Anlisis de Protenas

Electroforesis, Transferencia e Inmunodeteccin

advansta
 Anlisis de Protenas

Anlisis de Protenas:
Electroforesis, Transferencia e Inmunoprecipitacin.
Un manual de laboratorio de la empresa Advansta

Western Blot es una tcnica analtica, ampliamente utilizada, para el estudio de protenas.
Este mtodo, descrito por primera vez por Towbin, et. al1, permite la deteccin de una sola
protena dentro de una muestra biolgica. La especificidad de Western Blot se logra me-
diante la utilizacin de un anticuerpo que reconoce y se une a un eptopo nico de la pro-
tena de inters.
Con la tcnica de Western Blot se puede estimar el tamao de una protena, confirmar la
presencia de modificaciones post-traduccionales como la fosforilacin,
y ser utilizado para comparar cuantitativamente los niveles
de protena entre muestras.
Esta gua de laboratorio describe los pasos
involucrados en la realizacin de un Western
blot, incluyendo la preparacin de muestras,
la separacin de protenas, la transferencia y
la deteccin.

ndice de Contenidos Pgina

1. Western Blot: Visin General 2

2. Preparacin de las muestras 4

3. Electroforesis en gel de Poliacrilamida 5

4. Transferencia Electrofortica 11

5. Hibridacin Anticuerpos 13

6. Deteccin 15

7. Solucin de Problemas 17

8. Herramientas y Referencias Tcnicas 21

1. Towbin, H. et. al. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some appli-
cations. Proc Natl Acad Sci U S A. 76(9):4350-4.

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 Western Blot:
Visin General
1. Western Blot: Visin General
Consulte los captulos siguientes para obtener ms detalles acerca de cada paso.
a. Preparacin de la muestra
Extraccin de las protenas de
las muestras biolgicas me-
diante disrupcin mecnica o
qumica.
b. Electroforesis en gel de
Acrilamida
Las protenas en el extracto se
separan de acuerdo a su ta-
mao mediante electroforesis.
Se prepara un gel de acrilami-
da, bisacrilamida.
El dodecilsulfato de sodio
(SDS) aadido al gel se une a
las protenas y confiere, de
forma proporcional a la masa
de cada protena, una carga
negativa a cada una de ellas.
c. Transferencia electroforti-
ca a una membrana
Las protenas son transferidas
electroforticamente a un
soporte rgido o membrana,
dnde quedan inmovilizadas.
Los materiales de partida incluyen La disrupcin mecnica
planta, tejidos animales, clulas con un homogenizador
cultivadas, levadura, o bacterias. disgrega los tejidos.
Procesos adicionales
logran el fraccionamien-
to subcelular
Se usan tampones con-
teniendo detergentes
para la lisis celular
Figura 1. Preparacin de muestras
Se aade un coloran-
te de carga. As, la Se utiliza una pipeta para
migracin de la mues- cargar las muestras en los
tra se puede monitori- pocillos del gel Una fuente de ali-
zar. mentacin propor-
ciona el voltaje
El gel se coloca dentro de un tanque
de electroforesis lleno de tampn,
que conducir la corriente. La prote-
nas con carga negativa migran des-
de el nodo.
Figura 2. Electroforesis en Acrilamida
El gel y la membrana se coloca Se aplica voltaje en el
entre papel de filtro y almohadillas tanque de transferencia y
de esponja.. las protenas migran desde
el gel a la membrana.
Un cartucho aplica presin y
mantiene un estrecho contacto
entre el gel y la membrana.
Figura 3. Transferencia de Protenas a la Membrana
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Anlisis de Protenas

a. Hibridacin del Anticuerpo

La membrana con las prote-

nas inmovilizadas debe tratar-
Los materiales de partida incluyen
se para bloquear las zonas tejidos vegetales, tejidos animales,
con ausencia de protenas y clulas en cultivo, levadura, o bac-
as evitar la unin no especfi- terias.
ca de los anticuerpos.
A continuacin se incuba con
un anticuerpo primario dirigi-
do contra el eptopo especfi-
co de la protena diana.
Tras varios lavados de la mem-
brana, se adiciona un anti-
Figura 4. Hibridacin de Anticuerpo
cuerpo secundario marcado
que se unir de forma espec-
fica al anticuerpo primario,
proporcionando una forma
de deteccin.

e. Deteccin de las Bandas

Despus de un lavado de la
membrana para eliminar el
anticuerpo no unido, se pro-
cede a detectar la localiza-
cin de la banda en la mem-
brana. Para la deteccin de
quimioluminiscencia, se utiliza
un anticuerpo secundario
conjugado con el enzima pe-
roxidasa (HRP); la adicin de
un sustrato de HRP provoca
una reaccin enzimtica que
da como resultado final la
emisin de luz. Dicha luz pue-
de ser detectada en una pel-
cula de rayos X, o de forma
digital, mediante un sistema
de captacin de imgenes.
La deteccin de fluorescen- Figura 5. Deteccin quimioluminiscente de las bandas de protenas
cia se basa en la captacin
de luz emitid por sustancias
fluorforas conjugadas con el
anticuerpo secundario.

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 Preparacin
de la muestra

2. Preparacin de la muestra
Una adecuada preparacin de la muestra es Tabla 1. Mtodos fsicos para la dirupcin de muestras
esencial para tener xito en un ensayo de Wes-
Mtodo Descripcin Tipo de muestra
tern Blot. En la mayora de ensayos, las protenas
se extraen mediante procesos qumicos y/o Licuadora La muestra se tritura Gran cantidad de
mecnicos. El mtodo elegido depender del mediante cuchillas tejido
rotatorias
tipo de muestra de partida, de la localizacin
subcelular de la protena y de las condiciones Homogenizador Tubo de vidrio con Clulas tisulares; til
ptimas que requiera el anticuerpo para recono- Dounce pistn ajustado maja para protocolos de
las clulas por ac- enriquecimiento de
cer el eptopo proteico. En la tabla 1 se resumen cin de corte. protenas mitocon-
los mtodos mecnicos que habitualmente se driales o nucleares
utilizan en la extraccin de protenas para inmu- Homogenizador de Ondas de sonido Clulas, tejidos, bac-
notransferencia. ultrasonidos emitidas por una terias.
sonda para romper
A menudo, en muestras tisulares de plantas y ani- las membranas celu-
males, se requiere el uso de un proceso mecni- lares
co para la disrupcin de la compleja matriz celu- Pulverizacin en La muestra se pulve- Tejido animal o o
lar. Disrupcin mecnica que suele preceder a un Nitrgeno lquido riza utilizando un vegetal
proceso qumico de lisis celular, mediante el uso mortero y una almi-
rez refrigerados
de solucin tampn que contiene detergentes,
que va dirigida a enriquecer la protena de inters Perlas de vidrio La ruptura celular se Levaduras
produce por agita-
dentro del extracto final. Las clulas en cultivo,
cin de las perlas de
frecuentemente, se suelen lisar utilizando una so- vidrio
lucin tampn con detergente y sin la aplicacin
de mtodos mecnicos.

