Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico. Laboratorio de Diagnóstico Clínico. 2º curso.

Pruebas de identificación bacteriana - 1 U.T. 16 - 1 Bloque temático III

Pruebas de identificación bacteriana
Identificación bacteriana
La identificación es un proceso por el cual debemos determinar a qué especie pertenece una determinada cepa bacteriana, mediante la comparación de una serie de características que pueden ser puestas en evidencia en el laboratorio y que han sido estudiadas para la gran mayoría de las especies importantes desde el punto de vista de la patología infecciosa humana. Cuanto más semejanza haya entre las características obtenidas en el laboratorio y las que habitualmente presenta una determinada especie, mayor será la probabilidad de que esa cepa problema pertenezca a dicha especie. Las características utilizadas en la identificación de cada grupo de microorganismos dependen de las posibilidades de cada laboratorio, fundamentalmente económicas y de cualificación del personal, así como de la epidemiología específica de la zona. Las características que se tienen en cuenta para lograr una correcta identificación son las siguientes: Características no bacterianas: ? Paciente: Edad Sexo Patología Características bacterianas: ? de cultivo: Medios en los que crece Temperatura Atmósfera de crecimiento Crecimiento en aero o anaerobiosis Morfología de las colonias

? Muestra: Obtención Conservación Transporte ? individuales: Características estructurales: - Tinción de Gram - Morfología - Dimensiones - Forma de agruparse - Presencia de estructuras: - Cápsula, Flagelos, Esporas - Movilidad Características metabólicas: Acción bacteria/sustrato Enzimáticas un enzima aislado un sistema enzimático No enzimáticas Acción agente químico/bacteria Pruebas de susceptibilidad Determinación de metabolitos libres Características inmunológicas. Análisis de DNA.

En el proceso de identificación tradicional se establecen tres niveles de procesamiento: a) el primero hace referencia a la morfología y a su comportamiento ante la tinción de Gram u otras tinciones que se utilicen específicamente para cada grupo. b) el segundo nivel de identificación debe especificar el género a que pertenece el microorganismo. c) por último, la conclusión debe hacerse con la identificación a nivel de especie

Gustavo A. Díaz Martín. I. E. S. Jaime Ferrán Clúa.

Profesor Técnico de Formación Profesional. San Fernando de Henares. (28830 Madrid)

Curso 2006-2007 Código 28038616

Las pruebas podríamos clasificarlas fundamentalmente en aquellas que nos permiten la identificación de Gram positivos y pruebas para identificación de Gram negativos.2 U. como son: Micobacterias Anaerobios Rickettsias y Chlamydias Micoplasmas Espiroquetas Actinomices y Nocardias Ciñéndonos a los cuatro grupos descritos más arriba. E. 16 . Profesor Técnico de Formación Profesional.Hidrólisis de esculina .T.oxidasa Oxidación -fermentación Fermentación de azúcares Gram negativos ß galactosidasa (ONPG) Arginina dehidrolasa Lisina y ornitina decarboxilasa Utilización de citrato Producción de SH2 Producción de indol Ureasa Triptófano desaminasa (TDA) Reducción de nitratos Rojo de metilo Voges Proskauer Kligler Hidrólisis de la gelatina Pruebas inmunológicas Gustavo A. Jaime Ferrán Clúa. Pruebas de identificación iniciales: Morfología bacteriana Tinción de Gram Agrupamiento celular Movilidad Atmósfera de crecimiento Gram positivos . aunque hay una serie de pruebas comunes a ambos grupos que vamos a enumerar. Laboratorio de Diagnóstico Clínico.Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico. S.1 Bloque temático III Pruebas de identificación Tradicionalmente la identificación de una cepa bacteriana comienza con la visualización de un frotis de la colonia aislada al que se le ha realizado una tinción de Gram: Básicamente los cuatro grandes grupos que nos encontraremos en este primer paso son los siguientes: Cocos Gram positivos Cocos Gram negativos Bacilos Gram negativos y Bacilos Gram positivos La identificación puede realizarse también sobre grupos de microorganismos con características especiales que veremos específicamente cuando tratemos a dichos grupos. aunque las reacciones de aglutinación o precipitación utilizadas son más rápidas y más específicas. los laboratorios deben utilizar una rutina específica que vaya realizando de forma secuencial o simultánea una serie de pruebas que nos permitirá ir diferenciando las especies más importantes desde el punto de vista infeccioso.DNAsa . Díaz Martín.Lisostafina .Fosfatasa . 2º curso. (28830 Madrid) Curso 2006-2007 Código 28038616 .CAMP .Coagulasa . San Fernando de Henares.Hidrólisis del hipurato Sensibilidad a novobiocina Sensibilidad a optoquina Sensibilidad a bacitracina Sensibilidad a SXT Crecimiento en ClNa Crecimiento en bilis Producción de hemólisis Pruebas inmunológicas Catalasa Citocromo . I. Pruebas de identificación bacteriana . Quizás las más utilizadas cuantitativamente sean las pruebas bioquímicas que nos permiten determinar características metabólicas de los microorganismos objeto de identificación.

