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INSTITUTO AGRONMICO

CURSO DE PS-GRADUAO EM AGRICULTURA TROPICAL E


SUBTROPICAL

FOTOSSNTESE E METABOLISMO DE
CARBOIDRATOS EM PLANTAS JOVENS DE
CANA-DE-ACAR SOB BAIXA TEMPERATURA E
DEFICINCIA HDRICA

DANIELA FAVERO SO PEDRO MACHADO

Orientadora: Ana Maria Magalhes Andrade Laga

Tese submetida como requisito parcial para


obteno do grau de Doutor em Agricultura
Tropical e Subtropical, rea de Concentrao
em Tecnologia da Produo Agrcola.

Campinas, SP
Fevereiro 2014
Ficha elaborada pela bibliotecria do Ncleo de Informao e Documentao do
Instituto Agronmico

M149f Machado, Daniela Favero So Pedro


Fotossntese e metabolismo de carboidratos em plantas jovens de
cana-de-acar sob baixa temperatura e deficincia hdrica / Daniela
Favero So Pedro Machado. Campinas, 2013. 75 fls.

Orientadora: Ana Maria Magalhes Andrade Laga


Tese (Doutorado) Agricultura Tropical e Subtropical Instituto
Agronmico

1 Plantas jovens de cana-de-acar 2. Trocas gasosas 3. Fluorescncia


da clorofila 3. Sntese de sacarose fosfato I. Lagoa, Ana Maria
Magalhes Andrade III. Ttulo

CDD. 633.61
Aos meus pais
Nelva e Ablio (in memorian),
por todo amor.
DEDICO

Ao meu marido Ricardo e minha filha


Carolina por todo amor, pacincia,
auxlio e apoio durante a execuo deste
trabalho,
OFEREO

iv
AGRADECIMENTOS

- A Deus.
- Ps-Graduao e ao Instituto Agronmico pela oportunidade.
- Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES) pela bolsa de
estudos concedida.
- Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (Fapesp) pelo financiamento do
projeto.
- Dra. Ana Maria M. A. Laga pela oportunidade, orientao e ensinamentos.
- Ao Dr. Eduardo Caruso Machado por todo apoio, pacincia e ensinamentos.
- Ao Severino Nogueira por todo auxlio e ideias na montagem dos experimentos.
- minha sogra Celina, por todo amor, carinho, pacincia e dedicao nestes anos cuidando
da Carolina.
- Ao meu marido Ricardo S. Machado por todo auxlio na execuo dos experimentos e acima
de tudo pacincia e compreenso nos momentos de ausncia.
- Aos colegas da Fisiologia: Jos R. Magalhes Filho, Paulo E. R. Marchiori, Fernanda
Castro, Vernica L. Dovis, Guilherme G. Roberto, Cristina R. G. Sales e Karina I. Silva por
todo auxlio durante os experimentos e anlises bioqumicas.
- Dra. Norma de M. Erismann e Dra. Rose M. A. G. Tomaz pelo auxlio e sugestes nas
anlises bioqumicas.
- Aos professores da rea de concentrao Tecnologia da Produo Agrcola da PG-IAC,
pelos ensinamentos transmitidos.
- Ao Prof. Dr. Joaquim Albensio G. Silveira e aos alunos da Universidade Federal do Cear,
Ana Karla M. Lobo, Mrcio O. Martins e Adilton de V. Fontenele por todo auxlio nas
determinaes das atividades enzimticas.
- Ao Prof. Dr. Joaquim Albensio G. Silveira, Prof. Dr. Marcelo de A. Silva e Dra. Norma de
M. Erismann pelas sugestes na pr-banca.
- Enfim, a todos aqueles que de uma forma direta ou indireta contriburam para a realizao
deste trabalho.

v
"Desistir... eu sempre pensei seriamente nisso, mas nunca me
levei realmente a srio; que tem mais cho nos meus olhos
do que o cansao nas minhas pernas, mais esperana nos
meus passos do que tristeza nos meus ombros, mais estrada
no meu corao do que medo na minha cabea."
(Cora Coralina)

vi
SUMRIO

LISTA DE SMBOLOS E ABREVIATURAS............................................................... ix


NDICE DE FIGURAS.................................................................................................. xii
NDICE DE TABELAS.................................................................................................. xvi
Resumo............................................................................................................................. xvii
Abstract............................................................................................................................ xix

CAPTULO I
1 INTRODUO............................................................................................................ 2
2 REVISO DE LITERATURA.................................................................................... 3
3 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS........................................................................ 13

CAPTULO II - Baixa temperatura noturna e deficincia hdrica na fotossntese de


cana-de-acar
RESUMO......................................................................................................................... 20
ABSTRACT..................................................................................................................... 21
1 INTRODUO............................................................................................................ 22
2 MATERIAL E MTODOS.......................................................................................... 23
2.1 Variveis medidas e calculadas.................................................................................. 25
Assimilao de CO2 e fluorescncia da clorofila a.......................................................... 25
Teor de carboidratos solveis.......................................................................................... 27
Teor de amido.................................................................................................................. 28
Potencial da gua na folha............................................................................................... 28
Delineamento experimental............................................................................................. 28
3 RESULTADOS E DISCUSSO................................................................................ 29
4 CONCLUSES........................................................................................................... 38
5 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS....................................................................... 39

CAPTULO III - Metabolismo de carboidratos em duas cultivares de cana-de-acar


sob baixa temperatura e deficincia hdrica
RESUMO........................................................................................................................ 44
ABSTRACT.................................................................................................................... 45
1 INTRODUO........................................................................................................... 46
2 MATERIAL E MTODOS......................................................................................... 48
2.1 Variveis medidas e calculadas................................................................................. 49
Assimilao de CO2 e fluorescncia da clorofila a......................................................... 49
Potencial da gua na folha............................................................................................... 50
Teor de carboidratos........................................................................................................ 50
Atividade de enzimas do metabolismo de carboidratos.................................................. 51
Protena solvel total....................................................................................................... 51
Atividade da sintase de sacarose fosfato........................................................................ 51
Atividade da sintase de sacarose.................................................................................... 52
Atividade das invertases cidas...................................................................................... 52
Atividade das invertases neutras.................................................................................... 53
Delineamento experimental............................................................................................. 53
3 RESULTADOS............................................................................................................ 53
4 DISCUSSO................................................................................................................ 63
Perodo de baixa temperatura e deficincia hdrica......................................................... 63

vii
Perodo de recuperao.................................................................................................... 69
5 CONCLUSES........................................................................................................... 70
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.......................................................................... 72

viii
LISTA DE SMBOLOS E ABREVIATURAS

A Assimilao de CO2, mol m-2 s-1


Ai Assimilao diria de CO2, mmol m-2 d-1
AMI Amido
Apot Assimilao mxima de CO2 em concentrao saturante de CO2, mol m-2 s-1
AS Acares solveis
ATP Adenosina trifosfato
A/Ci Eficincia aparente de carboxilao, mol m-2 s-1 Pa-1
BFV Bainha do feixe vascular
BSA Albumina srica bovina
cc-ec Clulas companheiras - elementos crivados
Ci Concentrao intercelular de CO2, mol mol-1
DAP Dias aps plantio
DH Deficincia hdrica
E Transpirao, mmol m-2 s-1
EDTA cido etilenodiamino tetra-actico
ETR Transporte aparente de eltrons, mol m-2 s-1
EUAi Eficincia intrnseca do uso da gua, mol mol-1
Fo Fluorescncia mnima em tecidos adaptados ao escuro
Fo' Fluorescncia mnima em tecidos iluminados
Fm Fluorescncia mxima em tecidos adaptados ao escuro
Fm' Fluorescncia mxima em tecidos iluminados
Fq' Extino fotoqumica da fluorescncia pelos centros oxidados do
fotossistema II
Fq'/Fm' Eficincia operacional do fotossistema II
Fq'/Fv' Fator de eficincia do fotossistema II
FRU Frutose
Fru-6-P Frutose-6-fosfato
FSII Fotossistema II
Fv Fluorescncia varivel em tecidos adaptados ao escuro
Fv' Fluorescncia varivel em tecidos iluminados
Fv/Fm Eficincia quntica mxima do fotossistema II em tecidos adaptados ao

ix
escuro
Fv'/Fm' Eficincia quntica mxima do fotossistema II em tecidos iluminados
GLU Glicose
Glu-6-P Glicose-6-fosfato
gs Condutncia estomtica, mol m-2 s-1
H2SO4 cido sulfrico
IVA Invertase cida solvel (EC 3.2.1.25)
IVN Invertase neutra (EC 3.2.1.26)
KOH Hidrxido de potssio
LM Limitao metablica, %
MF Massa fresca
MgCl2 Cloreto de magnsio
MOPS cido 3-(N-morfolino)-propanossulfnico
MS Massa seca
NADPH Nicotinamida adenina dinucleotdeo de piridina fosfato reduzida
NPQ Coeficiente de extino no-fotoqumico da fluorescncia
OAA cido oxaloactico
PEP Fosfoenolpiruvato
PEPcase Fosfoenolpiruvato carboxilase
Pi Fosfato inorgnico
PPDK Piruvato ortofosfato diquinase
PVPP Polivinilpolipirrolidona
Q Radiao fotossinteticamente ativa
QA Quinona A
Rubisco Ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase/ oxigenase
RuBP Ribulose-1,5-bisfosfato
SAC Sacarose
SPP Fosfatase de sacarose fosfato (EC 3.1.3.24)
SPS Sintase de sacarose fosfato (EC 2.4.1.14)
SuSy Sintase de sacarose (EC 2.4.1.13)
TN Temperatura noturna
UDP-glicose Uridina-5'-difosfoglicose
Vmax Eficincia mxima de carboxilao, mol m-2 s-1

x
Vpmax Eficincia aparente de carboxilao da fosfoenolpiruvato carboxilase, mol m-
2 -1
s
w6h Potencial da gua na folha medido antes do amanhecer, MPa
w14h Potencial da gua na folha medido s 14:00 h, MPa
CO2 Eficincia quntica da fotossntese, mol CO2 (mol ftons)-1

xi
NDICE DE FIGURAS

CAPTULO I

Figura 1- Produo, transporte e acmulo de sacarose em cana-de-acar.


Adaptado de GROF e CAMPBELL (2001)................................................ 4

CAPTULO II

Figura 1- Fotografias ilustrando (A) bandeja para germinao contendo substrato


comercial e mini-toletes de cana-de-acar, (B) detalhe do mini-tolete
contendo gema, e (C) viso geral das plantas em casa de vegetao aos
56 dias aps o plantio.................................................................................. 24

Figura 2- Variao da radiao solar (A) e da temperatura (B) durante o perodo


experimental. Setas indicam os dias de medidas de trocas gasosas e
fluorescncia da clorofila a em cana-de-acar.......................................... 29

Figura 3- Variao da assimilao diria de CO2 (Ai) de cana-de-acar, cv.


IACSP94-2094 aos seguintes tratamentos: TN20, temperatura noturna de
20 C - irrigada; DH/TN20, temperatura noturna de 20 C - no irrigada;
TN12, temperatura noturna de 12 C - irrigada e DH/TN12, temperatura
noturna de 12 C - no irrigada. As colunas indicam mdia de trs
repeties ( erro padro)........................................................................... 30

Figura 4- A, Resposta da assimilao de CO2 (A) e B, condutncia estomtica (gs)


em cana-de-acar cv. IACSP94-2094. Tratamentos: TN20, temperatura
noturna de 20 C - irrigada (); DH/TN20, temperatura noturna de 20 C
- no irrigada (); TN12, temperatura noturna de 12 C - irrigada () e
DH/TN12, temperatura noturna de 12 C - no irrigada (). Dados
retirados da curva A vs. Ci, sob saturao de luz e 400 mol mol-1 de
CO2. Perodo de aplicao dos tratamentos, dias 1 a 5; perodo de
recuperao com retorno da irrigao das plantas e temperatura noturna
de 20 C, dias 5 a 9..................................................................................... 31

Figura 5- A, Variao de potencial da gua na folha (W14) e B, transpirao (E)


em cana-de-acar cv. IACSP94-2094 submetida aos tratamentos: TN20,
temperatura noturna de 20 C - irrigada; DH/TN20, temperatura noturna
de 20 C - no irrigada; TN12, temperatura noturna de 12 C - irrigada e
DH/TN12, temperatura noturna de 12 C - no irrigada. As colunas
indicam mdia de trs repeties ( erro padro). Perodo de aplicao
dos tratamentos, dias 1 a 5; perodo de recuperao com retorno da
irrigao das plantas e temperatura noturna de 20 C, dias 5 a 9............... 32

Figura 6- A,Variao de assimilao mxima em CO2 saturante (Apot); B,


limitao metablica (LM); C, eficincia de carboxilao da PEPcase
(Vpmax) e D, eficincia mxima da Rubisco (Vmax) em cana-de-acar cv.
IACSP94-2094 submetida aos tratamentos: TN20, temperatura noturna
de 20 C - irrigada (); DH/TN20, temperatura noturna de 20 C - no

xii
irrigada ();TN12, temperatura noturna de 12 C - irrigada () e
DH/TN12, temperatura noturna de 12 C - no irrigada (). Os smbolos
indicam mdia de trs repeties ( erro padro). Perodo de aplicao
dos tratamentos, dias 1 a 5; perodo de recuperao com retorno da
irrigao das plantas e temperatura noturna de 20 C, dias 5 a 9............... 33

Figura 7- A, Resposta de eficincia quntica mxima do fotossistema II (Fv/Fm);


B, eficincia operacional do FSII (Fq'/Fm'); C, transporte aparente de
eltrons (ETR) e D, fator de eficincia do FSII (Fq'/Fv') em cana-de-
acar cv. IACSP94-2094 submetida aos tratamentos: TN20, temperatura
noturna de 20 C - irrigada (); DH/TN20, temperatura noturna de 20 C
- no irrigada ();TN12, temperatura noturna de 12 C - irrigada () e
DH/TN12, temperatura noturna de 12 C - no irrigada (). Os smbolos
indicam mdia de trs repeties ( erro padro). Perodo de aplicao
dos tratamentos, dias 1 a 5; perodo de recuperao com retorno da
irrigao das plantas e temperatura noturna de 20 C, dias 5 a
9................................................................................................................... 35

Figura 8- Relao entre eficincia quntica de CO2 (CO2) e eficincia


operacional do fotossistema II (Fq/Fm) em cana-de-acar cv.
IACSP94-2094 submetida aos tratamentos: TN20 (), temperatura
noturna de 20 C - irrigada; DH/TN20 (), temperatura noturna de 20
C - no irrigada; TN12 (), temperatura noturna de 12 C - irrigada e
DH/TN12 (), temperatura noturna de 12 C - no irrigada, um
(smbolos cheios e linha, CO2=-0,003+0,132*Fq/Fm, R2=0,93,
p<0,01) e quatro dias aps os tratamentos (smbolos vazios e linha
tracejada, CO2=-0,005+0,136*Fq/Fm, R2=0,87, p<0,01)....................... 36

CAPTULO III

Figura 1- (A, B) Resposta da assimilao de CO2 (A) e (C, D) assimilao diria


de CO2 (Ai) de cana-de-acar, cultivares IACSP94-2094 e IACSP95-
5000, sendo o dia 0 (testemunha) medida feita aps 18 dias de
aclimatao a 32/20 C (dia/ noite) com plantas irrigadas; dia 2 medida
feita aps 34 horas a 22/12 C (dia/ noite) com plantas irrigadas (I) e no
irrigadas (NI); dia 13 medida feita aps 13 dias de baixa temperatura em
plantas irrigadas e no irrigadas (estresse intermedirio); dia 20 medida
aps 20 dias de baixa temperatura em plantas irrigadas e no irrigadas
(estresse mximo); dia 22 medida aps 2 dias de retorno temperatura
de 32/20 C e reidratao e dia 28 medida aps 8 dias de recuperao
das plantas. Smbolos indicam mdia de 20 repeties erro padro para
A e 4 repeties erro padro para Ai........................................................ 55

Figura 2- (A, B) Resposta da condutncia estomtica (gs), (C, D) transpirao (E)


e (E, F) eficincia intrnseca do uso da gua (EUAi) de cana-de-acar,
cultivares IACSP94-2094 e IACSP95-5000, sendo o dia 0 (testemunha)
medida feita aps 18 dias de aclimatao a 32/20 C (dia/ noite) com
plantas irrigadas; dia 2 medida feita aps 34 horas a 22/12 C (dia/
noite) com plantas irrigadas (I) e no irrigadas (NI); dia 13 medida feita
aps 13 dias (estresse intermedirio); de baixa temperatura em plantas

xiii
irrigadas e no irrigadas; dia 20 medida aps 20 dias de baixa
temperatura em plantas irrigadas e no irrigadas (estresse mximo); dia
22 medida aps 2 dias de retorno temperatura de 32/20 C e
reidratao e dia 28 medida aps 8 dias de recuperao das plantas.
Smbolos indicam mdia de 20 repeties erro padro........................... 56

Figura 3- (A, B) Variao da concentrao intercelular de CO2 (Ci) e da (C, D)


eficincia aparente de carboxilao (A/Ci) de cana-de-acar, cultivares
IACSP94-2094 e IACSP95-5000, sendo: dia 0 (testemunha) medida
feita aps 18 dias de aclimatao a 32/20 C (dia/ noite) com plantas
irrigadas; dia 2 medida feita aps 34 horas a 22/12 C (dia/ noite) com
plantas irrigadas e no irrigadas; dia 13 medida feita aps 13 dias
(estresse intermedirio) de baixa temperatura em plantas irrigadas (I) e
no irrigadas (NI); dia 20 medida aps 20 dias de baixa temperatura em
plantas irrigadas e no irrigadas (estresse mximo); dia 22 medida aps
2 dias de retorno temperatura de 32/20 C e reidratao e dia 28
medida aps 8 dias de recuperao das plantas. Smbolos indicam mdia
de 20 repeties erro padro.................................................................... 57

Figura 4- (A, B) Resposta da eficincia operacional do FSII (Fq'/Fm') de cana-de-


acar, cultivares IACSP94-2094 e IACSP95-5000, sendo o dia 0
(testemunha) medida feita aps 18 dias de aclimatao a 32/20 C (dia/
noite) com plantas irrigadas; dia 2 medida feita aps 34 horas a 22/12 C
(dia/ noite) com plantas irrigadas (I) e no irrigadas (NI); dia 13 medida
feita aps 13 dias (estresse intermedirio); de baixa temperatura em
plantas irrigadas e no irrigadas; dia 20 medida aps 20 dias de baixa
temperatura em plantas irrigadas e no irrigadas (estresse mximo); dia
22 medida aps 2 dias de retorno temperatura de 32/20 C e
reidratao e dia 28 medida aps 8 dias de recuperao das plantas.
Smbolos indicam mdia de 20 repeties erro padro........................... 58

Figura 5- (A, B) Variao do coeficiente de extino no fotoqumico (NPQ) e da


(C, D) eficincia quntica mxima do FSII (Fv/Fm) e eficincia quntica
mxima do FSII sob Q (Fv'/Fm') de cana-de-acar, cultivares IACSP94-
2094 e IACSP95-5000, sendo o dia 0 (testemunha) medida feita aps 18
dias de aclimatao a 32/20 C (dia/ noite) com plantas irrigadas; dia 2
medida feita aps 34 horas a 22/12 C (dia/ noite) com plantas irrigadas
(I) e no irrigadas (NI); dia 13 medida feita aps 13 dias de baixa
temperatura em plantas irrigadas e no irrigadas; dia 20 medida aps 20
dias de baixa temperatura em plantas irrigadas e no irrigadas (mximo
estresse); dia 22 medida aps 2 dias de retorno temperatura de 32/20
C e reidratao e dia 28 medida aps 8 dias de recuperao das plantas.
Smbolos indicam mdia de 20 repeties erro
padro.......................................................................................................... 59

Figura 6- (A, B) Variao do fator de eficincia do FSII (Fq'/Fv') e do (C, D)


transporte aparente de eltrons (ETR) de cana-de-acar, cultivares
IACSP94-2094 e IACSP95-5000, sendo o dia 0 (testemunha) medida
feita aps 18 dias de aclimatao a 32/20 C (dia/ noite) com plantas
irrigadas; dia 2 medida feita aps 34 horas a 22/12 C (dia/ noite) com

xiv
plantas irrigadas (I) e no irrigadas (NI); dia 13 medida feita aps 13
dias de baixa temperatura em plantas irrigadas e no irrigadas; dia 20
medida aps 20 dias de baixa temperatura em plantas irrigadas e no
irrigadas (mximo estresse); dia 22 medida aps 2 dias de retorno
temperatura de 32/20 C e reidratao e dia 28 medida aps 8 dias de
recuperao das plantas. Smbolos indicam mdia de 20 repeties
erro padro.................................................................................................. 60

Figura 7- (A, B) Variao no teor dos acares solveis (AS), da (C, D) sacarose
(SAC) e do amido (AMI) em folhas de cana-de-acar, cultivares
IACSP94-2094 e IACSP95-5000, sendo o dia 0 (testemunha) medida
feita aps 18 dias de aclimatao a 32/20 C (dia/ noite) com plantas
irrigadas; dia 2 medida feita aps 34 horas a 22/12 C (dia/ noite) com
plantas irrigadas (I) e no irrigadas (NI); dia 13 medida feita aps 13
dias de baixa temperatura em plantas irrigadas e no irrigadas; dia 20
medida aps 20 dias de baixa temperatura em plantas irrigadas e no
irrigadas (mximo estresse); dia 22 medida aps 2 dias de retorno
temperatura de 32/20 C e reidratao e dia 28 medida aps 8 dias de
recuperao das plantas. Smbolos indicam mdia de quatro repeties
erro padro.................................................................................................. 61

Figura 8- Variao da atividade das enzimas (A, B) sintase de sacarose (SuSy) e da


(C, D) sintase de sacarose fosfato (SPS) em folhas de cana-de-acar,
cultivares IACSP94-2094 e IACSP95-5000, sendo o dia 0 (testemunha)
medida feita aps 18 dias de aclimatao a 32/20 C (dia/ noite) com
plantas irrigadas; dia 2 medida feita aps 34 horas a 22/12 C (dia/
noite) com plantas irrigadas e no irrigadas; dia 13 medida feita aps 13
dias de baixa temperatura em plantas irrigadas e no irrigadas; dia 20
medida aps 20 dias de baixa temperatura em plantas irrigadas e no
irrigadas (mximo estresse); dia 22 medida aps 2 dias de retorno
temperatura de 32/20 C e reidratao e dia 28 medida aps 8 dias de
recuperao das plantas. Smbolos indicam mdia de quatro repeties
erro padro.................................................................................................. 62

Figura 9- Variao da atividade das (A, B) invertases cidas (IVA) e das (C, D)
invertases neutras (IVN) em folhas de cana-de-acar, cultivares
IACSP94-2094 e IACSP95-5000, sendo o dia 0 (testemunha) medida
feita aps 18 dias de aclimatao a 32/20 C (dia/ noite) com plantas
irrigadas; dia 2 medida feita aps 34 horas a 22/12 C (dia/ noite) com
plantas irrigadas e no irrigadas; dia 13 medida feita aps 13 dias de
baixa temperatura em plantas irrigadas e no irrigadas; dia 20 medida
aps 20 dias de baixa temperatura em plantas irrigadas e no irrigadas
(mximo estresse); dia 22 medida aps 2 dias de retorno temperatura
de 32/20 C e reidratao e dia 28 medida aps 8 dias de recuperao
das plantas. Smbolos indicam mdia de quatro repeties erro padro. 63

xv
NDICE DE TABELAS

CAPTULO II

Tabela 1- Teor de acares solveis totais (mol g-1 MS) em folhas de cana-de-
acar cv. IACSP94-2094 submetida aos tratamentos: TN20, temperatura
noturna de 20 C - irrigada; DH/TN20, temperatura noturna de 20 C -
no irrigada; TN12, temperatura noturna de 12 C - irrigada e DH/TN12,
temperatura noturna de 12 C - no irrigada, no 5 dia de tratamento e 4
dia de recuperao. Perodo de aplicao dos tratamentos, dias 1 a 5;
perodo de recuperao com retorno da irrigao das plantas e
temperatura noturna de 20 C, dias 5 a 9.................................................... 36

Tabela 2- Teor de sacarose (mol g-1 MS) em folhas de cana-de-acar cv.