La estructura qumica de los detergentes permite

romper las membranas celulares y solubilizar las
protenas. Estas substancias tienen una parte po-
Tabla 2. Soluciones Tampn y detergentes, segn el tipo de pro-
lar y otra no polar y se pueden clasificar segn las tena de inters y la localizacin subcelular
caractersticas del grupo polar: inicos si el grupo
Tipo/Localizacin Detergente o Solu- TComentarios
polar tiene carga positiva o negativa, no inicos si Protena de inters cin Tampn
no poseen carga o zwiterinicos si poseen carga
Nativa (no desnatu- Detergente suave Evitar detergentes
negativa y positiva y la carga neta es 0. ralizada) no inico desnaturalizantes
(SDS, Deoxicolatos)
La eleccin de la substancia detergente, depen-
de en parte de la localizacin, dentro de la clu- Citoplasmticos Tris-HCl Puede combinarse
(soluble) con mtodos mec-
la, de la protena de inters, citoplasmtica, uni-
nicos, tales como el
da a la membrana, dentro de orgnulos celulares homogenizador
como el ncleo y las mitocondrias, etc...Las pro- Dounce
tenas citoplasmticas se pueden unir a las prote- Citoplasmtico Tris-Triton Los detergentes
nas del citoesqueleto, afectando as a los proce- (unida a citoesque- Triton son suaves y
sos de fraccionamiento subcelular. leto) no inicos
Membrana mitocon- NP-40, RIPA Para antgenos con
En la tabla 2 se clasifican las soluciones tampn y drial o nuclear (multiples detergen- niveles bajos de
detergentes, ms utilizados habitualmente, segn tes), Triton X-100 expresin pueden
el tipo de protena y localizacin subcelular. ser necesarios pro-
cesos de enriqueci-
miento
Lisado total de clu- NP-40, RIPA,
las Triton X-100

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Anlisis de Protenas

Con la rotura celular, se liberan enzimas proteasas Tabla 3. Inhibidores de fosfatasas y proteasas utilizans en la ex-
traccin de protenas.
que pueden degradar la protena de inters. Por
tanto, es importante evitar, durate la preparacin Inhibidores Protea- Concentracin en Enzimas diana
de la muestra, cualquier actividad protesica. sas el Tampn de lisis

Aprotinina 1-2 g/ml Proteasas de Serina

La siguiente estrategia ayuda a evitar la degra-
dacin de protenas: EDTA 1-10 mM Mg++/Mn++ Metalopro-
teasas
Evitar excesivos ciclos de congelacin/
EGTA 1-10 mM Ca++ Metaloproteasas
descongelacin.
Leupeptin 1-2 g/ml Proteasas de Serinas,
Trabajar rpido y mantener las muestras en Cisteinas
fro durante todo el proceso. Pepstatina A 1g/ml Proteasas de Aspartico
Aadir inhibidores de la proteasa en el PMSF (17-170 g/ml) Proteasas de Serina
tampn de lisis. O,11 mM

Adems de inhibir la actividad de la proteasa, Inhibidores Concentracin en Enzimas diana

puede ser interesante reducir la actividad de la Fosfatasas el Tampn de lisis
fosfatasa alcalina, en particular en estudios de
- Glicerofosfato 1 mM Fosfatasas Serina/
fosforilacin. Treonina
En la tabla 3 se muestran los inhibidores deprotea- EDTA 1-10 mM Mg++/Mn++ Metalopro-
sa y fosfatasa de uso ms habitual. teasas

EGTA 1-10 mM Ca++ Metaloproteasas

Leupeptin 1-2 g/ml Proteasas de Serinas,

3. Electroforesis en Acrilamida Cisteinas

Pepstatina A 1g/ml Proteasas de Asparti-

Las protenas del extracto se separan mediante co
electroforesis en gel de poliacrilmaida (PAGE). En
PMSF (17-170 g/ml) Proteasas de Serina
primer lugar, las protenas, se revisten con carga O,11 mM
negativa, mediante la accin del detergente Do-
decilsulfato Sdico (SDS), as Las protenas, se
pueden separar en el gel segn su tamao (SDS-
PAGE).

Medicin de protena total

Previamente a la electroforesis, es importante de-

terminar la concentracin de protenas por las
siguientes razones:

1. Asegurar la carga de la cantidad correcta de

protenas en el gel.

La cantidad de protena ptima a cargar de-

pender de la prevalencia de la protena de
inters y de la sensibilidad del anticuerpo pri-
mario.
Cargar mucha cantidad puede dar lugar a un
mayor ruido de fondo y unin no especfica de
los anticuerpos. A menudo, para determinar la
carga de protena apropiada, se requiere
hacer experimentos preliminares con cantida-
des seriadas de protenas.
Nota: con el kit Afyon SDS-PAGE de preparacin de
muestra, se puede controlar la cantidad de carga de la pro-
tena mediante la cantidad de resina utilizada, evitando la
necesidad de determinar la concentracin de protena. Por
ejemplo, para 5 g de protena se utilizan 20 l de resina Af-
yon.
Informacin para pedidos
K-02101-025 Afyon SDS-PAGE ssmple preparation kit

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 Electroforesis
en Acrilamida

2. Realizacin de Western Blots cuantitativos o Tabla 4. Mtodos fsicos para la dirupcin de muestras
semi-cuantitativos. Ensayo Descripcin Ventajas Inconvenientes

Si la cantidad de protena cargada por carril Bradford El colorante La realizacin Interferencia

es la misma, se pueden comparar los niveles azul de Coo- de los ensayos de SDS o de
masie se une a son general- otros deter-
relativos de la protena de inters. Un experi- las protenas y mente rpidos gentes a
mento de Western Blot cuantitativo es til para sufre un cam- y sencillos altas con-
estudio de cambios de expresin de protenas bio de absor- centraciones
o de modificaciones proteicas como la fosfori- vancia .
Rango lineal
lacin. pequeo.
Descripcin del mtodo BCA Reduccin de Compatible Interferencia
iones de Cu2+ con la mayo con agentes
Existen diversos mtodos para medir la protena mediante inter- - quelantes o
total de una muestra. Los ms habituales son los acin con las ra de deter- reductores del
protenas, el gentes Cobre
mtodos Lowry, Bradford y cido Bincocinico BCA se une a Comercial-
(BCA) (Tabla 4). Estos ensayos colorimtricos se los iones de mente dispo-
basan en las reacciones que se producen entre Cu1+ y forman nible en for-
las protenas de la muestra y los reactivos de de- un producto mato com-
coloreado que patible con
teccin. se puede me- agentes
dir espectrofo- reductores.
Con el fin de determinar la concentracin de pro- metricamente Menos varia-
tenas totales en una muestra, se debe realizar (reaccin de cin prote-
una curva estndar en cada ensayo. Esto se logra Biuret) na-protena
con la realizacin de un ensayo de concentra- que en el
mtodo
cin crecientes, de protena pura. El estndar utili- Bradford.
zado con mayor frecuencia es la albmina de
Lowry Similar al BCA Muy bien cita- El tiempo de
suero bovino (BSA), aunque se puede utilizar cual- (reaccin de da en literatura ensayo pue-
quier protena producida en el laboratorio o dis- Biuret) de ser mayor
ponible comercialmente. que en otros
mtodos
En la figura 6 se muestra un ejemplo de una curva No es prcti-
estndar. Los valores de absorvancia se trazan en co para
grupos gran-
funcin del contenido conocido de la protena des de
estndar utilizada. El contenido de la protena de muestras
inters en la muestra (lnea verde) se puede de- Se pueden
terminar mediante la extrapolacin de la absor- formar preci-
pitados
vancia obtenida a la cantidad o concentracin
de protena correspondiente.

