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I.

JUSTIFICACIN

La a-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva


humana y cataliza la degradacin del almidn, que es un polisacrido de
reserva vegetal. El almidn est formado por dos tipos de molculas: la
amilosa y la amilopectina, ambos polisacridos de glucosa. La amilosa se
conforma por cadenas lineales de glucosas unidas por enlaces a- C1-C4,
mientras que la amilopectina tiene, adems de estos ltimos enlaces,
uniones C1 con C6, formando cadenas ramificadas. La a-amilasa rompe
uniones C1-C4, tanto en la amilasa como en la amilopectina, dejando
dextrinas lineales y ramificadas (oligosacridos) como productos.
Para medir la actividad enzimtica de la a-amilasa, se utilizar un test
colorimtrico que detecta el almidn. Para ello se contar con una
solucin de iodo/ioduro de potasio (I2/IK), ya que el almidn en presencia
de esta solucin adquiere una coloracin azulada caracterstica. Esto
tiene una explicacin fsica: el iodo se coloca en el interior de la hlice que
forma la amilosa (en las regiones hidrofbicas), formando un complejo de
color azul. Cuando la a-amilasa acta, degrada la amilosa, se desintegra
la hlice y por tanto en presencia de I2/IK ya no dar una coloracin azul.
Por lo tanto, en este TP mediremos la desaparicin de sustrato
(evidenciada por el test colorimtrico) para determinar la actividad de la
enzima. Adems, analizaremos cmo afectan las distintas condiciones en
que acta la enzima (pH, temperatura, concentracin de NaCl), as como
los efectos que pueden causar diferentes pretratamientos (proteinasa,
calor).1

II. OBJETIVOS

Terminando la prctica estar en condiciones de:

Determinar la actividad enzimtica.


III. MATERIAL Y REACTIVOS

Reactivos cido tricloroactico


Solucin de amilasa salival al 20%
10%
Materiales
Sol de cloruro de sodio al 0,15
M Tubos de ensayo

Buffer fosfato pH = 6,6 Pipetas

Solucin de almidn al 10% Gradillas

Agua destilada Frasco lavador

Solucin NaOH 1N Mechero de alcohol

Solucin CuSO4 20% Vasos de precipitacin

Solucin HCl 3N Pinzas

Solucin HCl 0,05 N Trpode y rejilla

Solucin yodada metlica

IV. PROCEDIMIENTO

COMPONENTES I II III IV V VI
Solucin de 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL
amilasa al 10%
NaOH 1N ----- 2,4mL ----- ----- ----- -----
HCl 3N ----- ----- 2,4mL ----- ----- -----
cido ----- ----- ----- 2,4mL ----- -----
tricloroactico
CuSO4 20% ----- ----- 2,4mL -----
Buffer fosfato pH 2,4mL ----- ----- ----- ----- 2,4mL
6,6
Dejar los tubos I al V en reposo durante 10 minutos a la temperatura del
ambiente y el tubo VI en bao de agua hirviendo por el mismo tiempo.
Despus de este periodo de tiempo se observ todos los cambios
producidos (Anexo visual 1)

Tubo I

Luego de verter 1ml de amilasa al 10% al tubo (con ayuda de la pipeta)


se agreg el buffer fosfato pH 6.6, puesto que cada enzima acta a un pH
determinado (normalmente en 6-8, superando este intervalo tiende a
desnaturalizarse e inactivarse). Al utilizar esta sustancia amortiguadora
(buffer fosfato) nos permitir, que la enzima no se desnaturaliza.

Tubo II

Una vez vertida la amilasa al 10%, posteriormente se agreg NaOH 1N


(con ayuda de la pipeta), este por ser una base fuerte tendera a producir
la desnaturalizacin de la enzima (amilasa) por lo cual no actuara. No se
observara cambio de color de la solucin.

Tubo III

Luego de verter la amilasa, pasamos a agregar HCl 3N (con ayuda de la


pipeta), al ser este un cido fuerte va alterar la conformacin de la amilasa
y esta tendera a desnaturalizarse; sin embargo no presenciamos cambio
de color de solucin.

Tubo IV

Al haber agregado amilasa, procedimos a verter 2.4 ml de Ac.


Tricloroactico (con la pipeta), el cual siendo un cido dbil, proceder a
desnaturalizar a la enzima (amilasa).