IACSP94-2094 submetida aos tratamentos: TN20, temperatura noturna
de 20 C - irrigada; DH/TN20, temperatura noturna de 20 C - no
irrigada; TN12, temperatura noturna de 12 C - irrigada e DH/TN12,
temperatura noturna de 12 C - no irrigada, no 5 dia de tratamento e 4
dia de recuperao. Perodo de aplicao dos tratamentos, dias 1 a 5;
perodo de recuperao com retorno da irrigao das plantas e
temperatura noturna de 20 C, dias 5 a 9.................................................... 37

Tabela 3- Teor de amido (mol de Glu g-1 MS) em folhas de cana-de-acar cv.
IACSP94-2094 submetida aos tratamentos: TN20, temperatura noturna
de 20 C - irrigada; DH/TN20, temperatura noturna de 20 C - no
irrigada; TN12, temperatura noturna de 12 C - irrigada e DH/TN12,
temperatura noturna de 12 C - no irrigada. No 5 dia de tratamento e 4
dia de recuperao. Perodo de aplicao dos tratamentos, dias 1 a 5;
perodo de recuperao com retorno da irrigao das plantas e
temperatura noturna de 20 C, dias 5 a 9.................................................... 38

CAPTULO III

Tabela 1- Resposta do potencial hdrico foliar (w6h) de cana-de-acar cv.


IACSP94-2094 e cv. IACSP95-5000 submetida aos tratamentos de baixa
temperatura e deficincia hdrica. Mdias de quatro repeties ( desvio
padro)......................................................................................................... 54

xvi
Fotossntese e metabolismo de carboidratos em plantas jovens de cana-de-acar sob
baixa temperatura e deficincia hdrica

RESUMO

O produto mais importante da cana-de-acar a sacarose acumulada nos colmos. A


diferena na capacidade de armazenar sacarose entre gentipos de cana-de-acar est
relacionada com fatores fisiolgicos, bioqumicos e ambientais. A ocorrncia de temperaturas
baixas e deficincia hdrica afetam a fisiologia da cana-de-acar. O objetivo deste trabalho
foi estudar a influncia da baixa temperatura e da deficincia hdrica sobre a fotossntese,
atividade das enzimas do metabolismo de carboidratos e contedo de carboidratos foliares.
Foram realizados dois estudos, o primeiro utilizando a cultivar IACSP94-2094 e o segundo
experimento utilizando duas cultivares de cana-de-acar, IACSP94-2094 e IACSP95-5000
que exibem diferenas em sua rusticidade. No primeiro estudo, verificaram-se as respostas
fotossintticas da cana-de-acar aos efeitos simultneos e isolados da baixa temperatura
noturna (TN) e da deficincia hdrica (DH). Aps 128 dias do plantio, as plantas da cultivar
IACSP94-2094 foram submetidas aos seguintes tratamentos: 1) testemunha, com temperatura
noturna (TN) de 20 C irrigada (TN20); 2) TN de 20 C com deficincia hdrica (TN20/DH); 3)
TN de 12 C irrigada (TN12) e 4) TN de 12 C com deficincia hdrica (TN12/DH) por cinco
dias. Aps o perodo de tratamento, as plantas foram irrigadas e retornaram temperatura
noturna de 20 C por mais quatro dias, para recuperao. Houve decrscimos na assimilao
de CO2 nos tratamentos TN20/DH, TN12 e TN12/DH. A recuperao total da assimilao de
CO2 foi observada apenas nas plantas do tratamento de baixa temperatura noturna. Com a
ocorrncia simultnea da baixa temperatura noturna e da deficincia hdrica foram observados
efeitos negativos na condutncia estomtica, na eficincia mxima da ribulose-1,5-bisfosfato
carboxilase, no transporte aparente de eltrons, no fator de eficincia e na eficincia
operacional do fotossistema II, causando limitaes difusivas, bioqumicas e fotoqumicas da
fotossntese. A ocorrncia de baixa temperatura noturna e dficit hdrico causou queda no teor
de amido foliar, favorecendo o aumento do teor de sacarose foliar. No segundo estudo
verificou-se as respostas da fotossntese e do metabolismo de carboidratos de cana-de-acar
sob baixa temperatura e deficincia hdrica. Para tanto foram utilizadas duas cultivares de
cana-de-acar, IACSP94-2094 e IACSP95-5000. Aos 87 dias aps o plantio, as plantas
foram submetidas aos tratamentos de baixa temperatura (221/121 C) e deficincia hdrica,
por 22 dias, em cmara de crescimento. Aps este perodo, as plantas foram reidratadas e a
temperatura retornou a 321/201 C, por 9 dias. Sob condies ambientais ideais, a cultivar

xvii
IACSP95-5000 tem maior capacidade fotossinttica que a cultivar IACSP94-2094. Aps
imposio dos tratamentos, em ambas as cultivares, foram observados decrscimos da
assimilao de CO2 devido a fatores difusivos, metablicos e fotoqumicos. Entretanto, a
cultivar IACSP95-5000 foi mais tolerante ao frio devido menor reduo da assimilao de
CO2 e melhor recuperao. No entanto, sob frio e deficincia hdrica, a cultivar IACSP94-
2094 foi mais tolerante. Com a imposio dos tratamentos, foi observado aumento no teor de
acares solveis e amido foliar em ambas cultivares. Entretanto, na cultivar IACSP94-2094
sob baixa temperatura e deficincia hdrica o aumento dos acares solveis totais foi devido
ao aumento da sacarose, quando h tambm aumento da atividade da sintase de sacarose
fosfato.

Palavras-Chave: Saccharum spp., trocas gasosas, fluorescncia da clorofila, resfriamento,


sintase de sacarose fosfato

xviii
Sugarcane photosynthesis and carbohydrate metabolism in young sugarcane at low
temperature and water deficit

ABSTRACT

Sucrose accumulated in stems is the most important product of sugarcane. The ability
difference to store sucrose among genotypes of sugarcane is related to physiological,
biochemical and environmental factors. The occurrence of low temperatures and water deficit
are common factors affecting the physiology of sugarcane. The aim of this work was to study
the influence of low temperature and water deficit on photosynthesis, carbohydrate
metabolism enzymes activity and leaf carbohydrate profile. Two studies were conducted, first
using IACSP94-2094 cultivar and in the second study we using two sugarcane cultivars,
IACSP94-2094 and IACSP95-5000 which have differences in their hardiness. In the first, it
was verified the photosynthetic responses of sugarcane at low night temperature (TN) and
water deficit (DH) applied isolated and combined. After 128 planting days, IACSP94-2094
plants were treated for five days with the following treatment: 1) control, with night
temperature (TN) 20 C and watered (TN20); 2) TN 20 C and water deficit (TN20/DH); 3) TN
12 C and watered (TN12) and 4) TN 12 C and water deficit (TN12/DH). After the treatment
period, plants were watered and returned to the nighttime temperature of 20 C for four days
for recovery. There was a decrease in the CO2 assimilation in treatments TN20/DH, TN12 e
TN12/DH. The total CO2 assimilation recovery was observed only in low night temperature.
The combined low night temperature and water deficit caused a negative effect on stomatal
conductance, maximum capacity of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase, apparent electron
transport, PSII efficiency factor and PSII operating efficiency, causing diffusive, biochemical
and photochemical limitations of photosynthesis. Low night temperature and water deficit
caused decreases in leaf starch content, favoring an increase in sucrose content. In the second
study, it was examined the responses of photosynthesis and carbohydrate metabolism of
sugarcane under low temperature and water deficit. We used two sugarcane cultivars,
IACSP94-2094 and IACSP95-5000. At 87 days after planting, plants were treated with low
temperature (221/121 C) and water deficit for 22 days in a growth chamber. After this
period, plants were rehydrated and the temperature returned to 32 1/20 1 C for 9 days.
Under ideal environmental conditions IACSP95-5000 has a higher photosynthetic capacity
than IACSP94-2094 cultivar. After imposition of the treatments in both cultivars were
observed decreases in CO2 assimilation due to diffusive, metabolic, and photochemical

xix
factors. However the IACSP95-5000 cultivar was more tolerant to chilling, due to lower
reduction in CO2 assimilation and better recovery. While under low temperature and water
deficit, the IACSP94-2094 cultivar was more tolerant. With the imposition of the treatments,
it was observed an increase in soluble sugars and starch in both cultivars. However, the
soluble sugars increase on IACSP94-2094 cultivar under low temperature and water deficit,
was due sucrose increase, when there is an activity increase of sucrose phosphate synthase.

Key Words: Saccharum spp., gas exchange, chlorophyll fluorescence, chilling, sucrose
phosphate synthase

xx
CAPTULO I

1
1 INTRODUO

A cana-de-acar tem importncia mundial como fonte alimentar e de energia e o seu


cultivo no Brasil tem crescido significativamente nos ltimos anos. Essa expanso foi
ocasionada pelo incentivo da indstria sucro-alcooleira, alavancada pelo consumo crescente
de etanol e pela poltica mundial de bioenergia (FRONZAGLIA, 2007; YUAN et al., 2008).
A sustentabilidade da produo agrcola da cana-de-acar no Brasil est fundamentada no
suprimento contnuo de variedades com maior tolerncia s pragas e doenas e s variaes
ambientais (MACEDO, 2007).
A necessidade dos pases desenvolvidos substiturem os derivados de petrleo por
biocombustveis estimulou a demanda global de etanol. Em vrios pases, sobretudo nos
Estados Unidos, a produo local no vem sendo suficiente para o consumo e o setor
sucroalcooleiro do Brasil rapidamente respondeu a essa nova demanda com safras recordes
consecutivas (FNP CONSULTORIA & COMRCIO, 2009). Porm, recentemente na regio
Centro-Sul do Brasil, houve uma queda da produtividade devido s adversidades ambientais,
chuvas em excesso e geadas, e entre os meses de junho e agosto houve perodos longos com
baixas temperaturas (FNP CONSULTORIA & COMRCIO, 2012; UNICA, 2012).
O Estado de So Paulo responde por 60% da produo nacional de cana-de-acar
(FNP CONSULTORIA & COMRCIO, 2012) e a rea cultivada com cana-de-acar tem se
expandido para regies situadas a Oeste e Noroeste do Estado (EMBRAPA, 2009), em reas
marginais onde h variao anual acentuada da disponibilidade hdrica (ROLIM et al., 2007).
O produto mais importante da cana-de-acar a sacarose acumulada nos colmos. O
acmulo de sacarose em cana-de-acar o resultado final do ciclo de sntese e hidrlise da
sacarose, envolvendo a atividade de vrias enzimas tanto na fonte como no dreno. A diferena
na capacidade de armazenar sacarose entre gentipos de cana-de-acar est relacionada com
fatores morfolgicos, enzimticos e ambientais (MOORE, 2005; RAE et al., 2005). Para
entender o armazenamento de sacarose no colmo necessrio identificar os principais fatores
limitantes desse processo, ou seja: fotossntese e sntese de sacarose; taxa de carregamento,
transporte e descarregamento no floema durante a maturao e taxa de transporte de sacarose
para o armazenamento no parnquima e vacolos. Nos meses de inverno h acmulo
significativo de sacarose no colmo, quando a baixa temperatura e a seca so fatores
ambientais que afetam a fisiologia da cana-de-acar. Estas condies causam a queda no

2
crescimento da cana-de-acar e favorecem o acmulo de sacarose nos vacolos das clulas
do parnquima (RAE et al., 2005). Tais condies causam queda no processo fotossinttico da
cana-de-acar, cujo metabolismo fotossinttico C4 menos eficiente sob frio e seca
(CARMO-SILVA et al., 2008; DU & NOSE, 2002; MACHADO et al., 2009; SAGE, 2007).
Os efeitos da ocorrncia de deficincia hdrica e de baixa temperatura causam vrias
alteraes fisiolgicas, e o grau dessas alteraes decorrente da intensidade do estresse e
depende do gentipo (DU & NOSE, 2002; MACHADO et al., 2009; RIBEIRO et al., 2013;
SALES et al., 2012; SMIT & SINGELS, 2006).
O objetivo deste trabalho foi testar a hiptese que cultivares de cana-de-acar
tolerantes deficincia hdrica e/ou baixa temperatura apresentam metabolismo do carbono
menos suscetvel a estes fatores ambientais, estudando seus efeitos sobre a fotossntese,
atividade das enzimas do metabolismo de carboidratos e contedo de carboidratos foliares em
plantas jovens de duas cultivares de cana-de-acar.
Esta tese foi dividida em dois experimentos, sendo o primeiro avaliando o efeito
simultneo da deficincia hdrica e baixa temperatura noturna sobre a fotossntese e contedo
de carboidratos foliares de plantas jovens de cana-de-acar na cultivar IACSP94-2094.
No segundo experimento, foi avaliado o efeito da baixa temperatura diria e da
deficincia hdrica sobre a fotossntese, atividade das enzimas do metabolismo de
carboidratos e contedo de carboidratos foliares em plantas jovens de cana-de-acar, nas
cultivares IACSP94-2094 e IACSP95-5000.

2 REVISO DE LITERATURA

A cana-de-acar possui metabolismo fotossinttico do tipo C4, na qual a assimilao


de CO2 pode atingir valores prximos de 63 mol CO2 m-2 s-1 (MOORE & MARETZKI,
1996). Em apenas um dia, a cana-de-acar pode acumular 40 g m-2 de fitomassa, sendo
grande parte do carbono assimilado direcionado aos colmos (MACHADO et al., 1982;
MOORE & MARETZKI, 1996). Apesar da grande capacidade fotossinttica da cana-de-
acar, no h relao direta com a produo de sacarose e com o acmulo nos colmos. Essa
afirmativa sustentada pela comparao de duas espcies de Saccharum: S. spontaneum, que
tem baixa produo de sacarose (2% sacarose/ massa fresca), enquanto a S. officinarum tem
alta produo (25% sacarose/ massa fresca), entretanto observou-se que a fotossntese de S.
spontaneum duas vezes maior que da S. officinarum (IRVINE, 1975; MOORE &

3
MARETZKI, 1996). A produo de sacarose em cana-de-acar est relacionada com a
produo de fitomassa, sendo ambos os processos incrementados pela mxima interceptao
de energia solar e/ ou alta eficincia na converso de fitomassa (SINGELS et al., 2005). A
interceptao de radiao est relacionada com a dimenso do aparelho fotossinttico, i.e.,
com o ndice de rea foliar. O acmulo de sacarose nos colmos regulado pela capacidade de
armazenar acar e pelo metabolismo e transporte de acar tanto na fonte como no dreno. H
evidncias que tanto a atividade da fonte como a do dreno so determinantes na produo e
acmulo de sacarose (GROF & CAMPBELL, 2001; MOORE & MARETZKI, 1996;
MOORE, 2005; RAE et al., 2005).
O acmulo de sacarose um processo complexo envolvendo diversas etapas (Figura
1).

Figura: 1 - Produo, transporte e acmulo de sacarose em cana-de-acar. Adaptado de


GROF e CAMPBELL (2001).

4
necessrio compreender os fatores que limitam essas etapas, incluindo: a
fotossntese, as enzimas envolvidas na sntese e partio de sacarose, o carregamento da
sacarose no floema das folhas e o descarregamento nos tecidos dreno, alm da taxa de
armazenamento primrio em clulas do parnquima e vacolos e a taxa de remobilizao de
sacarose para o crescimento vegetativo.
O acmulo de sacarose varia de acordo com o gentipo, estdio de desenvolvimento
da planta e do ambiente em que cultivada. A planta responde ao ambiente atravs da
transduo de sinais que coordenam o seu desenvolvimento, alm do acmulo de sacarose
(GROF & CAMPBELL, 2001; MOORE, 2005).
A fotossntese o principal mecanismo que transforma a energia solar em energia
qumica utilizvel (ATP) e em NADPH, nas membranas dos tilacides no cloroplasto.
A caracterstica de alta produtividade de fotoassimilados em plantas C4 atribuda
cooperao metablica de dois tipos de clulas das folhas fotossinteticamente ativas, que
constituem a anatomia do tipo Kranz, na bainha do feixe vascular (BFV) (HATCH, 1987).
As plantas de metabolismo do tipo C4 esto agrupadas em trs sub-tipos bioqumicos,
que diferem principalmente no cido C4 transportado (malato ou aspartato) e na forma de
descarboxilao. O primeiro grupo, do qual faz parte a cana-de-acar entre outras plantas
cultivadas, o NADP-ME em que a enzima mlica dependente de NADPH e a
descarboxilao do cido C4 ocorre no cloroplasto das clulas da BFV. O segundo grupo o
NAD-ME, no qual a enzima mlica dependente de NADH e a descarboxilao do cido C4
ocorre na mitocndria das clulas da BFV. No terceiro grupo a descarboxilao realizada
pela fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PCK) e ocorre predominantemente no citoplasma das
clulas da BFV (GHANNOUM, 2009; TAIZ & ZEIGER, 2009; VON CAEMMERER &
FURBANK, 2003).
A fixao de CO2 ocorre inicialmente nos cloroplastos das clulas do mesofilo foliar
atravs da enzima fosfoenolpiruvato (PEP) carboxilase (PEPcase), onde produzido cido
oxaloactico (OAA) que convertido em malato, que se difunde para as clulas da BFV. Na
BFV o OAA descarboxilado resultando em CO2 que fixado atravs da ribulose bisfosfato
carboxilase/oxigenase (Rubisco), no ciclo de Calvin. Na BFV a descarboxilao do malato
resulta em CO2 e piruvato em reao catalisada pela enzima citoplasmtica NADP-mlica
(HATCH, 1987). O produto de trs carbonos (piruvato) do ciclo de Calvin retorna ao mesofilo
sendo utilizado na sntese de PEP, receptor inicial de CO2, com utilizao de ATP. A via C4
funciona como uma "bomba" bioqumica que concentra o CO2 nas clulas da BFV de tal
forma a saturar eficazmente o ciclo de Calvin e inibir a fotorrespirao (LUNN &

