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UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA

MOLINA

ESCUELA DE POST GRADO

ESPECIALIDA DE TECNOLOGA DE ALIMENTOS

TEMA : OBTENCIN DE AISLADO PROTEICO DE SOYA

CURSO : TECNOLOGA AVANZADA DE ALIMENTOS.

PROFESOR : msc Ing. Eduardo morales soriano.

ALUMNOS : ana v., Escalante varona.

KARINA M., AGUADO Huamani.

CSAR, HUAMAN SALAZAR.

NOVIEMBRE del 2010

I.- INTRODUCCION

Desde el punto de vista biolgico, las protenas animales son las mejores, pero son
escasas y de costo elevado. Por eso muchas investigaciones tratan de aprovechar al
mximo las protenas vegetales. Las protenas vegetales, generalmente son deficientes
en uno o varios aminocidos esenciales, pero esta deficiencia puede ser evitada con el
mejoramiento gentico de las plantas, la posibilidad de combinar diferentes protenas
vegetales o su enriquecimiento mediante agregados de productos proteicos poco
explotados hasta la fecha, o bien, incorporando aminocidos sintticos como la lisina y
metionina (Ferrer et al., 1977; citado por Guerrero 1989).

Estas protenas vegetales se pueden obtener en la forma de concentrados proteicos o


aislados, los cuales pueden estar dirigidos ya sea a aumentar el nivel de protenas en
productos alimenticios bsicos o como reemplazo total o parcial de las protenas
animales como ingredientes en alimentos ( Rodrguez, 1981; citado por Guerrero 1989).

Las protenas vegetales tienen muchas caractersticas fsicas deseables, tales como:
capacidad de retencin de agua, de grasa, emulsificante, espesante y propiedades de
formacin de espuma, de pelcula y de masa. Adems estos aislados y concentrados
proteicos contienen solamente pequeas cantidades de carbohidratos, grasas y cenizas
(Bressani, 1968; citado por Guerrero 1989).

Las fuentes usuales de aislado proteico de origen vegetal son las oleaginosas, las cuales
tienen un alto contenido proteico (Anson, 1962; citado por Guerrero 1989). Sin embargo
en trminos de economa, sostenibilidad y nutricin; la soya es la fuente ms eficaz, que
combina un excelente valor nutritivo con una amplia gama de propiedades funcionales.
La protena de soya posee una elevada biodisponibilidad y suministra un rango amplio y
completo de aminocidos esenciales, incluyendo la lisina que con mucha frecuencia es el
aminocido limitante (Hoogenkamp, 2005).

La semilla o grano comprende tres partes principales, la envoltura, los cotiledones y el


hipocotilo, cuyas proporciones respectivas y composiciones medias, se indican en el
cuadro1. La composicin de los granos de soya, por seleccin gentica se logr obtener
variedades ms o menos ricas en protenas (40 45%) y lipidos(18-20%). (Cheftel et
al.1989).
Cuadro 1. Composicin fsico qumica del grano de Soya.
% Composicin (% P/P seco)
ponderal en
Protenas Lpidos Glcidos Cenizas
la semilla
(N x 6,25) (incluye
fibras)
Grano entero 100 40 20 35 4,9
Cotiledones 90 43 23 29 5,0
Envoltura 8 8,8 1 86 4,3
Hipocotilo 2 41 11 43 4,4
Fuente: Cheftel et al. (1989).

Cuadro 2. Aminocidos en protenas comerciales de soya(gramos de aminocidos por


100 g de protena)

Soja
Aminocidos Harina
Aislados
desgrasada
Isoleucina 4.63 4.8
Leucina 7.7 7.8
Lisina 6.2 6.0
Metionina 1.3 1.0
Cisitina 1.2 1.0
Fenilalanina 5.3 5.5
Treonina 4.2 3.7
Triptfano 1.4 1.3
Valina 4.9 4.8
Fuente: Adaptado de Badui (2006)

Son tres los tipos de productos, segn su contenido proteico, que se pueden obtener a
partir de la soya. Estos son: harina o grits de soya, concentrado proteico de soya y
aislado proteico de soya (Canales, 1982).