Tubo V

A este tubo con amilasa se le agrega sulfato de cobre al 20% (utilizando


la pipeta), el cual por ser una sal pesada generara un cambio en la enzima.
Tubo VI

Luego de agregar la amilasa al tubo (con la pipeta) se agreg el buffer


fosfato pH 6.6, se lo coloco en agua hirviendo.

Durante este lapso constituir el siguiente sistema:

Sistema B

COMPPONENTES/ I II III IV V VI
TUBOS
Solucin de 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL
almidn 1,0%
Buffer fosfato pH 5mL 5mL 5mL 5mL 5mL 5mL
6,6
NaCl 0,15 M 1,4mL 1,4mL 1,4mL 1,4mL 1,4mL 1,4mL
Agua destilada 2mL 2mL 2mL 2mL 2mL 2mL

En este sistema se utilizaron 6 tubos ms, a los cuales se les agrego los
reactivos indicados en el recuadro. (Anexo visual 2)

Tubo I

Se le agrego 1mL de solucin de almidn al 1,0%, 5mL de buffer fosfato pH


6.6, 1.4mL de NaCl 0.15 M y 2mL de agua destilada (con la pipeta).

Tubo II

Se le agrego 1mL de solucin de almidn al 1,0%, 5mL de buffer fosfato pH


6.6, 1.4mL de NaCl 0.15 M y 2mL de agua destilada (con la pipeta).

Tubo III

Se le agrego 1mL de solucin de almidn al 1,0%, 5mL de buffer fosfato pH


6.6, 1.4mL de NaCl 0.15 M y 2mL de agua destilada (con la pipeta).
Tubo IV

Se le agrego 1mL de solucin de almidn al 1,0%, 5mL de buffer fosfato pH


6.6, 1.4mL de NaCl 0.15 M y 2mL de agua destilada (con la pipeta).

Tubo V

Se le agrego 1mL de solucin de almidn al 1,0%, 5mL de buffer fosfato pH


6.6, 1.4mL de NaCl 0.15 M y 2mL de agua destilada (con la pipeta).

Tubo VI

Se le agrego 1mL de solucin de almidn al 1,0%, 5mL de buffer fosfato pH


6.6, 1.4mL de NaCl 0.15 M y 2mL de agua destilada (con la pipeta).

Luego se puso a incubar este sistema por dos minutos a 37C.

Despus se agreg 0,6mL de la enzima tratada en el paso anterior a su tubo


correspondiente y dejar en incubacin a 37C por 20 minutos.

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

Sistema C

COMPONENTES/TUBOS I II III IV V VI
HCl 0.05 N 5mL 5mL 5mL 5mL 5mL 5mL
Tubos de reac. Del 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL
sistema B
Solucin yodada 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL

Al ya tener los tubos en donde estn actuando la enzima (amilasa) del sistema
A con el sustrato (almidn) del sistema B, se procede a verter el volumen de
cada reactivo indicados en el recuadro del sistema C. (Anexo visual 3)

Tubo I

Se agreg 5mL de HCl 0.05 N, 0.5mL de los tubos de reaccin del sistema
B y 0.5mL de solucin yodada.
Tubo II

Se agreg 5mL de HCl 0.05 N, 0.5mL de los tubos de reaccin del sistema
B y 0.5mL de solucin yodada.

Tubo III

Se agreg 5mL de HCl 0.05 N, 0.5mL de los tubos de reaccin del sistema
B y 0.5mL de solucin yodada.

Tubo IV

Se agreg 5mL de HCl 0.05 N, 0.5mL de los tubos de reaccin del sistema
B y 0.5mL de solucin yodada.

Tubo V

Se agreg 5mL de HCl 0.05 N, 0.5mL de los tubos de reaccin del sistema
B y 0.5mL de solucin yodada.

Tubo VI

Se agreg 5mL de HCl 0.05 N, 0.5mL de los tubos de reaccin del sistema
B y 0.5mL de solucin yodada.

V. RESULTADOS
Tubo I: Como resultado se observ que el primer tubo nos mostr un
color amarillento.
Tubos II-VI: Se observ que los tubos restantes (II-VI) presentaron un
color azul marino oscuro.

