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Agrobiotecnologa.

Clase 22: Fitorremediacin

Alternativas actuales para eliminar contaminaciones de metales pesados

Transparencias 3-6

La contaminacin ambiental con metales pesados y radionucletidos es un serio


problema tanto para la salud humana como para la agricultura. La fitorremediacin es
una de las tecnologas emergentes que podr solucionar, al menos parcialmente, este
problema. Tanto la contaminacin de suelos como la de aguas ponen en riesgo la
salud y la calidad de vida humana. Por ejemplo, el nquel puede producir desde
irritacin en la piel hasta daos pulmonares, del sistema nervioso y de las mucosas, y
es adems un agente carcinognico. Por otro lado, el plomo puede producir anemia,
enfermedades del hgado y riones, dao cerebral y hasta la muerte. La transparencia
4 muestra los rangos de concentracin comnmente hallados y los lmites permitidos
para algunos contaminantes metlicos y para los radionucletidos ms importantes

La actividad industrial ha crecido enormemente desde los comienzos del siglo XX.
Este crecimiento fue acompaado con el aumento de desechos txicos, nocivos tanto
para el ambiente como para los organismos que en l habitan, incluyendo al hombre.
La necesidad de disminuir el impacto ambiental de los subproductos industriales ocupa
un lugar creciente en la agenda pblica. Paralelamente, comienza a divisarse un
nuevo mercado econmico, dirigido hacia el tratamiento de efluentes y
descontaminacin ambiental. La transparencia 5 presenta algunos datos referidos al
costo actual de los procesos de descontaminacin en Estados Unidos.

Existen diversas alternativas tecnolgicas para el tratamiento de suelos y aguas


contaminados, pero su alto costo hace que muchas de stas resulten poco factibles
desde el punto de vista econmico. Recientemente, se ha generado un gran inters en
utilizar especies vegetales capaces de crecer en suelos altamente contaminados en
tcnicas de biorremediacin (transparencia 6). Muchas de estas especies acumulan
las sustancias contaminantes en su parte area y esto permite utilizarlas como
extractores de bajo costo de una variada categora de sustancias txicas.

Fitorremediacin

Transparencias 7-24

Existe una abundante literatura sobre la remediacin de suelos y aguas mediante el


uso de plantas. Esta tecnologa, an emergente, se vuelve cada vez ms prometedora
dadas las grandes ventajas que presenta respecto de las tecnologas tradicionalmente
utilizadas en descontaminacin. Dependiendo de los autores, pueden encontrarse
distintas definiciones de fitorremediacin. En la transparencia 8 se presentan dos de
ellas a modo de ejemplo. La transparencia 9 enumera algunos ejemplos de
contaminantes orgnicos y las formas ms frecuentes utilizadas para degradarlos por
fitorremediacin. La transparencia 10 hace lo propio para el caso de los contaminantes
inorgnicos.
Se conocen hasta el momento ms de 400 especies vegetales capaces de acumular
sustancias txicas con distintos grados de eficiencia. La fitorremediacin ofrece una
serie de ventajas importantes en comparacin con las tcnicas tradicionales de
descontaminacin ambiental, algunas de las cuales se enumeran en la transparencia
12. Sin duda, el mayor beneficio que deriva de los mtodos de fitorremediacin es de
tipo econmico. Por ejemplo, en Estados Unidos, el costo para remediar un acre de
suelo hasta 50 cm de profundidad ronda los U$S 400.000 si se aplican tecnologas de
excavacin, mientras que si se utilizan plantas para el mismo propsito el costo
desciende a U$S 60.000. Esta diferencia se debe principalmente a que no se
necesitan maquinarias costosas ni personal altamente calificado.

En muchos casos, la fitorremediacin se utiliza como paso final para la


descontaminacin de algn sitio que fue previamente tratado mediante el uso de otras
tecnologas. A pesar de las grandes ventajas listadas en la transparencia anterior, al
encarar un proceso de fitorremediacin deben considerarse tambin las limitaciones
de este enfoque, las cuales se enumeran en la transparencia 13. Un riesgo que debe
ser correctamente evaluado es el efecto potencial sobre la cadena alimentaria. Por
ejemplo, si algn herbvoro se alimenta de plantas utilizadas en un proceso de
fitorremediacin, ello podra tener efectos nocivos y hasta letales sobre l y/o sobre
sus predadores. Aunque se est trabajando activamente en el anlisis de efectos de
este tipo, se requiere an ms investigacin para que se puedan establecer mtodos
de manejo adecuados.

Pueden distinguirse distintos tipos de fitorremediacin segn el modo en que la planta


capta o metaboliza la sustancia contaminante (transparencia 14). Una de las formas
ms importantes, la fitoextraccin, involucra el uso de plantas terrestres para absorber
metales pesados desde el suelo, para luego transportarlos hacia el tallo y las hojas.
Una vez fitoextrados, los metales pueden acumularse en la porcin area de la planta
y cosecharse para luego reducir su volumen por incineracin. Los compuestos txicos
pueden tambin liberarse como especies voltiles menos txicas.

