Produccin de cido ctrico por una pelcula aislado de Aspergillus niger: I.

La mutagnesis y los estudios de reduccin de costes

RESUMEN:
Radiacion ultavioleta (UV), Etil metano sulfonato (EMS), y Acridina de Naranja (AO),
se utilizaron para inducir la mutacion de sobreproduccin de Acido ctrico en
Aspergillus Nger UMI 2564. Entre el 15, 8 de los mutantes derivados, se han
mejorado con respecto a la produccin de Acido Citrico, a partir de Sacarosa en
cultivos discontinuos. El mximo rendimiento en la produccin (60,25%), se registr
por W5, un mutante UV estable, con aumento de aproximadamente 3,2 veces en
comparacin con la cepa de tipo salvaje parental. En trminos de los parmetros
cinticos para los procesos de fermentacin por lotes, la mutacin duplic la tasa
de captacin de sustrato especfico y logra 4.5- y las mejoras en la productividad de
cido ctrico y la productividad especfica de 7,5 veces, respectivamente. Para la
reduccin del coste medio de fermentacin, licor de maz fermentado y melazas de
remolacha pre-tratados con fosfato de calcio se utilizaron con xito como
sustituyentes de fuentes de nitrgeno y carbono en el medio de crecimiento,
respectivamente. Estas sustituciones medianas resultaron en un cultivo de
fermentacin de cido ctrico W5 con un rendimiento de producto del 74.56%.

Palabras clave
Aspergillus niger; El cido ctrico; Fermentacin sumergida; La mutacin; melaza de
remolacha.

INTRODUCCIN:
La fermentacin de cido ctrico es uno de las mayores industrias biotecnolgicas,
ya que se utiliza en varias otras aplicaciones industriales (Ali et al, 2001; Rohr,
1998). Mejora de la cepa microbiana productora ofrece la mayor oportunidad para
la reduccin de costes y sin inversin de capital significativa (Stanbury et al., 1995).
Esto se logra cuando una cepa seleccionada puede sintetizar una mayor proporcin
del producto utilizando la misma cantidad de materias primas. Puesto que el cido
ctrico es un producto intermedio del metabolismo energtico, su concentracin
puede elevarse a cantidades apreciables en las condiciones de los desequilibrios
metablicos (Hutter, 1983).
Las cepas con caracteres superiores, tales como la produccin de cido ctrico
mejorada y una mayor velocidad de fermentacin han sido previamente
seleccionados tras someter el material gentico a los agentes mutagnicos fsicos
o qumicos ( Ikram - ul et al , 2003, 2004 , 2005;.. Parekh et al , 2000; Rohr et
al,1983). En la presente investigacin, se hicieron retos para elevar la potencia de
Aspergillus niger UMIP 2.564,04, una cepa fngica aislada recientemente, para la
produccin de cido ctrico por mutagnesis aleatoria usando diferentes dosis de
los agentes de la irradiacin UV y mutagenizante qumico. Para ms reduccin de
costes, la capacidad de la cepa mutagenizada fue seleccionada para utilizar agro-
subproductos industriales como tambin se examin fuentes de carbono y
nitrgeno.