VI. DISCUSIN

En el tubo I

Como se present un color amarillento es signo que la enzima no ha sufrido


ningn tipo de cambio (desnaturalizacin) y la gran parte del sustrato se ha
convertido en producto ya que el lugol no ha encontrado al almidn y
adems porque no hemos agregado cidos ni sal.
En los tubos II-VI

En cambio es estos tubos se present un color azul marino oscuro ya que el


lugol si ha encontrado al almidn, lo cual nos indica que gran cantidad del
sustrato no se ha activado con la enzima.

VII. CONCLUSIN

Al trmino de esta prctica se concluy que:

Con esta prctica se ha demostrado con es que la enzima (en este caso la
amilasa) tiene que estar en un medio adecuado para poder actuar, y por el mismo
hecho de ser esta una protena tiende a desnaturalizarse fcilmente si son
expuestos a factores como: PH fuera del rango 6-8, temperatura, cidos y bases
tanto dbiles como fuertes.

VIII. BIBLIOGRAFA

1. http://www.monografias.com/trabajos916/actividad-enzimatica-
amilasa/actividad-enzimatica-amilasa.shtml#ixzz4uNbifDGl
2. https://es.scribd.com/doc/39218792/COFACTORES-Y-COENZIMAS
3. http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz22.htm#t
4. http://lccbtis7.blogspot.pe/2011/06/enzimas.html
5. http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/velocidad%20reaccion%
20enzimatica4.html
6. https://cienciaencomun.wordpress.com/2016/01/26/quimica-rotulador-
billetes-falsos/
7. http://laurafitness.es/7-mejores-enzimas-vegetales-y-su-funcion/
8. https://elvagodelbarrio.wordpress.com/2011/11/22/importancia-de-las-
enzimas/
9. http://www.wobenzym.de/lang/es/mas-informacion/como-actuan-las-
enzimas/
10. https://www.academia.edu/15310442/Factores_que_afectan_la_activida
d_de_las_enzimas
11. https://www.hsnstore.com/blog/las-enzimas-digestivas-su-importancia/
IX. ANEXOS

1. Cul es el mecanismo de accin de las sales pesadas sobre la


protena (amilasa)?

Las sales pesadas actan sobre las enzimas desnaturalizndolas. En el caso


de esta prctica la sal pesada que se utilizo fue el CuSO4 y la enzima fue la
amilasa, al reaccionar origina que de la sal se desprenda un ion cprico el
cual une el coo- de la enzima a los grupos de las cadenas laterales originando
la ruptura de los puentes salinos.

2. Cmo actan los cidos y las bases fuertes sobre la protena


(amilasa)? ejemplos.

La exposicin a los cidos y bases fuertes a la amilasa tienden a


desnaturalizar a la protena. Estas tienden a precipitarse de la solucin
acuosa por la adicin de ciertos cidos y bases.

Ejemplo:

cidos fuertes: disminuyen el PH: HCL, ATCA

Bases fuertes: aumentan el PH: NaOH

3. Qu cofactor es necesario para mayor eficacia actividad


enzimtica de la amilasa saliva?

La amilasa, es una enzima que se encuentra en la saliva y su funcin es


desdoblar almidn hasta glucosa. Esta enzima utiliza iones cloro como
cofactor, la ausencia de este, ocasiona que la velocidad de catlisis
enzimtica disminuya. 2

4. Cmo acta la temperatura sobre la estructura proteica de la


enzima?

Con la accin de la temperatura elevada, tambin aumenta la energa cintica


de las molculas que conforman la enzima. El aumento de la temperatura
tambin destruye las interacciones dbiles y desorganiza la estructura de la
protena, de tal forma que el interior hidrfobo interacciona con un medio
acuoso y se reproduce la precipitacin de la enzima desnaturalizada. 3

5. Cmo repercute la modificacin de la estructura proteica producida


por agentes fsicos y qumicos sobre la actividad enzimtica?

La modificacin de la estructura de las protenas (desnaturalizacin) ocasiona


que esta enzima se inactive y no tenga una actividad enzimtica normal.
Algunos agentes son ms desnaturalizantes que otros, por ende la actividad
de la enzima estar ms inactivada si es sometido a altas temperaturas.

6. A qu clase de enzima corresponde la amilasa? Su nombre y su


cdigo EC

La amilasa forma parte de las peptidasas o proteasas a la cual estas son


enzimas digestivas. Nombre -amilasa (alfa-amilasa) es una enzima (EC
3.2.1.1) 4

7. De qu manera influye el PH a la velocidad de una reaccin


enzimtica?