El diseo del sistema a utilizar para la descontaminacin variar segn el o los


compuestos contaminantes, la concentracin de dichas sustancias y las condiciones
del sitio a remediar (transparencias 15 y 16). El tipo de fitorremediacin que ser
utilizado es muy importante, ya que el diseo del sistema depender de ello. Algunos
factores clave a tener en cuenta son:

Seleccin de la especie vegetal: en general se utilizan plantas de rpido crecimiento,


fciles de crecer y mantener. No debe olvidarse el requerimiento de agua de las
plantas en el terreno en que sern ubicadas. Algunos diseos utilizan especies
autctonas para no modificar demasiado la flora local. Obviamente, la especie
seleccionada deber descontaminar eficientemente la sustancia txica. Pueden
utilizarse plantas, rboles, pastos o algas.

Datos de toxicidad y de degradacin de contaminantes: es necesario analizar el tipo


de contaminacin para asegurar la correcta eleccin del sistema. Probablemente
deben realizarse ensayos a pequea escala para comparar la efectividad de
descontaminacin de distintas especies. Tambin es necesario analizar la cantidad y
caractersticas de los compuestos que la planta produce y/o libera.

Esquema y densidad de las plantaciones: la densidad de plantacin depender de la


planta utilizada y del tipo de aplicacin. Debe estimarse la cantidad de biomasa
producida lo largo del tiempo por unidad de superficie. Adems, en algunos casos ser
necesario realizar plantaciones sucesivas a lo largo de un perodo preestablecido.
Irrigacin, insumos agronmicos y mantenimiento: en aplicaciones de fitorremediacin
terrestre debe incluirse el costo de irrigacin. La frecuencia y cantidad de las lluvias y
las caractersticas del clima regional son factores que podrn modificar el
requerimiento de agua de riego. Otros costos importantes que deben incluirse en el
plan son las plantaciones sucesivas, el mantenimiento y monitoreo, la cosecha y la
fertilizacin, entre otros.

Zona de captura de agua y tasa de transpiracin: Debe analizarse el movimiento del


agua y su destino final. Un rbol maduro es capaz de liberar ms de 760 L de agua por
ao a travs de la transpiracin. En algunos casos, las plantas liberarn al medio
productos menos txicos que aquellos que les dieron origen mediante el proceso de
transpiracin.

Tasa de captacin del contaminante y tiempo de limpieza requerido: existen varias


ecuaciones para determinar la tasa de descontaminacin.

Anlisis de riesgos contingentes: no debe excluirse la posibilidad de que se presenten


eventos inesperados (plagas, sequa, vientos, animales, etc.) que pongan en peligro el
sistema de fitorremediacin planteado. Es recomendable considerar esto y disponer de
estrategias de contingencia para asegurar el xito del programa.

La fitoextraccin, uno de los tipos de fitorremediacin ms utilizados, es empleada


comercialmente para la descontaminacin de ciertos metales. En la tabla de la
transparencia 17, se presentan ejemplos de pruebas de campo realizadas para
descontaminar distintos compuestos. Sin embargo, an se requiere un mayor
desarrollo de la tecnologa para optimizar la capacidad de las especies fitoextractoras.
Una posibilidad a considerar es la aplicacin de tcnicas mixtas combinando
fitorremediacin con tecnologas tradicionales.

Pueden distinguirse tres grandes pasos durante el proceso de acumulacin de metales


pesados en las plantas: a) la captacin por las races; b) el transporte y; c) los
mecanismos de evasin y de tolerancia (transparencia 18).

Captacin por las races: los metales pueden presentarse disueltos en el agua
superficial del suelo o adsorbidos a componentes del mismo. En el primer caso, la
planta ser capaz de absorberlos directamente de la solucin en la que se encuentran.
En el segundo, deber solubilizar previamente los metales mediante la secrecin
radicular de fitosiderforos, protenas quelantes (fitoquelatinas y metalotionenas), y
protones que acidifican el medio. Una vez solubilizados, los iones metlicos podrn
ingresar a la raz por va apoplstica (extracelular) o por va simplstica (intracelular).

Transporte: una vez que los metales se encuentran dentro de la planta, pueden ser
acumulados en las races o exportados hacia el tallo. La exportacin hacia el tallo se
realiza a travs del xilema y la redistribucin dentro del mismo de realiza por el floema.
Finalmente, los metales son almacenados dentro de la vacuola celular.

Mecanismos de evasin y de tolerancia: la planta debe contar con mecanismos que


eviten que los metales pesados la afecten severamente. La evasin, es decir, la
limitacin en la captacin de los metales, puede ser uno de los sistemas utilizados. La
detoxificacin o la resistencia metablica a los metales pesados son otras alternativas
para evitar los efectos txicos.

Las transparencias 19 a 23 presentan algunos de los procesos biolgicos que afectan


a la fitorremediacin y que deben ser estudiados en mayor profundidad para poder
hacer ms eficientes los procedimientos basados en esta tcnica.
La transparencia 24 presenta algunos ejemplos de las especies ms utilizadas en
fitorremediacin. En particular, los lamos han sido utilizados para la remocin de
suelos contaminados con diversos compuestos. Entre ellos, pueden citarse como
ejemplos la atrazina, el tricloroetileno y el selenio.