MTODOS
MICROORGANISMO
El hongo de tipo salvaje utilizada en este estudio es una nueva cepa de A. niger
aislada de una muestra de suelo egipcio y fue depositada en el Instituto Pasteur
(Hongos Culture Collection) Pars, Francia, con el cdigo UMIP 2.564,04.
MEDIOS
Todos los medios se esterilizaron en autoclave a 121 C durante 15 min y se ajust
el pH antes de la esterilizacin. Se emplearon los siguientes medios de cultivo (g/l)
a lo largo del trabajo.
Dextrosa agar de Sabouraud (SDA) para los cultivos y placa inclinados.
Peptona Micolgica, 10.0; Glucosa, 40.0; Agar, 15.0; Ph (5.6 +- 0.2).
Medio de fermentacin para la produccin basal de cido ctrico (Khan et
al.,1970)
Sacarosa, 160.0; NaNO3, 4.0; KH2PO4, 1.0; MgSO4-7H20, 0.23; ZnSO4, 0.0012;
MnCl2-H2O, 0.0012; Ph (4+-0.2).
Para la reduccin de costes del medio de fermentacin, la sacarosa fue sustituida
por melaza de remolacha sin tratar y pre tratadas.
Un tratamiento fsico se lleva a cabo por centrifugacin repetida de solucin bruta
sencilla diluida de melaza de remolacha a 4000 rpm hasta que la eliminacin
completa de precipitados lodosos.
Los tratamientos qumicos incluyen ferrocianuro potsico (El- Abyad et al., 1992),
cido sulfrico (Mayilvahanan et al.,1996), fosfato de calcio (Mayilvahanan et al.,
1996), fitato de sodio (Wang, 1998) y metanol (El- Abyadet al., 1992)
 Preparacin de suspensiones de esporas
Las suspensiones de esporas de cepas de hongos se prepararon mediante el
lavado de tubos inclinados de cultivo de 5 das de edad con solucin salina
esterilizada (0,9 % NaCl) con agitacin vigorosamente durante 1 min. Las esporas
se contaron mediante un hemocitmetro para ajustar el recuento a
aproximadamente 107 esporas/ml.
INDUCCIN DE LA MUTACIN
Una suspensin de esporas se prepar a partir de una inclinacin 24 h de edad
cultivo de A. niger (tipo salvaje) suspendiendo en agua salina estril. Una30 W
Perkin Elmer lmpara UV (tipo G10T5-1 / 2L) se utiliz como la fuente de radiacin.
Se aplic mutagnesis ultravioleta como se describe por Ikram -ul et al. (2004), con
tiempos de exposicin de 12, 18 y 24 min. Siguiendo el mtodo de Roy y Das (1977),
mutagnesis qumica se llev a cabo mediante el uso de etil metano sulfonato
(EMS) y naranja de acridina (AO ), cada uno disuelto en tampn de fosfato, pH 7,
con una concentracin de 50 g/ml. En todos los casos, se seleccionaron derivados
mutantes basados en variaciones en la morfologa de la colonia o la esporulacin
en SDA. Colonias mutantes purificadas fueron seleccionadas para la produccin de
cido ctrico en cultivos lquidos.
CULTIVOS DISCONTINUOS
El hongo se dej crecer en alcuotas de 100 ml del medio de fermentacin
dispensada en 250 ml Erlenmeyer Xasks. Cada Xask se inocul con 1 % (v/v) de
inculo que contiene 107 esporas / ml. Los cultivos se incubaron a continuacin a
30+-1 C en condiciones de sacudidas a 300 rpm durante el tiempo requerido. La
biomasa se aisl por centrifugacin a 5000 rpm durante 10 min utilizando centrfuga
rotor libre y las sobrenadantes se separaron para los anlisis necesarios.
Cada tratamiento se realiz por triplicado y los resultados que se muestran son las
medias aritmticas.
PROCEDIMIENTOS ANALITICOS
Los elementos de subproductos fueron estimados por el mtodo descrito por Piper
(1950), utilizando Perkin Elmer modelo 100 de los analistas de absorcin atmica.
Se determin la biomasa tal como se describe por Kirimura et al. (1988). El cido
ctrico, glucosa y fructosa se determinaron en filtrados de cultivo por un instrumento
Gilson HPLC equipado con un ndice de refraccin Detector (RID), la columna HPX-
87H Aminex (7,8 mm x 300, Bio- Rad, EE.UU.) para el anlisis de cido ctrico y la
columna Aminex HPX- 87P (7,8 mm x 300, Bio- Rad, EE.UU.) para el anlisis de la
glucosa y la fructosa. El eluyente utilizado para el anlisis fue de 0,01N de solucin
de cido sulfrico. Anlisis de HPLC se llevaron a cabo bajo las siguientes
condiciones de operacin: caudal de la bomba, 0,6 ml/min; temperatura de la
columna, 40 C y la cantidad de la muestra, 20 l. Las concentraciones se calcularon
automticamente por el software Gilson Unipoint. La concentracin de sacarosa se
calcul como la suma de las concentraciones de glucosa y fructosa.