5
FURBANK, 1999), que em plantas C3 responsvel por uma perda substancial de
fotoassimilados devido oxidao.
Assim, a energia extra envolvida na supresso da fotorrespirao nas plantas C4 lhe
permite um aumento significativo na produtividade potencial sobre as plantas C3,
especialmente em ambientes onde a temperatura e intensidade de luz so altas (SAGE, 2007).
No estroma dos cloroplastos das clulas da BFV, ATP e NADPH so utilizados na reduo do
CO2 triose-P. A partir da triose-P so sintetizados a sacarose e o amido. A sacarose
transportada para todos os rgos da planta (HARTT et al., 1963), e constitui o substrato
primrio para o crescimento e desenvolvimento enquanto o amido um carboidrato de reserva
temporrio nas folhas. Em cana-de-acar supe-se que o amido seja sintetizado no
cloroplasto das clulas da BFV e a sacarose no citoplasma do mesofilo (GROF & CAMPBEL,
2001; LUNN & FURBANK, 1999).
Em cana-de-acar a sacarose alm de principal produto da fotossntese, uma
molcula de transporte envolvida no crescimento, desenvolvimento, armazenamento,
transduo de sinais e aclimatao a estresses ambientais (HARTT et al., 1963; SALERNO &
CURATTI, 2003). A sntese de sacarose pode ser catalisada por duas enzimas: a sintase de
sacarose fosfato (SPS):

UDP-glicose + frutose-6-fosfato sacarose-6-fosfato + UDP + H+

e a sintase de sacarose (SuSy):

UDP-glicose + frutose sacarose + UDP + H+

A SPS uma protena de baixa abundncia (< 0,1% da protena solvel foliar) e
relativamente instvel (HUBER & HUBER, 1996). considerada uma enzima chave no
processo de sntese de sacarose, porm ambas as enzimas (SPS e SuSy) esto solveis no
citoplasma e catalisam livremente as reaes. Entretanto, a principal via de sntese de sacarose
envolve a ao sequencial da SPS, que catalisa a penltima etapa da rota de sntese e da
enzima fosfatase de sacarose fosfato (SPP;) que remove rapidamente o fosfato inorgnico (Pi)
da sacarose-6-fosfato liberando a sacarose. A liberao da sacarose torna a reao da SPS
irreversvel, proporcionando uma eficiente produo de sacarose, mesmo em condies de
baixa concentrao de substrato (HUBER & HUBER, 1996; SALERNO & CURATTI, 2003).
A SPS exerce controle maior em altas taxas fotossintticas e, como tal, tem grande
controle sobre o fluxo mximo atravs da rota de sntese de sacarose (HUBER & HUBER,
1996). Alm disso, a SPS o passo limitante da velocidade da biossntese da sacarose, e se

6
correlaciona com exportao deste acar (HUBER & HUBER, 1996; STITT et al.,1988).
GROF & CAMPBEL (2001) observaram que a atividade da SPS foliar est correlacionada
com o contedo de sacarose entre cultivares de cana-de-acar, entretanto isso somente no
tecido fonte.
A SPS tambm est presente em outros tecidos que atuam na sntese de sacarose,
como por exemplo, frutos em fase de amadurecimento, e em cana-de-acar (RAE et al.,
2005), tendo importante ao sobre o acmulo e metabolismo da sacarose nos colmos (GROF
et al., 2007). Os mecanismos de controle da SPS so: a expresso gnica, o controle alostrico
pela glicose-6-fosfato (Glu-6-P) (ativador) e Pi (inibidor) e ainda pela fosforilao reversvel
da poro seril da molcula da enzima (HUBER & HUBER, 1996; VERMA et al., 2011).
A sacarose sintetizada nas clulas do mesofilo e tambm como resultado da hidrlise
de amido na BFV (Figura 1). A sacarose sintetizada nas folhas da cana-de-acar
transportada para os outros tecidos, via floema. Duas hipteses de como a sacarose entra no
floema foram postuladas: o carregamento simplstico, atravs do plasmodesmata, e
carregamento apoplstico, mediada por um sistema de transporte ativo (FROMMER &
SONNEWALD, 1995). Em cana-de-acar, as clulas do floema no esto conectadas a
outras clulas da folha por plasmodesmas (ROBINSON-BEERS & EVERT, 1991) sugerindo
que o carregamento do floema ocorra, principalmente, via apoplasto. O carregamento ativo
ocorre no sentido da clula do mesofilo para as clulas do floema, contra um gradiente de
concentrao. O gradiente de prtons, que necessrio para o co-transporte de sacarose e de
prtons (DELROT, 1981), gerado por uma H+-ATPase, localizada na membrana plasmtica
das clulas companheiras (BOUCHE-PILLON et al., 1994).
O transporte da sacarose da fonte para os drenos inicia-se com seu movimento a partir
do citoplasma das clulas do mesofilo para os complexos clulas companheiras-elementos
crivados (cc-ec) do floema. Ou seja, o carregamento do floema, uma interface entre a
produo de fotoassimilados na fonte e o seu consumo nos drenos. O carregamento do floema
regulado tanto pela fonte como pelo dreno (SMITH & STITT, 2007). Em cana-de-acar o
carregamento do floema ocorre possivelmente via apoplasto nas folhas. No floema o
transporte da sacarose a partir das folhas para os outros rgos drenos, ocorre em resposta a
um gradiente de concentrao (VAN BEL, 2003; RAE et al., 2005).
O fluxo de sacarose das clulas do mesofilo para o complexo cc-ec afetado pela
temperatura (DU & NOSE, 2002), deficincia hdrica (DU et al., 1998), e pela atividade de
enzimas relacionadas com o metabolismo da sacarose, como a SPS, SuSy, invertases neutras
(IVN), invertases cidas (IVA) (VERMA et al., 2010) e demanda por fotoassimilados pelo

7
dreno (WARDLAW, 1990). Em condies limitantes na folha, o aumento da fotossntese
lquida acarreta aumentos proporcionais ao fluxo de fotoassimilados. Durante o curso de um
dia h variao no fluxo de radiao e consequentemente, na produo fotossinttica. Sob alta
radiao o excesso de fotoassimilado armazenado como amido no cloroplasto (PAUL &
PELLNY, 2003) e/ou como sacarose nos vacolos (SOUZA, 2011). Conforme ocorre
diminuio da radiao e queda na fotossntese pode ocorrer mobilizao e exportao de
amido acumulado durante o dia (SMITH & STITT, 2007; SOUZA, 2011). Durante a noite o
amido degradado produzindo sacarose, a qual transportada e utilizada metabolicamente. A
intensidade de remobilizao e de exportao durante a noite consistente com o teor de
amido nas folhas no final do dia (HENDRIX & GRANGE 1991).
O fluxo de exportao da sacarose parece ser definido pela atividade da SPS
(GALTIER et al., 1993; HARTT et al., 1963; VERMA et al., 2011) que afetada pela
demanda do dreno e pelo ambiente (DU et al., 1998; DU & NOSE, 2002; YANG et al., 2001).
Por exemplo, a durao do dia tem efeito significativo sobre a partio de fotoassimilados
entre a sacarose e o amido. H forte correlao na proporo de sacarose e de amido em
folhas com a atividade da SPS (GALTIER et al., 1993). Sob condies de dias curtos o
acmulo de amido aumenta e h queda na atividade da SPS. O aumento da sntese de amido
durante o dia possibilita a manuteno da exportao de fotoassimilados durante o perodo da
noite (SMITH & STITT, 2007). A taxa de exportao de sacarose est relacionada com o teor
de amido nas folhas no final do dia. Desta forma, a atividade da SPS nas folhas desempenha
um papel crucial na partio de carbono, a partir do substrato da hidrlise do amido. Alm
disso, os nveis elevados de SPS tm o potencial de aumentar as taxas fotossintticas em
condies favorveis (GALTIER et al., 1993). Ocorre, portanto uma coordenao entre a
produo de fotoassimilados e a utilizao destes produtos para o metabolismo e crescimento
(GRAHAM & MARTIN, 2000).
O movimento da sacarose a partir do floema para o parnquima de armazenamento
inicia-se com o descarregamento do floema. A presena de inmeros plasmodesmas nas
clulas sugere que as clulas sejam conectadas simplasticamente e que o transporte de
sacarose poderia ser potencialmente via simplasto. No entanto, a presena de sacarose no
apoplasto sugere que a sacarose tambm seja descarregada via apoplasto (RAE et al., 2005).
Assim, a sacarose e os produtos da sua hidrlise (hexoses) pelas IVA (GLASZIOU &
GAYLER, 1972) podem ser acumulados nas clulas do parnquima, via transportadores de
membrana. Sugere-se que a atividade das invertases mantm o gradiente de sacarose entre a
fonte e o floema, dando continuidade ao descarregamento do floema.

8
A rota do movimento de sacarose e o local da sua quebra, alm de serem fundamentais
para o mecanismo de importao, tm importncia devido aos sinais gerados pelos acares.
Dependendo da via de entrada de sacarose nos drenos, ou seja, via plasmodesmata ou parede
celular, a sacarose pode ser quebrada pela invertase de parede celular, invertase
citoplasmtica ou invertase vacuolar (produzindo hexoses) ou pela SuSy (gerando frutose e
UDP-glicose) (KOCH, 2004). Entretanto na quebra da sacarose via invertases h duas vezes
mais produo de hexoses que pela SuSy.
Como descrito anteriormente, a SuSy tambm est envolvida com a sntese, assim
como na quebra da sacarose, gerando UDP-glicose e frutose, sendo esta ltima a, sua funo
principal (SALERNO & CURATTI, 2003). A quebra da sacarose vital em plantas, no s na
alocao do carbono, mas na sinalizao a base de hexoses nos drenos. Apenas as reaes das
invertases e da SuSy esto envolvidas na rota da quebra da sacarose in vivo, sendo a regulao
dessas reaes e suas consequncias, importantes no metabolismo de carbono em plantas
(KOCH, 2004). De maneira geral, a SuSy est envolvida em processos de direcionamento da
sacarose a processos anablicos, partio de sacarose entre fonte e dreno, em respostas
anaerobiose e frio, armazenamento e maturao (KOCH, 2004; STURM & TANG, 1999).
As invertases esto relacionadas com a quebra da sacarose em glicose e frutose. As
invertases presentes no citoplasma tem pH timo entre 6,5 e 8,0, sendo chamadas de
invertases neutras (IVN) e as presentes nos vacolos e parede celular, tem um pH timo cido
(pH 5,0), portanto sendo chamadas de invertases cidas (IVA). Geralmente a invertase da
parede celular est envolvida na partio da sacarose entre fonte e dreno, respirao, reduo
do turgor em zonas relacionadas ao carregamento do floema, respostas a ferimentos e
infeces e no controle da diferenciao celular e desenvolvimento da planta. A invertase
vacuolar est envolvida no processo de osmorregulao e expanso celular, respirao,
mxima gerao de hexoses no vacolo, controle da composio de acares em frutas e
rgo de armazenamento e resposta ao frio. A invertase citoplasmtica tem provvel funo
no catabolismo (STURM & TANG, 1999; KOCH, 2004).
Em cana-de-acar, um acmulo significativo de sacarose ocorre no inverno, quando
as baixas temperaturas e a seca so fatores ambientais comuns que afetam a fisiologia da
planta. No inverno, a baixa taxa de crescimento da planta favorece os processos de acmulo
de sacarose nos colmos, ou seja, crescimento ativo e armazenamento so processos
competitivos e determinados pelas condies do ambiente (HATCH & GLASZIOU, 1963).
A baixa temperatura e a deficincia hdrica so fatores que afetam diretamente o
crescimento e produtividade dos cultivos agrcolas (MACHADO et al., 2009; PEARCE,

9
1999; PIMENTEL, 2004). A taxa mxima de crescimento da cana-de-acar ocorre entre 25 e
35 C e quando expostas a temperatura de 15 C j se observa inibio do crescimento
vegetativo (EBRAHIM et al., 1998; SALES et al., 2012).
A mudana de temperatura incide diretamente sobre todo processo cintico e
termodinmico nos aspectos bioqumicos e fisiolgicos da planta (PEARCE, 1999). Sob baixa
temperatura, as plantas so classificadas em trs categorias em relao a sensibilidade: 1)
suscetveis ao frio, ou seja, so danificadas por temperaturas abaixo de 12 C; 2) tolerante ao
frio, mas suscetveis ao congelamento, ou seja, podem aclimatar em temperaturas inferiores a
12 C, mas so incapazes de sobreviver ao congelamento; e 3) tolerantes ao congelamento, ou
seja, capazes de se adaptarem para sobreviver em temperaturas abaixo de zero. A baixa
temperatura tem efeito direto sobre as clulas, enquanto o congelamento, muitas vezes age de
forma indireta e danificando as clulas pela desidratao (PEARCE, 1999). Entretanto, em
espcies tropicais sensveis ao resfriamento podem ocorrer danos mesmo quando expostas a
temperaturas superiores de congelamento do tecido (KAKANI et al., 2008; SAGE, 2007).
Folhas de plantas expostas ao resfriamento mostram inibio da fotossntese,
translocao de sacarose, menor respirao, inibio do metabolismo de protenas, gerao de
espcies reativas de oxignio, crescimento lento e murcha foliar. Estas modificaes so
causadas por disfunes em processos metablicos promovidos por alteraes das
propriedades da membrana, mudanas na estrutura de protenas e nas interaes entre
macromolculas, alm de inibio de reaes enzimticas (CARMO-SILVA et al., 2008;
KAKANI et al., 2008; LIU et al., 2012; SOARES-CORDEIRO et al., 2010).
Entretanto, plantas que permanecem ativas durante o inverno, tm a respirao, a
fotossntese e a sntese de protenas reguladas pelo frio (GUY, 1990). Em geral, essa
regulao do metabolismo primrio essencial para sustentar o crescimento, ainda que este
seja menor que em temperaturas mais elevadas (PEARCE, 1999). Segundo LEVITT (1980) e
SAKAI & LARCHER (1987) citados por PEARCE (1999), durante o crescimento sob baixas
temperaturas ocorre acmulo de solutos como aminocidos livres e, especialmente,
carboidratos. Uma possvel explicao para esse acmulo durante a aclimatao ao frio que
nesse perodo h maior limitao do crescimento do que da fotossntese, sendo assim uma
consequncia direta do menor uso do carboidrato (PEARCE, 1999). A formao de reserva
contribui para o crescimento rpido quando o ambiente torna mais quente (PEARCE, 1999;
POLLOCK & JONES, 1979). H uma variedade de solutos que podem ser acumulados e
correlacionados com a tolerncia ao frio. Em gramneas, por exemplo, foi observado o
acmulo de sacarose e frutanos (POLLOCK & JONES, 1979).

10
Alm das condies trmicas, a deficincia hdrica do solo constitui um dos estresses
mais limitantes da produtividade vegetal (PIMENTEL, 2004). A deficincia hdrica tem
impacto varivel na produtividade agrcola dependendo da fase fenolgica em que ocorre e da
cultivar (INMAN-BAMBER & SMITH, 2005; MACHADO et al., 2009, SALES et al., 2012).
A emergncia da plntula e o perodo compreendido entre a pr e ps-florao so as fases
fenolgicas de maior suscetibilidade seca em termos de produo agrcola de gros
(PIMENTEL, 2004). Contudo, nos cultivos em que os rgos de interesse econmico no so
os frutos ou sementes, como no caso da cana-de-acar (colmo), os efeitos da deficincia
hdrica so prejudiciais quando a mesma ocorre na fase inicial de estabelecimento das plantas
(MACHADO, 2009), bem como na de intenso crescimento (ROBERTSON et al., 1999).
Sob deficincia hdrica, as plantas apresentam alteraes morfofisiolgicas, tais como
enrolamento e alterao do ngulo da folha, reduo da rea foliar, da transpirao, da
condutncia estomtica, da fotossntese (comprometimento das etapas fotoqumica e
bioqumica), da condutividade hidrulica das razes, modificao da atividade de enzimas do
metabolismo do carbono e mudanas nos teores de antioxidantes (GHANNOUM, 2009;
LOPES et al., 2011; MACHADO et al., 2009; RIBEIRO et al., 2013). Algumas destas
respostas visam reduzir os efeitos deletrios da baixa disponibilidade hdrica, constituindo,
portanto, mecanismos de tolerncia seca (KRAMER, 1980). No caso da cana-de-acar,
alguns gentipos mostram diferentes capacidades de recuperao no crescimento aps eventos
de seca (LANDELL et al., 2004; MACHADO et al., 2009; SALES et al., 2012).
A fotossntese sob deficincia hdrica decresce inicialmente devido ao fechamento
estomtico e, com o agravamento da seca, tambm se evidenciam limitaes metablicas
(CARMO-SILVA et al., 2008; GHANNOUM et al., 2003; GHANNOUM, 2009; LOPES et
al., 2011). O fechamento estomtico a primeira linha de defesa contra dessecao, pois
mais rpido que as mudanas no crescimento radicular, da rea foliar, da ultraestrutura dos
cloroplastos, dos pigmentos e protenas. Espcies tolerantes seca tem controle estomtico
que permite alguma fixao de carbono durante o estresse, melhorando assim a eficincia do
uso da gua, ou ainda, os estmatos abrem rapidamente aps reidratao (MACHADO et al.,
2009; YORDANOV et al., 2000).
So poucos os estudos envolvendo a atividade das enzimas do metabolismo da
sacarose e amido em folhas (fonte) de cana-de-acar sob deficincia hdrica e/ou baixa
temperatura, assim como as trocas gasosas quando estes fatores ocorrem de forma simultnea
(SALES et al., 2012). A maioria dos trabalhos relaciona as enzimas do metabolismo de
sacarose apenas com o transporte e armazenamento nos colmos (dreno). No entanto, o

11
conhecimento de como estas enzimas atuam nas folhas e os efeitos dos estresses ambientais
sobre suas atividades so fundamentais para a compreenso da partio dos fotoassimilados,
do crescimento e do acmulo de sacarose em cana-de-acar (GROF & CAMPBELL, 2001).

12
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18
CAPTULO II

19
Baixa temperatura noturna e deficincia hdrica na fotossntese de cana-de-acar

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi avaliar as respostas fotossintticas da cana-de-acar aos


efeitos simultneos e isolados de temperatura noturna (TN) baixa e deficincia hdrica (DH).
Aps 128 dias do plantio, as plantas da cultivar IACSP94-2094 foram submetidas aos
tratamentos: controle sem DH e TN de 20 C (TN20); com DH e TN de 20 C (DH/TN20); sem
DH e TN de 12 C (TN12); e com DH e TN de 12 C (DH/TN12) por cinco dias. Aps o perodo
de tratamento as plantas foram irrigadas e retornaram a TN de 20 C por mais quatro dias, para
recuperao. Houve decrscimos na assimilao de CO2 em todos os tratamentos. A
recuperao total da assimilao de CO2 foi observada apenas nas plantas do tratamento TN12.
A ocorrncia simultnea da baixa temperatura noturna e da deficincia hdrica causou efeito
negativo na condutncia estomtica, na capacidade mxima da ribulose-1,5-bisfosfato
carboxilase e no transporte aparente de eltrons, fator de eficincia e eficincia operacional do
fotossistema II, causando limitaes difusivas, bioqumicas e fotoqumicas da fotossntese. A
ocorrncia de baixa temperatura e dficit hdrico causa queda no teor de amido nas folhas,
favorecendo o aumento no teor de sacarose.

Palavras-chaves: Saccharum spp.; assimilao de CO2; PEPcase; resfriamento; Rubisco.

20
Low night temperature and water deficit on photosynthesis of sugarcane

ABSTRACT

The objective of this work was to evaluate the photosynthetic responses of sugarcane
to the isolate and simultaneous effects of low night temperature (TN) and water deficit (WD).
After 128 days of planting, plants of the cultivar IACSP94-2094 were subjected to the
following treatments: control, without WD and TN of 20 C (TN20); with WD and TN of 20 C
(DH/TN20); without WD and TN of 12 C (TN12); and with WD and TN of 12 C (DH/TN12).
After five days in each treatment, plants were irrigated and subjected to TN of 20 C for four
days for recovering. There were decreases in leaf CO2 assimilation in all treatments. Total
recovery of CO2 assimilation was noticed only in plants of treatment TN12. The simultaneous
occurrence of low night temperature and water deficit caused a negative effect on stomatal
conductance, on the maximum capacity of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase and on
electron transport rate, efficiency factor and operational efficiency of photosystem II, causing
diffusive, biochemical and photochemical limitations of photosynthesis. The occurrence of
low temperature and water deficit causes a decrease in starch content in the leaves, favoring
an increase in sucrose content.

Keys-words: Saccharum spp.; CO2 assimilation; PEPcase; cooling; Rubisco.