Eleccin de un ensayo de protenas

Hay muchos kits de determinacin de protenas

Absorvancia

disponibles comercialmente. La eleccin depen-

de de muchos factores:

El equipo de lectura disponible en el labora-

torio (espectrofotmetro, lector de placas,
etc).

Los reactivos del tampn de lisis - revisar el

protocolo del fabricante para identificar
Protena (mg)
sustancias interferentes.

La cantidad de muestra disponible. Figura 6. Ejemplo de la curva estndar de un ensayo de pro-

La facilidad/rapidez del ensayo.
tenas. Se representa la absorvancia de las soluciones estndar
que contienen la protena conocida (lnea roja). La concentra-
cin de la protena de inters se puede determinar extrapolan-
do la absorvancia obtenida en la curva patrn o estndar
(lnea verde de puntos).

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Anlisis de Protenas

Tampn de carga de muestras La protena se encuentra en su

estado conformacional, mante-
Una vez se tienen las muestras de protena, se niendo su carga intrnseca
pueden conservar congeladas, teniendo cuida-
do en evitar ciclos repetitivos de congelacin/
descongelacin. Alternativamente, se pueden
SDS
utilizar inmediatamente, combinndolas con un
tampn de carga y cargar la muestra en un gel
de electroforesis. Los componentes del tampn
de carga varan, dependiendo de las condicio-
nes deseadas. Los ingredientes tpicos de un
tampn de carga para detectar protenas bajo
El SDS se une a la protena y da
condiciones desnaturalizantes/reductoras se des- lugar a una linearizacin y a una
criben en la Tabla 5. No se utilizarn ni SDS, beta uniformidad de la carga negativa
mercaptoetanol o ditiotreitol, si se necesitan con- de sta.
diciones no desnaturalizantes /no reductoras.
Figura 7. Mecanismo de desnaturalizacin por SDS de las prote-
nas.
Previamente a la carga del gel, las muestras se
someten a una incubacin a 95C durante 5-10
minutos, para asegurar que la desnaturalizacin/
reduccin es total. En condiciones no desnaturali-
zantes/no reductoras, esta incubacin no es ne-
cesaria. En la Figura 7 se ilustra cual es el mecanis-
mo de desnaturalizacin del SDS. Tabla 5. Componentes del tampn de carga.

Reactivo Propsito

Glicero. Aportan Viscosidad/densidad para arrastrar

la muestra la fondo del pocillo y evitar que se
extienda a los pocillos adyacentes.
Azul de Bromofe- Molcula colorante pequea:
nol Da color a la muestra para ayudar a
la carga.
Migra por delante de las protenas, de
modo que se puede hacer el segui-
miento del movimiento de las muestras
en el gel.
SDS Detergente desnaturalizante
Cola hidrofbica que rodea la esque-
leto peptdico.
Unin a la protena de forma regular,
Nota: Los tampones de carga permiten ahorrar tiempo y aportando carga negativa de forma
garantizan que las muestras se separan de forma reproduci- proporcional al tamao de la prote-
ble, carril a carril y gel a gel. Advansta dispone de tampones na.
de carga reductores y no reductores. Evita las interacciones hidrofbicas y
rompe los enlaces de hidrgeno.
Destruye la estructura secundaria/
Informacin para pedidos terciaria y lineariza la protena.

R 03018-B10 Non-reducing protein sample loading buffer (2x) Beta Mercaptoe- Agentes reductores
tanol o DTT Evita la oxidacin de cistenas.
R-03019-B10 Reducing protein sample loading buffer (2x) Completan la linearizacin de la pro-
tena al romper los puentes disulfuro.
Tampn Tris Peps- Mantiene el pH adecuado
tatina A

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 Electroforesis
en Acrilamida

Gel de Electroforesis Tabla 6. Componentes del gel de acrilamida en las electroforesis

de protenas
Si se requieren condiciones naturales para que el
Reactivos Propsito
anticuerpo pueda detectar el eptopo, en la
electroforesis no se aadir SDS ni en el gel ni en
Acrilamida Molculas que polimerizan para formar
el tampn de electroforesis. En esta situacin, cadenas.
tambin conocida como PAGE nativo, las prote-
Bisacrilamida Forman uniones con las cadenas de acri-
nas mantienen su estructura tridimensional y la lamida para formar un entramado.
migracin en el gel depende de su masa: rela-
SDS Mantiene la linearidad y la uniformidad
cin de carga de la protena por encima de su de carga de las protenas segn la elec-
tamao. Sin embargo, la mayora de ensayos troforesis.
Western Blot, se realizan en geles de poliacrilami-
Tampn Tris Mantiene el pH adecuado.
da conteniendo SDS (SDS-PAGE) en condiciones
desnaturalizantes. Bajo estas condiciones desna- Persulfato de Amonio Generacin de radicales libres que cata-
turalizantes y de reduccin, las protenas carga- lizan la reaccin de polimerizacin.
das negativamente, cuando se someten a un TEMED Aumenta la generacin de radicales
campo elctrico, migran al electrodo positivo. libres por el persulfato de amonio.
Debido a que el SDS iguala la carga en todas las
protenas, la tasa de migracin viene determina-
da por su peso molecular. Las molculas ms pe-
queas migran ms rpidamente que aquellas
con pesos moleculares mayores.

Los geles de SDS-PAGE estn disponibles comer-

cialmente o se pueden elaborar en el propio la-
boratorio. Los geles pre-fabricados son muy
prcticos pero debido al coste, no son tan renta-
bles como los elaborados por el usuario. En la ta-
bla 6, se describen los componentes qumicos de
un gel de SDS-PAGE.

Eleccin del grosor del gel y del tamao de poro

El tipo de muestra y el peso molecular de la pro-

tena de inters dictan el espesor y tamao de
poro del gel.
Tabla 7. Rango de separacin de protenas segn el porcentaje
Los espaciadores de gel (ver Figura 8) con- de acrilamida.
trolan el espesor del gel. Estn disponibles en Porcentaje Rango Peso Molecular (kDa)
diversos tamaos.
7,5 25-500
Los geles con mayor espesor, pueden acep-
tar mayor volumen de carga. Tambin se
10 15-300
procesarn ms lentamente y requieren
tiempos de transferencia mas largos que los
12 10-200
geles ms delgados

El porcentaje del gel, segn la cantidad de 15 10-45

acrilamida y bisacrilamida, determina el ta-
20 5-40
mao del poro. A ms porcentaje menos
tamao de poro.

El tamao de poro determina la ratio de se-

paracin de las protenas. (tabla 7).

