion
Chromatography, MEC). Este tipo de cromatografa realiza separaciones ms discriminatorias
basadas en el tamao. Las columnas empleadas estn rellenas de esferas porosas compuestas de
un polmero insoluble pero altamente hidratado (dextrano, agarosa o poliacrilamida). Las
molculas pequeas se encapsulan y se distribuyen entre las esferas, permitiendo la fluidez de las
molculas grandes a travs de la columna, las cuales son de inters.

Por otro lado, se encuentra la cromaografa de intercambio inico (Exchange Ion Chromatography,
EIC), tcnica ms usada en la separacin de protenas en base a su carga neta positiva a pH 7, sta
se unir normalmente a una columna de esferas que contengan grupos carboxilos, mientras que
una protena con carga neta negativa no lo har. Las protenas cargadas positivamente se pueden
separar en columnas de carboximetil-celulosa cargadas negativamente. Mientras que las protenas
cargadas negativamente se pueden separar en columnas de dietilaminoetil-celulosa cargadas
positivamente (Berg et al., 2008).

Un tipo de cromatografa lquida es FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography). La fase mvil
consiste en un lquido que arrastra a la muestra a travs de una fase estacionaria que suele ser
una resina compuesta de perlas de agarosa reticulada con diferentes ligandos de superficie en
funcin de la meta de purificacin (Prado-Barragn et al., 1999).

Las columnas que se utilizan en FPLC pueden separar macromolculas en funcin del tamao,
distribucin de la carga, hidrofobicidad o en fase inversa (Verbeke & Verbruggen, 1996).

Se ha realizado diversos estudios sobre la produccin y purificacin de invertasa por hongos


filamentosos especficamente del gnero Aspergillus. A continuacin, se muestran los pasos de
purificacin de invertasa segn diversos autores.