21
1 INTRODUO

A cultura de cana-de-acar (Saccharum spp.) tem importncia mundial como fonte de


alimento e de energia e o cultivo dessa espcie no Brasil aumentou em reas marginais, onde
h variaes anuais acentuadas de temperatura e da disponibilidade hdrica (ROLIM et al.,
2007). Episdios de baixa temperatura noturna ocorrem com certa frequncia e causam danos
que podem afetar a produtividade das plantas (SALES et al., 2012; SOARES-CORDEIRO et
al., 2010). Nas regies subtropicais, a ocorrncia de baixas temperaturas noturnas comum no
final do inverno, quando h deficincia hdrica no solo e dias com temperaturas relativamente
altas.
As plantas tm tolerncia varivel baixa temperatura e em espcies tropicais
sensveis ao resfriamento podem ocorrer danos mesmo em temperaturas bem acima da
temperatura de congelamento do tecido (KAKANI et al., 2008; SAGE, 2007). Folhas de
plantas expostas ao resfriamento mostram inibio da fotossntese, translocao mais lenta de
carboidratos, menor respirao, inibio do metabolismo de protenas, gerao de espcies
reativas de oxignio, crescimento lento e murcha foliar. Estas modificaes so causadas por
disfunes em processos metablicos promovidos por alteraes das propriedades da
membrana, mudanas na estrutura de protenas e nas interaes entre macromolculas, alm
de inibio de reaes enzimticas (CARMO-SILVA et al., 2008; KAKANI et al., 2008;
SOARES-CORDEIRO et al., 2010; LIU et al., 2012). Em condies de baixa temperatura
noturna (5 a 12 C), observaram-se decrscimos na fotossntese em espcies C4 (milho e
gramneas) devido tanto a fatores difusivos quanto metablicos (KAKANI et al., 2008;
SOARES-CORDEIRO et al., 2010).
Alm das condies trmicas, a deficincia hdrica do solo constitui um dos estresses
mais limitantes da produtividade vegetal. A deficincia hdrica tem impacto varivel na
produtividade agrcola dependendo da fase fenolgica em que ocorre (INMAN-BAMBER &
SMITH, 2005; MACHADO et al., 2009), havendo gentipos de cana-de-acar que mostram
diferentes capacidades de recuperao no crescimento aps eventos de seca (LANDELL et
al., 2004; MACHADO et al., 2009). Sob deficincia hdrica, as plantas apresentam alteraes
morfofisiolgicas, tais como enrolamento e alterao do ngulo da folha, reduo da rea
foliar, da transpirao, da condutncia estomtica, da fotossntese, da condutividade
hidrulica das razes, modificao da atividade de enzimas do metabolismo de nitrognio e de

22
carbono e mudanas nos teores de antioxidantes (GHANNOUM, 2009; LOPES et al., 2011;
MACHADO et al., 2009; RIBEIRO et al., 2013). A fotossntese decresce inicialmente devido
ao fechamento dos estmatos e, com o agravamento da deficincia hdrica, tambm se
evidenciam limitaes metablicas (CARMO-SILVA et al., 2008; GHANNOUM et al., 2003;
GHANNOUM, 2009; LOPES et al., 2011).
Os estudos sobre os danos causados pela baixa temperatura noturna e deficincia
hdrica em espcies C3 so frequentes (ALLEN et al., 2000; BERTAMINI et al., 2005;
FLEXAS et al., 1999; MACHADO et al., 2010) porm, em espcies C4 como cana-de-acar,
so menos estudadas principalmente quando ocorrem simultaneamente (SALES et al., 2012).
O objetivo deste trabalho foi avaliar as respostas fotossintticas e relaes hdricas
ocorrncia de baixa temperatura noturna do ar e de restrio hdrica no solo, isoladamente ou
em conjunto, considerando os processos, bioqumicos, fotoqumicos e estomticos em plantas
jovens de cana-de-acar.

2 MATERIAL E MTODOS

Em bandejas contendo substrato comercial (Carolina Soil, Vera Cruz, RS) composto
de turfa de Sphagno, vermiculita expandida, calcrio dolomtico, gesso agrcola e fertilizante
NPK (traos) foram plantados mini-toletes de cana-de-acar (Saccharum spp.) cv. IACSP94-
2094 (Figura 1A e B).
Aos 35 dias aps o plantio (DAP), as mudas foram transplantadas para vasos plsticos
contendo 8,5 L de uma mistura de terra, areia e substrato comercial na proporo 1:1:1
(v/v/v). Foi plantada uma muda por vaso e conduzidos somente o colmo primrio. As plantas
foram mantidas em casa de vegetao (Figura 1C) e receberam tanto irrigao diria quanto
aplicaes de nutrientes. As aplicaes dos nutrientes foram parceladas em trs vezes,
totalizando, por vaso: 18,21 g de Ca(NO3)2; 5,31 g de fosfato monoamnico; 7,29 g de KCl;
2,12 g de MgSO4; 0,17 g de H3BO3; 0,20 g de MnSO4; 0,02 g de CuSO4; 0,02 g de
(NH4)6Mo7O24 x 4(H2O); 0,09 g de ZnSO4; e 0,212 mg de FeEDTA (6% Fe).
Aos 128 DAP (06/01/2011), as plantas foram submetidas aos seguintes tratamentos: 1)
testemunha, com temperatura noturna (TN) de 20 C irrigada (TN20); 2) TN de 20 C com
deficincia hdrica (TN20/DH); 3) TN de 12 C irrigada (TN12) e 4) TN de 12 C com
deficincia hdrica (TN12/DH).

23
Para imposio da baixa temperatura noturna, as plantas foram transferidas para uma
cmara de crescimento (modelo PGR14, Conviron, Canad) nas seguintes condies
ambientais: temperatura do ar 121 C e umidade relativa de 65% e permaneceram nessa
condio durante 12 h (19:00 s 7:00h).

A B
C

Figura 1 - Fotografias ilustrando (A) bandeja para germinao contendo substrato comercial
e mini-toletes de cana-de-acar, (B) detalhe do mini-tolete contendo a gema, e (C) viso
geral das plantas em casa de vegetao aos 56 dias aps o plantio.

As plantas foram irrigadas diariamente, fazendo-se a reposio da gua


evapotranspirada, que foi medida por pesagens dirias dos vasos. A deficincia hdrica foi
imposta pela suspenso da rega e o substrato foi mantido com 50% da capacidade mxima de
reteno de gua, medida pela pesagem dos vasos. Ou seja, foi reposta somente a gua
suficiente para manter ao substrato com 50% da capacidade de reteno total de gua (SALES
et al., 2012). Os tratamentos foram impostos pelo perodo de cinco dias. Na sequncia, as
plantas foram submetidas a um perodo de quatro dias de recuperao, quando os tratamentos
TN12 e TN12/DH retornaram temperatura noturna de 20 C e as plantas com DH foram
reidratadas. A reidratao do substrato foi realizada ao entardecer do 5 dia de tratamento, at
90% de capacidade mxima de reteno de gua.

24
Durante o perodo experimental a temperatura do ar e a radiao solar foram
registradas continuamente pelo posto meteorolgico, distante 300 m do experimento, do
Centro Experimental Central (CEC) do Instituto Agronmico (IAC), em Campinas-SP.

2.1 Variveis medidas e calculadas

Assimilao de CO2 e fluorescncia da clorofila a

Na primeira folha totalmente expandida e com a lgula aparente (folha +1), foram
realizadas simultaneamente as medidas de trocas gasosas e fluorescncia da clorofila a, por
meio de um analisador de gases por infravermelho integrado com cmara de fluorescncia,
modelo Li 6400-40F (Licor, Inc. Nebraska, EUA). Foram realizadas curvas de resposta da
assimilao de CO2 (A) e da fluorescncia da clorofila a pela variao da concentrao
intercelular de CO2 (Ci), nas condies de radiao fotossinteticamente ativa (Q) de 2000
mol m-2 s-1, temperatura foliar de 30 C e dficit de presso de vapor entre a folha e o ar ao
redor de 1,5 kPa. A variao de Ci foi obtida pela variao da concentrao de CO2 do ar (Car)
de entrada da cmara de medida de acordo com LONG & BERNACCHI (2003). Essas curvas
foram realizadas no perodo entre 9:00 h e 12:00 h.
As variveis analisadas em relao fluorescncia da clorofila a foram: fluorescncia
mnima (Fo) e mxima (Fm), medidas aps adaptao ao escuro; fluorescncia no estado de
equilbrio dinmico (F') e mxima (Fm'), medidas aps adaptao luz (MAXWELL &
JOHNSON, 2000). A fluorescncia varivel mxima no escuro e luz foram calculadas,
respectivamente, por Fv=Fm-Fo e Fv'=Fm'-Fo', onde Fo' representa a fluorescncia mnima em
folhas adaptadas luz. O termo Fq' foi calculado por Fq'=Fm'-F', representando a extino
fotoqumica da fluorescncia causada pelos centros oxidados do fotossistema II (FSII)
segundo BAKER (2008). Desta forma, calculou-se a eficincia quntica mxima (Fv/Fm) e a
eficincia operacional do FSII (Fq'/Fm'), o transporte aparente de eltrons (ETR=Fq'/Fm' x Q x
0,4 x 0,85) e o fator de eficincia do FSII (Fq'/Fv') de acordo com MAXWELL & JOHNSON
(2000) e BAKER (2008), respectivamente. Para o clculo de ETR, considerou-se uma
distribuio de eltrons entre o FSI e FSII de 0,4 (EDWARDS et al., 1993) e a absoro de
luz 0,85. Calculou-se tambm a eficincia quntica da fotossntese (CO2) pela relao
A/0,85Q, para cada valor de Ci.
A partir da curva A vs. Ci foram calculadas a eficincia aparente de carboxilao da
fosfoenolpiruvato carboxilase (PEPcase, Vpmax) e a capacidade mxima da ribulose-1,5-

25
bisfosfato carboxilase/oxigenase (Rubisco, Vmax) Os dois parmetros bioqumicos foram
calculados partir da soluo analtica das equaes propostas por COLLATZ et al. (1992):

M - M(Vmax + Q) + VmaxQ

Ag - Ag (M + Vpmax /P) + M Vpmax /P = 0 (2)

onde significa a convexidade da curva A/Q, M a assimilao de CO2 no plat da curva A/Ci,
significa a eficincia quntica aparente da curva A/Q, significa a convexidade da curva
A/Ci, Ag a assimilao bruta de CO2, e P a presso atmosfrica. Ag foi calculada por Ag = A +
Rd, onde Rd a respirao foliar.
Para estimar a convexidade , foi ajustada a curva A/Ci, pela equao proposta por
LIETH & REYNOLDS (1987), respectivamente:

A=(((*Ci+Amax+Rd)-((* Ci +Amax+Rd)-(4** Ci **(Amax+Rd))0,5)/(2*))-Rd (3)

onde Amax significa a assimilao de CO2 sob saturao de luz.


A convexidade relativa curva A vs. Q, tambm foi estimada pela equao proposta
por LIETH & REYNOLDS (1987). As curvas de reposta de A em funo da variao da luz
foram medidas aplicando-se 13 Q, de forma decrescente: 2300, 1900, 1500, 1100, 900, 700,
600, 500, 300, 200, 100, 50 e 0 mol m-2 s-1. O tempo mnimo de equilbrio para cada medida
em cada Q foi 180 segundos e o mximo 300 segundos, ou at que a medida apresentasse um
coeficiente de variao de 0,5 %. A concentrao de CO2 e a DPVfolha-ar no ar foram de 400
mol CO2 mol-1 e 1,5 kPa, respectivamente.
Tambm a partir da curva A vs. Ci foram calculadas a assimilao de CO2 a 400 mol
mol-1 no ar e a assimilao potencial de CO2 em concentrao saturante de CO2 (Apot).
Estimou-se a limitao metablica (LM) pela equao LM=[(AA')/A]*100 conforme
LAWLOR (2002), onde A a assimilao de CO2 das plantas controle, TN20 e A' a das plantas
sob estresse, ambas medidas em Ci de 400 mol mol-1. As curvas A vs. Ci foram realizadas no
1, 2 e 4 dias aps o incio dos tratamentos e no 1 e 4 dias aps a reidratao do solo, sob
condies naturais.
A variao diria da assimilao de CO2 foi avaliada no 3 e 5 dias aps o incio dos
tratamentos, considerando-se a variao natural das condies atmosfricas. Os valores de Q

26
foram medidos no incio de cada horrio de avaliao para ajustar a fonte de luz da cmara de
medida em Q constante homogeneizando assim as repeties. As medidas foram realizadas
entre 07:00 h e 17:00 h, em intervalos de trs horas. Calculou-se a assimilao diria de CO2
(Ai) a partir da integrao da assimilao instantnea de CO2 ao longo do dia.

Teor de carboidratos solveis

No perodo de mximo estresse e recuperao, foram coletadas folhas +1 das plantas,


que foram imediatamente imersas em nitrognio lquido e mantidas em freezer (-80 C) at o
momento das anlises. As folhas coletadas para anlise do teor de carboidratos foram
submetidas secagem em estufa com circulao forada de ar temperatura de 60 C, por
quatro dias ou at massa constante.
Os extratos para anlises de sacarose (SAC) e de acares solveis totais (AST) foram
obtidos pelo mtodo do MCW (metanol, clorofrmio e gua) na proporo 12:5:3 (v/v),
descrito por BIELESK & TURNER (1966). Foram transferidos para um tubo de rosca
contendo 75 mg de amostra previamente macerada, 3 mL da soluo de MCW e ficaram sob
refrigerao por 2 dias. Aps a separao de fases obtida pela adio de 1,8 mL de
clorofrmio e 1,2 mL de gua, coletou-se o sobrenadante que em seguida foi concentrado em
banho-maria (50 C) para evaporao do metanol e resduos de clorofrmio.
A determinao do teor de AST foi feita pelo mtodo do fenol-sulfrico (DUBOIS et
al.,1956). Em tubo de ensaio adicionaram-se 15 L de extrato e 485 L de gua destilada,
500L de soluo de fenol 5% e 2 mL de cido sulfrico (H2SO4) concentrado. Aps agitao
e resfriamento temperatura ambiente, fez-se a leitura da absorbncia em espectrofotmetro
(Genesys 10UV Scanning, Thermo Scientific) no comprimento de onda de 490 nm. A
concentrao de AST foi calculada a partir de uma curva padro de glicose (0,25 mg/mL) cuja
concentrao variou entre 5 e 50 g. Como branco, colocou-se gua no lugar da amostra.
Determinou-se a concentrao de SAC pelo mtodo descrito por VAN HANDEL
(1968) e a dosagem pelo mtodo do fenol-sulfrico (DUBOIS et al.,1956). Em tubo de ensaio
adicionaram-se15 L de extrato, 485 L de gua destilada e 500 L de soluo de hidrxido
de potssio (KOH) 30%. Os tubos foram vedados e levados ao banho-maria a 100 C por 10
minutos. Em seguida, foram adicionados 500 L de soluo de fenol 5% e 2 mL de H2SO4
concentrado. Aps agitao e resfriamento temperatura ambiente, fez-se a leitura da
absorbncia em espectrofotmetro no comprimento de onda de 490 nm. A concentrao de

27
SAC foi calculada a partir de uma curva padro de sacarose (0,25 mg/mL) cuja concentrao
variou entre 5 e 50 g. Como branco, colocou-se gua no lugar da amostra.

Teor de amido

O extrato para quantificao de amido foliar foi obtido utilizando o mtodo enzimtico
descrito por AMARAL et al. (2007). Em microtubo contendo 10 mg de amostra realizou-se
uma extrao prvia dos acares solveis, pigmentos e fenis adicionando-se 500 L de
etanol 80%, levando em seguida ao banho-maria a 80 C por 20 minutos e descartando em
seguida o sobrenadante. Este passo foi repetido quatro vezes. Aps secagem do material
restante em temperatura ambiente at completa evaporao do etanol, foram adicionados 500
L de uma soluo contendo 120 U mL-1 da enzima -amilase (EC 3.2.1.1) termoestvel de
Bacillus licheniformis (Megazyme, Irlanda), diluda em tampo MOPS 10 mM e pH 6,5.
Essas amostras foram incubadas a 75 C por 30 minutos. Este procedimento foi repetido mais
uma vez. Em seguida, adicionaram-se 500 L de uma soluo contendo 30 U mL-1 da enzima
amiloglucosidase (EC 3.2.1.3) de Aspergillus niger (Megazyme, Irlanda), diluda em tampo
acetato de sdio 100 mM e pH 4,5. Essas amostras foram incubadas a 50 C por 30 minutos.
Este procedimento foi repetido mais uma vez. Foram acrescentados 100 L de cido
perclrico 0,8 M para parar a reao e precipitar as protenas. O extrato foi centrifugado por
dois minutos a 10.000 g e procedeu-se a dosagem de amido. A glicose liberada foi dosada
adicionando-se em um microtubo 50 L do extrato e 750 L do reagente glicose GOD-PAP
(Laborlab, Brasil), incubados a 37 C por 15 minutos. Fez-se a leitura da absorbncia em
leitor de microplacas de ELISA (modelo EL307C, Bio- Tek Instruments, Winooski, Vermont)
no comprimento de onda de 490 nm. A concentrao de glicose foi calculada a partir de uma
curva padro de glicose (1 mg/mL) cuja concentrao variou entre 2,5 e 30 g de glicose.
Como branco, colocou-se gua no lugar da amostra.

Potencial da gua na folha

O potencial da gua na folha (w) foi medido em cmara psicromtrica (C-52, Wescor,
Logan, EUA) acoplada a um microvoltmetro (modelo HR-33T, Wescor, Logan, EUA) no
modo higromtrico s 6:00h e 14:00h (BOYER, 1995) em discos retirados da folha +2.

Delineamento experimental

28
O delineamento experimental foi inteiramente ao acaso com parcelas subdivididas no
tempo, sendo as causas de variao os quatro tratamentos (TN20; TN20/DH; TN12 e TN12/DH)
e o tempo de avaliao. Os resultados foram submetidos anlise de varincia, sendo as
mdias provenientes de trs repeties para as medidas de fotossntese e quatro para as
medidas de teor de carboidrato. Quando encontradas diferenas significativas, as mdias
foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

3 RESULTADOS E DISCUSSO

A figura 2 mostra a variao da radiao solar e da temperatura durante o perodo de


imposio dos tratamentos de baixa temperatura noturna e deficincia hdrica em cana-de-
acar, quando foram feitas as medidas de trocas gasosas e fluorescncia da clorofila a.

A
Radiao solar (W m-2)

1000
800
600
400
200
0
28 B
26
Temperatura (oC)

24
22
20
18
16

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Janeiro /2011

Figura 2 - Variao da radiao solar (A) e da temperatura (B) durante o perodo


experimental. Setas indicam os dias de medidas de trocas gasosas e fluorescncia da clorofila
a em cana-de-acar.

A imposio do frio noturno e da deficincia hdrica causou reduo significativa na


assimilao diria de CO2 (Ai) a partir do 3o dia de tratamento, com redues de 24%, 31% e

29
42% nos tratamentos DH/TN20, TN12 e DH/TN12, respectivamente, em relao testemunha
TN20 (Figura 3). No 5 dia de tratamento, Ai teve um decrscimo mais acentuado com 71%,
50% e 61% nos tratamentos DH/TN20, TN12 e DH/TN12, respectivamente, mostrando efeito
cumulativo conforme o tempo de estresse. Os menores valores observados, nas plantas
testemunha, em Ai no 5 dia em relao ao 3 dia foram devidos menor incidncia de
radiao solar (Figura 2A).

800
A 30 dia 50 dia
Ai (mmol m-2 d-1)

600

400

200

0
TN20 DH/TN20 TN12 DH/TN12
Tratamentos
Figura 3 - Variao da assimilao diria de CO2 (Ai) de cana-de-acar, cv. IACSP94-2094
aos seguintes tratamentos: TN20, temperatura noturna de 20 C - irrigada; DH/TN20,
temperatura noturna de 20 C - no irrigada; TN12, temperatura noturna de 12 C - irrigada e
DH/TN12, temperatura noturna de 12 C - no irrigada. As colunas indicam mdia de trs
repeties ( erro padro).

Aps o 2 dia, A nas plantas submetidas deficincia hdrica (DH/TN20) e ao frio


noturno e deficincia hdrica (DH/TN12) continuou menor em relao a TN20, atingindo
valores menores que as plantas submetidas ao tratamento TN12 (Figura 4A). Aps quatro dias
da reidratao do substrato e retorno da temperatura noturna a 20 C, apenas as plantas TN12
apresentaram A semelhante testemunha, persistindo o efeito do frio associado deficincia
hdrica sobre A nas plantas DH/TN12 e DH/TN20 (Figura 4A).
O decrscimo da fotossntese observada em plantas tanto em baixa temperatura
noturna quanto sob deficincia hdrica ou a combinao de ambos os estresses, pode ser
devido a fatores difusivos, metablicos ou fotoqumicos (GHANNOUM et al., 2003;
GHANNOUM, 2009; MACHADO et al., 2009, 2010).
A queda em gs em plantas submetidas baixa temperatura noturna (TN12 e DH/TN12)
ocorreu possivelmente devido reduo da condutncia hidrulica ocasionada pelo

30
decrscimo da permeabilidade do protoplasma (SELLIN & KUPPER, 2007), visto que no
houve variao do potencial da gua na folha (W14) nestes tratamentos (Figura 5A).

TN20 DH/TN20 TN12 DH/TN12


A B
40 0,25
A (mol m-2 s-1)

gs (mol m-2 s-1)


30 0,20

0,15
20
0,10
10
0,05
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Dias Dias

Figura 4 - A, Resposta da assimilao de CO2 (A) e B, condutncia estomtica (gs) em cana-


de-acar cv. IACSP94-2094. Tratamentos: TN20, temperatura noturna de 20 C - irrigada
(); DH/TN20, temperatura noturna de 20 C - no irrigada (); TN12, temperatura noturna de
12 C - irrigada () e DH/TN12, temperatura noturna de 12 C - no irrigada (). Dados
retirados da curva A vs. Ci, sob saturao de luz e 400 mol mol-1 de CO2. Perodo de
aplicao dos tratamentos, dias 1 a 5; perodo de recuperao com retorno da irrigao das
plantas e temperatura noturna de 20 C, dias 5 a 9.