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Anlisis de Protenas
Elaboracin del gel
Si el gel de acrilamida esta elaborado en el labo-
ratorio, los distintos reactivos se mezclan y se vier-
te en el molde, formado por el conjunto de dos
cristales, espaciadores lateral, espaciador inferior,
peines y un sistema de sujecin (Figura 8), dnde
la acrilamida se polimeriza en aproximadamente
30 minutos. Para mejorar la nitidez de la banda el
gel resolutivo se corona con una acrilamida de
menor porcentaje (stacking gel).
Diseo Experimental; Controles y Estndares
Antes de la carga del gel, es importante disear
el experimento incorporando los controles y
estndares necesarios para la validacin de los
resultados. Los tipos de estndares y controles utili-
zados incluyen:
1. Marcadores de Peso Molecular.
Son una mezcla de protenas purificadas de
peso molecular conocido.
Se utilizan para verificar si la protena de in-
ters est dentro del rango de tamao apro-
piado.
Disponible en diversos intervalos de pesos
moleculares, as como teidos o incoloros.
Las versiones preteidas se utilizan para
controlar el progreso de la electroforesis y
comprobar la eficacia de la posterior trans-
ferencia.
Pueden estar marcadas por la deteccin
por fluorescencia o quimioluminiscencia.
2. Controles Positivos.
Para verificar si el anticuerpo primario se une
a la protena correcta.
Generalmente, si est disponible, son una
muestra de la protena de inters purificada.
Puede ser una lnea celular que sobreexpre-
se la protena de inters.
Puede ser una muestra de tejido del que se
conozca que expresa altos niveles de la pro-
tena de inters. Se pueden utilizar otras es-
pecies como tejido de control si el anticuer-
po tiene reactividad cruzada apropiada.
Pgina 9
1. Colocar los espaciadores de la parte inferior y laterales entre
los cristales.
2. Tras fijacin de los lados, verter el gel resolutivo y esperar que
el gel se polimerice.
3. Colocar el peine en la parte superior del gel.
4. Verter el stacking gel y quitar el peine una vez el gel haya
polimerizado. Lavar los pocillos con ddH20. El gel est listo
para cargar las muestras y la electroforesis.
Figura 8. Preparacin del gel de electroforesis para la separa-
cin de protenas.
Controles de carga
Como norma general se utilizan protenas con
niveles de expresin constante para todas las
muestras. Similar a los housekeeping genes
en Biologa Molecular.
Algunos tratamientos pueden alterar la expre-
sin de estas protenas housekeeping.
Se utiliza para verificar que la carga de prote-
na por carril es ms o menos igual, as los nive-
les de protenas se pueden comparar de forma
cuantitativa.
La expresin cuantitativa de la protena de in-
ters puede normalizarse con la del control de
carga para cada muestra.
Pptidos de bloqueo
Algunos proveedores ofrecen pptidos de blo-
queo para sus anticuerpos.
El pptido de bloqueo se mezcla con el anti-
cuerpo primario antes de la incubacin con la
membrana y evita la unn del anticuerpo a la
protena diana. Por tanto no se detectar nin-
guna banda.
Estos estudios demuestran que el anticuerpo
utilizado se une de forma especfica a la prote-
na de inters.
 Electroforesis
en Acrilamida

Inicio de Electroforesis
Muestra (pH 6,8)
Las muestras se cargan en los pocillos del gel me-
diante una pipeta. Normalmente se cargan de 20
a 40 g de protena total por carril. Es importante
conocer de antemano, el volumen que se puede
cargar por pocillo, para as evitar sobrecargas
Gly
que pueden dar lugar a la prdida de muestra o Proteinas Stacking Gel
derrames en pocillos adyacentes. Una vez finali- CL- pH 6,8
zada la carga, el gel se somete a un campo elc-
trico generado por una fuente de alimentacin. El
tampn utilizado durante la electroforesis, contie-
ne Tris (mantiene el pH), Glicina (conductor elec-
tricidad) y SDS (mantiene las protenas cargadas
Gly Resolving Gel
negativamente). El progreso en el gel se monitori- Proteinas pH 8,8
za observando el frente coloreado por el coloran-
te presente en el tampn de carga y la posicin
de los marcadores de tamao siempre que estos
estn teidos.

La tcnica de electroforesis ms habitualmente

utilizada es la de Laemmli. En este mtodo, los
valores de pH de la capa de gel de apilamiento
o concentracin (Stacking Gel) y el gel de resolu-
cin (Resolving Gel) son diferentes. La figura 9 ilus-
tra el flujo de iones durante la electroforesis.
Tampn de Electroforesis (pH 8,3)
La glicina tiene carga negativa en el tampn de electrofo-
resis a pH 8,3.
Con la aplicacin de un campo elctrico, la glicina, en el
Stacking Gel, se aleja del electrodo negativo.

La glicina empieza a perder su carga a pH 6,8 y ralentiza

su movimiento. Los iones de cloruro avanzan por delante
de la Gly. El aumento de la resistencia, obliga a las prote-
nas a alejarse, de forma apilada, del electrodo negativo.

La glicina, debido a un mayor pH del Resolving Gel, au-

menta su carga negativa y se mueve por delante de las
protenas.

Las protenas se separan segn su peso molecular por el

Figura 9. Concentracin de bandas de protenas por el flujo

inico en el sistema discontinuo de Laemmli.

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Anlisis de Protenas

4. Transferencia a una Membrana

Una vez la electroforesis del gel ha terminado, las
protenas se transfieren a una membrana. La
membrana es un soporte slido que une e inmovi-
liza las protenas, permitiendo as que la hibrida-
cin de un anticuerpo las pueda detectar. La
mayora de los sistemas de transferencia utilizan la
generacin de un campo elctrico para condu-
cir a las protenas desde el electrodo negativo al
positivo. Los sistemas de transferencia estn dispo-
nibles en formato semiseco o hmedo. Los siste-
mas semisecos son ms rpidos y requeiren menor
cantidad de volumen de Tampn que los siste-
mas hmedos, sin embargo no son apropiados
para transferencia de protenas de gran tamao
(>70 kDa) y pueden causar, segn el sistema de
deteccin, un mayor ruido de fondo. Ambos
mtodos requieren, para una transferencia efecti-
va de las protenas, un estrecho contacto entre el
gel y la membrana.

Aunque ambas funcionan bien en experimentos

de inmunotransferencia, las diferencias en sus ca- Figura 8. Transferencia de protenas a una membrana.
ractersticas puden influir a la hora de la eleccin.
La membrana de PVDF, ofrece una mayor resis-
tencai mecnica, resistencia la SDS y una mayor
unin que la nitrocelulosa. La membrana de nitro-
celulosa tiene la ventajas de proporcionar un me-
nor ruido de fondo y que no requieren un pre-
tratamiento con metanol. Recientemente se han
desarrollado, con el objetivo de reducir el ruido
de fondo al utilizar mtodos de deteccin de fluo-
rescencia, membranas PVDF de baja autofluores-
cencia.

Previamente a la transferencia, tanto el gel como

la membrana se equilibran en una solucin
tampn pre-enfriada. Tpicamente, el tampn de
transferencia contiene Tris, Glicina, SDS (opcional)
y metanos (para membranas de nitrocelulosa). La
figura 10 ilustra como se ensamblan el gel y la
membrana en un transferencia semiseca o hme-
da.
Nota: Advansta suministra membranas de transferencia pre
-cortadas de nitrocelulosa o PVDF aptas de tamao de mini-
gel. El uso de membranas pre-cortadas permite ahorrar tiem-
po y elimina la contaminacin accidental de las membranas
con guantes o tijeras contamindas.
Informacin para pedidos
L-08001-010 Membrana PVDF baja fluorescencia 7x9 cm