Cuando las escamas, hojuelas o lminas de soya son molidas para reducir su tamao, el
producto resultante se denomina harina de soya, siendo sus partculas lo suficientemente
finas como para pasar por un tamiz malla 100 (u.s.); o bien son grits, cuando el grosor de
las partculas es mayor. La harina de soya tiene un contenido proteico mnimo de 50% de
protena en b.s. (Canales, 1982).
Los concentrados de protena de soya son protenas derivadas de las lminas
desgrasadas de soya, obtenidas por extraccin con cido diluido (pH 4.5) se eliminan los
azcares solubles, nitrgeno proteico y otros componentes de bajo peso molecular y una
pequea cantidad de protena. Los concentrados proteicos de soya deben contener
mnimo 70% de protena en b.s. (Wolf, 1961; citado por Canales, 1982).

Es aislado proteico de soya es definido como la mejor fraccin proteica obtenida del frijol
de soya de alta calidad. La materia usada para la produccin de aislado proteico de soya
son las hojuelas de soya desgrasada o harina, la cual tiene una protena de alta
dispersibilidad. En el proceso de extraccin se humedecen las hojuelas de soya con una
cantidad apropiada de agua, controlando la temperatura, pH, tiempo y adems la relacin
slido lquido para obtener resultados mximos (Meyer, 1967; citado por Canales, 1982).
Los aislados proteicos de soya deben contener mnimo 90% de protena en b.s.
(Canales, 1982).

Cuadro 3: Composicin tpica de un Aislado de protena de soya.

Harina
COMPONENTE Sin desgrasar Desgrasada Aislado
Proteinas 41.5 53.0 90
Grasas 21.0 1.0 0.0
Humedad 5.0 5.0 4.7
Fibra cruda 2.1 2.9 0.2
Ceniza 5.2 6.0 3.8
ISN - - 85.0
ISN: Indice de solubilidad del nitrgeno
Fuente: Adaptado de Badui (2006)

Proteina
Las proteinas de la soya son una mezcla heterognea de globulinas (60 a 75%) del total y
de albuminas, con pesos moleculares muy variados, solubles en disoluciones salinas y en
agua, y precipitan en su punto isolelctrico, en el intervalo de 4.2 a 4.8 (Badui ,2006).

La solubilidad de las protenas de la soya en agua es fuertemente afectada por el pH,


como se muestra en la Figura 1. Casi el 85% del nitrgeno es soluble a pH 2 7 ( y a pH
11 puede solubilizarse hasta un 95%). Un perfil de solubilidad parecido se observasi se
utiliza una torta desengrasada de soya. Las globulinas, principales constituyentes
proteicos, son insolubles en una zona de pH (3.7 5.2) situada en torno de su punto
isoelctrico (pH 4.2 4.6), pero pueden solubilizarse progresivamente a esos mismos pH
por aumento de la fuerza inica (con NaCl, por ejemplo) (Cheftel et al. 1989).
Figura 1. Extraccin de la protena a diferente svalores de pH.

Fuente: Badui (1990)

La baja solubilidad a pH 4.2 4.6 se utiliza para preparar los aislados proteicos de soya
por precipitacin isoelctrica (Cheftel et, al. 1989).

Despues de la disolucin en agua o a un pH ligeramente alcalino, las protenas de soya


pueden separarse en varias fracciones por cromatrografa permeable de gel,
electroforesis, ultracentrfuga, etc. Cuando se utilizan esta ultima tecnica se separarn
cuatro fracciones cuyos coeficentes de sedimentacin S20, w (unidades Svedberg, a 20C,
en el agua son respectivamentes iguales a 2S, 7S, 11S y 15S. Las globulinas 11S y 7S
representan por si solas ms del 70% del las proteinas del grano de soya. La relacin
globulina 11S/globulina 7S esta comprendida entre 0.5 a 3, segn la variedad de soya.
(Cheftel et, al. 1989).

As la globulina 11S o glicinina de alto peso molecular y que de amnera indicidual es el


polipptido ms abundanteen la soiya,puesto que representa el 31% del total esta
constituida de 12 subunidades, 6 de carcter acido y 6 de carcter alcalino. Los pesos
moleculares de las subunidades son de 37200 y 22300 para las cidas y las bsicas
(Cheftel et, al. 1989) ( Badui 2006).
La fraccin 2S esta compuesta por polmeros de peso molecular bajo (8000-21500),
solubles en su punto isoelctrico y contiene los inhibidores de tripsina de Bowman-Birk y
de Kunitz ( Badui 2006).