O fechamento estomtico devido reduo da umidade do substrato est relacionado


com a diminuio do W14 em DH/TN20 (Figura 5A), com a condutividade hdrulica e com o
transporte de sinais bioqumicos como o transporte e redistribuio do cido abscsico devido
alcalinizao da seiva do xilema, desde as razes at as folhas (GHANNOUM et al., 2009;
MACHADO et al., 2009; 2010).
Assim como observado para gs, a transpirao (E) foi menor nos tratamentos TN12,
DH/TN20 e DH/TN12 em relao testemunha, aps quatro dias dos tratamentos (Figura 5B).
Somente as plantas do tratamento DH/TN20 tiveram menor W14 em relao
testemunha (Figura 5A). Este resultado intrigante, pois em relao s plantas DH/TN12, gs e
E foram semelhantes DH/TN20 (Figuras 4B e 5B). No 4 dia de reidratao e retorno da
temperatura noturna a 20 C, nas plantas DH/TN20 e DH/TN12 houve recuperao parcial de
gs e E (Figuras 4B e 5B). Somente TN12 recuperou totalmente gs e E aps retorno da
temperatura noturna a 20 C. As plantas do tratamento DH/TN20 recuperaram totalmente o
W14 no 4 dia aps a reidratao (Figura 5A).
A assimilao mxima de CO2 (Apot) dos tratamentos TN12, DH/TN20 e DH/TN12
foram menores que a testemunha (p<0,05) a partir do 1 dia. No 2 dia as plantas que foram

31
submetidas a TN12 e DH/TN12 apresentaram Apot menor que as DH/TN20, sugerindo efeito
mais intenso da baixa TN do que do DH no incio do estresse.

Dias
1 4 9
0,0
A B 7
-0,2 6

E (mmol m-2 s-1)


W14 (MPa)

-0,4 5
4
-0,6
3
-0,8
2
-1,0 1
0
TN20 DH/TN20 1 4 9
TN12 DH/TN12 Dias

Figura 5 - A, Variao de potencial da gua na folha (W14) e B, transpirao (E) em cana-


de-acar cv. IACSP94-2094 submetida aos tratamentos: TN20, temperatura noturna de 20 C
- irrigada; DH/TN20, temperatura noturna de 20 C - no irrigada; TN12, temperatura noturna
de 12 C - irrigada e DH/TN12, temperatura noturna de 12 C - no irrigada. As colunas
indicam mdia de trs repeties ( erro padro). Perodo de aplicao dos tratamentos, dias 1
a 5; perodo de recuperao com retorno da irrigao das plantas e temperatura noturna de 20
C, dias 5 a 9.

No 4 dia, Apot de DH/TN20 e DH/TN12 foram as menores, enquanto as plantas TN12


apresentaram aclimatao (Figura 6A). Apot medida em condies de saturao de CO2 e,
portanto, desconsidera limitaes difusivas. Assim, os valores inferiores em relao s plantas
TN20 indicam limitaes metablicas. Em DH/TN20 e DH/TN12 os valores de Apot foram
menores que os outros tratamentos no final do perodo de recuperao sugerindo que as
limitaes metablicas ainda persistiram nestes dois tratamentos, destacando DH/TN12 que foi
menor que DH/TN20. De fato, o decrscimo da fotossntese foi associado ao aumento
significativo da limitao metablica (LM) nas plantas que sofreram restrio hdrica
(DH/TN20 e DH/TN12) e que no apresentaram reduo de LM aps a reidratao do solo
(Figura 6B). Tambm neste caso a LM de DH/TN12 ficou maior que DH/TN20 na recuperao.
O ciclo fotossinttico C4 da cana-de-acar caracteriza-se por adaptaes celulares,
bioqumicas e fisiolgicas. O CO2 atmosfrico inicialmente fixado pela fosfoenolpiruvato
carboxilase (PEPcase) em cido C4 nas clulas do mesofilo. Os cidos C4 so transportados
para as clulas da bainha do feixe vascular (BFV), onde so descarboxilados, e o CO2 liberado
entra no metabolismo C3 via ribulose-1,5-bisfosfato (RuBP) carboxilase/oxigenase (Rubisco)
confinada nas clulas da BFV. Este mecanismo concentra CO2 prximo enzima Rubisco,

32
permitindo sua maior atividade como carboxilase e consequente maior eficincia do uso de
gua e de nitrognio e ausncia de fotorrespirao (SAGE, 2007). Desta forma, a LM da
fotossntese pode estar relacionada a alteraes na atividade enzimtica da PEPcase e da
Rubisco, com a regenerao dos substratos das enzimas e transporte de eltrons (CARMO-
SILVA et al., 2008; GHANNOUM, 2009; RIPLEY et al., 2007; SOARES-CORDEIRO et al.,
2010). A eficincia aparente de carboxilao da PEPcase (Vpmax) foi menor, em relao a
testemunha, no 1 dia, em todos os tratamentos. No entanto, houve aclimatao das plantas no
incio do perodo de recuperao, ou seja, os valores de Vpmax se igualaram aos verificados em
TN20 (Figura 6C). Alguns estudos tambm mostram a reduo na atividade da PEPcase com a
diminuio do contedo de gua no solo (DU et al., 1996; MARKELZ et al., 2011) e com a
baixa temperatura noturna (KAKANI et al., 2008; SOARES-CORDEIRO et al., 2010).

TN20 DH/TN20 TN12 DH/TN12


A B 100
50
Apot (mol m-2 s-1)

80
40
60

LM (%)
30 40

20 20

0
10
-20
0
0,4 C D 50

Vmax (mol m-2 s-1)


Vpmax (mol m-2 s-1)

40
0,3

30
0,2
20
0,1
10
0,0
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Dias Dias

Figura 6 - A,Variao de assimilao mxima em CO2 saturante (Apot); B, limitao


metablica (LM); C, eficincia de carboxilao da PEPcase (Vpmax) e D, eficincia mxima da
Rubisco (Vmax) em cana-de-acar cv. IACSP94-2094 submetida aos tratamentos: TN20,
temperatura noturna de 20 C - irrigada (); DH/TN20, temperatura noturna de 20 C - no
irrigada (); TN12, temperatura noturna de 12 C - irrigada () e DH/TN12, temperatura
noturna de 12 C - no irrigada (). Os smbolos indicam mdia de trs repeties ( erro
padro). Perodo de aplicao dos tratamentos, dias 1 a 5; perodo de recuperao com retorno
da irrigao das plantas e temperatura noturna de 20 C, dias 5 a 9.

33
A capacidade mxima da Rubisco (Vmax) in vivo foi menor que a testemunha em todos
os tratamentos no 1 dia, sendo mais acentuada em TN12 e DH/TN12 no 2 dia e DH/TN20 e
DH/TN12 no 4 dia de tratamento. Nas plantas do tratamento TN12 foi observada a aclimatao
de Vmax. Os valores de Vmax foram maiores que dos outros tratamentos e prximos a
testemunha no 4 dia de tratamento e semelhantes testemunha no final do perodo de
recuperao (Figura 6D). As plantas DH/TN12 apresentaram recuperao parcial de Vmax ao
trmino do perodo de recuperao (Figura 6D).
As redues de Vpmax e Vmax indicam limitaes bioqumicas do metabolismo
fotossinttico C4 da cana-de-acar em condies de baixa temperatura noturna e deficincia
hdrica. A atividade da Rubisco foi mais sensvel aos tratamentos, em especial nas plantas
submetidas deficincia hdrica (DH/TN20 e DH/TN12), mesmo aps a reidratao quando
apresentavam LM ao redor de 25%, devido aos baixos valores de Vmax (Figura 6B, D). No 4
dia de recuperao Vmax de DH/TN12 foi menor que DH/TN20 (Figura 6D).
Os tratamentos no causaram variaes significativas na eficincia quntica mxima
do FSII (Fv/Fm), sugerindo que no houve fotoinibio da fotossntese (Figura 7A). No
entanto, o transporte aparente de eltrons (ETR) e a eficincia operacional do FSII (Fq'/Fm')
foram menores no 1 dia dos tratamentos do que no controle (Figura 7B, C).
Apenas as plantas do tratamento DH/TN12 no recuperaram ETR e Fq'/Fm' aps quatro
dias da reidratao. O decrscimo de Fq'/Fm' indica diminuio significativa da dissipao da
energia dos eltrons na etapa fotoqumica, tambm confirmada pela reduo do fator de
eficincia do FSII (Fq'/Fv') (Figura 7D), implicando aumento na dissipao no fotoqumica
de fluorescncia (RIPLEY et al., 2007). Assim, a reduo de Fq'/Fm' pode estar relacionada ao
fechamento (reduo) dos centros de reao do FSII sob condio de baixa temperatura e
deficincia hdrica (BAKER, 2008), refletindo em acmulo de QA em estado reduzido,
indicado pela diminuio de Fq'/Fv', devido significativa reduo da assimilao de CO2 em
DH/TN20, TN12 e DH/TN12.
A diminuio de gs causa menor fluxo de CO2 para o mesofilo foliar podendo causar
reduo na concentrao de CO2 junto Rubisco e assim estimular a atividade da oxigenase,
ou seja, a fotorrespirao (CARMO-SILVA et al., 2008). De fato, no nosso experimento
houve queda de Ci somente em DH/TN20 e no 4 dia de estresse (Ci =11525 mol mol-1 em
DH e Ci =17619 mol mol-1 nos demais tratamentos).

34
TN20 DH/TN20 TN12 DH/TN12
A B 0,25
0,80
0,20

Fq'/Fm'
Fv/Fm
0,75
0,15

0,70 0,10

0,65 0,05

C D
ETR (mol m-2 s-1)

150
0,4
120

Fq'/Fv'
0,3
90

60 0,2

30
0,1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 90 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Dias Dias

Figura 7 - A, Resposta de eficincia quntica mxima do fotossistema II (Fv/Fm); B,


eficincia operacional do FSII (Fq'/Fm'); C, transporte aparente de eltrons (ETR) e D, fator de
eficincia do FSII (Fq'/Fv') em cana-de-acar cv. IACSP94-2094 submetida aos tratamentos:
TN20, temperatura noturna de 20 C - irrigada (); DH/TN20, temperatura noturna de 20 C -
no irrigada (); TN12, temperatura noturna de 12 C - irrigada () e DH/TN12, temperatura
noturna de 12 C - no irrigada (). Os smbolos indicam mdia de trs repeties ( erro
padro). Perodo de aplicao dos tratamentos, dias 1 a 5; perodo de recuperao com retorno
da irrigao das plantas e temperatura noturna de 20 C, dias 5 a 9.

A relao entre a eficincia quntica CO2 e Fq'/Fm' no foi modificada pelos


tratamentos (Figura 8), sugerindo que no houve aumento na atividade de drenos alternativos
de eltrons, como fotorrespirao e reao de Mehler (GHANNOUM, 2009), e sim
decrscimo no uso da energia em reaes fotoqumicas da fotossntese. Este resultado sugere
que, apesar de ter ocorrido menor fluxo de CO2 devido diminuio de gs, o mecanismo de
concentrao de CO2 da cana-de-acar nos tratamentos avaliados efetivo em limitar a
fotorrespirao (CARMO-SILVA et al., 2008).
O carboidrato gerado pela fotossntese a fonte de energia e substrato para o
crescimento e manuteno da fitomassa. Com relao aos carboidratos, os teores de acares
solveis totais (AST) no foram alterados at o 5 dia de tratamento (Tabela 1), porm ocorreu
queda no 4 dia da recuperao em DH/TN20 e TN12, sugerindo efeito da seca e da baixa
temperatura, respectivamente.

35
TN20 DH/TN20 TN12 DH/TN12

CO2 [(mol CO2 mol ftons)-1]


0,03

0,02

0,01

0,00

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25


Fq'/Fm'

Figura 8 - Relao entre eficincia quntica de CO2 (CO2) e eficincia operacional do


fotossistema II (Fq/Fm) em cana-de-acar cv. IACSP94-2094 submetida aos tratamentos:
TN20 (), temperatura noturna de 20 C - irrigada; DH/TN20 (), temperatura noturna de
20 C - no irrigada; TN12 (), temperatura noturna de 12 C - irrigada e DH/TN12 (),
temperatura noturna de 12 C - no irrigada, um (smbolos cheios e linha, CO2=-
0,003+0,132*Fq/Fm, R2=0,93, p<0,01) e quatro dias aps os tratamentos (smbolos vazios e
linha tracejada, CO2=-0,005+0,136*Fq/Fm, R2=0,87, p<0,01).

No 5 dia de estresse, o teor de sacarose (Tabela 2) aumentou em funo da deficincia


hdrica somente a 20 C (DH/TN20) e da baixa temperatura noturna (mdia de TN12).

Tabela 1 - Teor de acares solveis totais (mol g-1 MS) em folhas de cana-de-acar cv.
IACSP94-2094 submetida aos tratamentos: TN20, temperatura noturna de 20 C - irrigada;
DH/TN20, temperatura noturna de 20 C - no irrigada; TN12, temperatura noturna de 12 C -
irrigada e DH/TN12, temperatura noturna de 12 C - no irrigada, no 5 dia de tratamento e 4
dia de recuperao. Perodo de aplicao dos tratamentos, dias 1 a 5; perodo de recuperao
com retorno da irrigao das plantas e temperatura noturna de 20 C, dias 5 a 9.

5 dia de tratamento 4 dia de recuperao


TN20 296,43 92,59 Aa* 251,19 35,83 Aa
DH/TN20 391,92 38,82 Aa 270,84 34,24 Ab
Mdia 344,18 83,22 Aa 261,02 34,11 Ab

TN12 382,02 41,7 Aa 209,83 48,85 Bb


DH/TN12 296,32 74,27 Aa 366,45 70,51 Aa
Mdia 339,18 72,16 Aa 288,15 100,80 Aa
*Letras maisculas diferentes na coluna indicam diferena significativa ao nvel de 5% pelo teste de
Tukey entre irrigaes na mesma temperatura e mdias. Letras minsculas diferentes na linha indicam
diferena significativa entre 5 dia de tratamento e o 4 dia de recuperao, ao nvel de 5% pelo teste
de Tukey

36
Os teores de SAC no 5 dia de tratamento aumentaram com a deficincia hdrica e com
a baixa temperatura noturna, sendo que este aumento foi maior nos tratamentos com baixa
temperatura noturna (Tabela 2).
No 4 dia de recuperao, somente os tratamentos com baixa temperatura noturna
apresentaram decrscimo de SAC (TN12 e DH/TN12) atingindo valores prximos aos do
controle (TN20, Tabela 2).

Tabela 2 - Teor de sacarose (mol g-1 MS) em folhas de cana-de-acar cv. IACSP94-2094
submetida aos tratamentos: TN20, temperatura noturna de 20 C - irrigada; DH/TN20,
temperatura noturna de 20 C - no irrigada; TN12, temperatura noturna de 12 C - irrigada e
DH/TN12, temperatura noturna de 12 C - no irrigada, no 5 dia de tratamento e 4 dia de
recuperao. Perodo de aplicao dos tratamentos, dias 1 a 5; perodo de recuperao com
retorno da irrigao das plantas e temperatura noturna de 20 C, dias 5 a 9.

5 dia de tratamento 4 dia de recuperao


TN20 36,37 13,60 Ba* 56,46 16,55 Aa
DH/TN20 74,13 24,25 Aa 78,20 13,45 Aa
Mdia 55,25 27,18 Ba 67,33 18,17 Aa

TN12 102,99 30,08 Aa 59,12 18,55 Ab


DH/TN12 107,69 39,28 Aa 63,42 24,64 Ab
Mdia 105,35 32,49 Aa 61,27 20,32 Ab
*Letras maisculas diferentes na coluna indicam diferena significativa ao nvel de 5% pelo teste de
Tukey, entre irrigaes na mesma temperatura e mdias. Letras minsculas diferentes na linha indicam
diferena significativa entre 5 dia de tratamento e o 4 dia de recuperao, ao nvel de 5% pelo teste
de Tukey.

No estresse mximo, foi observado decrscimo na concentrao de amido (AMI) no


tratamento DH/TN20, em funo do dficit hdrico (Tabela 3). Esse decrscimo em plantas sob
estresse por temperatura e deficincia hdrica, possivelmente foi devido a dois principais
fatores: queda em A e Ai (Figuras 3 e 4) e aumento na hidrlise do AMI, permitindo assim a
manuteno do suprimento de carbono em condies de reduzida fixao de CO2 (SALES et
al., 2012). Por outro lado, o aumento do teor de SAC deve estar relacionado com o aumento da
hidrlise de AMI, alm do possvel aumento na atividade da sintase de sacarose fosfato (DU et
al., 1999, 2000; FU et al., 2010; VANDOORNE et al., 2012).

37
Tabela 3 - Teor de amido (mol de Glu g-1 MS) em folhas de cana-de-acar cv. IACSP94-
2094 submetida aos tratamentos: TN20, temperatura noturna de 20 C - irrigada; DH/TN20,
temperatura noturna de 20 C - no irrigada; TN12, temperatura noturna de 12 C - irrigada e
DH/TN12, temperatura noturna de 12 C - no irrigada. No 5 dia de tratamento e 4 dia de
recuperao. Perodo de aplicao dos tratamentos, dias 1 a 5; perodo de recuperao com
retorno da irrigao das plantas e temperatura noturna de 20 C, dias 5 a 9.

5 dia de tratamento 4 dia de recuperao


TN20 208,97 66,92 Aa* 32,68 9,02 Bb
DH/TN20 134,34 82,89 Ba 55,61 6,91 Ab
Mdia 171,65 80,34 Aa 44,14 14,34 Aa

TN12 140,28 30,70 Aa 94,51 29,27 Aa


DH/TN12 80,05 48,92 Ab 162,47 38,77 Aa
Mdia 110,17 49,66 Aa 128,49 48,28 Aa
*Letras maisculas diferentes na coluna indicam diferena significativa ao nvel de 5% pelo teste de
Tukey entre irrigaes na mesma temperatura e mdias. Letras minsculas diferentes na linha indicam
diferena significativa entre 5 dia de tratamento e o 4 dia de recuperao, ao nvel de 5% pelo teste
de Tukey.

A deficincia hdrica e baixa temperatura noturna afetaram a fotossntese devido a


fatores relacionados com a abertura dos estmatos e queda na atividade de Rubisco e PEPcase
(Figura 6C e D), sendo esperado que ocorresse diminuio da sntese de acar, no entanto,
paradoxalmente aumentou o teor de sacarose. Possivelmente o aumento da sntese de sacarose
seja devido ao estmulo da sintase de sacarose fosfato (FU et al. 2010; VANDOORNE et al.,
2012).

4 CONCLUSES

1. Na cultivar IACSP94-2094 a assimilao diurna de CO2 decresce em funo da baixa


temperatura noturna e da deficincia hdrica, sendo associada diminuio da condutncia
estomtica (fator difusivo), reduo na atividade da PEPcase e da Rubisco (fatores
bioqumicos) e menor atividade fotoqumica.
2. A ocorrncia simultnea de baixa temperatura noturna e deficincia hdrica em plantas
jovens de cana-de-acar interferem na recuperao fotossinttica das plantas.
3. A ocorrncia de baixa temperatura e deficincia hdrica causa queda no teor de AMI
favorecendo o aumento no teor de SAC nas folhas.

38
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42
CAPTULO III

43
Metabolismo de carboidratos em duas cultivares de cana-de-acar sob baixa
temperatura e deficincia hdrica

RESUMO

Para sobreviver s condies adversas, as plantas exibem uma srie de respostas aos estresses
ambientais, que frequentemente, ocorrem de forma simultnea. Tais respostas tambm esto
relacionadas com diferentes tolerncias ou sensibilidades aos diversos tipos de estresses. O
objetivo deste trabalho testar a hiptese de que cultivares de cana-de-acar mais tolerantes
deficincia hdrica e/ou baixa temperatura apresentam a fotossntese e o metabolismo de
carboidratos menos suscetvel a estes fatores ambientais. Para tanto, foram utilizadas as
cultivares de cana-de-acar IACSP94-2094 e IACSP95-5000 plantadas em potes plsticos de
8,5 L. Aos 87 dias aps o plantio, foram submetidas aos tratamentos de baixa temperatura
(221/121 C) e deficincia hdrica, por 22 dias, em cmara de crescimento. Aps este
perodo, as plantas foram reidratadas e a temperatura retornou a 321/201 C, por 9 dias.
Sob condies ambientais ideais, a IACSP95-5000 tem maior eficincia fotossinttica que a
IACSP94-2094. A IACSP95-5000 mostrou ser mais tolerante ao frio, devido a menor reduo
da assimilao de CO2 e maior recuperao, superando as plantas controle. Sob frio e
deficincia hdrica, a IACSP94-2094 mais tolerante por no ter apresentado decrscimo
maior da fotossntese nos estresses simultneos. Com a imposio dos tratamentos, foi
observado aumento no teor de acares solveis e amido em ambas cultivares. Na cultivar
IACSP94-2094 sob baixa temperatura e deficincia hdrica o aumento dos acares solveis
totais foi devido ao aumento da sacarose, quando h tambm aumento da atividade da sintase
de sacarose fosfato.