L-08002-010 Membrana Nitrocelulosa 0,45 m 8x10 cm

L-08003-010 Membrana Nitrocelulosa 0,22 m 8x10 cm

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 Electroforesis
en Acrilamida
A continuacin se describen algunas sugerencias
para la consecucin exitosa de una transferen-
cia:
Evitar la manipulacin de las membranas con
las manos desnudas. Las protenas y aceites de
la piel pueden adherirse a la membrana y pue-
den dar lugar a manchas no deseadas en la
membrana.
Las burbujas de aire entre el gel y la membra-
na pueden causar transferencia defectuosa y
desigual. Se pueden eliminar haciendo rodar
suavemente una pipeta Pasteur por encima
del sndwich formado por el gel/
membrana/papel de filtro.
No permitir un sobrecalentamiento durante la
transferencia. Es aconsejable utilizar tampn
frio, un sistema de refrigeracin o hacer la
transferencia en una cmara fra. Disminuir el
voltaje o el tiempo si fuera necesario.
Ajustar las condiciones de transferencia al ta-
mao de la protena. Las protenas ms peque-
as se transferirn ms rpidamente y pueden
atravesar la membrana. Reducir o eliminar el
SDS o utilizar una membrana con un tamao
de poro menor puede ayudar a una mayor
retencin de la protena. Incrementar la canti-
dad de SDS y disminuir la concentracin de
Metanol pueden facilitar la transferencia de
protenas de gran tamao.
La aparicin de marcadores de tamao prete-
idos en la membrana es indicacin que se ha
completado la transferencia.
El colorante Ponceau S puede utilizarse para
teir la membrana y asegurarse de la eficacia
de la transferencia. La membrana debe ser
desteida antes del proceso de transferencia.
La tincin con Coomassie puede usarse para
la tincin del gel una vez realziada la transfe-
rencia y comprobar los residuos de protena en
el gel.
Bloqueo
El bloqueo de la membrana se lleva a cabo incu-
bando con una solucin diseada para reducir los
lugares de unin no especficos al anticuerpo. A me-
nudo, son soluciones a base de protenas, como la
leche descremada en polvo o la albmina de suero
bovino (BSA). La primera eleccin, cuando se inicia
un nuevo protocolo, es la utilizacin de la leche des-
cremada en polvo, ya que es ms rentable que el
BSA, sin embargo y debido a la presencia de biotina
en las fosfoprotenas, puede que no sea la mejor
eleccin cuando se van a utilizar anticuerpos fosfo-
especficos o en mtodos de deteccin de biotina.
Es preferible, para estas y otras situaciones, el uso
de agentes bloqueantes no proteicos.
El agente bloqueante se diluye en TBS (Tampn
Tris salino) o en PBS (Tampn Fosfato salino); se
puede aadir tambin detergente Tween 20.
Una incubacin durante una hora
(temperatura ambiente o a 4C) suele ser sufi-
ciente para un bloqueo de los lugares de unin
no especficos del anticuerpo. Si los niveles del
ruido de fondo son demasiados altos, se pue-
den seleccionar otras soluciones de bloqueo
alternativas.
Nota: Advansta ofrece soluciones optimizadas de bloqueo
y de lavado para su lnea de reactivos de deteccin, Wes-
ternBright, as como soluciones tampn en polvo de PCS, TBS,
...que facilitan una rpida y fcil preparacin
Informacin para pedidos
R-03024-D50 AdvanWashTM, 500 ml
R-03023-D20 AdvanBlockTM-PF, 200 ml
R-01038-020 AvantTM Buffer Pouches - PBS
R-01039-020 AvantTM Buffer Pouches - TBS
Pgina 12
Anlisis de Protenas

5. Hibridacin del Anticuerpo.

Despus del proceso de bloqueo, la membrana Tabla 8. Anticuerpos Policlonales vs Monoclonales.
se incuba con el anticuerpo primario. En general, Anticuerpos Anticuerpos
los anticuerpos reconocen una secuencia de Monoclonales Policlonales
aminocidos pequea (eptopo) que queda ex-
Reconocimiento Reconocimiento Reconocimiento
puesta al eliminar la estructura tridimensional de epitopo y de un nico ep- mltiples eptopos
la protena en condiciones desnaturalizantes y sensibilidad topo en una protena
reductoras. Los geles nativos se pueden utilizar Menos sensibili- Ms sensible debi-
cuando los anticuerpos requieren de la protena dad debido a do a los multiples
que slo un anti- lugares de unin
plegada para el reconocimiento del antgeno. cuerpo se une a de anticuerpo en
cada protena cada protena.
Bueno para prote-
nas poco abun-
dantes.
Anticuerpos Primarios: Reactividad cruza- Reactividad cru- Reactividad cruza-
Monoclonal vs Policlonal. da potencial zada menos da ms probable.
probable. Mayor ruido de
Potencial para fondo potencial
En la transferencia Western se pueden utilizar, tan- reconocer otras debido al recono-
to anticuerpos primarios monoclonales como poli- protenas que cimiento de multi-
clonales. Los dos tipos tienen distintas ventajas y contengan el ples eptopos.
desventajas y se diferencian segn la forma en la eptopo. Reactividad cruza-
da con otras espe-
que se sintetizan. El primer paso en la produccin cies ms probable.
de ambos anticuerpos, es la inyeccin de un ant-
Tiempo requerido Largo Ms corto
geno en un animal, para provocar una respuesta para su produccin
inmune. Los anticuerpos policlonales se obtienen
Coste de Prepara- Mayor coste - re- Menor coste
directamente a partir del suero del animal,
cin quiere personal
comnmente conejo, cabra, burro u oveja y son capacitado y equi-
finalmente purificados y probados. Los anticuer- pamiento especiali-
pos policlonales reconocen mltiples eptopos del zado.
antgeno y en cambio los monoclonales recono- Variabilidad Los lotes de un mis- Propenso a cierta
cen un nico eptopo de la protena. Para la snte- mo hibridoma son variabilidad entre
sis de un anticuerpo monoclonal, las clulas que muy estables. lotes.
sintetizan anticuerpos se aslan del bazo del ani- Tolerancia a condi- Poca tolerancia - Ms tolerante a con-
mal y se fusionan con clulas del mieloma. Lo ciones variables puede dejar de diciones variables.
reconocer al ant-
hibridomas resultantes secretan anticuerpos al
geno en condicio-
medio de cultivo, el cual se analiza y determina nes de desnaturali-
la afinidad al antgeno. Los hibridomas con secre- zacin/reduccin
cin ms estable se seleccionan y pueden ser cul- de la protena, o
por modificaciones
tivados indefinidamente. Algunas caractersticas
qumicas
de los anticuerpos monoclonales y policlonales se (glicosilacin fosfori-
describen en la Tabla 8. lacin) o por dife-
rencias en la se-
cuencia peptdica
debido a la presen-
cia de polimorfis-
mos.

Pgina 13
 Hibridacin
Anticuerpos

Incubacin de los anticuerpos

El anticuerpo primario se diluye en tampn de

bloqueo, TBST o en un tampn de disolucin de
anticuerpo comercial. El fabricante puede reco-
mendar una cantidad inicial, pero a menudo la
concentracin ptima de anticuerpo debe deter-
minarse empricamente. La afinidad del anticuer-
po, la abundancia de la protena en la muestra y
la sensibilidad del sistema de deteccin afec-
tarn a la cantidad de anticuerpo a utilizar.

Generalmente, un periodo de incubacin

de 1 hora a temperatura ambiente suele ser
suficiente. Tambin es posible una incuba-
cin a 4C durante toda la noche.