Tipos de fitorremediacin

Transparencias 25-62

La fitorremediacin puede aplicarse tanto al tratamiento de contaminaciones con


compuestos orgnicos como con sustancias inorgnicas. Los agentes contaminantes
pueden a su vez, estar presentes en un sustrato slido (suelo), lquido (agua), o en el
aire. Tomando en cuenta estos factores, los procesos de fitorremediacin puede
dividirse en distintos tipos: fitoextraccin, rizofiltracin, fitoestimulacin,
fitoestabilizacin, y fitotransformacin. En las transparencias 26 a 28 se resumen los
aspectos esenciales de cada tipo de proceso. La transparencia 29 resume y
complementa la informacin anterior. Se enumeran los distintos tipos de
fitorremediacin y se presentan algunos ejemplos de las contaminaciones ms
frecuentes para los que han sido utilizados.

La planta ideal para su utilizacin en procesos de fitoextraccin debera tolerar y


acumular altas concentraciones de metales en las partes cosechables, tener una alta
tasa de crecimiento y una alta produccin de biomasa. Thlapsi caerulescens,
perteneciente a la familia Brassicaceae, es una de las plantas identificadas como
hiperacumuladora de metales. Sin embargo, su reducido tamao limita la utilizacin de
esta especie en aplicaciones a campo. Brassica juncea es otra especie prometedora
para su utilizacin en este proceso. Es capaz de acumular distintos metales pesados
en su tallo, y produce mayor cantidad de biomasa que T. caerulescens. Sin embargo,
para la mayora de los casos citados en la tabla, T. caerulescens acumula niveles ms
altos de metales pesados que B. juncea. En consecuencia, al elegir la especie para un
sistema de fitoextraccin, es muy importante establecer la relacin entre la biomasa
producida y la capacidad de acumular sustancias txicas. En la transparencia 31, se
enumeran algunas plantas tpicas que han sido empleadas en procesos de
fitoextraccin. T. caerulescens es una de las especies ms estudiadas por su
capacidad hiperacumuladora. Esta especie puede acumular hasta 40 mg de zinc por
gramo de tejido foliar seco. Tambin puede acumular niveles considerables de cadmio.
Sin embargo, es una planta de crecimiento lento y genera poca biomasa, por lo que se
la usa principalmente como un modelo experimental.

La biodisponibilidad de los metales para su captacin por la planta es un factor


determinante de la efectividad de la remediacin (transparencia 32). Los metales en
estado inico o adsorbidos a constituyentes inorgnicos del suelo pueden ser
captados por la planta para comenzar el proceso de fitoextraccin. El manejo de la
biodisponibilidad de los metales es crtico para el xito de cualquier plan de
fitorremediacin, existiendo varios mtodos para incrementar la misma. Por ejemplo, el
agregado de quelantes origina la formacin de complejos quelante-metal y permite que
los metales estn disponibles para su captacin. En suelos con bajo pH, la adsorcin
de los metales se halla disminuida y aumenta la concentracin de las formas solubles.
En este caso, manteniendo un pH levemente cido, se puede incrementar la
biodisponibilidad de los metales y, por lo tanto, su captacin. Muchos metales pesados
estn unidos a xidos, y su disolucin es otra forma de aumentar la biodisponibilidad.
Algunas plantas exudan agentes reductores por sus races, lo que modifica el estado
redox del suelo y permite disociar los xidos metlicos. Es sabido tambin que los
microorganismos presentes en la rizosfera facilitan la captacin de nutrientes por la
planta. El enriquecimiento de la rizosfera con microorganismos capaces de favorecer
la captacin de metales pesados puede contribuir a facilitar la biodisponibilidad. La
transparencia 33 muestra grficos que representan dos estrategias de fitoextraccin:
fitoextraccin continua y fitoextraccin asistida por quelantes.

Fitoextraccin continua: se basa en la capacidad natural de algunas plantas de


hiperacumular metales a lo largo de su ciclo de vida. La desventaja de este sistema
deriva de que muchas plantas hiperacumuladoras son de bajo crecimiento, producen
poca biomasa, y no son capaces de acumular los principales metales contaminantes
(cadmio, plomo, uranio). En el esquema de la transparencia 32 se muestra la
captacin del metal a lo largo del tiempo a medida que las plantas crecen. La cosecha
de las mismas se efecta una vez que alcanzan su tamao ptimo y la mxima
incorporacin del metal
.
Fitoextraccin asistida por quelantes: debido a que los metales ms problemticos no
estn bajo formas disponibles en el suelo, se utilizan quelantes, como EDTA, para
favorecer la biodisponibilidad de dichos compuestos e incrementar la acumulacin en
la planta. El esquema de la transparencia 33 muestra las dos etapas del proceso. En
la primera, se deja crecer la planta hasta el tamao deseado, siendo mnima la
incorporacin del metal. En la segunda, se aplica el quelante y se produce la mxima
captacin del metal. Finalmente, se efecta la cosecha. El grfico de barras muestra
un ejemplo en que la aplicacin de EDTA permite aumentar la captacin de plomo. En
este caso, se midi la concentracin del metal en los tallos de B. juncea tras haber
tratado el suelo con distintas concentraciones del quelante. Se observa que a medida
que se incrementa la cantidad de quelante aplicado, aumenta significativamente la
captacin de plomo por la planta.