Rendimiento de cido ctrico (%) = (gramos de cido ctrico producido / gramos de

azcar original) x 100.

RESULTADOS
Mutagnesis y cribado para la hiperproduccin de cido ctrico

En un experimento de seleccin, la cultura parental de A. niger y sus derivados

mutantes fueron cultivadas en el medio de fermentacin basal durante 8 das y se
compar con respecto al rendimiento de cido ctrico y la produccin de biomasa.
Como se muestra en la Fig. 1, la mayora de los mutantes derivados, especialmente
los inducidos por UV, se han mejorado con respecto a la produccin de cido.
Mutantes W1, W4, W5, W6, W8 y W9 mostr cido ctrico marcado exceso de
produccin de registros. Entre ellos, el rendimiento mximo del producto se
consigui mediante el mutante W5 (60,25%) con aumento de aproximadamente 3,2
veces en comparacin con el tipo salvaje. Curiosamente, la cultura W5 dio lugar a
la produccin de biomasa ms bajo. Se obtiene este mutante a travs del
tratamiento ultravioleta, a una distancia de 20 cm, por 18 min. Cinco cultivos
sucesivos de este mutante en placas de SDA se examinaron adicionalmente bajo la
misma fermentacin condiciones. Todos los cultivos se mostraron casi la misma
concentracin de cido ctrico, as como los registros de produccin de biomasa que
indica la estabilidad del genotipo mutagenizada.

Tiempo de estudio de la fermentacin del cido ctrico

La evolucin temporal de crecimiento, la utilizacin de azcar y fermentacin de
cido ctrico por el mutante seleccionado W5 y su parental de tipo salvaje fueron
investigados en cultivos discontinuos. Cada cultivo se termina por separado, como
el consumo completo del azcar se llev a cabo. La germinacin de conidias de W5
se observ 9 h despus de la inoculacin.
Hinchazn de los pequeos aglomerados de hifas se detect microscpicamente
despus de la WRST 40 h de incubacin Ocho horas ms tarde, el hongo estaba
presente en la forma de sedimentos miceliales esfricas que mejoran el rendimiento
del proceso de produccin de cido (Haq et al, 2001; Pera y Callieri, 1997). En el
caso de la cultivo de la cepa parental, los pellets se desarrollaron despus de
hongos 64 h. Perodos de incubacin ms largos mostraron una ligera creciente en
los dimetros de los grnulos.

Fig.1. Produccin de cido ctrico y la formacin de biomasa por cepa parental A.

niger, y los genotipos (W1-W15) mutagenizado mediante UV (radiacin ultravioleta),
EMS (metanosulfonato de etilo) y AO (naranja de acridina).