La fraccin 7S esta basicamente integrada por cuatro protenas , dos de las cuales son
enzimas (-amilasa y lipoxigenasa), una es hemaglutininay la otra, la globulina 7S , a un
pH de 7.6 y una fuerza inica de 0.5, tiene un peso molecular de 186000 a 210000.
Mientras que la 15S no se ha estudiado tanto como oas anteriores, pero se supone que
puede ser un polmero de la 11S; sta es la fraccin de mayor peso molecular (Badui
2006).

Las fuerzas que hacen posible la formacin de geles son diversas y algunas influyen ms
en una fraccin protenica; la 11S y la 7S interaaccionan cuando se calientan y ayudan a
producir rpidamente ese estado de dispersin; sin embargo, en forma indicvidual, la 7S
establece geles por medio de puentes de hidrgeno, mientras que los provenientes de la
11S lo hacen gracias a la cracin de interacciones electrostticas con iones divalentes y
de enlaces disulfuro (Badui 2006).

Muchos de los usos de los productos de la soya estn basados en las propiedades
funcionales de las protenas de la soya. Estas caractersticas incluyen la propiedad de
estas protenas para espesar (viscosidad), emulsificar, formar geles, espumas, absorber
agua y/o grasa y crear estructuras texturizadas parecidas a la carne (Canales, 1982).

Uno de los mtodos para determinar protenas es el Mtodo de Biuret, que se basa en
la formacin de un complejo coloreado entre el Cu 2+ y los grupos NH de los enlaces
peptdicos en medio bsico. 1Cu 2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de
coloracin es directamente proporcional a la cantidad de protenas (enlaces
peptdicos) y la reaccin es bastante especfica, de manera que pocas sustancias
interfieren. La sensibilidad del mtodo es muy baja y slo se recomienda para la
cuantificacin de protenas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero)
(Fernndez; 2008).

En el presente trabajo se realizo lo obtencin del aislado proteico a partir de una fuente
vegetal, se determin la capacidad de retencin de agua de un aislado proteico de soya
y la cuantificacin de protenas por el mtodo de Biuret; con la finalidad de evaluar sus
propiedades funcionales importante para la aplicacin tecnolgica en la industria
alimentaria.

II. OBJETIVOS

Obtener aislado proteico a partir de una fuente vegetal.


Cuantificacin de protenas por el mtodo de Biuret.

III.- MATERIALES Y METODOS

3.1. Materiales, equipos e instrumentos

3.1.1. Materiales
Agua destilada
Harina de soya

3.1.2. Reactivos
Solucin de hidrxido de sodio 1 N
Solucin de cido clorhdrico 1 N
Reactivo de Biuret
Reactivo blanco de Biuret

3.1.3. Materiales y equipos


Beaker de 1 litro
Tubos de centrifuga
Placas petri
Embudo de vidrio
Papel filtro
Matraz 500ml
Centrfuga
Estufa
Potencimetro
Agitador magntico
Tubos
Tubos de centrifuga
Micropipeta
Pipeta de 5 ml
Baguetas
Centrifuga
Potencimetro
Vasos de precipitado

3.2. Metodologa experimental

A. Extraccin de Protenas

Se mezcl 50 g de harina de soya con 750ml de agua (1:15) y


homogenizar.
Se ajust lentamente el pH hasta 9 con hidrxido de sodio 1N, con
agitacin continua durante 40 minutos.
Se centrifug a 3000 rpm durante 15 minutos. Separar El
sobrenadante del residuo por filtracin (si fuera necesario).
Se ajust el pH del sobrenadante a 4,5 con cido clorhdrico 1 N,
con agitacin continua por 15 minutos.
Se centrifug a 3000rpm durante 15 min. Luego se separ el
sobrenadante y el precipitado. Se transfiri el precipitado a una
placa petri previamente pesada. Se coloc la placa en una estufa
(Temperatura = 50 C tiempo = 24hr.; hasta peso constante).
Finalmente, se guard el aislado proteico para los anlisis de
protena correspondientes.

En la Figura 2 se aprecia el flujo de operaciones que se sigui en laboratorio para realizar


la extraccin del aislado proteico de soya.