Una posible forma de incrementar la acumulacin de metales en las plantas es


mediante la sobrexpresin constitutiva de protenas que intervienen en el transporte de
stos a la vacuola celular. En las transparencias 34 y 35, se muestran experimentos
realizados con clulas de Saccharomyces cereviciae y plantas de Nicotiana tabacum
transformadas con el gen de Arabidopsis thaliana cax2, el que codifica una protena
transportadora de Ca2+. Los ensayos realizados se explican parcialmente en las
propias transparencias. Todas las cepas de la levadura se cultivaron hasta saturacin
y luego se diluyeron 500 veces en medio conteniendo distintas concentraciones de
MnCl2. Las incubaciones se realizaron por 1 da a 30 oC. La tolerancia al Mn2+ est
cuantificada mediante la densidad ptica de los cultivos de S. cereviciae. Como puede
observarse en la grfica, la sobrexpresin de CAX2 en S. cereviciae aumenta la
tolerancia a Mn2+, tanto en la cepa mutante cnb como en la cepa salvaje. Panel
superior de la transparencia 35: los ensayos se realizaron complementando el medio
con 10 mM CaCl2, 0,1 mM CdCl2 o 0,1 mM MnCl2. El contenido de iones se determin
por espectrometra de absorcin atmica. Las plantas transgnicas para CAX2 son
capaces de acumular mayor cantidad de iones. Estos resultados son ms notorios si
se analiza el contenido de iones de las races. Panel inferior de la transparencia 35:
para los tres iones analizados, puede observarse que la expresin de CAX2 en ambas
lneas transgnicas (curvas en anaranjado y azul) aumenta al transporte de iones
comparado con la lnea control (curva verde).

La contaminacin con cadmio de los suelos se debe principalmente al excesivo uso de


fertilizantes fosfatados, desechos domiciliarios y deposicin ambiental. Muchos
cultivos de inters agronmico captan el metal. Por lo tanto, dicho problema alcanza la
alimentacin humana y las tierras cultivables. Algunos organismos resisten
naturalmente al estrs causado por metales pesados mediante protenas quelantes del
metal en cuestin (metalotionenas y fitoquelatinas). Aumentando la expresin de
dichas protenas en la especie vegetal a utilizar mediante la sobrexpresin de los
respectivos genes, se podra desarrollar resistencia frente al metal pesado. Como se
muestra en la tabla de la transparencia 36, el gen que codifica la protena de inters
puede derivar de una especie vegetal o de otros organismos.

Las algas y plantas acuticas constituyen una alternativa de eleccin cuando se trata
de descontaminar aguas o tierras inundadas. Lemna minor es una planta que posee
una alta tasa de multiplicacin. La fitorremediacin de aguas contaminadas con esta
especie hace uso de esta ventaja para generar una gran cantidad de biomasa en un
corto perodo de tiempo. La transparencia 37 presenta los dos mecanismos principales
que utilizan las especies acuticas para remover contaminantes de aguas
polucionadas.

La transparencia 38 presenta un ejemplo de fitoextraccin de nquel y plomo realizado


con L. minor. Las figuras muestran ensayos realizados en presencia de ambos metales
con el fin de establecer la presencia o ausencia de efectos antagnicos o sinrgicos.
Figura superior: se observa la remocin de nquel a partir de un nivel inicial alto (5
mg/L) para tres concentraciones diferentes de plomo. La remocin del metal es rpida,
y luego de las 5 h permanece constante. Se logra remover hasta un 87% del nquel
presente. Figura inferior: se muestra la remocin del plomo a partir de un nivel inicial
alto (10 mg/L) para tres concentraciones distintas de nquel. Se observa una remocin
del 83%. Puede concluirse que la presencia de cada uno de estos metales no incide
sobre la captacin del otro, por lo cual se deduce que los mecanismos involucrados
son independientes.

El uso de races de plantas para absorber, concentrar y precipitar metales txicos de


aguas o napas contaminadas se denomina rizofiltracin (transparencia 39). Este
sistema permite el tratamiento in situ de los contaminantes, minimizando su impacto
en el entorno. En una primera etapa, plantas con races bien desarrolladas se ponen
en contacto con agua contaminada a modo de aclimatacin. Luego, las mismas son
implantadas en el sitio contaminado para colectar los compuestos txicos. Una vez
que las races se saturan con los mismos, se lleva a cabo la cosecha de las plantas.
Estudios realizados con este tipo de mtodos demostraron que algunas plantas tienen
la capacidad de remover hasta el 60% de su peso seco en forma de metal txico.

Se han realizado estudios para analizar la capacidad de distintas plantas acuticas


para descontaminar sustancias txicas presentes en su ambiente mediante
rizofiltracin (transparencia 40). Por ejemplo, se ha demostrado que Myriophyllum
aquaticum puede degradar trinitrotolueno (TNT). Esta planta posee la habilidad de
tomar TNT de su medio y metabolizarlo, formando productos de oxidacin. Los
productos de degradacin se acumulan en el tejido vegetal. A pesar de que an no se
han determinado los niveles de toxicidad del TNT ni de sus derivados para la planta,
se estn llevando a cabo numerosos estudios para dilucidar este interrogante.

Un posible enfoque para la rizofiltracin de radionucletidos es la utilizacin de


tumores de races obtenidos por transformacin con Agrobacterium rhizogenes. Las
transparencias 41 y 42 muestran ensayos realizados con races transformadas de B.
juncea y Chenopodium amaranticolor para la captacin de uranio. El panel inferior de
la transparencia 43 muestra estudios de captacin de uranio (bajas concentraciones;
25-500 mM) realizados con las races de ambas especies. La relacin entre la
concentracin de uranio en el medio y la cantidad de uranio captado por el tejido
radicular resulta lineal: a medida que aumenta la concentracin del metal en el medio,
aumenta proporcionalmente la cantidad de uranio captado por las races. La
transparencia 44 muestra estudios de captacin de uranio (altas concentraciones; 500-
5000 mM) realizados por las races de las especies mencionadas anteriormente. Se
observa captacin lineal para el caso de las races de C. amaranticolor. Por el
contrario, los ensayos con races de B. juncea muestran que el sistema llega a
saturacin a partir de una determinada concentracin de uranio.