Palavras-Chave: Saccharum spp., estresses ambientais, trocas gasosas, sintase de sacarose


fosfato, invertases

44
Carbohydrate metabolism in two cultivars of sugarcane under low temperature and
water deficit

ABSTRACT

To survive under adverse environmental conditions, plants show some responses to


environmental stress that often act simultaneously. These responses are also related to
different tolerances or sensitivities to various types of stress. The aim of this study is to test
the hypothesis that sugarcane cultivars more tolerant to water deficit and/or low temperature
have photosynthesis and carbohydrate metabolism less susceptible to these environmental
factors. We used two sugarcane cultivars, IACSP94-2094 and IACSP95-5000 and planted in
plastic pots of 8.5 L. At 87 days after planting, plants were treated with low temperature
(221/121 C) and water deficit for 22 days in a growth chamber. After this period, the
plants were rehydrated and the temperature returned to 321/201 C for 9 days. Under ideal
environmental conditions IACSP95-5000 has a higher photosynthetic capacity than
IACSP94-2094 cultivar. The IACSP95-5000 cultivar was more tolerant to chilling, due to
lower reduction in CO2 assimilation and greater recovery, overcoming the control plants.
Under low temperature and water deficit, the IACSP94-2094 cultivar was more tolerant for
not having higher decrease of photosynthesis in combined stresses. After treatments, we
observed an increase in soluble sugars and starch in both cultivars. Soluble sugars increase on
IACSP94-2094 cultivar under low temperature and water deficit, was due to sucrose increase,
when there is an activity increase of sucrose phosphate synthase.

Key Words: Saccharum spp., environmental stress, gas exchanges, sucrose phosphate
synthase, invertases

45
1 INTRODUO

Os carboidratos gerados pela fotossntese constituem a fonte de energia para produo


e manuteno da biomassa (VANDOORME et al., 2012). Em plantas superiores, a sacarose
alm de principal produto da fotossntese, uma molcula de transporte para o crescimento,
desenvolvimento, armazenamento, transduo de sinais e aclimatao a estresses ambientais
(SALERNO & CURATTI, 2003).
O acmulo de sacarose varia de acordo com o gentipo e estdio de desenvolvimento
da planta e do ambiente em que cultivada. A planta responde ao ambiente atravs da
transduo de sinais que coordenam o desenvolvimento, alm do acmulo de sacarose (GROF
& CAMPBELL, 2001; MOORE, 2005).
Em plantas C3 a sntese de sacarose pode ser controlada pela regulao da frutose-1,6-
bisfosfatase e sintase de sacarose fosfato (SPS) dependendo da disponibilidade de substrato,
pela regulao alostrica e, em algumas espcies, pela fosforilao proteica (LUNN &
FURBANK, 1999). Esses mecanismos de regulao permitem que a sntese de sacarose seja
coordenada pela fotossntese e pelas exigncias de exportao ou armazenamento temporrio
de carboidratos na folha. Entretanto, esse controle mais complexo em plantas C4, devido
presena de dois tipos de clulas fotossintticas. Assim, os processos de fixao de carbono e
a sntese do produto final so coordenados no s entre cloroplasto e citosol, mas tambm
entre mesofilo e as clulas da bainha do feixe vascular (BFV) (LUNN & FURBANK, 1999).
Assim como a sntese de sacarose, a sua quebra vital para as plantas, no s pela
alocao de carbono, mas tambm como iniciador de sinais por hexoses, mantendo um
equilbrio entre ambos. Diferentes mecanismos so ativados por hexoses e outros metablitos,
alm da prpria sacarose. Apenas as invertases e a reao reversvel da sintase de sacarose
(SuSy) catalisam esta quebra in vivo da sacarose em tecidos vegetais. Entretanto, as invertases
produzem glicose e frutose livres em vez de UDP-glicose e frutose, gerando duas vezes mais
hexoses que a quebra da sacarose pela SuSy (KOCH, 2004).
No campo, as plantas esto expostas a diversos estresses ambientais (YORDANOV et
al., 2000), como temperaturas extremas, deficincia hdrica e salinidade. Frequentemente,
alguns estresses agem de forma simultnea, como a combinao de baixa temperatura e
deficincia hdrica, fatores comuns no inverno, que afetam a fisiologia da cana-de-acar.
Entretanto, para sobreviver s condies adversas, as plantas exibem uma srie de respostas

46
ao estresse. Tais respostas tambm esto relacionadas com diferentes tolerncias ou
sensibilidades aos diversos tipos de estresses.
O metabolismo de carboidratos responde de maneira diferente baixa temperatura e
deficincia hdrica, dependendo da espcie e exposio ao estresse (DU et al. 1998, DU &
NOSE, 2002). Em cana-de-acar so poucos os trabalhos que relatam estas respostas,
principalmente quando a exposio a estas condies ocorrem de forma simultnea (SALES
et al., 2012).
Em plantas submetidas ao resfriamento, h acmulo dos principais acares como
glicose, frutose e sacarose. Alm disso, a atividade da SPS foliar aumenta enquanto a da SuSy
e das invertases no (GUY et al., 1992). Sob baixa temperatura, a sacarose acumulada como
carboidrato de reserva pode ser rapidamente mobilizada conforme as necessidades
metablicas. Dessa forma, a sacarose rapidamente translocada para ser utilizada aps o
retorno a temperaturas favorveis, em reaes como, por exemplo, a respirao. Alm disso,
sob baixa temperatura o crescimento ativo quase sempre reduzido ou paralisado (GUY et
al., 1992; JAVIER et al., 1997; SALES et al., 2012), resultando em diminuio da demanda
por produtos da fotossntese podendo, mesmo sob estresse, acumular reservas na forma de
amido.
DU & NOSE (2002) observaram que em cultivares de cana-de-acar com trs meses
de idade, tolerantes baixa temperatura, aps 52 h de exposio ao frio houve acmulo de
acares solveis (glicose, frutose e sacarose), semelhante ao que ocorre em plantas C3
tolerantes. Alm disso, o contedo de amido se manteve alto durante todo o tratamento. Aps
exposio ao frio, nestas cultivares tolerantes a atividade da enzima SPS foi semelhante das
plantas controle, porm houve aumento do estado de ativao da enzima, sugerindo que o frio
no afetou o contedo de protena. J a cultivar suscetvel, apresentou decrscimo da
atividade da SPS aps exposio ao frio, provavelmente devido a uma reduo desta enzima.
Sob deficincia hdrica moderada, DU et al. (1998) observaram em folha de cana-de-
acar, que os processos bioqumicos de sntese de sacarose e amido, do ciclo de Calvin e da
rota C4 no foram seriamente afetados sendo o fechamento estomtico a causa do declnio da
fotossntese. Esses autores sugerem que sob deficincia hdrica severa, a queda significante da
atividade da PPDK (piruvato ortofosfato diquinase) seja responsvel pela queda da
fotossntese. Foi observado ainda aumento da glicose e frutose, possivelmente, devido ao
aumento da atividade de enzimas de quebra do amido e da sacarose, resultando em aumento
da concentrao osmtica em folhas de cana-de-acar.

47
VANDOORME et al. (2012) observaram em chicria que, sob deficincia hdrica, no
houve impacto sob a concentrao de protena, porm houve aumento da atividade da SPS
foliar, enquanto a atividade da SuSy no foi significativamente afetada. J a atividade da
invertase cida foi maior no incio do tratamento de deficincia hdrica, enquanto a invertase
neutra teve decrscimo no final do tratamento quando comparada s plantas controle. Alm
disso, as plantas sob estresse aumentaram a eficincia do uso da gua e a concentrao de
acares solveis, houve diminuio na proporo raiz-parte area e baixou o potencial
osmtico.
Algumas cultivares de cana-de-acar apresentam diferentes respostas de aclimatao
e de recuperao aps a ocorrncia de deficincia hdrica (LANDELL et al., 2004;
MACHADO et al., 2009; RIBEIRO et al., 2013) e de baixa temperatura (DU & NOSE, 2002;
SALES et al., 2012).
Nossa hiptese que cultivares de cana-de-acar mais tolerantes deficincia hdrica
e/ou baixa temperatura apresentam metabolismo do carbono (fotossntese e metabolismo de
carboidratos) menos suscetvel a estes fatores ambientais. Baseado nesta hiptese, nosso
objetivo estudar os efeitos da ocorrncia de baixa temperatura e/ou deficincia hdrica sobre
a fotossntese (trocas gasosas e atividade fotoqumica) e sobre o metabolismo de carboidratos
(acmulo de carboidratos e atividade de enzimas) em duas cultivares de cana-de-acar, com
diferentes caractersticas quanto a sua rusticidade.

2 MATERIAL E MTODOS

Em bandejas contendo substrato comercial (Carolina Soil, Vera Cruz, RS) composto
de turfa de esfagno, vermiculita expandida, calcrio dolomtico, gesso agrcola e fertilizante
NPK (traos) foram plantados mini-toletes de cana-de-acar (Saccharum spp.) cv. IACSP94-
2094 e cv. IACSP95-5000. A IACSP94-2094 apresenta rusticidade sendo indicada para
ambientes desfavorveis e a IACSP95-5000 uma cultivar produtiva e indicada para
ambientes favorveis (LANDELL et al., 2005).
Aos 35 dias aps o plantio (DAP), as mudas foram transplantadas para vasos plsticos
contendo 8,5 L de uma mistura de terra, areia e substrato na proporo 1:1:1 (v:v:v). Foram
plantadas uma muda por vaso e conduzidos somente o colmo primrio. As plantas foram
mantidas em casa de vegetao onde receberam tanto irrigao diria quanto aplicaes de
nutrientes. As aplicaes dos nutrientes foram parceladas em trs vezes, totalizando, por vaso:

48
18,21 g de Ca(NO3)2; 5,31 g de fosfato monoamnico; 7,29 g de KCl; 2,12 g de MgSO4; 0,17
g de H3BO3; 0,20 g de MnSO4; 0,02 g de CuSO4; 0,02 g de (NH4)6Mo7O24 x 4(H2O); 0,09 g
de ZnSO4; e 0,212 mg de FeEDTA (6% Fe).
Aos 87 DAP, as plantas foram transferidas para cmara de crescimento (Instalafrio,
Brasil) onde permaneceram por um perodo de 18 dias, recebendo irrigao diria, nas
seguintes condies ambientais: fotoperodo 14 h/10 h (dia/noite), temperatura do ar
321/201 C (dia/noite), umidade relativa de 65% e Q de 1000 mol m-2 s-1 (14 h). Aps o
18 dia, a temperatura da cmara foi diminuda para 221/121 C (dia/ noite). Metade das
plantas permaneceu irrigada e a outra metade foi submetida deficincia hdrica. A restrio
hdrica foi imposta pela suspenso da rega at 30% da capacidade mxima de reteno de
gua do substrato, medida por pesagem dos vasos. As plantas permaneceram nestas condies
(221/121 C sem ou com restrio hdrica) por 22 dias, aps este perodo, elas foram
reidratadas e a temperatura da cmara de crescimento foi reajustada para 321/201 C
(dia/noite) e permaneceram assim por um perodo de 8 dias.
Durante o perodo experimental, foram realizadas seis medidas/coletas, nos seguintes
dias, contados aps o perodo de aclimatao das plantas: 1 medida/coleta feita no 18 dia na
temperatura 321/201 C em plantas irrigadas (I) (testemunha); 2 medida/coleta feita aps
34 horas de baixa temperatura com e sem deficincia hdrica; 3 medida/coleta feita aps 13
dias de baixa temperatura e deficincia hdrica (estresse intermedirio); 4 medida/coleta feita
aps 20 dias de baixa temperatura e deficincia hdrica (mximo estresse); 5 medida/coleta
feita aps dois dias de retorno temperatura inicial e reidratao; e a 6 (medida/coleta) feita
aps 8 dias de retorno temperatura inicial e reidratao.

2.1 Variveis medidas e calculadas

Assimilao de CO2 e fluorescncia da clorofila a

Mediu-se a variao diurna das trocas gasosas e fluorescncia da clorofila a por meio
de um analisador de gases por infravermelho integrado com cmara de fluorescncia, modelo
Li 6400-40F (Licor, Inc. Nebraska, EUA). As medidas foram realizadas na primeira folha
totalmente expandida e com lgula aparente (folha +1), no tero mdio do limbo foliar, em
intervalos de trs horas, totalizando cinco medidas, em Q de 1300 mol m-2 s-1 e dficit de
presso de vapor entre a folha e o ar ao redor de 1,5 kPa, as temperatura utilizadas foram as
mesmas indicadas nos tratamentos testemunha (32 C) e baixa temperatura (22 C). As

49
variveis medidas em relao s trocas gasosas foram: assimilao de CO (A, mol m-2 s-1),
2
-2 -1 -2 -1
condutncia estomtica (g , mol m s ), transpirao (E, mmol m s ) e concentrao interna
s

de CO2 (Ci). Calculou-se a eficincia aparente de carboxilao pela razo entre A/Ci (ZHANG
et al., 2001) e a eficincia intrnseca do uso da gua (EUAi) pela razo (A/gs).
As variveis analisadas em relao fluorescncia da clorofila a foram realizadas
como descrito no captulo II.
Para anlise dos dados tanto das trocas gasosas como da fluorescncia da clorofila a,
foram utilizadas as mdias das 20 medidas (quatro medidas por horrio) realizadas em cada
dia do perodo experimental. Calculou-se a assimilao diurna de CO2 (Ai) a partir da
integrao da assimilao instantnea de CO2 ao longo do dia, utilizando a mdia de 4
repeties.

Potencial da gua na folha

Em cada um dos dias de medidas das trocas gasosas tambm foram realizadas medidas
do potencial da gua na folha (w), antes das lmpadas da cmara de crescimento serem
acesas (pr-manh) e s 14:00 h, como descrito no captulo II.

Teor de carboidratos

Nos dias de medidas, s 9:00 h foram coletadas folhas +1 de quatro plantas por
tratamento, as quais foram imediatamente imersas em nitrognio lquido e mantidas em
freezer (-80 C) at o momento das anlises. Antes da elaborao do extrato para anlise do
teor de carboidratos, as folhas foram submetidas secagem em estufa com circulao forada
de ar temperatura de 60 C, por quatro dias ou at massa constante. Os procedimentos foram
realizados como descrito no captulo II.
Os extratos para anlises de sacarose (SAC) e de acares solveis totais (AST) foram
obtidos pelo mtodo descrito por BIELESK & TURNER (1966).
A determinao do teor de AST foi feita pelo mtodo do fenol-sulfrico, descrito por
DUBOIS et al. (1956), de SAC pelo mtodo descrito por VAN HANDEL (1968) e de amido
pelo mtodo enzimtico descrito por AMARAL et al. (2007).

50
Atividade de enzimas do metabolismo de carboidratos

A atividade das enzimas envolvidas no metabolismo de carboidratos foi quantificada


em folhas +1 que foram coletadas s 9:00 h e imediatamente imersas em nitrognio lquido e
mantidas em freezer (-80 C) at o momento das anlises.
Para obteno do extrato para determinao da atividade enzimtica foram macerados
com nitrognio lquido, 300 mg de material vegetal fresco em almofariz com 5% de
polivinilpolipirrolidona (PVPP) e 1,5 mL de tampo fosfato de potssio 100 mM contendo
EDTA 1mM com pH 7,0. Em seguida esse extrato foi centrifugado a 14.000 g por 30 minutos
a 4 C e o sobrenadante foi utilizado para as anlises.

Protena solvel total

A dosagem de protena total no extrato foi feita segundo BRADFORD (1976),


utilizando-se um reagente preparado (Sigma-Aldrich, Brasil). Em tubo de ensaio adicionaram-
se 10 L de extrato, 90 L de gua e 3 mL do reagente preparado, diludo na proporo 1:4
(reagente: gua). Fez-se a leitura da absorbncia em espectrofotmetro (Genesys 10UV
Scanning, Thermo Scientific) no comprimento de onda de 595 nm. A concentrao de
protena total foi calculada a partir de uma curva padro obtida com leituras de solues
contendo 5, 10, 20, 40 e 60 g de albumina srica bovina (BSA). Como branco, colocou-se
gua no lugar da amostra.

Atividade da sintase de sacarose fosfato

A determinao da atividade da sintase de sacarose fosfato (SPS, EC 2.4.1.14) foi feita


segundo ZHU et al. (1997) com adaptaes. Foram adicionados, em tubo de rosca, 50 L de
extrato e 50 L de tampo de reao contendo: tampo Tris-HCl 200 mM em pH 7,5, cloreto
de magnsio (MgCl2) 10 mM, EDTA 2 mM, frutose-6-fosfato (Fru-6-P) 8 mM, glicose-6-
fosfato (Glu-6-P) 40 mM e UDP-glicose (uridina 5'-difosfoglicose) 50 mM. A reao foi
incubada a 37 C por 0, 30 e 60 minutos. A reao foi interrompida em banho-maria a 100 C
por trs minutos.
A dosagem da sacarose formada na reao foi realizada como descrito por VAN
HANDEL (1968). Foram adicionadas reao 100 L de KOH 30% e mantida, por 10

51
minutos, em banho-maria a 100 C. Em seguida, acrescentou-se 1,5 mL de reagente antrona
preparado da seguinte forma: 76 mL de H2SO4, 30 mL de gua e 150 mg de antrona. A reao
foi incubada a 40 C por 20 minutos e realizada a leitura da absorbncia em
espectrofotmetro (Genesys 10UV Scanning - Thermo Scientific) no comprimento de onda de
620 nm. A concentrao de sacarose foi calculada a partir de uma curva padro obtida com
leituras de solues contendo respectivamente 0,5, 1, 2, 3 e 4 mM de sacarose. Como branco,
colocou-se gua no lugar da amostra.

Atividade da sintase de sacarose

A determinao da atividade da sintase de sacarose (SuSy, EC 2.4.1.13) foi feita


segundo ZHU et al. (1997) com adaptaes, em tubo de rosca foram adicionados 50 L de
extrato e 50 L de tampo de reao contendo: tampo Tris-HCl 200 mM em pH 7,5, MgCl2
15 mM, frutose 25 mM e UDP-glicose 25 mM. A reao foi incubada a 37 C por 0, 30 e 60
minutos e foi interrompida em banho-maria a 100 C por trs minutos. A dosagem da
sacarose formada foi realizada como descrito anteriormente para a enzima SPS, segundo VAN
HANDEL (1968).

Atividade das invertases cidas

A atividade da enzima invertase cida solvel (IVA, EC 2.4.1.25) foi obtida pelo
mtodo descrito por ZHU et al. (1997). Em microtubo foram adicionados: 50 L de extrato,
50 L de tampo de reao acetato de sdio 1 M e pH 4,5 e 100 L de uma soluo de
sacarose 120 mM. A reao foi incubada a 37 C por 0, 30 e 60 minutos. A reao foi
interrompida acrescentando-se 30 L de Tris 2,5 M e levada ao banho-maria a 100 C por trs
minutos.
A dosagem de acares redutores foi realizada pelo mtodo de Somogyi-Nelson
(NELSON, 1944; SOMOGYI, 1945; 1952). Foram colocados em tubos de ensaio 100 L de
reao enzimtica e 400 L de gua, em seguida adicionou-se 500 L de soluo Somogyi
A+B (misturadas na proporo 4:1), os tubos foram agitados, vedados e levados ao banho-
maria 100 C por 10 minutos. Ao trmino do tempo a reao foi colocada em banho de gelo e
em seguida adicionou-se 500 L de soluo de Nelson e 1000 L de gua. Os tubos foram
agitados e foram feitas as leituras de absorbncia em espectrofotmetro (Genesys 10UV

52
Scanning - Thermo Scientific) no comprimento de onda de 560 nm. A concentrao de
acares redutores foi calculada a partir de uma curva padro obtida com leituras de solues
contendo respectivamente 0,5, 1, 2, 3 e 4 mM de glicose. Como branco, colocou-se gua no
lugar da amostra.

Atividade das invertases neutras

Procedeu-se a atividade da enzima invertase neutra (IVN, EC 2.4.1.26) pelo mtodo


descrito por ZHU et al. (1997). Em microtubo foram adicionados: 50 L de extrato, 50 L de
tampo de reao acetato de sdio 1 M e pH 7,5 e 100 L de uma soluo de sacarose 120
mM. A reao foi incubada a 37 C por 0, 30 e 60 minutos. A reao foi interrompida em
banho-maria a 100 C por trs minutos. A dosagem de acares redutores foi realizada pelo
mtodo de Somogyi-Nelson (NELSON, 1944; SOMOGYI, 1945; 1952), como descrito para
IVA.

Delineamento experimental

O delineamento experimental foi inteiramente ao acaso com parcelas subdivididas no


tempo, sendo os fatores de variao as cultivares (IACSP94-2094 e IACSP95-5000), a
temperatura (32/20 C e 22/12 C) e o status hdrico (irrigado e deficincia hdrica). Os
resultados foram submetidos anlise de varincia (ANOVA) sendo as mdias provenientes
de vinte repeties (trocas gasosas e fluorescncia da clorofila a) e quatro repeties
(assimilao diria de CO2, potencial hdrico e metabolismo de carboidratos). Quando
encontradas diferenas significativas, as mdias foram comparadas pelo teste de Tukey ao
nvel de 5% de probabilidade.

3 RESULTADOS

Ambas as cultivares submetidas DH tiveram decrscimo significativo do potencial


hdrico foliar (w6h) atingindo o valor de -0,69 no perodo de estresse mximo, nas plantas NI
(Tabela 1), considerado estresse moderado (DU et al., 1996), sendo que somente a baixa
temperatura no afetou w6h. No houve diferena significativa no w medido s 14:00 h
(dados no apresentados).