Como se muestra en la Fig. 2, la formacin de biomasa en la cultura mutante era

relativamente ms rpido dentro de los WRST 4 das. Sin embargo, el extremo de
peso seco de micelio de la cepa mutante era ligeramente menor que la biomasa
cosechada de la cultura de los padres. El mutante empez a producir cido ctrico
a 32 h, mientras que la cepa parental comenz 16 horas despus. Al final de la
fermentacin de ejecucin de la cultura mutante (152 h), las concentraciones de
cido ctrico y de biomasa registrados fueron de aproximadamente 24 y 96,3 g/l,
respectivamente, con el consumo de azcar 100 %.
Esta cantidad de cido ctrico representa aproximadamente un aumento de 5,9
veces en comparacin con la cantidad producida por la cultura de tipo salvaje dentro
del mismo perodo de incubacin. El consumo total de sacarosa por la cepa parental
requiere casi 9 das y el resultado de la biomasa y las concentraciones de cido
ctrico fueron 32,2 y 30,12 g/l, respectivamente.
En consecuencia, el extremo de peso seco de micelio de la cepa mutante represent
aproximadamente el 75 % de la biomasa cosechada de la cultura parental.
Los trminos de los parmetros cinticos para los procesos de fermentacin por
lotes, determinada despus de PIRT (1975) se presentan en la Tabla 1 , la mutacin
duplic la tasa de captacin de sustrato especfico y aument notablemente la
produccin de cido ctrico especfico por biomasa. El mutante A. niger
seleccionada logra 4.5- y las mejoras en la productividad de cido ctrico y la
productividad especfica de 7,5 veces, respectivamente.

Fig.2. Evolucin temporal de consumo de azcar (), la produccin de cido ctrico ()

y la formacin de biomasa ( ) por cepa parental A. niger (abierto) y W5 (slido).
 Cintica de consumo de sustrato.
tasa de captacin de sustrato (sustrato g/l/h)
ndice de absorcin especfica (g sustrato sustrato clulas / g / l / h )

coeficientes de rendimiento del producto

coeficiente de rendimiento del producto (g de producto / sustrato g)
coeficiente de rendimiento de productos especficos (g clulas producto / g)

Cintica de la formacin de cido ctrico

Productividad (g de producto / l / h)
productividad especfica (g clulas producto / g/h)

Los cultivos de la cepa madre y W5 se terminaron despus de 212 y 152 horas,

respectivamente, ya que el consumo total de azcar se llev a cabo.

La utilizacin de agro - subproductos industriales para la produccin de

cido ctrico por A. niger W5

En un intento por economizar los componentes de fermentacin, la sacarosa en el

medio basal fue reemplazada por concentraciones equivalentes de carbono de
melaza de remolacha cruda, melaza de caa, hojas de maz, mazorcas de maz,
cscaras de limn, cscara de arroz, semillas de palma, paja de trigo y cscaras de
mango, una a la vez. Todos los cultivos se agitaron durante 152 h. Como se muestra
en la Fig. 3, la remolacha y la melaza de caa dieron los rendimientos ms altos de
cido ctrico (61,44 % y 57 %, respectivamente) que son comparables a la sacarosa
resultado del cultivo (60,52 %)

Los efectos de algunos pre- tratamientos fsicos y qumicos de remolacha y de caa

de melaza, son sustratos para la produccin de cido ctrico como se investig. Pre-
tratados de melaza de remolacha mostraron concentraciones de cido ctrico en un
rango de 99,5 hasta 113,5 g/l, mientras que los de la melaza de caa registraron
92,5 a 98,08 g/l (Tabla 2). Se logr un rendimiento ms alto de cido ctrico (70,94%)
por melaza de remolacha tratado con fosfato de calcio 10 g / l.
Entre todas las culturas examinadas, las variaciones en la formacin de la biomasa
eran relativamente ligeros.
Diferentes concentraciones de fosfato de calcio (5 a 20 g/l) se examinaron para pre-
tratamiento de la melaza de remolacha usado para la fermentacin del cido ctrico
por W5. Los registros de rendimiento del producto variaron de 67,81 % a 73,19 %
con el resultado ptimo en la concentracin de fosfato de calcio de 15 g/l (Fig.4).
Por otra parte, la formacin de la biomasa fngica no fue casi afectado.
El anlisis qumico de fosfato tratado, melaza de remolacha sin tratar y de calcio
mostr que los tratamientos resultaron en disminuciones marcadas en un grupo de
metales pesados (Tabla 3). Por ejemplo, el tratamiento con fosfato de calcio 10%
elimina aproximadamente 65,8%, 55,9% y 53,8% de Cu, Zn y Si, respectivamente.
Adems se logr la eliminacin de estos metales mediante el aumento de la
concentracin de fosfato de calcio de hasta 15 g/l.
Adems de los metales pesados, las concentraciones de otros elementos tal como
K y Mg tambin estn claramente reducidos como consecuencia de estos
tratamientos.