La fitotransformacin, que abarca los procesos de fitodegradacin y fitosolubilizacin,


es la conversin de contaminantes orgnicos dentro de la planta mediante procesos
metablicos propios de la misma. Los txicos son degradados en compuestos ms
simples, que se integran a algn tejido de la planta. La transparencia 43 enumera los
factores que deben considerarse al implementar este tipo de fitorremediacin. La
liberacin de contaminantes voltiles a la atmsfera mediante la transpiracin de la
planta se conoce con el nombre de fitovolatilizacin, y es una forma de
fitotransformacin. A pesar de que la liberacin de contaminantes a la atmsfera no
sea el objetivo principal de la remediacin, la fitovolatilizacin puede ser deseable, ya
que se reduce el riesgo de contaminacin de las napas de aguas subterrneas. Se ha
demostrado que algunos lamos hbridos son capaces de transformar el tricloroetano
(TCE) en tricloroetanol, cido tricloroactico, y cido dicloroactico, con mineralizacin
parcial de TCE a CO2. Tambin se ha observado que el pesticida atrazina es
transformado por esta especie.

Las especies vegetales son capaces de metabolizar distintas familias de compuestos


orgnicos porque poseen rutas metablicas que no estn presentes en otros
organismos. La transparencia 45 muestra ejemplos de procesos de degradacin que
pueden ser realizados por las plantas. La identificacin de estas rutas en distintas
especies permitir extender el uso de este tipo de fitorremediacin.

Los trabajos previos de remediacin de explosivos se basaban en la capacidad de


hongos y microorganismos para degradar compuestos tales como TNT
(trinitroglicerina), RDX (1,3,5-trinitro-1,3,5- triazina), TETRYL (N-metil-N,2,4,6-
tetranitroanilina), y HMX (octahidro-1,3,5,7-tetrazocina). Estos enfoques presentan
como desventaja el requerimiento de excavar la tierra contaminada para su
procesamiento posterior en biorreactores, lo que equipara los costos de este mtodo a
los de la incineracin tradicional. Una posible solucin a esta clase de contaminantes
es la utilizacin de especies vegetales capaces de asimilar y modificar los compuestos
mencionados. Aunque hasta el presente la fitotransformacin de explosivos por esta
va ha resultado parcial (transparencia 46), se trabaja intensamente para optimizar el
proceso.

El TNT es uno de los explosivos ms txicos y peligrosos. Durante los ltimos 100
aos se ha estado acumulando en depsitos y arsenales, y su eliminacin se ha
convertido en un gran problema desde el punto de vista ambiental. Actualmente, la
incineracin es el nico mtodo disponible para el tratamiento de suelos contaminados
con TNT, pero este proceso produce cenizas sin ninguna posible utilidad y contamina
el aire. En los procesos de fitotransformacin de compuestos orgnicos debe
contemplarse no slo la degradacin del compuesto original, sino tambin la
produccin de compuestos intermedios y productos finales. La transparencia 47
muestra la ruta de degradacin del TNT. Como se puede observar, en los sucesivos
pasos de esta va se generan distintos productos intermediarios. Resulta de suma
importancia analizar la toxicidad de los mismos, ya que si estos resultan almacenados
en las plantas podran ingresar en la cadena alimentaria y causar efectos nocivos, y
an mortales, en los animales que se alimentan de ellas.

En general, los explosivos son compuestos fitotxicos, aunque algunas especies


vegetales poseen mecanismos para su detoxificacin. Por otra parte, la enzima
bacteriana nitroreductasa (NR) de Enterobacter cloacae resulta activa para la
degradacin del TNT. En el ejemplo que se ilustra en las transparencias 48 a 51 se
transformaron plantas de Nicotiana tabacum con el gen de NR de esta bacteria y se
analizaron los efectos txicos del TNT sobre plantas transgnicas (NR 3-2) y plantas
control no transformadas (NT). Para realizar los ensayos, se cultivaron plantas de 14 d
de edad en medio con o sin TNT durante 7 d adicionales y se midi su peso para
establecer la variacin en biomasa. La variacin de este parmetro fue tomada como
indicativa de fitotoxicidad. Panel superior de la transparencia 48: se esterilizaron
superficialmente 50 semillas, se germinaron y se crecieron durante 14 d en medio sin
TNT (figura izquierda). Luego se incubaron los brotes de semillas no transformadas y
transgnicas con 0,25 mM de TNT en agua estril por 7 d adicionales (figura derecha).
En medio conteniendo 0,25 mM de TNT, los brotes de semillas sin transformar
perdieron 34% del peso fresco respecto de los controles sin TNT. Los brotes de
semillas transformadas aumentaron un 18% su peso fresco respecto de los mismos
controles. Panel inferior de la transparencia 48: se sembraron 4 semillas de cada tipo
en placas y se registr el crecimiento de las races a los 20 d. En presencia de 0,05
mM de TNT, los brotes de semillas no transformadas mostraron atrofia radicular,
mientras que los brotes de semillas NR 3-2 desarrollaron races similares a las de los
brotes cultivados en medio libre de TNT. En medio con 0,1 mM de TNT, los brotes de
semillas no transformadas mostraron un retardo notable en el desarrollo. En contraste
con esto, los brotes de semillas transgnicas sufrieron mnimos efectos fitotxicos.