53
Tabela 1 - Resposta do potencial hdrico foliar (w6h) de cana-de-acar cv. IACSP94-2094 e
cv. IACSP95-5000 submetidas aos tratamentos de baixa temperatura e deficincia hdrica.
Mdias de quatro repeties ( desvio padro).

w6h (MPa)
cv. Controle Mximo estresse
(32/20 C) (22/12C)
IACSP94-2094 I -0,35 0,02 -0,36 0,02
IACSP94-2094 NI -0,35 0,02 -0,69 0,02
IACSP95-5000 I -0,40 0,02 -0,40 0,015
IACSP95-5000 NI -0,40 0,02 -0,68 0,02

Independente do tratamento (controle, baixa temperatura e baixa temperatura e


deficincia hdrica), a assimilao de CO2 (A) (Figura 1A, B) e a assimilao diria de CO2
(Ai) (Figura 1C, D) da IACSP95-5000 foram significativamente maiores que o da IACSP94-
2094.
Em ambas as cultivares aps 34 horas de baixa temperatura houve decrscimo
significativo de A e de Ai (Figura 1C, D). Aps a imposio dos tratamentos, o decrscimo de
A na IACSP94-2094 foi de 35% enquanto na IACSP95-5000 foi de 17,5%, permanecendo
baixo durante todo o perodo de tratamento (Figura 1A, B).
No dia de mxima restrio hdrica (dia 20), A do tratamento no irrigado (NI) da
IACSP95-5000 foi significativamente mais baixo quando comparado s plantas irrigadas (I)
(Figura 1B), enquanto na IACSP94-2094 A nos tratamentos I e NI foi semelhante. Aps dois
dias de retorno s temperaturas 32/20 C (dia/noite) e reidratao das plantas, a IACSP94-
2094 recuperou A e Ai (Figura 1A, C) enquanto que na cv. IACSP95-5000 NI esta
recuperao ocorreu aps 8 dias (Figura 1B, D).
Houve decrscimo significativo da condutncia estomtica (gs) (Figura 2A, B) e
transpirao (E) (Figura 2C, D) aps 34 h de resfriamento em ambas as cultivares,
independente do status hdrico, permanecendo assim durante todo o perodo de estresse.
Ambas cvs. recuperaram gs e E aps dois dias de retorno s temperaturas mais altas e
reidratao das plantas. Interessante notar que aps 8 dias em recuperao gs e E da
IACSP95-5000 I e NI foram maiores que o controle, ocorrendo um sbito aumento.

54
IACSP94-2094 I IACSP95-5000 I
IACSP94-2094 NI IACSP95-5000 NI

30 A B

A (mol m-2 s-1)


25

20

15

10

1200 C D

1000
Ai (mmol m-2 d-1)

800

600

400

200
0
2

13

20
22

28

0
2

13

20
22

28
Dias de tratamento

Figura 1 - (A, B) Resposta da assimilao de CO2 (A) e (C, D) assimilao diria de CO2 (Ai)
de cana-de-acar, cultivares IACSP94-2094 e IACSP95-5000, sendo o dia 0 (testemunha)
medida feita aps 18 dias de aclimatao a 32/20 C (dia/ noite) com plantas irrigadas; dia 2
medida feita aps 34 horas a 22/12 C (dia/ noite) com plantas irrigadas (I) e no irrigadas
(NI); dia 13 medida feita aps 13 dias de baixa temperatura em plantas irrigadas e no
irrigadas (estresse intermedirio); dia 20 medida aps 20 dias de baixa temperatura em plantas
irrigadas e no irrigadas (estresse mximo); dia 22 medida aps 2 dias de retorno
temperatura de 32/20 C e reidratao e dia 28 medida aps 8 dias de recuperao das plantas.
Smbolos indicam mdia de 20 repeties erro padro para A e 4 repeties erro padro
para Ai.

Houve decrscimo significativo da eficincia intrnseca do uso da gua (EUAi) aps 13


dias de baixa temperatura em ambas as cvs., independente do status hdrico, permanecendo
baixo durante o estresse mximo (Figura 2E, F). Entretanto, EUAi no mximo estresse na cv.
IACSP94-2094 NI foi maior que nas plantas I (Figura 2E).
Foi observado aumento significativo de Ci em ambas as cultivares aps 13 dias de
imposio dos tratamentos, mantendo-se alto at o mximo estresse (Figura 3A, B). A
IACSP94-2094 I apresentou Ci mais alto que das plantas NI aps 34 h de baixa temperatura
(Figura 3A). Aps dois dias de retorno s temperaturas mais altas e reidratao das plantas, Ci
voltou aos valores controle (Figura 3A, B).

55
IACSP94-2094 I IACSP95-5000 I
IACSP94-2094 NI IACSP95-5000 NI
0,24
A B
0,20

gs (mol m-2 s-1)


0,16
0,12
0,08
0,04
7,5 C D
E (mmol m-2 s-1)
6,0

4,5

3,0

1,5

E F
180
EUAi (mol mol-1)

150

120

90

60
13

20
22

28

13

20
22

28
0
2

0
2

Dias de tratamento

Figura 2 - (A, B) Resposta da condutncia estomtica (gs), (C, D) transpirao (E) e (E, F)
eficincia intrnseca do uso da gua (EUAi) de cana-de-acar, cultivares IACSP94-2094 e
IACSP95-5000, sendo o dia 0 (testemunha) medida feita aps 18 dias de aclimatao a 32/20
C (dia/ noite) com plantas irrigadas; dia 2 medida feita aps 34 horas a 22/12 C (dia/ noite)
com plantas irrigadas (I) e no irrigadas (NI); dia 13 medida feita aps 13 dias (estresse
intermedirio); de baixa temperatura em plantas irrigadas e no irrigadas; dia 20 medida aps
20 dias de baixa temperatura em plantas irrigadas e no irrigadas (estresse mximo); dia 22
medida aps 2 dias de retorno temperatura de 32/20 C e reidratao e dia 28 medida aps 8
dias de recuperao das plantas. Smbolos indicam mdia de 20 repeties erro padro.

O frio e a deficincia hdrica causaram queda na eficincia aparente de carboxilao


(A/Ci) em ambas as cultivares e tratamentos, sendo a queda em IACSP95-5000 foi
relativamente mais acentuada. Porm, comparativamente, os valores de A/Ci foram mais
elevados em IACSP95-5000. A resposta de A/Ci foi oposta a de Ci, ou seja, quando Ci
aumentou, A/Ci diminuiu (Figura 3C e 3D).
A partir de 34 h de baixas temperaturas, a eficincia operacional do FSII (Fq'/Fm') de
ambas as cultivares, tanto das plantas I como nas NI, baixou significativamente
permanecendo baixa durante todo o perodo de estresse (Figura 4A, B). As duas cultivares
recuperaram Fq'/Fm' logo no primeiro dia de retorno s temperaturas mais altas e reidratao
(Figura 4).

56
IACSP94-2094 I IACSP95-5000 I
IACSP94-2094 NI IACSP95-5000 NI
300
A B

250

Ci (mol mol-1)
200

150

100

3,0 C D
A/Ci (mol m-2 s-1 Pa-1)

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5
0
2

13

20
22

28

0
2

13

20
22

28
Dias de tratamento

Figura 3 - (A, B) Variao da concentrao intercelular de CO2 (Ci) e da (C, D) eficincia


aparente de carboxilao (A/Ci) de cana-de-acar, cultivares IACSP94-2094 e IACSP95-
5000, sendo: dia 0 (testemunha) medida feita aps 18 dias de aclimatao a 32/20 C (dia/
noite) com plantas irrigadas; dia 2 medida feita aps 34 horas a 22/12 C (dia/ noite) com
plantas irrigadas e no irrigadas; dia 13 medida feita aps 13 dias (estresse intermedirio) de
baixa temperatura em plantas irrigadas (I) e no irrigadas (NI); dia 20 medida aps 20 dias de
baixa temperatura em plantas irrigadas e no irrigadas (estresse mximo); dia 22 medida aps
2 dias de retorno temperatura de 32/20 C e reidratao e dia 28 medida aps 8 dias de
recuperao das plantas. Smbolos indicam mdia de 20 repeties erro padro.

Houve aumento significativo do coeficiente de extino no fotoqumico (NPQ)


durante o perodo de baixas temperaturas na cv. IACSP94-2094 I e NI, e no dia de mximo
estresse, o NPQ das plantas NI foi significativamente menor que das plantas I (Figura 5A). Na
cv. IACSP95-5000 o NPQ foi semelhante durante todo o perodo experimental (Figura 5B).
Nas plantas I e NI das duas cultivares houve decrscimo significativo de Fv/Fm aps 34
h de baixa temperatura, permanecendo baixo durante todo o perodo de tratamento (Figura
5C, D) e ambas recuperaram Fv/Fm aps o perodo de retorno s temperaturas mais altas e
reidratao.
Houve decrscimo significativo da eficincia quntica mxima do FSII sob luz
(Fv'/Fm'), durante o perodo de baixas temperaturas na IACSP94-2094 I e na NI, porm, nas
plantas NI o Fv'/Fm' foi significativamente maior que nas plantas I. A IACSP94-2094 NI
recuperou parcialmente Fv'/Fm' (Figura 5C). A IACSP95-5000 NI apresentou decrscimo
significativo de Fv'/Fm' aps 34 h de baixa temperatura e durante o mximo estresse por

57
temperatura e deficincia hdrica tendo se recuperado totalmente aps retorno s temperaturas
mais altas e reidratao (Figura 5D).

IACSP94-2094 I IACSP95-5000 I
IACSP94-2094 NI IACSP95-5000 NI
0,28
A B
0,24

0,20
Fq'/Fm'

0,16

0,12

0,08
0
2

13

20
22

28

0
2

13

20
22

28
Dias de tratamento

Figura 4 - (A, B) Resposta da eficincia operacional do FSII (Fq'/Fm') de cana-de-acar,


cultivares IACSP94-2094 e IACSP95-5000, sendo o dia 0 (testemunha) medida feita aps 18
dias de aclimatao a 32/20 C (dia/ noite) com plantas irrigadas; dia 2 medida feita aps 34
horas a 22/12 C (dia/ noite) com plantas irrigadas (I) e no irrigadas (NI); dia 13 medida feita
aps 13 dias (estresse intermedirio); de baixa temperatura em plantas irrigadas e no
irrigadas; dia 20 medida aps 20 dias de baixa temperatura em plantas irrigadas e no
irrigadas (estresse mximo); dia 22 medida aps 2 dias de retorno temperatura de 32/20 C e
reidratao e dia 28 medida aps 8 dias de recuperao das plantas. Smbolos indicam mdia
de 20 repeties erro padro.

Na IACSP94-2094 I e NI houve decrscimo significativo do fator de eficincia do


fotossistema II (Fq'/Fv') aps 34 h de frio, ocorrendo em seguida a recuperao (Figura 6A). J
na IACSP95-5000, tanto I como NI, Fq'/Fv' decresceu significativamente por todo perodo de
estresse (Figura 6B), com o retorno s temperaturas maiores e reidratao os valores de Fq'/Fv'
se recuperaram.
Em ambas as cultivares o transporte aparente de eltrons (ETR) decresceu
significativamente aps 34 h de baixas temperaturas, permanecendo baixo durante todo o
perodo de tratamento (Figura 6C, D) e recuperando ETR aps o retorno s temperaturas mais
altas e reidratao (Figura 6C, D).
Houve aumento significativo do teor de acares solveis (AS) no perodo de mximo
estresse (Figura 7A) na IACSP94-2094 I e NI. Aps o retorno s temperaturas de 32/20 C e
reidratao, os valores no retornaram aos do controle, enquanto que nas NI, retornaram
(Figura 7A). J na IACSP95-5000 I e NI houve aumento significativo de AS aps 34 h de
baixa temperatura, permanecendo alto durante todo o perodo de estresse (Figura 7B) e

58
recuperando aos valores do controle aps o perodo de retorno s temperaturas mais altas e
reidratao (Figura 7B).

IACSP94-2094 I IACSP95-5000 I
IACSP94-2094 NI IACSP95-5000 NI
2,1 A B

1,8
NPQ

1,5

1,2

0,9

0,6
C D
Fv/Fm

0,75

0,60
Fv'/Fm'

0,45

0,30
0
2

13

20
22

28

0
2

13

20
22

28
Dias de tratamento

Figura 5 - (A, B) Variao do coeficiente de extino no fotoqumico (NPQ) e da (C, D)


eficincia quntica mxima do FSII (Fv/Fm) e eficincia quntica mxima do FSII sob Q
(Fv'/Fm') de cana-de-acar, cultivares IACSP94-2094 e IACSP95-5000, sendo o dia 0
(testemunha) medida feita aps 18 dias de aclimatao a 32/20 C (dia/ noite) com plantas
irrigadas; dia 2 medida feita aps 34 horas a 22/12 C (dia/ noite) com plantas irrigadas (I) e
no irrigadas (NI); dia 13 medida feita aps 13 dias de baixa temperatura em plantas irrigadas
e no irrigadas; dia 20 medida aps 20 dias de baixa temperatura em plantas irrigadas e no
irrigadas (mximo estresse); dia 22 medida aps 2 dias de retorno temperatura de 32/20 C e
reidratao e dia 28 medida aps 8 dias de recuperao das plantas. Smbolos indicam mdia
de 20 repeties erro padro.

O teor de sacarose (SAC) aumentou significativamente na IACSP94-2094 NI no


perodo de mximo estresse (Figura 7C), enquanto na IACSP95-5000 I e NI o aumento de
SAC ocorreu logo aps 34 h de baixa temperatura, permanecendo alto durante todo o perodo
de estresse (Figura 7D). SAC tanto da IACSP94-2094 NI como da IACSP95-5000 I e NI
retornaram aos valores do controle aps o retorno da temperatura e reidratao (Figura 7C,
D).

59
IACSP94-2094 I IACSP95-5000 I
IACSP94-2094 NI IACSP95-5000 NI
0,54 A B
0,45

Fq'/Fv'
0,36

0,27

0,18

120
ETR (mol m-2 s-1)

C D
100

80

60

40
0
2

13

20
22

28

0
2

13

20
22

28
Dias de tratamento

Figura 6 - (A, B) Variao do fator de eficincia do FSII (Fq'/Fv') e do (C, D) transporte


aparente de eltrons (ETR) de cana-de-acar, cultivares IACSP94-2094 e IACSP95-5000,
sendo o dia 0 (testemunha) medida feita aps 18 dias de aclimatao a 32/20 C (dia/ noite)
com plantas irrigadas; dia 2 medida feita aps 34 horas a 22/12 C (dia/ noite) com plantas
irrigadas (I) e no irrigadas (NI); dia 13 medida feita aps 13 dias de baixa temperatura em
plantas irrigadas e no irrigadas; dia 20 medida aps 20 dias de baixa temperatura em plantas
irrigadas e no irrigadas (mximo estresse); dia 22 medida aps 2 dias de retorno
temperatura de 32/20 C e reidratao e dia 28 medida aps 8 dias de recuperao das plantas.
Smbolos indicam mdia de 20 repeties erro padro.

Em ambas as cultivares, independente do status hdrico, houve um aumento


significativo no teor de amido foliar (AMI), sendo na IACSP94-2094 no perodo de baixa
temperatura e deficincia hdrica (Figura 7E), enquanto que na IACSP95-5000 o aumento
ocorreu logo aps 34 h de baixa temperatura (Figura 7F). Aps o perodo de retorno da
temperatura e reidratao na IACSP94-2094 (Figura 7E), os teores de AMI no atingiram os
valores do controle, enquanto na IACSP95-5000 houve recuperao parcial dos teores de AMI
(Figura 7F).
A atividade da sintase de sacarose (SuSy) aumentou na IACSP94-2094 I e NI com as
baixas temperaturas (Figura 8A). Nas plantas I esse aumento foi observado somente no
perodo de mximo estresse, enquanto nas plantas NI esse aumento ocorreu no perodo de
estresse intermedirio (Figura 8A).

60
IACSP94-2094 I IACSP95-5000 I
IACSP94-2094 NI IACSP95-5000 NI
560
A B
480

AS (mol g-1 MS)


400

320

240

250 C D
SAC (mol g-1 MS)

200

150

100

50
420
E F
350
AMI (mol g-1 MS)

280
210
140
70
0
0
2

13

20
22

28

0
2

13

20
22

Dias de tratamento 28

Figura 7 - (A, B) Variao no teor dos acares solveis (AS), da (C, D) sacarose (SAC) e do
amido (AMI) em folhas de cana-de-acar, cultivares IACSP94-2094 e IACSP95-5000, sendo
o dia 0 (testemunha) medida feita aps 18 dias de aclimatao a 32/20 C (dia/ noite) com
plantas irrigadas; dia 2 medida feita aps 34 horas a 22/12 C (dia/ noite) com plantas
irrigadas (I) e no irrigadas (NI); dia 13 medida feita aps 13 dias de baixa temperatura em
plantas irrigadas e no irrigadas; dia 20 medida aps 20 dias de baixa temperatura em plantas
irrigadas e no irrigadas (mximo estresse); dia 22 medida aps 2 dias de retorno
temperatura de 32/20 C e reidratao e dia 28 medida aps 8 dias de recuperao das plantas.
Smbolos indicam mdia de quatro repeties erro padro.

Durante o mximo estresse observou-se ainda que a atividade da SuSy na IACSP94-


2094 I foi significativamente maior que das plantas NI (Figura 8A). A atividade da SuSy na
IACSP94-2094 retornou aos valores do controle no perodo de recuperao (Figura 8A). Foi
observado aumento significativo da atividade da SuSy na IACSP95-5000 NI no estresse
intermedirio (Figura 8B), retornando aos valores do controle j no mximo estresse.
Houve aumento significativo na atividade da sintase de sacarose fosfato (SPS) na
IACSP94-2094 I e NI durante o perodo de baixas temperaturas (Figura 8C). No perodo de
mximo estresse, a atividade da SPS foi maior nas plantas NI (Figura 8C). Na IACSP95-5000
a atividade da SPS foi semelhante durante todo o perodo experimental (Figura 8D).

61
IACSP94-2094 I IACSP95-5000 I
IACSP94-2094 NI IACSP95-5000 NI

0,60 A B

0,45

(mol gMF min-1)


0,30
SuSy
0,15

0,00
0,75
C D
(mol gMF min-1)

0,60

0,45
SPS

0,30

0,15

0,00
0
2

0
2
13

20
22

28

13

20
22

28
Dias de tratamento

Figura 8 - Variao da atividade das enzimas (A, B) sintase de sacarose (SuSy) e da (C, D)
sintase de sacarose fosfato (SPS) em folhas de cana-de-acar, cultivares IACSP94-2094 e
IACSP95-5000, sendo o dia 0 (testemunha) medida feita aps 18 dias de aclimatao a 32/20
C (dia/ noite) com plantas irrigadas; dia 2 medida feita aps 34 horas a 22/12 C (dia/ noite)
com plantas irrigadas e no irrigadas; dia 13 medida feita aps 13 dias de baixa temperatura
em plantas irrigadas e no irrigadas; dia 20 medida aps 20 dias de baixa temperatura em
plantas irrigadas e no irrigadas (mximo estresse); dia 22 medida aps 2 dias de retorno
temperatura de 32/20 C e reidratao e dia 28 medida aps 8 dias de recuperao das plantas.
Smbolos indicam mdia de quatro repeties erro padro.

Foi observado decrscimo significativo da atividade das invertases cidas (IVA) na


IACSP94-2094 I e NI durante o perodo de estresse (Figura 9A) e houve recuperao dos
valores aps o retorno s temperaturas de 32/20 C e reidratao (Figura 9A). Nas IACSP95-
5000 I e NI houve decrscimo, apesar de no significativo, na atividade das IVA somente aps
34 h de baixa temperatura, recuperando os valores mesmo com a continuidade do estresse
(Figura 9B). Em IACSP95-5000 I, no 8 dia de recuperao, a atividade da IVA foi
significativamente maior que a da testemunha (Figura 9B).
Houve aumento significativo na atividade das invertases neutras (IVN) nas cultivares
IACSP94-2094 I e IACSP95-5000 I no mximo estresse (Figura 9C, D), enquanto neste
mesmo perodo houve decrscimo significativo das atividades em ambas as cultivares NI
(Figura 9C, D). As cultivares NI recuperaram a atividade das IVN aps dois dias de retorno s
temperaturas mais altas e reidratao das plantas (Figura 9C, D).

62
IACSP94-2094 I IACSP95-5000 I
IACSP94-2094 NI IACSP95-5000 NI
5,4 A B

(mol gMF min-1)


4,5
3,6

IVA
2,7
1,8
0,9
0,0
4,5 C D
(mol gMF min-1)

3,6
IVN

2,7

1,8

0,9

0,0
0
2

0
2
13

20
22

28

13

20
22

28
Dias de tratamento

Figura 9 - Variao da atividade das (A, B) invertases cidas (IVA) e das (C, D) invertases
neutras (IVN) em folhas de cana-de-acar, cultivares IACSP94-2094 e IACSP95-5000,
sendo o dia 0 (testemunha) medida feita aps 18 dias de aclimatao a 32/20 C (dia/ noite)
com plantas irrigadas; dia 2 medida feita aps 34 horas a 22/12 C (dia/ noite) com plantas
irrigadas e no irrigadas; dia 13 medida feita aps 13 dias de baixa temperatura em plantas
irrigadas e no irrigadas; dia 20 medida aps 20 dias de baixa temperatura em plantas
irrigadas e no irrigadas (mximo estresse); dia 22 medida aps 2 dias de retorno
temperatura de 32/20 C e reidratao e dia 28 medida aps 8 dias de recuperao das plantas.
Smbolos indicam mdia de quatro repeties erro padro.