Efecto del pH en la ionizacin del sitio activo: la concentracin de H+ afecta


la velocidad de la reaccin en muchas formas. Primero el proceso cataltico
usualmente requiere que la enzima y el substrato tengan grupos qumicos en
una forma inica particular para poder interactuar. Por ejemplo la actividad
cataltica puede necesitar a un grupo amino, por ejemplo de una lisina en
estado protonado (-NH3+) o no (-NH2+), el pH modifica este estado y por
tanto a la velocidad de la reaccin.5

8. Explique el proceso por el cual el lugol tie de azul intenso al


almidn.
La prueba del yodo es una reaccin qumica usada para determinar la
presencia o alteracin de almidn u otros polisacridos. ... Esta reaccin es
el resultado de la formacin de cadenas de poliyoduro a partir de la reaccin
del almidn con el yodo presente en la solucin de un reactivo llamado Lugol.

9. Haga la estructura qumica del almidn

El almidn es un polmero de glucosa est formado de dos subpolmeros, uno


lineal llamado amilosa y el de las ramificaciones se llama amilopectina. Las
glucosas se unen por enlaces glucosidicos -1,4- y en las ramificaciones por
enlaces glucosidicos -1, -6.6

10. Cmo se prepara una solucin de lugol?

Consiste en 20 gramos de yodo diatmico y 40 gramos de yoduro potsico,


disueltos en un litro de agua destilada. El yoduro potsico facilita la disolucin
del yodo diatmico, debido a la formacin de iones triyoduro.

11. Qu otros factores pueden considerarse para demostrar que las


enzimas son protenas?

Las enzimas son un grupo de protenas que tienen gran importancia en la


vida. Gracias a ellas se realizan las reacciones qumicas en las clulas. Todas
las clulas contienen una enzima llamada catalasa que descompone al agua
oxigenada (perxido de hidrgeno). Cuando derramamos perxido de
hidrgeno sobre una herida abierta, se produce espuma por la accin de la
catalasa presente en las clulas. El hombre ha usado enzimas desde los
tiempos prehistricos para producir vino, vinagre, queso, etc.
12. Mencione cuatro enzima que pueden extraerse vegetales

1) La planta de la pia contiene altos niveles de una enzima digestiva


llamada bromelina.
2) El kiwi tambin conocido como la grosella china, contiene una enzima
llamada proteasa actinidain.
3) La ficina es una enzima, una cisteinilproteinasa, aislada del ltex de
algunas especies y variedades de higueras e higos.
4) La enzima papana se extrae del ltex del rbol de papaya. 7

13. Importancia de las enzimas

Las enzimas son importantes ya que disminuyen la energa de activacin,


permitiendo acelerar todo tipo de reacciones qumicas, ya que estas son muy
lentas y requieren de mucha ms energa. Las enzimas son esenciales en
mucho de los procesos necesarios para la vida por ejemplo: digerir alimentos,
regenerar tejido, degradar sustancias). 8

14. Buscar informacin sobre enzimas: Qu son? Cmo actan?


Qu factores afectan su actividad?

Las enzimas son compuestos qumicos que mantienen el metabolismo en


marcha. Las enzimas ayudan en las lesiones deportivas, cuando hay dolores
articulares reumticos y en muchos otros tipos de molestias. 9 Algunos
factores que influyen en la actividad de las enzimas son: Cofactores y
coenzimas, temperatura, pH, concentracin del sustrato, inhibidores,
mecanismos reguladores.10
15. Buscar informacin sobre el enzima amilasa: Qu reaccin
cataliza? Dnde se encuentra? Por qu es tan importante?

La amilasa, es una enzima hidrolasa que tiene la funcin de catalizar la


reaccin de hidrlisis de los enlaces 1-4 del componente -amilasa al digerir
el glucgeno y el almidn para formar azcares simples. Se produce
principalmente en las glndulas salivales (sobre todo en las glndulas
partidas) y en el pncreas. La amilasa es una enzima digestiva que ayuda
al cuerpo a digerir los carbohidratos. Acta sobre los almidones y los
azcares. Proporciona glucosa.11
Anexos visuales

1)

2)
3)