Las transparencias 49 y 50 muestran resultados del mismo trabajo. Se midi la


longitud de las races de brotes NT y NR 3-2, y se utiliz este parmetro para calcular
un ndice de tolerancia (longitud de las races de brotes tratados con TNT/longitud de
races de brotes control x 100) en cada concentracin de TNT ensayada. Como puede
observarse, las races de los brotes transformados exhiben mayor longitud que las
races de los brotes no transformados, efecto que se observa tanto en el tratamiento
de 0,05 mM como de 0,1 mM de TNT, lo que se refleja en los respectivos ndices de
tolerancia. Los resultados que se muestran son un promedio de las mediciones
realizadas sobre 10 brotes individuales. La tabla de la transparencia 50 muestra las
variaciones registradas en el peso de brotes expuestos a dos concentraciones
distintas de TNT. En medio con 0,1 mM de TNT, los brotes transgnicos mostraron una
mayor ganancia en peso que los brotes de plantas sin transformar. Cuando ambos
tipos de plantas se cultivaron en presencia de 0,25 mM de TNT, se observaron
reducciones de peso en ambos casos. Sin embargo, la prdida de peso result menor
en el caso de los brotes transgnicos.

Las transparencias 51 a 53 muestran otro ejemplo de degradacin de explosivos, en


este caso la hexahidro 1,3,5-trinitro-1,3,5-triazina (RDX). Este explosivo es txico para
todo tipo de organismos (incluyendo las plantas) y un posible carcingeno. Su
degradacin ambiental es muy lenta y su presencia en suelos y napas de agua
constituye un problema grave. El hongo Phanerochaete chrysosporium y las bacterias
del gnero Rhodococcus son capaces de degradar RDX, pero no desarrollan
suficiente biomasa para ser utilizados en procesos de biodegradacin. La molcula
responsable de la degradacin es un citocromo P450. Como prueba de concepto, se
aisl el gen de citocromo P450 XplA de Rhodococcus rhodocochrous y se lo expres
en plantas de A. thaliana. Las plantas fueron utilizadas en ensayos de detoxificacin
de suelos contaminados con RDX. Los resultados obtenidos se muestran en las
transparencias mencionadas.

Las flechas del diagrama presentado en la transparencia 54 muestran las principales


interconversiones del mercurio en el medio ambiente. El mercurio elemental, Hg(0), y
el mercurio unido a azufre, RSHg, se convierten lentamente en mercurio inico libre,
Hg(II), el cual acta como sustrato de las reacciones de metilacin. El producto
resultante, metilmercurio, es una grave amenaza ambiental debido a su tendencia a
entrar en la cadena alimentaria acutica y a biomagnificarse. Se ha estimado que el
metilmercurio se concentra en los peces entre 6 y 7 rdenes de magnitud sobre la
concentracin presente en las aguas contaminadas y que constituye entre el 90 y el
100% del mercurio total. Por comparacin, el mercurio inico se bioconcentra mucho
menos eficientemente y se elimina con ms rapidez. El Hg ha sido utilizado en
diversas industrias cuyos efluentes pudieron contaminar los cuerpos de agua con
dicho metal. Este proceso provoc dos epidemias de envenenamiento en Japn en los
aos 60.

No se conocen plantas que detoxifiquen al mercurio. Para poder desarrollar un planteo


de fitorremediacin a nivel experimental, se transformaron plantas de A. thaliana con
los genes responsables de la conversin de metilmercurio a mercurio elemental, los
que se aislaron de la bacteria Desulfovibrio desulfuricans. La transparencia 55 muestra
los pasos involucrados en la conversin de metilmercurio a mercurio elemental.

La transparencia 56 muestra ensayos de crecimiento realizados con plantas de A.


thaliana transformadas con cada uno de los genes mencionados anteriormente
(plantas merA y merB) o con ambos en forma simultnea (plantas merA/merB). Por
otro lado, se evalu si la tolerancia al mercurio orgnico se relaciona con la tasa de
volatilizacin de Hg(0) utilizando 6 lneas de plantas merA/merB. Los ensayos se
realizaron en ausencia o presencia de 5 mM de acetato de fenilmercurio (PMA). Slo 2
de las lneas (merA/B-1 y merA/B-2) fueron capaces de crecer normalmente en estas
condiciones. Panel superior: se compararon las tasas de crecimiento de plantas
transgnicas (merA9-1, merB-4 y merA/merB-1) y controles no transformadas (NT) en
medio conteniendo mercurio orgnico. Las plantas se cultivaron verticalmente durante
3 semanas para observar el desarrollo radicular. En ausencia de mercurio, las plantas
transgnicas y no transgnicas crecen de manera similar. Las plantas merA no
toleraron la concentracin mnima de mercurio orgnico. Las plantas merB crecieron
vigorosamente en presencia de 1 mM de mercurio orgnico, pero su crecimiento fue
notablemente menor en 5 mM y exhibieron una marcada clorosis en 10 mM. En cambio,
las plantas merA/merB-1 germinaron y crecieron sostenidamente an en 10 mM de
mercurio orgnico. Panel inferior: las plantas transgnicas y control se cultivaron en
una cmara cerrada en medio suplementado con 25 mM de acetato de metilmercurio
(MeHg). Se realizaron mediciones del contenido de Hg(0) en el aire de la cmara cada
2 min. Los datos estn expresados en pg de Hg(0) por mg de peso fresco de tejido. Se
graficaron los totales acumulativos de 10 min en promedios de Hg(0) por minuto. Las
plantas no transformadas (NT), merA y merB exhibieron valores basales. Las plantas
doble transgnicas son poblaciones F2 y por lo tanto, el nivel de volatilizacin
observado representa el promedio de las plantas portadoras de ambos transgenes.
Las lneas merA/B-1 y merA/B-2 son las que muestran mayor tasa de volatilizacin de
Hg(0). Las lneas merA/B-3 y merA/B-5 presentaron una volatilizacin intermedia y
crecieron (aunque lentamente) en medio con 5 mM de PMA. Las lneas merA/B-4 y
merA/B-6 no lograron germinar. Estos resultados sugieren que la resistencia a
metilmercurio est relacionada directamente con la conversin del compuesto a
mercurio elemental.