4 DISCUSSO

Perodo de baixa temperatura e deficincia hdrica

Diversos fatores ambientais, como por exemplo a seca, temperaturas extremas e a


salinidade, afetam negativamente o crescimento e desenvolvimento das plantas, alm do
rendimento mdio de uma cultura (ASHRAF & FOOLAD, 2007), devido a uma srie de
distrbios morfolgicos, fisiolgicos, bioqumicos e moleculares (WANG et al., 2003), o que
leva ao interesse em elucid-los e relacion-los tolerncia das plantas a estes fatores
ambientais.
A assimilao de CO2 (A) da IACSP95-5000 na testemunha (32/20 C e irrigada) foi
significativamente maior que a da IACSP94-2094 (Figura 1A, B). Dois fatores determinam

63
esta resposta, ou seja, os maiores valores de gs (Figura 2A, B) permitindo maior fluxo de
difuso do CO2 atravs das aberturas estomticas, combinados com os maiores valores da
razo A/Ci (Figura 3C), que indica maior eficincia de carboxilao. Outras caractersticas se
destacam na IACSP95-5000, como a maior eficincia operacional do fotossistema II (Fq'/Fm',
Figura 4A, B) e consequentemente, maior ETR em relao a IACSP94-2094 (Figura 6C, D).
A IACSP95-5000 destaca-se em relao IACSP94-2094 como sendo uma cultivar menos
rstica e mais produtiva em ambientes favorveis (LANDELL et al., 2005), e neste trabalho
destacou-se tambm como uma cultivar com maior capacidade fotossinttica.
Sob estresse, independente do tratamento, baixa temperatura com e sem deficincia
hdrica, A e Ai da IACSP95-5000 tiveram valores significativamente maiores que o da
IACSP94-2094 (Figura 1). Entretanto, nas duas cultivares ocorreu decrscimo significativo
destes parmetros devido ao estresse. A queda relativa de Ai na IACSP94-2094 sob estresse
mximo de baixa temperatura (48%) e baixa temperatura e deficincia hdrica (38%) foram
estatisticamente semelhantes, no apresentando efeito cumulativo importante. No entanto, na
IACSP95-5000 ocorreu efeito cumulativo dos dois estresses, j que sob baixa temperatura Ai
decaiu 16%, enquanto em baixa temperatura e deficincia hdrica decaiu 35%, ou seja, mais
que o dobro. Outro aspecto a considerar que houve um aumento significativo de NPQ
durante o perodo de baixa temperatura e restrio hdrica na IACSP94-2094 I e NI (Figura
5A). Na IACSP95-5000, o NPQ foi semelhante durante todo o perodo experimental (Figura
5B). Segundo LAWLOR & TEZARA (2009), o NPQ uma forma de dissipao de energia
muito frequente quando h excesso de energia no utilizada. Estes resultados sugerem que a
fotossntese de ambas as cultivares foi sensvel baixa temperatura, porm a IACSP95-5000
com menor intensidade que a IACSP94-2094. Por outro lado, com a ocorrncia simultnea de
baixa temperatura e deficincia hdrica, a IACSP95-5000 foi, possivelmente, mais sensvel ao
efeito cumulativo de frio e seca. Interessante notar que RIBEIRO et al. (2013) observaram
que sob deficincia hdrica mais severa (W6h = -1,8 MPa) a IACSP94-2094 apresentou as
menores quedas em A, quando comparada a outras cultivares, SP87-365 e IACSP96-2042.
Comparativamente, a cv. IACSP95-5000 apresentaram queda maior da razo A/Ci do que a
IACSP94-2094 (Figura 3C e D). MARTINS (2012) tambm sugeriu que a maior tolerncia
deficincia hdrica da IACSP94-2094 em relao a IACSP95-5000 estaria relacionada com a
maior fotoproteo indicada pelo NPQ e maior atividade e expresso de PEPcase.
A queda de A aps 34 h de imposio dos tratamentos pode estar relacionada a fatores
difusivos, metablicos e fotoqumicos (ALLEN & ORT, 2001; DU et al., 1996;
GHANNOUM et al., 2003; GHANNOUM, 2009; MACHADO et al., 2009, 2010). De fato,

64
no presente trabalho a queda em A foi devida tanto a fatores difusivos, relacionados queda
de gs (Figura 2A e B), como metablicos, queda na razo A/Ci (Figura 3C e D) e tambm
fotoqumico, queda em Fq'/Fm', (Figura 4) com consequente queda em ETR (Figura 6C e D).
DU et al. (1996) observaram em cana-de-acar sob deficincia hdrica moderada (W6h = -
0,85 MPa), que o declnio da fotossntese ocorreu devido, principalmente, a fatores
estomticos. Sob deficincia hdrica mais severa (W6h < -0,85 MPa), o declnio de A foi
devido, em parte, queda de gs, acrescido por componentes metablicos, sendo o fator
limitante a enzima PPDK. LOBO (2012) tambm relatou que a deficincia hdrica em cana-
de-acar promoveu decrscimos em gs e da atividade e expresso de Rubisco e PEPcase.
O efeito mximo da baixa temperatura sobre A ocorreu de forma rpida, ou seja, j nas
34 horas iniciais, visto que durante o resto do perodo experimental, at o 20 dia, o
incremento na queda de A foi negligvel em ambas as cultivares. Como j foi descrito, na
IACSP94-2094 no ocorreu maior queda de A, mesmo com a adio do estresse hdrico
(Figura 1A).
Aps o resfriamento, com o declnio de A, foi observado o fechamento estomtico, que
pode ter ocorrido devido a um efeito direto do frio sobre as clulas-guarda ou ainda, uma
resposta indireta ao aumento de Ci, induzido pela diminuio da atividade de carboxilao
(ALLEN & ORT, 2001). De fato, Ci aumentou progressivamente enquanto A/Ci diminuiu em
ambas as cultivares (Figura 3). Alm disso, pode ocorrer sinalizao qumica causada pelo
frio e tambm pela deficincia hdrica o que poderia ainda causar o fechamento estomtico
(LIANG & ZHANG, 1999; VESELOVA et al., 2005; ZHOU et al., 2007). No tratamento com
baixa temperatura, as respostas em ambas as cultivares foram semelhantes, porm mais
acentuadas na IACSP94-2094. Em relao ao efeito conjunto da baixa temperatura e
deficincia hdrica, os mesmos efeitos podem ter ocorrido acrescidos da queda do w6h.
Entretanto, em nenhuma das cultivares ocorreu aumento da fotorrespirao devido aos
estresses, como pode ser verificado pela relao linear entre eficincia operacional (Fq'/Fm') e
eficincia quntica (CO2), dada por CO2 = -0,00312 + 0,09783*Fq/Fm (R2=0,96, p<0,01)
(dados no apresentados). Esta relao indica a utilizao de 10,2 ftons/CO2 fixado,
independente do tratamento.
Quando ambos os estresses ocorreram conjuntamente, com a queda de A tambm
ocorreu queda em gs evitando assim a desidratao. O aumento de Ci s ocorreu no perodo de
seca intermediria e mxima (respectivamente no 13o e 20 dias) (Figura 3A e B). O aumento
de Ci (Figura 3A e B) na IACSP94-2094 NI e na IACSP95-5000 NI coincide com o
decrscimo do w6h (Tabela 1), sugerindo que o declnio de A pode tambm ter ocorrido

65
devido a fatores no estomticos (DU et al., 1996; LOBO 2012), como foi sugerido pela
queda de A/Ci (Figura 3C e D).
Quando as plantas so expostas a estresses biticos e abiticos, so frequentemente
observados decrscimos na eficincia quntica mxima do FSII (Fv/Fm) (BAKER, 2008).
Fv/Fm representa a eficincia mxima com que a luz absorvida pelo FSII usada para a
reduo da QA (BAKER, 2008). Neste experimento, ambas as cultivares apresentaram
decrscimo significativo de Fv/Fm aps o resfriamento (Figura 5C e D), permanecendo baixo
durante todo o perodo de tratamento, porm somente a IACSP94-2094 I e NI apresentaram
valores abaixo de 0,725 caracterizando fotoinibio (CRITCHLEY, 1998). A alterao do
Fv/Fm pode ter ocorrido devido a mudana na eficincia da dissipao no-fotoqumica
(MAXWELL & JOHNSON, 2000). De fato, na IACSP94-2094 I e NI houve aumento de
NPQ acompanhado do decrscimo de Fv'/Fm' durante o perodo de tratamento (Figura 5A e
C).
A taxa de consumo de ATP e NADPH um dos principais fatores que determinam a
eficincia operacional FSII (Fq'/Fm') em muitas situaes. Alteraes na eficincia de
carboxilao, na taxa de regenerao da ribulose 1,5-bisfosfato (RuBP), no fornecimento de
CO2 para os stios de carboxilao via estmatos e na taxa de transporte de carboidratos para
fora da clula podem influenciar a taxa de utilizao de ATP e NADPH e, consequentemente,
Fq'/Fm'. Muitos estresses ambientais alteram a assimilao de CO2, embora os locais da
limitao da fotossntese possam ser muito variados. O estresse induz a reduo da
condutncia estomtica, do metabolismo de carbono e do transporte, podendo diminuir a
eficincia do FSII. Aumentos de NADPH e ATP diminuem o fluxo linear de eltrons e a taxa
de oxidao de QA, que podem ser monitorados por diminuies no fator de eficincia do FSII
(Fq'/Fv'). No entanto, a acidificao do lmen, bem como o aumento dos teores de ATP
tambm resultam num aumento do NPQ (Figura 5A, B) e uma diminuio do Fv'/Fm' (Figura
5C, D) (BAKER, 2008).
A assimilao de CO2 pelas folhas resulta em triose-P, da qual sintetizada sacarose e
amido como produtos finais de duas rotas gliconeognicas: a sacarose no citosol das clulas
do mesofilo e o amido nos cloroplastos da BFV em cana-de-acar (GROF & CAMPBELL,
2001; LUNN & FURBANK 1999). Durante o dia, a sacarose continuamente exportada para
tecidos no fotossintetizantes da planta, enquanto o amido acumulado nos cloroplastos. Os
teores de amido do cloroplasto so mximos durante o dia e mnimos a noite, quando
degradado para sntese de sacarose, mantendo assim, sua exportao durante a noite. Em
condies adequadas, baixos teores de acar estimulam a fotossntese (McCORMICK et al.,

66
2006; LOBO, 2012), a mobilizao de reservas e a exportao, enquanto a alta concentrao
de acar promove o crescimento e o armazenamento de carboidratos (SMITH & STITT,
2007; SOUZA, 2011; TAIZ & ZEIGER, 2009).
Em folhas de cana-de-acar, sob condies normais de crescimento, a glicose e a
frutose apresentam a maior concentrao s 10 h, enquanto o contedo de sacarose comea a
aumentar s 10h, atingindo valores mximos entre 13 e 16 h e o declnio da sacarose ocorre
aps as 19 h. A concentrao de amido comea a aumentar a partir das 10 h e tem um pico
mximo s 16 h. A partir das 19 h, 90% do amido produzido na folha so ento consumidos
no perodo noturno (SOUZA, 2011).
Neste experimento, durante o perodo de estresse, as folhas para anlises bioqumicas
foram coletadas s 9 h e foi observado aumento no teor de AS (composto principalmente por
glicose + frutose + sacarose) em ambas as cultivares (Figura 7A, B, C e D). Na IACSP95-
5000 I e NI este aumento ocorreu aps 34 h de frio, enquanto na IACSP94-2094 I e NI o
aumento de AS ocorreu no perodo de mximo estresse. Houve acmulo de SAC nas folhas na
IACSP94-2094 NI no perodo de estresse mximo. Este aumento provavelmente est
relacionado com a alta atividade da SPS (Figura 7C e 8C). No trabalho apresentado no
captulo II, tambm foi observado aumento da concentrao de SAC nas plantas expostas
baixa temperatura noturna e deficincia hdrica (Tabela 2, Captulo II).
Em ambas as cultivares, independente do status hdrico, foi observado aumento da
concentrao de AMI foliar, porm este aumento foi bem maior na IACSP94-2094,
independente do regime hdrico, em relao testemunha. MACHADO (2009) tambm
observou em citros, aps o tratamento com baixa temperatura noturna, que houve aumento na
concentrao de AMI, provavelmente devido inibio de enzimas de mobilizao do amido,
ou ainda, a queda no crescimento, diminuindo assim a demanda (ALLEN & ORT, 2001). O
acmulo de carboidratos nas folhas aps a imposio dos tratamentos, tambm observado por
LOBO (2012), pode ser devido baixa demanda de carboidratos. Ou seja, possvel que a
queda no crescimento das plantas, que tem temperatura ideal em 35 C (EBRAHIM et al.,
1998; SALES et al., 2012), tenha sido mais afetada do que a queda em A, e portanto,
decorrente disto, ocorreu acmulo de reservas. Esta formao de reserva pode ser
remobilizada para suprir o substrato necessrio ao crescimento rpido, quando o ambiente se
tornar favorvel (PEARCE, 1999; POLLOCK & JONES, 1979).
Na rota de sntese de sacarose, a enzima chave a SPS, exercendo alto controle em
altas taxas fotossintticas e, portanto, tambm sobre o fluxo mximo de sntese (HUBER &
HUBER, 1996). Foi observado que em plantas sob baixas temperaturas houve aumento da

67
atividade da SPS e da SuSy em folhas de espinafre (GUY et al., 1992), ou ainda, aumento no
estado de ativao da enzima em folhas de cana-de-acar de cultivar tolerante (DU & NOSE,
2002). Entretanto, sob deficincia hdrica severa, DU et al. (1998) observaram que a atividade
enzimtica relacionada com a sntese de sacarose e amido diminuram, porm em menor
proporo que as trocas gasosas, indicando baixa possibilidade dos componentes da rota da
sacarose e amido como fatores limitantes das trocas gasosas.
No presente experimento houve respostas diferenciadas entre cultivares (Figura 8).
Houve aumento da atividade da SPS em IACSP94-2094 I e NI durante o perodo de
tratamento, sendo que no perodo de mximo estresse a atividade da SPS foi maior nas plantas
NI. O aumento da SPS indica mudana nas propriedades regulatrias da enzima
(BASCUN-GODOY et al., 2006). Alm disso, sob baixas temperaturas, o aumento da
atividade da SPS associado ao acmulo de SAC sugerem que a resposta no simplesmente
de ajuste deste processo metablico para superar a cintica enzimtica lenta em baixas
temperaturas, mas provavelmente, um processo adaptativo para maximizar a sntese do
composto com propriedades osmticas importantes na tolerncia a esse estresse (GUY, et al.,
1992).
A utilizao da sacarose como fonte de energia depende de sua quebra, gerando
hexoses, e nas plantas duas enzimas catalisam esta reao: a SuSy, gerando FRU + UDP-
glicose, ou as invertases gerando GLU + FRU, que regulam a entrada da sacarose em
diferentes rotas de utilizao (STURM, 1999), incluindo o carregamento de carboidratos no
complexo cc-ec para exportao da sacarose (LALONDE et al., 2003: RAE et al., 2005;
SMITH & STITT, 2007). Em plantas de cana-de-acar, mudanas na atividade do dreno
podem promover ajustes nas taxas de descarregamento pelo floema (LALONDE et al., 2003)
promovendo a manuteno de um gradiente de exportao de sacarose.
A atividade da SuSy (Figura 8A e B) aumentou na IACSP94-2094 com a baixa
temperatura (no mximo estresse) e com a deficincia hdrica (no estresse intermedirio). Na
IACSP95-5000 NI houve aumento significativo da atividade da SuSy no estresse
intermedirio. VANDOORME et al. (2012) observaram em plantas de chicria, que a
deficincia hdrica no influenciou significativamente a atividade da SuSy, indicando a
utilizao de seus produtos em processos anablicos.
Durante o perodo de estresse, a atividade da IVA decresceu na IACSP94-2094 I e NI,
enquanto em ambas as cultivares nas plantas I houve aumento da IVN e nas plantas NI
decrscimo, indicando sensibilidade da IVN aos estresses impostos de forma simultnea
(Figura 9). Em decorrncia do aumento da atividade das invertases, houve um aumento do

68
teor de AS (Figura 7A, B). Decrscimo de IVA foi observado por FU et al. (2010) em uma
espcie de gramnea sob deficincia hdrica, sugerindo que a alta concentrao de sacarose
seja uma consequncia do aumento da atividades das enzimas SPS e SuSy e declnio da IVA.
Na IACSP95-5000 o aumento da atividade da IVN nas plantas I pode ter contribudo
para a menor queda de A em relao s plantas NI, devido ao aumento no teor de hexoses, que
pode incrementar o potencial osmtico (Figura 1B, 7B e 9D).

Perodo de recuperao

Aps o estresse mximo, as plantas foram reidratadas e retornaram temperatura de


32/20 C. Dois dias depois ocorreu aumento sbito de A e Ai em ambas as cultivares,
atingindo valores semelhantes aos da testemunha (Figura 1). Esta recuperao no 2 dia est
relacionada com a recuperao de gs, Ci, A/Ci, Fq'/Fm' e ETR, a valores semelhantes
testemunha, antes do estresse (Figuras 1, 2, 3, 4 e 6).
interessante notar que A e Ai em IACSP95-5000 que foi submetida baixa
temperatura continuou a aumentar at o 8 dia de recuperao e superaram em 45% e 30%,
respectivamente, aos valores de A e Ai da testemunha (Figura 1B, D). Esta resposta est
relacionada com o aumento de 79% em gs (Figura 2B), o que deve proporcionar aumento do
fluxo de CO2 aumentando o Ci em 40% (Figura 3B). Tambm pode estar relacionado com o
aumento de 15 e 25%, respectivamente, em Fq'/Fm' e ETR, em relao ao 2 dia de
recuperao (Figuras 4B e 6D). No tratamento de baixa temperatura combinado com a
deficincia hdrica, o aumento de A e Ai maior do que a testemunha no ocorreu, apesar de ter
ocorrido em gs e Ci. Porm, A/Ci permaneceu menor que a testemunha (Figura 3D), sugerindo
efeito residual da deficincia hdrica sobre o metabolismo fotossinttico, como tambm foi
observado por DU et al. (1996).
As plantas quando retornaram s condies ideais durante a recuperao,
possivelmente tiveram aumento no crescimento, demandando mais fotoassimilados. A taxa
mxima de crescimento da cana-de-acar ocorre entre 25 e 35 C e quando expostas
temperatura de 15 C j se observa inibio do crescimento vegetativo (EBRAHIM et al.,
1998; SALES et al., 2012). Concomitantemente ao aumento de A, ocorreu queda significativa
no teor dos demais carboidratos no tecido foliar (Figura 7), principalmente na IACSP95-5000.
Assim, sugere-se que o aumento sbito de A em relao testemunha durante a recuperao
da IACSP95-5000 I seja causado pela ao combinada dos aumentos em gs, A/Ci, Fq'/Fm' e da
queda acentuada nos teores de carboidratos, possivelmente causado pelo fluxo de sacarose ao

69
floema (McCORMICK et al., 2008; LOBO, 2012). LOBO (2012) observou que a maior
concentrao de sacarose, frutose ou glicose causa queda acentuada na assimilao de CO2 e
no ETR. Os processos de inibio ou estmulo da fotossntese esto relacionados com o
consumo de intermedirios nos drenos (McCORMICK et al., 2006; 2008; 2009) prevenindo a
falta ou o acmulo de metablitos. Na recuperao tambm houve mudana geral nas
atividades de enzimas relacionadas ao metabolismo de carboidratos, bem como de seus teores
nas folhas. Os teores de carboidratos (AS, SAC e AMI) em todos os tratamentos, exceto na
IACSP94-2094 I, decresceram significativamente durante a recuperao em relao ao
mximo estresse. Este tipo de resposta sugere que ocorreu grande exportao da fonte em
direo aos drenos em crescimento ativo. Ao mesmo tempo, as atividades de SPS e SuSy
decresceram, enquanto as atividades das invertases aumentaram do 2 para 8 dia de
recuperao. Alta atividade de invertases indica alta taxa de catabolismo.

5 CONCLUSES

1. Sob condies ideais, a cv. IACSP95-5000 tem maior fotossntese que a cv. IACSP94-2094
devido maior condutncia estomtica e eficincia aparente de carboxilao.

2. A cv. IACSP95-5000 mais tolerante baixa temperatura e apresenta maior capacidade de


recuperao da fotossntese aps a sua ocorrncia.

4. Sob a ocorrncia conjunta de frio e deficincia hdrica, a cv. IACSP94-2094 mais


tolerante do que a cv. IACSP95-5000.

5. O declnio da assimilao de CO2 em ambas as cultivares, em consequncia da ocorrncia


de frio e/ou deficincia hdrica devido a fatores difusivos, metablicos e fotoqumicos.

6. O alto teor de acares solveis totais nas folhas da cv. IACSP94-2094 NI no perodo de
estresse mximo devido, principalmente, ao aumento no teor de sacarose, quando h
tambm aumento da atividade da sintase de sacarose fosfato.

7. O alto teor de acares solveis totais nas folhas da cv. IACSP94-2094 I no perodo de
estresse devido, principalmente, hidrlise do amido. Neste mesmo perodo ocorre tambm
aumento da atividade das invertases neutras.

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