es imprescindible tener en cuenta lo siguiente: .Realizar el menor número posible de resiembras .1 Bloque temático III Una bacteria es un complejo ser vivo con un sistema de estructuras y moléculas intracelulares en parte similar al nuestro. Unicamente nos indicará cuál es la especie a la que el microorganismo identificado tiene mayor probabilidad de pertenecer. La dificultad en la identificación de una especie bacteriana estriba en que los enzimas o moléculas responsables de determinados procesos metabólicos no siempre se expresan fenotípicamente.Evitar medios demasiado selectivos Gustavo A. Para que la cepa aislada del paciente no experimente un gran número de transformaciones o mutaciones. 16 . unidas a otras características de identificación. I.Conservar la muestra en las condiciones establecidas si no va a ser inmediatamente procesada . Pruebas de identificación bacteriana . Díaz Martín. La elección de una prueba o de una batería de pruebas debe hacerse en función de . por lo que las enzimas y metabolitos presentes en la bacteria. E.Procurar realizar la identificación a partir de un cultivo puro .01% que podría llevar al traste con nuestro proceso de identificación si lo hiciésemos de forma dicotómica. Las pruebas bioquímicas. si el proceso puede desarrollarse siguiendo otra vía.99%.T. ya provengan de la propia estructura bacteriana. Profesor Técnico de Formación Profesional. puede ponerse de manifiesto mediante una serie de reacciones químicas adecuadas.Muestra estudiada . Casi todos los miembros de una misma especie bacteriana deben poseer un sistema metabólico similar. la ausencia de un enzima determinado impedirá esa transformación o al menos la retardará. Determinadas pruebas son específicas de género o de especie en un 99. el problema de la identificación sería mínimo. 2º curso.3 U.No diluir la muestra en medio líquido . Jaime Ferrán Clúa.Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico. no diferirán mucho entre sí. La presencia de ciertos enzimas hace que las bacterias puedan actuar sobre algunos substratos y transformarlos. Laboratorio de Diagnóstico Clínico.Especies bacterianas que se pretenden identificar . Si todos los miembros de una misma especie reaccionaran idénticamente ante determinados substratos y poseyeran siempre las mismas rutas metabólicas. el procedimiento de identificación puede darnos una certeza absoluta sobre las conclusiones obtenidas.Factores económicos . que podrían equivocarnos al mostrar falsas reacciones. La presencia de determinadas moléculas. hacen fiables casi en un 100% los procedimientos rutinarios de identificación bacteriana. Esto hace que tengamos que utilizar simultáneamente una gran diversidad de pruebas (pruebas bioquímicas) y comparar los resultados obtenidos con aquellas especies que presentan una mayor coincidencia.Experiencia en esas pruebas En ningún caso. San Fernando de Henares. ya sean subproductos de su metabolismo intermediario. pero aún queda un 0. S. El problema reside en que no siempre pueden ponerse de manifiesto las mismas transformaciones enzimáticas o la presencia de determinados metabolitos. (28830 Madrid) Curso 2006-2007 Código 28038616 .