Una estrategia similar a la del trabajo presentado en las transparencias 55 y 56


anteriores se sigui en tabaco, pero introduciendo los genes responsables de la
reduccin de metilmercurio en el genoma de los cloroplastos (transparencia 59). Se
germinaron semillas in vitro en medio conteniendo espectinomicina 500 mg/L. Las
plntulas (10 d post-germinacin) fueron transferidas a invernadero y cultivadas en
tierra por 6 d adicionales. Luego, las plantas fueron tratadas con 0,50, 100, y 200 mM
de acetato de fenilmercurio (PMA). Las fotografas de la transparencia 57 se tomaron
14 d despus del tratamiento. Las lneas transgnicas crecieron normalmente en suelo
conteniendo hasta 100 mM de PMA y sobrevivieron a 200 mM PMA. Ambas
concentraciones de PMA resultaron letales para las plantas no transformadas.

El selenio (Se) es un elemento esencial para muchos organismos, pero resulta txico
en altas concentraciones. La toxicidad se basa en la incorporacin inespecfica del Se
en algunas protenas en reemplazo del grupo azufrado (S) de los residuos de cistena
(Cys). Existen varios mecanismos de tolerancia al Se, y la mayora de ellos se basan
en evitar la incorporacin de Se-Cys en las protenas (el Se se puede volatilizar como
dimetildiselnido, de baja toxicidad, o acumular en forma de aminocidos que no se
incorporan a las protenas). Dado que las plantas acumulan y volatilizan
eficientemente Se del suelo y/o del agua, se ha propuesto utilizarlas para el
tratamiento de ambientes contaminados con este compuesto. Se ha planteado la
posibilidad de sobrexpresar en plantas la enzima selenocistena liasa (SL) para
aumentar su capacidad de acumular este elemento. En el trabajo que se presenta en
las transparencias 58 y 59 se sobrexpres el gen de la SL de ratn (que posee alta
actividad frente a Se-Cys y baja frente a Cys) en A. thaliana y se analiz la
incorporacin de Se en las protenas, su acumulacin in planta, y la tolerancia
desarrollada en las plantas transgnicas.

La transparencia 59 muestra resultados del trabajo presentado anteriormente. Las


construcciones genticas utilizadas para la transformacin con el gen de
selenocistena liasa permitieron la acumulacin de la protena a nivel del citoplasma o
del cloroplasto. Panel superior: se analiz la incorporacin de Se a protenas de la
planta. Para ello se cultivaron plantas de A. thaliana en medio conteniendo 0,5 mM de
selenito durante 14 d. Se observ que tanto las plantas que expresaban la
selenocistena liasa en el citoplasma (citSL) como en cloroplastos (cpSL) contenan en
promedio un 42% menos de Se incorporado en las protenas respecto de las plantas
control no transgnicas (NT). Esto demuestra que la expresin de la enzima previene
la incorporacin no especfica de Se-Cys en las protenas. Panel inferior: se estudi la
tolerancia a Se. Para ello se cultivaron plantas de Arabidopsis en medio conteniendo
50 mM de selenato, 25 mM de selenito o 50 mM de Se-Cys. Como parmetro
representativo de la tolerancia, se midi la longitud de las races. Estos ensayos
mostraron que las plantas citSL son ms tolerantes que las plantas NT. Las plantas
cpSL resultaron menos tolerantes (notar las diferentes escalas utilizadas para la
medicin de la longitud de las races). Las plantas transgnicas citSL resultan
prometedoras como fitorremediadoras, dado que toleran altas concentraciones de Se y
son capaces de acumularlo en el tallo. Podra utilizarse este modelo para generar
plantas transgnicas de otras especies con el fin de aplicarlas en ensayos de campo
en ambientes contaminados. Actualmente, se est trabajando en la obtencin de B.
juncea transgnicas para SL.