Figura 2. Flujo de Operaciones para la obtencin del Aislado Proteico


de Soya
Harina de soya

50g.harina de soya +
750ml Agua destilada
(1:15)
Hidratacin Homogenizar.

Ajustar con NaOH-1N


PH = 9
Agitacin ( pH = 9) Agitacin x 40 min.

3000rpm x 15 min.
Centrifugar

Precipitado
Filtrar

Ajustar con HCl-1N


PH = 4.5
Agitacin ( pH = 4.5) Agitacin x 15 min.

Centrifugar 3000rpm x 15 min.

T = 50C
Secado
Tiempo = 24 hors.

Aislado

B. Determinacin de protena por el mtodo de BIURET

PROCEDIMIENTO

1. Se pipete 5 ml del reactivo de Biuret en una serie prueba de tubos de


ensayo y 5 ml del blanco de Biuret en una serie Blanco.
2. Se pipete 100ul de espcimen (protena extrada o protena estndar) en
cada tubo de la serie. Se mezcl bien con vortex o por inversin repetida
despus de cubrir los tubos con parafilm. Se prepar un blanco de
muestra, mediante la adicin de 100ul de agua a 5ml del reactivo de
Biuret.
3. Se incub los tubos a temperatura ambiente por 30 minutos o a 37C por
10 minutos.
4. Se fij la absorbancia en cero a 540nm con el blanco del reactivo de
Biuret. Se leyeron las absorbancias de la serie blanco, luego se leyeron
las absorbancias del blanco de muestra y la serie prueba.
5. Calcular de la siguiente manera:
a. Sustraer tanto los blancos de reactivo y el blanco de muestra de las
absorvancias (A) obtenidas para la serie prueba.

Aneta A prueba Ablancoreactivo Ablancomuestra

El blanco de muestra con el reactivo de Biuret deber leer 0.095


0.105 para un tubo de 1 cm paso de luz para el reactivo descrito.

6. Se reemplaz la absorvancia neta en la ecuacin obtenida de la curva


estndar de albmina.

IV.- RESULTADOS Y DISCUSIONES

El mtodo de extraccin realizado en el laboratorio, corresponde a una extraccin


negativa; ya que se elimin todo lo que no se necesitaba y al final fue quedando slo la
protena.

En la etapa de hidratacin y agitacin, se realiz la extraccin de la protena utilizando un


pH extremo de 9; ya que a este pH se solubiliza la protena. Segn Anson (1962), citado
por Guerrero (1989); uno de los mtodos ms utilizados consiste en aislar la protena por
tratamiento de la materia a pH alcalino, seguido por una precipitacin en su punto
isoelctrico. Asimismo, Borgeois y Le Roux (1986), mencionan que la solubilidad de la
protena vara con el pH, temperatura, fuerza inica y la constante dielctrica del
solvente; incrementndose sta al aumentar la fuerza inica, hasta llegar a un valor
ptimo.

Luego de la solubilizacin de la protena, existi una etapa de centrifugacin; ya que


segn Wilcke (1979), citado por Guerrero (1989); la centrifugacin ayuda a separar a la
protena de la fraccin insoluble compuesta por polisacridos y fibra cruda.

En la segunda etapa de agitacin, donde se ajust el pH a 4.5, se hizo precipitar a la


protena que se encontraba soluble en el primer sobrenadante; con el fin de obtener a la
protena pura y eliminar otras sustancias indeseables. Segn Wood et al. (1974), citado
por Guerrero (1989); menciona que las protenas pueden ser precipitadas selectivamente
manipulando el pH, la fuerza inica y la constante dielctrica del solvente. Los mtodos
preferidos son la precipitacin en el pH isoelctrico, puesto que implican menor riesgo de
desnaturalizacin proteica. Smith y Circle (1978), citados por Rodrguez (1981); a su vez
citado por Guerrero (1989); encontraron una solubilidad mnima de la protena de soya a
pH 4.2, correspondiendo al punto isoelctrico de la mayora de protenas. La precipitacin
isoelctrica es por lo tanto til para concentrar globulinas y para separarlas de los
constituyentes menores como azcares y sales, que son extradas de la harina junto con
las protenas.

Figura 3: Etapas de extraccin de aislado proteico de soya.