Pruebas de identificación bacteriana .T. Laboratorio de Diagnóstico Clínico. entre dos y cuatro horas. En función del tipo de prueba o de su fundamento. San Fernando de Henares. Los aspectos metabólicos que pueden estudiarse son: (ver página siguiente) Gustavo A. con la utilización de sustratos cromogénicos de conversión rápida.Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico. E. de manera que la identificación puede realizarse en la misma jornada laboral.1 Bloque temático III Clasificación de las pruebas de identificación Las pruebas para realizar una identificación bacteriana deben partir de un cultivo puro donde las colonias estén perfectamente aisladas. Jaime Ferrán Clúa. Las pruebas de identificación bioquímica pueden clasificarse en función de la parte del metabolismo que están poniendo de manifiesto. Pruebas lentas (de 18 a 48 horas) A este grupo pertenecen la mayoría de las pruebas que detectan componentes metabólicos o aquellas que determinan la sensibilidad de un microorganismo a una sustancia dada.4 U. Profesor Técnico de Formación Profesional. la mayoría de las pruebas bioquímicas pueden leerse en cuatro horas aproximadamente. Díaz Martín. (28830 Madrid) Curso 2006-2007 Código 28038616 . 2º curso. 16 . las pruebas de identificación pueden dividirse en: Pruebas bioquímicas Pruebas inmunológicas Pruebas de sensibilidad a antimicrobianos Pruebas de tolerancia a condiciones especiales Hoy día se han desarrollado multitud de galerías multipruebas que permiten su lectura en un intervalo de tiempo muy corto. Pruebas intermedias (menos de 6 horas) Lisostafina y coagulasa. por ejemplo. También pueden incluirse todas las pruebas inmunológicas de detección de antígenos bacterianos por reacciones de aglutinación o precipitación. Hoy día. En función del tiempo utilizado en la realización de la prueba podemos diferenciarlas en Pruebas inmediatas (desde segundos a algunos minutos) Dentro de este grupo tenemos la catalasa y la oxidasa. S. I.

Las pruebas de susceptibilidad más utilizadas son: . San Fernando de Henares.Sensibilidad a Metronidazol y Sulfatiazol Dentro de este grupo podríamos incluir las pruebas de crecimiento bacteriano en condiciones especiales (inhibidoras para algunos microorganismos). lo cual nos puede permitir confirmar o descartar la presencia del microorganismo. 16 .Crecimiento (solubilidad) en bilis . I. Las más utilizadas son pruebas de aglutinación para detección de: Staphylococcus aureus Estreptococos beta hemolíticos Streptococcus pneumoniae Serotipos de Salmonella Serotipos de E. E. Entre las más importantes tenemos: . las pruebas de sensibilidad utilizan una característica de los microorganismos frente a una sustancia química o antimicrobiano que consiste en la sensibilidad o resistencia constante frente a dicha sustancia.5 U. Laboratorio de Diagnóstico Clínico.5% .Crecimiento en ClNa al 6. Jaime Ferrán Clúa.Sensibilidad a Optoquina . Pruebas de identificación bacteriana .Crecimiento a temperatura de 10º C Gustavo A.Sensibilidad a Novobiocina . S. Profesor Técnico de Formación Profesional. 2º curso.1 Bloque temático III Metabolismo respiratorio: Catalasa Citocromo-oxidasa Mecanismo de producción de energía: Oxidación-Fermentación Reducción de nitratos a nitritos Rojo de metilo Voges Proskauer Metabolismo hidrocarbonado Fermentación de hidratos de carbono Utilización del citrato Beta galactosidasa (ONPG) Metabolismo proteico: Hidrólisis de la gelatina Hidrólisis de la urea por ureasa Producción de indol Producción de ácido sulfhídrico Fenilalanina desaminasa (TDA) Prueba de las decarboxilasas LDC ODC ADH Detección de exoenzimas: Cogulasa Fosfatasa Desoxirribonucleasa Las pruebas inmunológicas utilizan las reacciones de aglutinación para poner en evidencia antígenos bacterianos.Sensibilidad a Bacitracina .T. Díaz Martín.Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico. (28830 Madrid) Curso 2006-2007 Código 28038616 . coli Haemophilus influenzae Neisseria meningitidis Por último.

