CUESTIONARIO PRCTICA 5.

1. Cul es la funcin del gel apilador y del gel separador en una

electroforesis en gel discontinua? Explica la funcin de ambos
geles en base a sus caractersticas fsico-qumicas (consultar
Anexo 1).
El gel separador, muy resistente y rigido, es el encargado de separar las proteinas. Para
ello, posee mayor concentracion de Acrilamida (10%) y pH mas basico ( 8,3) que el gel
apilador que posee baja concentracion de acrilamida (4%) en tampon ligeramente acido
(Tris/HCl 1M pH 6,8) y ofrece poca resistencia a la mezcla de proteinas sometidas a
electroforesis por tanto lo atraviesan con relativa rapidez. Una vez preparado y polimerizado
el gel separador, se prepara, en la parte superior de este el gel de apilamiento. Bajo la accion
del campo electrico, la mezcla proteica, colocada sobre el gel de apilamiento, comienza a
migrar hacia el polo positivo.

2. En base a la informacin del Anexo 4, explica la relacin entre

los parmetros electroforticos voltaje y corriente. En una
electroforesis a voltaje constante, de qu forma evoluciona el
amperaje y la velocidad de las protenas? En una electroforesis
a amperaje constante, de qu forma evoluciona el voltaje y la
velocidad de las protenas?

3. Qu tipo de interacciones moleculares definen la estructura

terciaria de las protenas y de qu manera quedan afectadas por
el SDS y por el - mercaptoetanol?

Las fuerzas que estabilizan la estructura terciaria de una protena se establecen entre las
distintas cadenas laterales de los AA que la componen. Los enlaces propios de la
estructura terciaria pueden ser de dos tipos: covalentes y no covalentes. Los enlaces
covalentes pueden deberse a la formacin de un puente disulfuro entre dos cadenas i
los enlaces no covalentes pueden ser de cuatro tipos: fuerzas electrostticas entre
cadenas laterales ionizadas, con cargas de signo opuesto, puentes de hidrgeno, entre
las cadenas laterales de AA polares interacciones hidrofbicas entre cadenas laterales
apolares y fuerzas de polaridad debidas a interacciones dipolo-dipolo. El SDS y por el
- mercaptoetanol se encarga de romper estos puentes disulfuro que mantienen la
estructura terciaria compacta, permitiendo asi, poder detectar la cantidad de
aminocidos que componen esa protena.
 4. Discute la sensibilidad y el lmite de deteccin del Azul de
Coomassie como colorante de protenas. Es la tincin de
Coomassie un mtodo cuantitativo?

El azul de Coomassie es un colorante de proteinas ideal para una situacion donde la cantidad
proteica es alta. A travs de un medio cido se genera Coomassie y las protenas
,gracias a los grupos amino, una atraccin de tipo Van Der walls ,generando un
complejo. La unin tinte-protena es reversible y el limite de deteccin del azul de
Coomassie es de 50ng de protenas por banda. La tincin de Coomassie no es un
mtodo cuantitativo ya que el resultado que se extrae de la coloracion no es numrico,
sino que se trata de una imagen con bandas que nos permite sacar conclusiones de
tipo cualitativo.

5. Cul es la funcin del actico y del metanol durante la

tincin/destincin de los geles?

La funcin de ambos cidos es de destincin del colorante de Coomasie

sobrante en los geles (el que no ha sido absorbido por las protenas)

6. Discute los patrones de bandas de los extractos proteicos

obtenidos por distintos mtodos de lisis celular en la prctica 4.
Son similares entre s? Por qu? Crees que la cuantificacin de
protenas realizada en la prctica 4 es una manera eficiente de
normalizar la cantidad de protena cargada en un gel?

7. Cmo explicas la complejidad de bandas obtenidas en los

extractos de la prctica 4 en comparacin con el patrn de
bandas obtenidos en las muestras de BSA?

8. Cul es el peso molecular de las protenas I-III del Anexo 2?

9. En base a la informacin de secuencia del Anexo 5, calcula de
forma terica el peso molecular (en KDa) y el punto isoelctrico de
las isoformas LDH-M y H.
10. Cul es el peso molecular de la BSA y de las LDH de msculo y
de corazn calculado de forma experimental en los geles SDS-PAGE?
Coincide con el peso molecular terico?