(a) (b) (c)
(a) Extraccin de proteina de soya a pH alcalino, (b) Proteina de soya centrifugada, luego de
precipitacin en el punto isoelctrico, (c) Aislado proteico de soya, antes del secado.

A continuacin, en el Cuadro 4, se observa el rendimiento en peso del aislado proteico de


soya, respecto a la materia prima inicial.

Cuadro 4: Rendimiento en peso del aislado proteico de soya.

Peso Peso Rdto. (%)


Rendimiento Inicia(gr) final(gr)
soya repet 1 50 18.86 37.72
soya repet 2 50 16.9404 33.88
Promedio 35.80

Como se observa en el Cuadro 4, el rendimiento en peso, respecto a la cantidad inicial de


harina; fue de 35.80%. Este resultado es un poco bajo comparado con el hallado por
Robles y Mora (s.a.), quienes obtuvieron rendimientos de 58.32% (para la harina
desgrasada con hexano) y 70.83% (para la harina desgrasada con etanol); utilizando el
mismo mtodo de extraccin que el realizado en prctica. Entonces, se puede suponer
que un desgrasado previo de la muestra mejora el rendimiento de extraccin, razn por la
cual nosotros obtuvimos un rendimiento menor; ya que no desgrasamos la harina de
soya.

A continuacin se presenta la curva estndar preparada con concentraciones conocidas


de albmina los cuales fueron comparados con la muestra inicial para determinar en ella
la concentracin de protena total.

Se utiliz albmina porque es la que ms se asemeja a la globulina , que es la proteina


encontrada en el aislado proteico de soya ( Meyer, 1966; citado por Canales, 1982).
Figura 2: Curva Estndar de Albmina.

Para determinar el contenido de proteina de la harina de soya, se extrajo una muestra de


la proteina que se solubiliz a pH 9 y sta se someti a la prueba de Biuret.
Este mtodo utiliza el reactivo de Biuret, el cual detecta la presencia de protenas,
pptidos cortos y otros compuestos con dos o ms enlaces peptdicos en sustancias de
composicin desconocida (Wikipedia, 2010).

Al realizar el anlisis por el mtodo de Biuret, se apreci un cambio de color de azul a un


color violeta-morado. Segn (FAO, 1997), la coloracin prpura se presenta cuando los
iones cpricos son complejados por los enlaces peptdicos a pH alcalino. El matiz del
color depende del tipo de protena y su intensidad depende del contenido de protena
presente.

La reaccin es bastante especfica, de manera que pocas sustancias interfieren. El


Hidrxido de Potasio no participa en la reaccin, pero proporciona el medio alcalino
necesario para que tenga lugar la reaccin (Fernndez y Galvn, 2008).

La sensibilidad del mtodo de Biuret es muy baja y slo se recomienda para la


cuantificacin de protenas en preparados muy concentrados (Fernndez y Galvn,
2008), es por ello que este mtodo es muy til para determinar proteina en aislados
proteicos.

De la prueba de Biuret se obtuvo el siguiente cuadro, con los resultados de la


absorbancia neta:
Cuadro 3: Absorbancia neta de la muestra por el mtodo de Biuret.

absorbancia
Muestra Blanco reactivo Prueba Blanco muestra
neta
soya
0.163 0.964 0.65 0.151
Repetto 1
soya
0.151 0.895 0.643 0.101
Repetto 2
Abs. Promedio 0.126

La absorbancia promedio obtenida para la muestra de soya fue de 0.126. Esta


absorvancia se reemplaz en la ecuacin correspondiente de la curva estndar de la
albmina, obteniendose un resultado de 25.833 g de albmina/ litro de solucin.

Luego, como no se sabe la concentracin de protena de la harina de soya utilizada; se


asumi que sta tena una concentracin de 50% de proteina, es decir 25g de proteina.
Entonces se realiz los siguientes clculos:

- Se multiplic el resultado obtenido en Biuret con la cantidad de agua que se utiliz para
hidratar los 50 g de harina de soya.

g
25.833 0.75 L 19.375 g de proteina
L

- Luego el resultado anterior se expres como rendimiento en peso de proteina extraido,


respecto a la cantidad de proteina en la materia prima.

19.375
Rendimiento de Proteina extraida (%) 100% 77.5%
25

Entonces se obtuvo que de un total de 25 g de proteina que contenia la harina de soya


inicial, se logr aislar 19.375 g de proteina, o en otras palabras el rendimiento proteico de
la extraccin fue de 77.5 %.