en el peor de los casos. la prueba de la TDA es positiva en P. ante la realización de determinadas pruebas. E. Así. Profesor Técnico de Formación Profesional. dicotómicos. Cada especie estaría definida por un código numérico. fue posible codificar el enorme número de pruebas que se hacían mediante la asignación de un código numérico a cada microorganismo en función de los resultados obtenidos. Voges Proskauer y Citrato. Una prueba que discriminase solo el 80% de las bacterias estaría cometiendo un error de identificación en una de cada 5 identificaciones. conducía por un camino equivocado y terminaba en una identificación incorrecta. Gustavo A. a veces era necesario esperar varios días hasta concluir el proceso de identificación. cada microorganismo era sometido a una batería de pruebas cuyos resultados se expresaban de forma numérica. El siguiente paso fue la realización simultánea de varias pruebas. para así. Estas pruebas eran elegidas de manera que tuvieran un poder discriminador muy alto. Evidentemente ésta no es un prueba que nos permita diferenciar entre ambas especies. Tanto la disminución del sustrato consumido como la formación del producto resultante de la reacción. una determinada característica no es exhibida siempre por todos los miembros de una especie bacteriana. que realizaba a la vez las pruebas de Indol. Los microorganismos que fermenten la lactosa darán como resultado final unos productos ácidos que harán que el pH del medio disminuya y. Es célebre. S. por su importancia histórica. hasta que al final de una de las ramas se conseguía una identificación presuntiva. aumentar la velocidad de procesamiento. Una prueba cualquiera. pues la probabilidad de que se tratase de una u otra especie estaría repartida al 50%. Jaime Ferrán Clúa. cada prueba tarda en realizarse 18-24 horas. Pruebas de identificación bacteriana . o una alteración o excepción en el metabolismo de una especie bacteriana. El inconveniente de este procedimiento era que no se podía realizar la siguiente prueba hasta conocer el resultado de la anterior. Pongamos otro ejemplo: la prueba de la oxidasa es una prueba que Escherichia coli y Proteus mirabilis darán negativa en el 100% de los casos. que dos especies diferentes dieran positiva en un 50% de los casos. en general mayor del 95%. tampoco serviría para diferenciar las cepas. API fue una de las primeras denominaciones comerciales de este sistema que había logrado disminuir los costes y el tiempo para llegar a una identificación aceptable. Con el advenimiento de la informática y la posibilidad de manejar muchos datos a velocidades impensables para el ser humano. resultado de la codificación de las reacciones a que hubiera sido sometido. 16 . San Fernando de Henares. en caso contrario. que deben escogerse entre aquellas que tengan mayor poder diferenciador. no tendríamos más que buscar el código numérico y comprobar a qué bacteria pertenecería. esto hace difícil la elección de pruebas para poder distinguir especies. aunque tanto mejores serían cuanto más se acercasen al 100%. Una prueba incorrecta. Finalmente aparecieron las galerías multipruebas. la identificación de bacterias en el laboratorio de microbiología se hacía basándose en unos esquemas arborescentes.1 Bloque temático III Sistemas de identificación multipruebas (galerías) Las características metabólicas de un microorganismo solo buscan poner de manifiesto la existencia de enzimas bacterianas que son capaces de metabolizar un sustrato específico. pueden ser objetivados mediante la utilización de un sistema visualizador que nos permita reconocer fácilmente si la reacción ha tenido lugar o no. un sistema de celdillas aisladas con sustrato liofilizado que se inoculaban individualmente y que permitían realizar simultáneamente entre 10 y 25 pruebas bioquímicas. la batería de pruebas denominada IMVyC. rojo de Metilo. La frecuencia con que una especie bacteriana muestra una determinada característica metabólica. Hasta hace relativamente pocos años. coli siempre: ésta sí es una prueba que nos serviría para diferenciar entre las dos especies. que el indicador vire hacia el color correspondiente al pH ácido. Laboratorio de Diagnóstico Clínico.Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico. Estos esquemas de identificación estaban rígidamente estructurados y tenían poca flexibilidad ante cualquier prueba con menor poder de discriminación. el pH del medio no cambiará y el indicador tampoco variará o. limitando cada vez más las posibilidades. El procedimiento dicotómico que históricamente había servido para avanzar por el camino correcto de la identificación. en general. puede variar desde el 0% hasta el 100%. Si tenemos en cuenta que. Como ejemplo podemos poner la utilización de un medio diferencial que contenga lactosa y un indicador de pH. por lo tanto. (28830 Madrid) Curso 2006-2007 Código 28038616 . I. X. Sin embargo. Díaz Martín.6 U. que atendiendo a los resultados de una prueba seguían bifurcándose con otras pruebas. Sin embargo. 2º curso. virará hacia el color correspondiente al lado básico.T. Ante un microorganismo problema. mirabilis en un 100% de casos y negativa en E. ya solo podía utilizarse en contados casos.