La fitoestimulacin, tambin conocida como biodegradacin estimulada por la


rizosfera, rizodegradacin o biorremediacin asistida por plantas, es la degradacin de
contaminantes orgnicos presentes en el suelo a travs del estmulo de la actividad
microbiana en la zona cercana a las races de la planta (rizosfera). La actividad
microbiana se ve estimulada mediante compuestos liberados por las plantas
(azcares, carbohidratos, aminocidos, acetatos, enzimas). Adems, el sistema
radicular oxigena la rizosfera y as se asegura la transformacin aerbica. Por otro
lado, la biomasa de las races aumenta el carbono orgnico disponible. Los hongos
micorrticos que crecen en las inmediaciones de las races pueden tambin degradar
contaminantes orgnicos. La transparencia 61 enumera las caractersticas de las
especies utilizadas en fitoestimulacin. Este enfoque est siendo ensayado para
reducir la contaminacin por combustibles utilizando plantas de alfalfa. Tambin se
realizaron estudios con lamos para combatir la contaminacin con atrazina.
La fitoestabilizacin se basa en la inmovilizacin de metales pesados del suelo. Ello
tiene importantes consecuencia en minimizar la erosin, reducir la solubilidad de los
contaminantes y su biodisponibilidad en la cadena alimentaria. La aplicacin de
materia orgnica, fosfatos, agentes alcalinos, entre otros, puede disminuir la
solubilidad de los metales en el suelo, minimizando su pasaje a las napas de aguas
subterrneas. La planta puede acumular los contaminantes en las races o causar la
precipitacin de los mismos en las inmediaciones de las races. La transparencia 62
enumera los principales contaminantes tratados por este mtodo, las caractersticas
buscadas en las plantas candidatas y algunos ejemplos de plantas utilizadas para este
fin.

Plantas transgnicas para detectar compuestos inorgnicos txicos en el medio


ambiente

Transparencias 63-67

Las plantas tambin pueden ser usadas como indicadoras para detectar la presencia
de compuestos txicos en el medio ambiente. La estrategia utilizada en el ejemplo que
se presenta en las transparencias 64 a 66 se basa en la transformacin de plantas de
A. thaliana con una versin del gen reportero uidA conteniendo una mutacin puntual
(sustrato de mutacin) o copias truncadas del mismo parcialmente superpuestas
(sustratos de recombinacin). En ambos casos, la transcripcin del gen uidA y, por
ende, la sntesis de la protena GUS, est inhibida. El gen slo se expresar en
aquellas clulas en las que hayan ocurrido una reversin puntual en el sustrato de
mutacin o una recombinacin homloga entre los sustratos de recombinacin. Estas
plantas se utilizan para la medir genotoxicidad inducida por compuestos txicos
inorgnicos. Con cierta frecuencia, las mutaciones inducidas por estos agentes puede
producir la reversin del gen al estado funcional. La tasa de reversin (medible por la
aparicin de actividad GUS) es proporcional a la concentracin del agente genotxico.

La transparencia 65 muestra resultados del trabajo mencionado. La frecuencia de


reversin del gen reportero al estado funcional se mide mediante un ensayo
histoqumico de actividad de b-glucuronidasa, lo que se visualiza como la aparicin de
puntos de coloracin azul en el tejido de la planta. Panel superior: cuantificacin de las
frecuencias de reversin por mutacin en funcin de la concentracin de distintos
metales pesados. Los asteriscos muestran diferencias significativas entre las plantas
cultivadas en distintas concentraciones de contaminante y las plantas cultivadas en
ausencia del mismo (Ct). Como regla general, se observa que al aumentar la
concentracin de la sustancia contaminante, tambin aumenta el nmero de puntos,
es decir, la frecuencia de mutacin. El zinc no parece causar el mismo efecto que las
otras sustancias, por lo menos a bajas concentraciones. Las barras de distintos
colores representan mediciones realizadas en dos lneas transgnicas diferentes.
Panel inferior: en este caso, se realizaron ensayos similares a los anteriores, pero
analizando la frecuencia de recombinacin homloga. Los resultados obtenidos son
similares a los comentados en el panel superior. La tabla de la transparencia 66
compara la sensibilidad de distintos sistemas de biomonitoreo. Entre los ensayos
mencionados, se encuentra el Microtox. El mismo se basa en la deteccin de la
luminiscencia emitida naturalmente por las bacterias Vibrio fischeri como subproducto
de la respiracin celular. El metablismo de la bacteria es afectado directamente por
agentes txicos y, en consecuencia, tambin lo es la emisin de luminiscencia. El
ensayo MetPlate se basa en la inhibicin por agentes txicos de la enzima b-
galactosidasa de Escherichia coli en muestras acuosas. Se utiliza una microplaca de
96 pocillos y se determina la absorbancia a 575 nm. El ensayo con ratones
transgnicos mencionado se basa en un ratn que porta el gen de la hormona de
crecimiento humana (hGH) bajo el promotor de la hsp70 humano, inducible por estrs.
Cuando cultivos primarios de las clulas de dicho ratn son tratados con compuestos
txicos, o cuando los ratones son inyectados con los mismos, se observa la
produccin de hGH. Otros ensayos convencionales utilizan organismos que son muy
sensibles a distintos compuestos txicos como indicadores de su presencia en
muestras ambientales, ya sea porque producen su mortandad o alteraciones genticas
y fenotpicas varias. Utilizando datos provenientes de diferentes estudios, se compar
la sensibilidad del sistema basado en plantas transgnicas con otros ensayos de
genotoxicidad mencionados. Se observa que este nuevo sistema propuesto resulta
ms sensible que los otros para varios contaminantes de gran inters.