V. CONCLUSIONES y RECOMENDACIONES

- El rendimiento en peso de la proteina extraida, respecto a la cantidad de materia prima


inicial, fue de 35.83% .
- Usando el mtodo de Biuret, el rendimiento en peso de la proteina, respecto a la
cantidad de proteina contenida en la harina de soya (considerando que sta tena 50%
de proteina), fue de 77.5%.
- Se recomienda realizar un desgrasado previo de la materia prima, para obtener
mejores rendimientos.
- Se recomienda realizar el anlisis del contenido proteico del aislado obtenido, para
poder conocer el porcentaje de proteina que ste posee y el cual debera ser de un
mnimo de 90%.

VI. BIBLIOGRAFIA
Badui, S. 1990. Qumica de los Alimentos. Editorial Alhambra. 2da edicin,
Mxico
Badui, S. 2006. Qumica de los Alimentos. Editorial Pearson Educacin. 4ta
edicin, Mxico
CANALES, D. 1982. Elaboracin de Pastel de carne con protena aislada
de soya. Tesis para opt. Tit. Ing. Ind. Al. UNALM. Lima. Per
CHEFTEL, J. C. 1989. Proteinas alimentarias: Bioquimica, Propiedades
funcionales, Valor nutricional, Modificaciones qumicas. Editorial Acribia.
Zaragoza. Espaa.
FAO. 1997. Produccin y manejo de datos de composicin qumica de
alimentos em nutricin. Univ. de Chile. Pgina web disponible en:
http://www.fao.org/docrep/010/ah833s/AH833S00.htm#Contents
FERNNDEZ, E. y GALVN, A. 2008. Mtodos para la cuantificacin de
protenas. Prtica. Departamento de Bioqumica y Biologia Molecular.
Crdoba. Argentina.
GENTA, M y ALVAREZ, N. 2006. El Complejo Soja. Pgina web disponible
en: http://www.herrera.unt.edu.ar/revistacet/anteriores/Nro28/PDF/N28Ext01.pdf
GUERRERO, D. 1989. Obtencin de un aislado proteico a de germen de
quinua (Chenopodium quinoa Willd) desgrasado. Tesis para opt. Tit. Ing.
Ind. Al. UNALM. Lima. Per.
ROBLES, M. y MORA, R. 2007 . Influencia del Mtodo de Obtencin en las
Caractersticas Fisicoqumicas, y Estructurales de Aislados de Soya.
Escuela Nacional de Ciencias Biologicas. Colombia. Pgina web disponible
en: www.respyn.uanl.mx/especiales/2007/ee.../CNCA-2007-103.pdf .
WIKIPEDIA. 2010. Biuret. Pgina web disponible en:
http://es.wikipedia.org/wiki/Biuret .

VII. ANEXOS

Anexo 1. Produccin de Proteina Aislada de Soya


El procedimiento convencional para la produccin de PAS (ISP-en Ingls-)est
basado en la solubilizacin de la protena en un pH neutro o ligeramente alcalino,
precipitacin por acidificacin en la regin isoelctrica, cerca de pH 4.5. El
producto resultante es el APS (ISP) isoelctrico. Tiene baja solubilidad en agua.
Se pueden producir diferentes proteinatos resuspendiendo el PAS en agua,
neutralizndolo con diferentes bases y secando por atomizacin la solucin o
suspensin resultante. De acuerdo con la base utilizada para la neutralizacin se
producen proteinatos de sodio, potasio, amonio o calcio. Los primeros tres son
altamente solubles en agua y producen soluciones con propiedades de alta
viscosidad, espumado, formacin de geles y emulsificacin (Genta y Alvarez
2006).
El proteinato de calcio tiene baja solubilidad. Los PAS de baja solubilidad (inertes)
son usados en donde las formulas piden un alto nivel de incorporacin de protena
sin excesiva viscosidad u otras contribuciones funcionales. Debido a que el
secado en spray es el mtodo comn de secado en la produccin del PAS, la
forma fsica primaria del PAS en el mercado es la de polvos finos (Genta y Alvarez
2006).
Figura 2. Aislado de proteina de soja

Fuente : Genta y Alvarez (2006).