con el consiguiente engorro en el manejo de un número con tantos dígitos. Jaime Ferrán Clúa. Por ejemplo. asignándose los dígitos de 0 a 3 en el primer caso y de 0 a 1 en el segundo. el 1 solo la primera prueba positiva.Si una prueba cualquier es negativa se le asigna un valor de 0 (cero) a la prueba.1 Bloque temático III El procedimiento de codificación más sencillo hubiese sido asignar un 1 a las pruebas positivas y un 0 a las negativas. . podría tener el siguiente código numérico: Gustavo A. Laboratorio de Diagnóstico Clínico. dependiendo del número de pruebas. I.T. El código numérico se obtiene sumando los valores de las tres pruebas. (28830 Madrid) Curso 2006-2007 Código 28038616 . S. 16 . El resultado hubiese sido que los códigos numéricos deberían tener entre 10 y 25 dígitos. . Supongamos tres pruebas cualesquiera: las combinaciones posibles de positividad y negatividad de todas ellas entre sí quedan reducidas a 8 casos. En caso de que el número de pruebas no fuese múltiplo de tres.Si la primera prueba es positiva se asigna un valor de 1. Para evitar este excesivo número de dígitos se utilizó un procedimiento ingenioso: agrupar los resultados de las pruebas de tres en tres. de manera que el resultado de cada trío de pruebas quedase reducido a un dígito. Pruebas de identificación bacteriana . Díaz Martín. Veámoslo: Prueba 1 + + + + Prueba 2 + + + + Prueba 3 + + + + - A cada combinación de resultados podríamos asignarle un dígito de 0 a 7. se efectuaría el agrupamiento de las sobrantes (dos o una prueba). un batería de 10 pruebas con unos resultados establecidos aleatoriamente por nosotros. La codificación quedaría de la siguiente manera: Prueba 1 positivo = 1 negativo = 0 + + + + 0 1 0 1 0 1 0 1 + + + + Prueba 2 positivo = 2 negativo = 0 0 0 2 2 0 0 2 2 + + + + Prueba 3 positivo = 4 negativo = 0 0 0 0 0 4 4 4 4 Código numérico 0 1 2 3 4 5 6 7 Para cada trío de resultados se adjudicaría un dígito. Los límites inferior y superior del código son 0 y 7 respectivamente. Para codificar el dígito de un trío de pruebas se establece el siguiente sistema: . etc.7 U.Si la tercera prueba es positiva se asigna un valor de 4. así el 0 podría indicar las tres pruebas negativas. . Profesor Técnico de Formación Profesional. E. 2º curso. San Fernando de Henares.Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico.Si la segunda prueba es positiva se asigna un valor de 2.