Para una mayor reduccin de coste del medio de fermentacin, nitrato de sodio en
el medio de fermentacin tambin se sustituy por concentraciones equivalentes de
nitrgeno de diferentes subproductos a saber; licor de maz, arroz empinada licor y
queso de suero, de una en una. Los rendimientos de cido ctrico obtenidos por
todas las culturas estaban muy cerca (73,21-74,56%) con licor de maz fermentado
en la parte superior. Estos resultados sugieren que el nitrato de sodio se podra
sustituir con xito por cualquiera de las tres fuentes de nitrgeno alternativos
examinados.
 DISCUSIN
Descripcin cuantitativa de los procesos celulares vitales es una herramienta en el
diseo de los procesos de fermentacin. Los dos ms importantes parmetros
cuantitativos, el rendimiento y la productividad, especifican cmo las clulas
convierten el sustrato en producto (Nielsen, 2004). Aqu, un mutante A. niger estable
UV, W5, logra plegado considerables aumentos en la tasa de absorcin del sustrato,
la tasa de captacin de sustrato especfico, coeficiente de rendimiento del producto,
coeficiente de rendimiento del producto especfico, la productividad, as como la
productividad especfica. Entre todos los genotipos examinados, este mutante dio
como resultado la produccin de biomasa ms bajo y acorta drsticamente el
periodo de consumo de sustrato.
En comparacin con algn otro tipo silvestre o cultivos de hongos mutados, W5
mostr registros de coeficiente de rendimiento de productos especficos (clulas
4.010 g de producto/g) y la productividad de cido ctrico (0,630 g de producto/ l/h)
(mejor Ikram ul - et al., 2004; Parvez et al., 1998; Kirimura et al., 1992; Bennet y
Klich,1992; Snedecor y Cochran, 1980).
Puesto que el cido ctrico es un producto intermedio del metabolismo de energa,
un fondo gentico mutagenizada como W5, puede resultar en desequilibrio
metablico que conduce a la acumulacin de cido ctrico a causa de la formacin
de la biomasa. Una posible explicacin es la presencia de los niveles de actividad
de la aconitasa ms bajos en tales tipos de clulas mutagenizada (Shoukat et al.,
1997) lo que conduce a menores tasas anormales de consumo de citrato.
Economa de fermentacin son impulsados por la rentabilidad de un producto
comercializado. Un componente clave de este valor se basa en la fabricacin de
coste por unidad de producto (Parekh, 1999).
Para la reduccin del coste medio de fermentacin, lo que equivale concentraciones
de melaza de remolacha y licor de maz fermentado se utilizaron con xito como
sustituyentes de carbono y fuentes de nitrgeno basal en el medio de fermentacin,
respectivamente.
Pre-tratamiento de la melaza de remolacha con fosfato de calcio reduce
drsticamente la concentracin de una serie de iones de metales pesados que
pueden retardar la utilizacin de melaza o afectar a la formacin de cido ctrico por
las clulas fngicas. Estos resultados estn posiblemente atribuirse a la presencia
de dos grupos fosfato rico con tomos de oxgeno cargados negativamente en
fosfato de calcio que actan como atrayentes para los elementos con carga positiva
presente en la melaza de remolacha crudo (Roukas y Kotzekidou, 1997;.
Mayilvahanan et al, 1996). Adems, el maz no tratado licor de maceracin
representa un sustrato favorable para el ajuste de equilibrio de metales traza en el
caldo de fermentacin debido a la presencia de fitato que tiene 12 protones
intercambiables en la molcula ftico (Wang, 1998).