Durante la incubacin, la membrana debe

someterse a agitacin suave y sumergida en
la disolucin, e incubar en un agitador de
vaivn. Un menor volumen puede utilizarse si
la membrana se sella dentro de una bolsa e
incuba en un agitador orbital.
Nota: Advansta ofrece una lnea completa de anticuerpos
secundarios marcados para deteccin mediante quimiolu-
En algunos casos, la disolucin con el anti- minscencia o fluorecencia.
cuerpo, puede reutilizarse. Si se utiliza acida
sdica como conservante, debe ser total- Informacin para pedidos
mente lavada de la membrana, ya que
R-05051-050 IgG conjugado APC-cabra-anti-conejo, 50 l
puede eliminar la actividad de la peroxidasa
e interferir en los mtodos de deteccin. R-05051-250 IgG conjugado APC-cabra-anti-conejo, 250 l

Despus de la incubacin con el anticuerpo pri- R-05052-050 IgG conjugado RPE-cabra-anti-ratn, 50 l

mario, se procede a la eliminacin del excedente
mediante tampones de lavado (TBS, PBS, TBST o R-05051-250
PBST). En mtodos de deteccin indirectos R-05071-500
(seccin 6), es necesario un anticuerpo secunda-
rio apropiado. A continuacin se describen las
consideraciones a tener en cuenta a la hora de la R-05072-500
eleccin de un anticuerpo secundario:
IgG conjugado RPE-cabra-anti-ratn, 250 l
Anticuerpo Secundario conjugado HRP
cabra-anti-ratn, 500 l
Anticuerpo Secundario conjugado APC
cabra-anti-conejo, 500 l

Las especie del primer Ac dicta la eleccin

del Ac secundario. Si el primer Ac es de co-
nejo, el segundo Ac debe ser anti-conejo, o
sea, deber ser producido en otra especie
distinta a conejo.

Para anticuerpos monoclonales se debe

considerar la clase de Inmunoglobulina (IgG,
IgM, IgA, IgD, IgE) y posiblemente la subclase
(IgG1, IgG2a,). Un anticuerpo con amplia
especificidad inmunoglobulnica debera ser
suficiente, ya que los anticuerpos especficos
para sub-clases se utilian mayoritariamente,
en experimentos de doble etiquetado u
otras aplicaciones.

Pgina 14
 Anlisis de Protenas

6. Deteccin.
La deteccin de la protena se puede hacer me-
diante mtodos directos o indirectos, cada uno
con sus ventajas e inconvenientes. Los mtodos
directos utilizan un anticuerpo primario conjuga-
do con un marcaje detectable, como un enzima,
biotina o molcula fluorescente. Los anticuerpos
se pueden marcar mediante kits disponibles en le
mercado u obtenerlos ya marcados. Lo mtodos
indirectos utilizan dos anticuerpos; un anticuerpo
primario y un anticuerpo secundario contra la es-
pecie del primer anticuerpo. En la deteccin indi-
recta, es el anticuerpo secundario el que est
conjugado con un marcaje detectable. La figura
11,ilustra los mtodos de deteccin directos e in-
directos y en la Tabla 9 se resumen las ventajas e
inconvenientes de los dos mtodos. Figura 11 . Deteccin directa e indirecta de protenas

Tabla 9. Ventajas e Inconvenientes de los mtodos de detec-

cin
Mtodos de deteccin.
Indirecto Directo

Los mtodos ms comnmente utilizados para Ventajas Amplificacin de Menos pasos.

detectar protenas son: 1. Quimioluminiscencia, 2. seal debido a la Menos posibilida-
unin de mlti- des de unin no
Fluorescencia y 3. Colorimetra. ples Ac secunda- especfica.
rios a cada Ac
1. Quimioluminiscencia. primario.
Verstil - el mis-
Los mtodos de deteccin de quimioluminiscen- mo Ac secunda-
cia utilizan comnmente anticuerpos secundarios rio puede utilizar-
conjugados con peroxidasa (HRP). La reaccin se para diversos
anticuerpos de
entre el encima y el substrato produce luz, que la misma espe-
puede ser detectada mediante la exposicin de cie.
la membrana a una pelcula de rayos X o capta-
Inconvenientes Mayor posibili- Puede ser ms
da de forma digital utilizando una cmara CCD. dad de unin no costoso.
inespecfica. La inmunorreactivi-
Ventajas: muy sensible, la membrana puede tra- Ms pasos. dad del Anticuer-
tarse para re-utilizarse, se pueden hacer multiples po puede estar
exposiciones en pelculas de rayos X, fcil de do- afectada por el
marcaje.
cumentar.

Inconvenientes: requiere una habitacin oscura

(pelcula rayos X) o sistemas de imagen caros, se-
micuantitativa - porque se basa en una reaccin
enzimtica, la pelcula tiene un rango dinmico
limitado, la intensidad de la seal puede variar
con la incubacin o el tiempo de exposicin, no
son posibles detecciones multiplex (deteccin de
mas de una protena, slo un color de reaccin)

Nota: LucentBlueTM es una pelcula que ha sido optimizada para Informacin para pedidos
la deteccin de seales de quimioluminiscencia en experimentos
L07014-100 Pelcula Rayos X LucentBlueTM , 20x25 cm, 100 uds
realizados con los substratos WesternBright HRP, incluyedo Western-
BrightTM ECL, Westernbright Quantum y WesternBright Sirius. L07013-100 Pelcula Rayos X LucentBlueTM , 13x18 cm, 100 uds

Pgina 15

2. Fluorescencia.
El anticuerpo secundario se une a un fluorforo,
que cuando es excitado emite luz. La luz emiti-
da, se detecta mediante un dispositivo capaz de
medir la fluorescencia o mediante una cmara
CCD provista con los filtros de longitud de onda
apropiada. La imagen se digitaliza para su anli-
sis.
Ventajas: sensibilidad (la sensibilidad puede incre-
mentarse utilizando el sistema streptavidina/
biotina), apto para ensayos multiplex con mlti-
ples colorantes, amplio rango dinmico, no se
requiere el uso de una cmara oscura, aporta
datas cuantificables, fcil documentacin de re-
sultados, pueden usarse Ac primarios marcados
(para protenas abundantes) y eliminar pasos.
Inconvenientes: los reactivos y el equipamiento
pueden ser costosos, no es tan sensible como la
quimioluminiscencia (puede no ser apropiado
para protenas poco abundantes).
3. Colorimetra.
Los mtodos colorimtricos utilizan un Ac secun-
dario que ha sido conjugado previamente a un
enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina). El enzi-
ma convierte el colorante en un producto insolu-
ble que es visible en la membrana. La cantidad
de colorante convertido es proporcional al canti-
dad en la muestra. La intensidad de la tincin
puede ser medida por espectrofotometra o por
un densitmetro.
Ventajas: sencilla de realizar, no requiere cmara
oscura, las membranas se pueden documentar
fcilmente mediante fotografa.
Inconvenientes: no es tan sensible como los otros
dos mtodos, el color se desvanece con el tiem-
po.
Deteccin
Re-utilizacin de la membrana
Despus de captar la imagen, la membrana pue-
de ser tratada para volver a ser utilizada para la
deteccin de otra protena. Este procedimiento
puede conservar las muestras, pero consume mu-
cho tiempo. Con la deteccin multiplex de fluo-
rescencia, se pueden detectar mltiples protenas
de forma simultanea, es ideal para comparar la
protena de inters con un control de carga, o
diferentes isoformas de la protena. Las membra-
nas PVDF son preferibles a la de nitrocelulosa en
protocolos de lavados para reutilizacin.
Nota: WesternBright TM MCF permite la deteccin, mediante la
deteccin fluorescente multicolor, de dos protenas en una
sola membrana. Perfecto para aquellos experimentos en los
que se necesite comparar la protena de inters con un control
de carga.
Informacin para pedidos
K-12021-010 WesternBrightTM fluorescent Western blotting kit
Nota: Advansta suministra una lnea completa de reactivos
de deteccin de quimioluminiscencia optimizados para los
diferenentes mtodos, concentracin de muestra y tipos expe-
rimentales.
Informacin para pedidos
K-12042-D10 WesternBrightTM Quantum Western Blotting HRP
Substrate (para 1000 cm2 de membrana)
K-12042-D10 WesternBrightTM Sirius Western Blotting HRP Subs-
trate (para 1000 cm2 de membrana)
K-12045-D20 WesternBrightTM ECL Western Blotting HRP Substra-
te (para 2000 cm2 de membrana)
K-12042-D10 WesternBrightTM ECL Spray
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Anlisis de Protenas

7. Solucin de Problemas

Solucin de problemas con Western Blot

A. No se puede B. Tamao inco-

C. Bandas arte- D. Problemas en E. Ruido de fon-
ver la protena rrecto de la
factuales la electroforesis do excesivo
de inters banda

Preparacin La protena es Bandas El gel polimeriza Bloqueo

Muestra menor de lo Incompletas demasiado Insuficiente
(ver 1) esperado (ver 12) rpido o dema- (ver 24)
(ver 7) siado lento
(ver 17,18,19)

Transferencia Bandas Difusas Lavado

Inadecuada La protena es (ver 13) inapropiado
(ver 2) mayor a lo es- (ver 25)
El gel corre de-
perado masiado rpido
(ver 8, 9) o demasiado
Rayas lento
Unin ineficien- Verticales (ver 20,21) Contaminacin
te del Anticuer- (ver 14) Reactivos
po (ver 3, 4) (ver 26)
Bandas Mlti-
ples (ver 10)
Frente corre
Distorsin curvado
Problemas con Lateral Eleccin de
los reactivos smiling
(ver 15) Membrana
(ver 5, 6) (ver 22)
(ver 27)
Las bandas
aparecen muy
altas o muy
bajas en el gel Bandas distor- Frente corre
sionadas Unin no es-
(ver 11) inclinado
(ver 16) pecfica del
(ver 23) Anticuerpo
(ver 28)

Revelado de la
pelcula
(ver 29)

Pgina 17

A. Problema
1. Preparacin Muestra
2. Transferencia indadecua-
da
3. Unin ineficiente del Anti-
cuerpo primario
4. Unin ineficiente del Anti-
cuerpo secundario
5. Conjugado/Substrato Inac- Reactivos viejos o inestables
tivo
6. Reactivo de deteccin
(ECL)
B. Problema
7. Protena ms pequea de
lo esperado
8. Protena ms larga de lo
esperado y/o bandas mlti-
ples
9. Protena ms larga de lo
esperado
Solucin de
Problemas
Causa(s) Solucin
Extraccin ineficiente Intentar mtodos alternativos; incluir con-
trol positivo en el gel
Baja expresin de la protena en el tejido Cargar ms cantidad de protena total en
o las clulas el gel; concentrar utilizando Afyon, juntar
mltiples muestras
La protena se ha degradado durante la Usar inhibidores de proteasa en le tampn
extraccin de lisis
Tampn de transferencia preparado inco- Revisar el protocolo/disminuir metanol
rrectamente/demasiado metanol en el
tampn
Protenas de mayor tamao necesitan Repetir con un tiempo mayor/mayor vol-
mas tiempo/voltaje taje
Contacto insuficiente entre el gel y la Revisar la almohadilla de fibra; sustituir si es
membrana muy delgada
Baja afinidad del anticuerpo por la prote- Incrementar la concentracin del Anti-
na o el anticuerpo es antiguo/dbil cuerpo; comprar un anticuerpo nuevo y
almacenarlo de forma apropiada
El Anticuerpo tiene reactividad cruzada Probar con un Anticuerpo primario de di-
dbil con las especies de inters ferente origen
El Anrticuerpo se ha eliminado con el lava- Usar menor numero de lavados; disminuir
do la concentracin de sales el tampn de
lavado
Antgeno enmascarado por el agente Utilizar un agente de bloqueo alternativo
bloqueante (ej.: Leche,) (ej.: BSA,)
Eleccin de especies errnea Usar Anticuerpos dirigidos contra la espe-
cie del Anticuerpo primario
Concentracin insuficiente del Anticuerpo Aumentar concentracin o comprar uno
o Anticuerpo antiguo Anticuerpo nuevo
Mezclar conjugado + substrato en un tu-
bo; o luminiscencia en oscuridad - conse-
guir un nuevo reactivo si no hay seal
Peroxidasa (HRP) inactiva por azida sdi- Evitar utilizar disoluciones conteniendo
ca este agente conservante
La disolucin es antigua o est almacena- Comprar reactivo nuevo
da de forma inapropiada
Causa (s) Solucin
Protelisis; Congelacin/descongelacin Uso de inhibidores de proteasa/muestras
de la muestra frescas
Protena variante (Splicing) Consultar literatura/utilizar controles apro-
piados
Protenas modificadas de forma natural Consultar literatura para encontrar aditi-
(glicosilacin, fosforilacin, acetilacin, vos que puedan eliminar grupos qumicos
etc)
Cambio de la expresin de la protena en Utilizar cultivos anteriores; incluir un control
la lnea celular positivo
Agregado de protenas - puentes disulfuro Uso de DTT en tampn de muestra; pulso
intactos de centrfuga previo a la carga de la
muestra
Pgina 18
Anlisis de Protenas
B. Problema
(continuacin)
10. Bandas Extras
11. La protena aparece muy Porcentaje errneo/no ptimo del gel
alta o muy baja en la mem-
brana
C. Problema
12. Bandas Incompletas
13. Bandas difusas
14. Rayas en los carriles
15. Distorsin lateral de las
bandas
16. Distorsin de las bandas
D. Problema
17. El gel no polimeriza
18. El gel polimeriza muy len-
to
Pgina 19
Causa(s) Solucin
Unin no especfica del Anticuerpo prima- Disminuir concentraciones; intentar un
rio o secundario experimento de bloqueo de pptido
(eliminar la protena de inters)
Incrementar el porcentaje para protenas
de pequeo tamao; disminuir para pro-
tenas de gran tamao
Causa(s) Solucin
Burbujas entre el gel y la membrana Usando una pipeta, hacer rodar por enci-
ma del paquete gel/membrana para for-
zar la salida de las burbujas
Migracin lenta Incrementar voltaje; asegurarse de la co-
rrecta preparacin del tampn
Las muestras no se han calentado correc- Asegurarse que las muestras se han incu-
tamente bado durante 2 min a 90C antes de car-
garlas en el gel
El SDS del tampn es antiguo Preparar SDS nuevo para le tampn de
muestra
Alta concentracin de sales en la muestra Disminuir la concentracin de sal en el
tampn de muestra
Muestra muy concentrada o insuficiente Incrementar concentracin/usar ms SDS
SDS
Difusin de la muestra en los pocillos du- Minimizar el tiempo de carga
rante la carga
Fallo en la completa polimerizacin de los Incrementar TEMED/AP
pocillos
Presin aplicada excesiva a la hora de No apretar en exceso los tornillos del siste-
montar el gel ma, apretar hasta encontrar primera resis-
tencia
Burbujas en el gel debido al uso de crista- Usar guantes en la preparacin de los ge-
les sucios les
Uso de Etanol y H2O desionizada en la lim-
pieza de los cristales
Burbujas introducidas en el gel por el dis- No expulsar totalmente el volumen de la
positivo de llenado (jeringa o pipeta) mezcla del gel
Burbujas de aire atrapadas por el peine Insertar el peine en ngulo y antes que se
polimerice el gel
Causa (s) Solucin
Fallo al aadir el TEMED y AP Repetir con TEMED y AP
La disolucin AP es estable durante dos o Preparar AP fresco
tres das a 4C
El oxgeno inhibe la polimerizacin Aplicar isopropanol antes de verter el gel
de apilamiento (stacking gel)
TEMED/AP Insuficiente Incrementar la cantidad de TEMED/AP
La disolucin de AP ha perdido su activi- Preparar disolucin fresca de AP
dad
 Solucin de
Problemas

D. Problema Causa(s) Solucin

(continuacin)
19. El polimeriza demasiado
rpido
20. Tiempo de carrera in-
usualmente largo
21. Tiempo de carrera in-
usualmente corto
22. Frente curvado (smiling)
23. Frente inclinado
E. Problema
24. Bloqueo insuficiente
25. Condiciones de lavado
inapropiadas
26. Contaminacin de los
reactivos
27. Eleccin de tipo de mem- Las membranas PVDF pueden tener ms
brana ruido de fondo que las de Nitrocelulosa
Cantidad excesiva de TEMED/AP
Buffer de electroforesis demasiado con-
centrado
Voltaje insuficiente
Tampn demasiado diluido
Migracin demasiado rpida
Generacin de calor
Burbuja atrapada entre los cristales en la
parte inferior del gel
Causa(s)
La presencia de Biotina en la leche es in-
compatible con el uso de Estreptavidina,
o la leche contiene el antgeno de inters
Si utiliza AdvanBlock-PF con WesternBright
MCF, algn Anticuerpo primario puede
requerir un bloqueante proteico
La disolucin est demasiado diluida
Tiempo de bloqueo muy corto
Algunos detergentes no son efectivos a
bajas temperaturas
Nmero insuficiente de lavados
Concentracin insuficiente de detergente Incrementar la concentracin de deter-
gente o usar detergentes ms fuertes
(SDS, NP-40)
Crecimiento bacteriano o fngico en los
tampones
Reducir la cantidad de TEMED/AP, mante-
niendo la relacin entre ambos
Revisar protocolo; diluir el tampn en caso
necesario
Incrementar voltaje
Revisar el protocolo; reemplazar tampn
en caso necesario
Disminuir voltaje
Disminuir voltaje; refrigerar
Aguantar el gel en ngulo; colocar una
esquina en el tanque inferior del sistema
de electroforesis; lentamente volver a po-
sicin vertical
Solucin
Usar BSA
Incluir BSA o leche en la disolucin Advan-
Block-PF utilizada en la dilucin del Anti-
cuerpo primario
Incrementar con un 5% la disolucin
Incrementar el tiempo de incubacin
Incubar a temperatura ambiente en vez
de toda la noche a 4C
Incrementar el nmero de lavados o la
duracin de cada uno de ellos
Revisar la turbidez de los tampones; pre-
parar nuevos
Elegir membranas de Nitrocelulosa

Algunas membranas tienen alta autofluo-
rescencia
Membrana seca
28. Unin no especfica del Concentracin muy alta del Anticuerpo o
Anticuerpo primario o secun- no purificado por afinidad
dario
Utilizar nicamente membranas PVDF con
baja autofluorescencia con Western Blots
fluorescentes
Estar seguro que la membrana esta hme-
da durante todo el proceso
Disminuir la concentracin de Anticuerpo;
intentar con Anticuerpo monoclonal o
purificado por afinidad

Mucha cantidad de protena en el gel Disminuir la cantidad de protena

29. Sobreexposicin de la El tiempo excesivo de exposicin a la pel- Reducir los tiempos de exposicin; si no es
imagen cula o al CCD posible incrementar la dilucin de los Anti-
cuerpos o cargar menor cantidad de
muestra

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Anlisis de Protenas

8. Herramientas y Referencias Tcnicas

g de Soluto
Molaridad de una disolucin =
[Masa molecular de Soluto (g/mol) x (L de disolucin)

Tabla 10. Cdigo gentico y abreviaciones de los aminocidos

Segunda Posicin
U C A G
UUU Fenilalanina UCU UAU Tirosina UGU Cisteina
UUC (Phe, F) UCC Serina UAC (Tyr, T) UGC (Cys, C)
UCA (Ser, S)
U UUA Leucina UCG UAA STOP UGA STOP
UUG (Leu, L) UAG
UGG Triptfano
(Trp, W)
CUU CCU CAU Histidina CGU
CUC Leucina CCC Prolina CAC (His, H) CGC Arginina
Primera posicin

C CUA (Leu, L) CCA (Pro, P) CGA (Arg, R)

CUG CCG CAA Glutamina CGG
CAG (Gln, Q)
AUU Isoleucina ACU AAU Asparagina AGU Serina
AUC (Ile, I) ACC Treonina AAC (Asn, N) AGC (Ser, S)
AUA ACA (Thr, T)
A
ACG AAA Lisina AGA Arginina
AUG Metionina AAG (Lys, K) AGG (Arg, R)
(Met, M)
GUU GCU GAU A. Asprtico GGU
GUC Valina GCC Alanina GAC (Asp, D) GGC Glicina
G GUA (Val, V) GCA (Ala, A) GGA (Gly, G)
GUG GCG GAA A. Glutmico GGG
GAG (Glu, E)

Tabla 11. Conversin entre masa y moles de protena Tabla 12. Absorvancia a 280 nm de Proteinas habituale
Peso molecular 1 g 1 nmol Proteina A280 Uds por 1 mg&ml
(Da)

10.000 100 pmol o 6x1013 molculas 10 g IgG 1,35

20.000 20 pmol o 1,2x1013 molculas 50 g IgM 1,2
100.000 10 pmol o 6x1012 molculas 100 g IgA 1,3
150.000 6,7 pmol o 4x1012 molculas 150 g Proteina A 0,17
Avidina 1,5
Estreptavidina 3.4
Albumina suero bovino 0,7

Pgina 21
 Herramientas y
Referencias

Tabla 13. Prefijos mtricos Tabla 16. Masa molecular media de los aminocidos
M mega 106 n nano 10-9 Cdigos Aminocidos Masa molecular media
K Kilo 103 K pico 10-12 A Ala 71,08
m mili 10-3 f femto 10-15 C Cys 103,1
micro 10-6 a atto 10-18 D Asp 115,1
E Glu 129,1

Tabla 14. Abreviaciones F Phe 147,2

ds doble cadena ( como en dsDNA) G Gly 57,05

ss cadena sencilla (como en ssDNA) H His 137,1

bp pares de base I Ile 113,2

kb kilobase; 1.000 bases o pares de base K Lys 128,2

Da Dalton, unidad de masa molecular L Leu 113,2

M Met 131,2
mol mol
N Asn 114,1
M molaridad, moles de soluto por litro de disolucin
P Peo 91,12
Q Gln 128,1
Tabla 15.. Vida media de los Radioistopos ms habituales R Arg 156,2
Radioistopo Vida media S Ser 87,08
T Thr 101,1
Carbono-14 (14C) 5.730 aos
V Val 99,07
Iodo-125 (125I) 60 das
W Trp 186,2
Fsforo-32 (32P) 14,3 das
Y Tyr 163,2
Azufre-35 (35S) 87,4 das
Tritio (3H) 12,4 aos

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