Una vez hecho esto podríamos encontrarnos.1 Bloque temático III Prueba 1 Prueba 2 Prueba 3 Prueba 4 Prueba 5 Prueba 6 Prueba 7 Prueba 8 Prueba 9 Prueba 10 Resultado + + + + + + + Valor 1 0 4 0 2 4 1 2 0 1 Dígito 5 6 3 1 El código numérico de esta combinación de resultados sería 5631 y ese sería el código que deberíamos buscar en nuestro libro de códigos para conocer la identificación del microorganismo. . los resultados podrían ser: Indol + + Citrato + VVoges Proskauer + - E.8 U. I. por ejemplo. E.T. podríamos predecir que si estudiásemos cualquier cepa de alguna de estas especies. el código numérico tendría 7 dígitos. coli K. y el último de ellos correspondería a la suma de valores de dos pruebas.Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico. Utilizando la teoría de probabilidades y aprovechando las capacidades actuales de los ordenadores (rapidez y memoria). San Fernando de Henares. Díaz Martín. coli K. 2º curso.: Variable negativo Gustavo A.: negativo . El primer paso seria estudiar los porcentajes de positividad de una bacteria para una determinada prueba o característica. hemos sido capaces de valorar no una sólo. Si la batería fuese de 20 pruebas. (28830 Madrid) Curso 2006-2007 Código 28038616 . Profesor Técnico de Formación Profesional. Fundamento del sistema de codificación numérica en la identificación de microorganismos La identificación de los microorganismos basándose en los sistemas dicotómicos tradicionales que valoraban las pruebas bioquímicas una a una ha dejado de ser válida. S. Jaime Ferrán Clúa. 16 . La ventaja de este sistema de identificación es que permite calcular la probabilidad de que una bacteria muestre un perfil de pruebas bioquímicas concreto. Laboratorio de Diagnóstico Clínico. La razón es que en muchas ocasiones existen especies atípicas que nos desvían en el árbol de identificación sin llevarnos a ninguna caracterización concreta. pneumoniae P vulgaris A la vista de estos resultados. pneumoniae P vulgaris + : positivo. Para ello habría que valorar un número de cepas de cada especie relativamente alto ( más de 300). V. expresándolo en forma de porcentaje sobre el total de bacterias investigadas. Pruebas de identificación bacteriana . con la siguiente tabla que nos permitiría diferenciar entre estos microorganismos utilizando tres pruebas Indol 96% 1% 85% Citrato 6% 98% 30% Voges Proskauer 1% 92% 1% E. sino varias decenas de características simultáneamente para poder identificar correctamente un microorganismo.

Jaime Ferrán Clúa. coli. sería para Escherichia coli a pesar de que el citrato no sea una prueba que esta especie dé positiva con frecuencia.66% para E. 2º curso.06 * 0.98 * (1 .000784 * 100 / 0823474 = 0.30 * (1 .96 * 0.T. Gustavo A. Díaz Martín. Profesor Técnico de Formación Profesional.57024 Haciendo lo mismo con los otros dos microorganismos encontraríamos: Para K. S. a la vista de estos resultados.0. vulgaris Por todo ello podríamos concluir que.01 * 0. E. p2 = 0. con la taxonomía numérica.000784 + 0. Citrato +.06 0.0. la probabilidad mayor de obtener una correcta identificación con estas tres pruebas y basándonos en los resultados obtenidos previamente.99 La probabilidad total será el producto de las probabilidades: p1 = 0. Voges Proskauer .823474 Si la probabilidad total es la sumada. Laboratorio de Diagnóstico Clínico.25245 Sumadas las tres probabilidades tendíamos: pt = 0.. Sin embargo.99 p1 = 0.85 * 0.25245 pt = 0.57024 * 100 / 0823474 = 0.0.96 0.25245 * 100 / 0823474 = 69. podríamos calcular la probabilidad de que esa combinación correspondiese a cada uno de los gérmenes estudiados.09% 30. podríamos pensar que pertenece a cualquier especie de las tres citadas que presentase una alteración en su metabolismo.Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico. I.000784 p3 = 0.1 Bloque temático III Si nosotros realizásemos estas tres pruebas a un microorganismo que queremos identificar y obtenemos los siguientes resultados: Indol +. 16 . está claro que esta combinación no se ajusta a ninguno de los patrones normales. Esto se haría así: Para E. (28830 Madrid) Curso 2006-2007 Código 28038616 . pneumoniae Para P. la probabilidad sería: Probabilidad de ser Indol positivo: Probabilidad de ser Citrato positivo: Probabilidad de ser Voges Proskauer negativo: (1.24% 0. San Fernando de Henares.01) .92) : 0. pneumoniae para P.9 U.01) 0. coli para K. Pruebas de identificación bacteriana . y en principio.57024 + 0. la probabilidad relativa de que esa combinación de resultados corresponda a cada uno de los tres microorganismos será: 0. vulgaris p2 = p3 = 0.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful