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ESTUDIO DE BACTERIAS

OBJETIVOS

Adquirir habilidad en la utilizacin de los distintos mtodos de


observacin de las bacterias.

Conocer las distintas formas de accin de los colorantes de acuerdo a


su carcter qumico.

Observar e identificar las diferentes formas bacterianas utilizando


tcnicas sencillas de coloracin, y aprender a distinguir los distintos
tipos de agrupaciones bacterianas.

INTRODUCCIN

Las bacterias son los organismos ms abundantes del mundo, que no


pueden ser observados a simple vista. Estos organismos procariotas
unicelulares, cuyo tamao vara entre 0,2 m y 50 m, son notables por
carecer de ncleo. Las bacterias pueden causar enfermedades y problemas
de salud en las personas, animales y plantas; sin embargo, un pequeo
grupo de bacterias juegan un papel importante en la biosfera, interactuando
con muchos otros organismos vivientes. Algunas desempean funciones en
el ciclo de nutrientes como el nitrgeno, azufre y carbono; otras atrapan
energa del sol o de sustancias inorgnicas; y algunas otras ayudan a
animales en la digestin de sus alimentos.

Casi todas las clases de bacterias poseen una capa protectora resistente
llamada pared celular, esta le da su forma y le permite vivir en una amplia
gama de ambientes. La pared celular da a la bacteria su forma, algunas
especies estn adems rodeadas por una cpsula, esta hace a la clula
resistente a los productos qumicos destructivos. Todas las bacterias tienen
una membrana celular dentro de la pared celular. Las pequeas molculas
de alimento se incorporan a la clula a travs de poros de esta membrana,
pero las molculas grandes no la pueden atravesar. Como todas las clulas,
estas contienen ADN que controla el crecimiento de la clula, la
reproduccin, y el resto de las actividades.

Los cientficos dividen a las bacterias en grupos segn su forma: Los cocos,
que son clulas esfricas que se pueden agrupar en parejas (diplococos),
racimos (estafilococos), cadenas (estreptococos), de cuatro (ttradas) o en
cubos (sarcinas). Los bacilos son clulas en forma de bastn que pueden
presentarse individualmente, en cadenas o en palizadas. Y las espiroquetas
son clulas que presentan forma helicoidal y generalmente no se agrupan.

Debido a que las bacterias tienen un tamao muy pequeo, se requiere de


tinciones especiales para el estudio y visualizacin de algunas partes de su
estructura interna y funciones biolgicas. En 1884 Hans Christian Gram,
desarrollo un procedimiento de alta tecnologa para la observacin y estudio
de bacterias. La coloracin de Gram que separa las bacterias en dos grupos
diferentes: Gram-Positivas y Gram-Negativas. Esta tcnica es importante en
la determinacin e identificacin de bacterias en una muestra desconocida.

El estudio microscpico de la clula bacteriana es el primer paso para la


identificacin y clasificacin de un gnero bacteriano por tanto es de gran
ayuda en la investigacin de los mismos. Su observacin al microscopio nos
permite diferenciar formas tpicas como cocos, bacilos y espirales.

Este estudio se puede realizar mediante los siguientes mtodos:

Preparaciones no coloreadas (examen en fresco): Con este mtodo se


observan las bacterias vivas, lo cual hace que podamos detectar con
facilidad la movilidad en las que la poseen y su forma. En estos
montajes muchas veces no se aprecian muy bien las clulas, debido a
la falta de contraste, por lo que es necesario realizar tinciones
especiales.

Preparaciones coloreadas (frotis teido): Como las bacterias son


incoloras, es necesario utilizar colorantes para poderlas visualizar. Los
mtodos para observar bacterias, logra un contraste entre la bacteria y
el medio que la rodea, permitiendo diferenciar los tipos morfolgicos
bacterianos; as como una visualizacin de las estructuras internas y
externas: esporas, nucleoide, grnulos citoplasmticos, pared celular,
capsulas y flagelos.

Las tinciones son tcnicas que permiten observar microorganismos en


funcin de la capacidad de los mismos para retener (o no) determinadas
sustancias colorantes, lo cual depende de la carga de la clula y la carga del
colorante. Los mtodos de tincin utilizados pueden ser simples (un solo
colorante), diferenciales (varios colorantes) o selectivos (cuando ciertas
estructuras se tien selectivamente con ciertos colorantes).
Coloracin simple. Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho
de que las clulas tienen una composicin qumica diferente a la de su
entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a
un colorante. El colorante tie las clulas (Azul de metileno, Safranina)
o no (Nigrosina).

Coloracin diferencial. Se basan en el hecho de que distintos tipos de


clulas tienen distinta composicin qumica, y por lo tanto reaccionan
de forma diferente frente a una tincin, lo que permite clasificar los
microorganismos en distintos grupos, segn su capacidad de tincin.
Estas tinciones utilizan ms de un colorante, por ejemplo tincin de
Gram.

Coloracin selectivas. Se basan en el hecho de que distintas


estructuras celulares tienen distinta composicin qumica, de modo
que se tien selectivamente con ciertos colorantes. Es el caso de tincin
de esporas, flagelos, paredes celulares, corpsculos metacromticos.

MATERIALES Y REACTIVOS

Portaobjetos y cubreobjetos Cultivos bacterianos


Frasco lavador Solucin de lugol al 1%
Puentes de coloracin Azul de metileno al 1%
Mechero de alcohol Agua destilada
Asas bacteriolgica Metanol
Mecheros Solucin salina isitnica
Aceite de inmersin Colorantes (cidos y bsicos)
Papel absorbente Microscopios
Muestras bacterianas de origen Nigrosina
natural: sarro dental, yogur, vinagre,
suelo, etc.
PROCEDIMIENTO

ACTIVIDAD 7-1.
Preparaciones no coloreadas (preparacin en fresco)

1. Cuando la muestra a analizar se encuentra en un medio lquido,


proceda as: Con el asa estril deposite una gota de cultivo bacteriano
en el centro de un portaobjeto limpio. Coloque un cubreobjetos sobre
la gota evitando la formacin de burbujas. Observe con objetivos de 10x
y 40x. Haga esquemas y describa lo observado.

2. Si la muestra a analizar se encuentra en un medio slido se debe


proceder de la siguiente forma: Coloque una gota de solucin salina
sobre un portaobjeto, toque con el asa una colonia de cultivo y haga
con esta muestra una emulsin en la gota. Cubra la preparacin con el
cubreobjetos. Observe al microscopio. Haga esquemas y describa lo
observado.

ACTIVIDAD 7-2.
Preparaciones coloreadas

7.2.1. Coloracin con colorantes bsicos (coloracin simple). Los


colorantes bsicos ms empleados son: azul de metileno, cristal
violeta, safranina, fascina y verde malaquita.

PROCEDIMIENTO.

1. Coloque la muestra de cultivo en el portaobjeto procediendo de


acuerdo al tipo de muestra que posea (lquida o slida).

2. Extienda la gota sobre el portaobjeto formando una pelcula fina


(casi transparente).

3. Seque la preparacin, psela rpidamente sobre la llama de un


mechero. (Evite un excesivo calentamiento). Despus de este
procedimiento las bacterias quedan fijas y listas para la tincin.

Tincin simple con azul de metileno (tincin positiva). Permite


teir el interior celular de microorganismos procariticos (vivos o
muertos); los eucariticos slo se tien si estn muertos. Algunas
estructuras, como los corpsculos metacromticos, se tien ms
intensamente con este colorante que el resto de la clula.

4. Coloque los portaobjetos con las muestras fijadas sobre un


puente de coloracin.

5. Cubra el extendido con una pequea cantidad de azul de


metileno y djelo actuar por 2 minutos.

6. Lave con agua hasta eliminar el exceso de colorante, y seque la


preparacin al aire libre.

7. Examine las preparaciones teidas al microscopio con el


objetivo de inmersin. Haga esquemas y describa lo observado.

7.2.2. Coloracin con colorantes cidos (tincin negativa).

Tincin simple con nigrosina. La nigrosina es uno de los


colorantes cidos ms utilizados, la cual no tie directamente la
clula sino que se deposita alrededor de ella facilitando as su
observacin al microscopio.Se trata de un colorante aninico,
proporciona una visin de la forma y el tamao celulares al
observarse los microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro.

PROCEDIMIENTO.

1. Limpie un portaobjetos con alcohol y gasa para liberarlo de


grasa; y coloque una gota de nigrosina sobre el extremo del
portaobjeto.

2. Mezcle dos asadas de cultivo bacteriano con la gota de


nigrosina, sin extender la muestra.

3. Con el borde de otro portaobjeto, extienda la gota suavemente


hasta el otro extremo del portaobjeto. Deje secar el extendido al
aire libre.

4. Observe al microscopio con el objetivo de inmersin. Haga


esquemas y describa lo observado.
ACTIVIDAD 10-3.
Observacin de bacterias del yogur

El yogur es un producto lcteo producido por la fermentacin natural de la


leche. A escala industrial se realiza la fermentacin aadiendo a la leche
dosis del 3-4% de una asociacin de dos cepas bacterianas: Streptococcus
termophilus, poco productor de cido, pero muy aromtico, y el Lactobacillus
bulgaricus, muy acidificante. En esta preparacin se podrn, por tanto,
observar dos morfologas bacterianas distintas (cocos y bacilos) y un tipo de
agrupacin (estreptococos). Adems, el tamao del lactobacilo (30m de
longitud) facilita la observacin aunque no se tenga mucha prctica con el
enfoque del microscopio.

PROCEDIMIENTO.

1. Realizar el frotis disolviendo una mnima porcin de yogur en una


pequea gota de agua; fijar con metanol para eliminar parte de la
grasa.

2. Teir con azul de metileno durante 1-2 minutos.

3. Observar al mximo aumento del microscopio. Dibuje sus


observaciones.

ACTIVIDAD 7-4.
Observacin de bacterias del vinagre

El vinagre es una solucin acuosa rica en cido actico resultante de la


fermentacin espontnea del vino o de bebidas alcohlicas de baja
graduacin. La acetificacin del vino es producida por bacterias aerbicas
del cido actico, principalmente Acetobacter aceti, aunque tambin
Gluconobacter. Se trata de bacilos rectos con flagelos polares.

PROCEDIMIENTO.

1. Tomar con una aguja enmangada una pequea porcin madre de


vinagre natural o de la telilla que se forma sobre la superficie de los
vinos agriado.
2. Extender la muestra en el portaobjetos con una gota de agua y hacer
el frotis. Dejar secar y fijar con calor.

4. Teir durante 2-3 minutos con azul de metileno lavar el exceso de


colorante y secar.

5. Observe al microscopio con mayor aumento. Anote sus


observaciones.

ACTIVIDAD 7-5.
Observacin de bacterias del sarro dental

El sarro dental es un depsito consistente y adherente localizado sobre el


esmalte de los dientes. Est constituido principalmente por restos proteicos,
sales minerales y bacterias junto con sus productos metablicos. La flora
bacteriana de la cavidad bucal es muy variable dependiendo de las
condiciones que se den en el momento de hacer la preparacin, pero suelen
abundar bacterias saprfitas, pudindose observar gran variedad de
morfologas: espiroquetas, cocobacilos, diplococos y bacilos.

PROCEDIMIENTO.

1. Con una aguja enmangada tomar una pequea porcin de sarro


dental y disolverla en una gota de agua sobre el portaobjetos.

2. Dejar secar y fijar con calor.

3. Teir durante 2-3 minutos con azul de metileno, lavar el exceso


de colorante y secar.

4. Observe al microscopio. Describa sus observaciones.


PREGUNTAS DE ACTIVIDAD COMPLEMENTARIA

1. Qu tipos de morfologa y agrupacin aparecen en los frotis de los


cultivos?
2. Qu fin tiene la fijacin de muestras al realizar un frotis bacteriano?
3. Seale las ventajas y desventajas de la tincin simple respecto del
examen en fresco.
4. Qu tcnicas se pueden emplear para tincin de flajelos, esporas y
capsulas bacterianas?, explique el fundamento de cada tcnica usada.
5. Investiga acerca de los colorantes catinicos, aninicos y liposolubles.
De ejemplos de cada uno.
6. En general, en qu consiste la fermentacin? , A cuales de los grupos
taxonmicos estudiados en esta prctica pertenecen los
microorganismos que intervienen ms comnmente en la
fermentacin?, cite algunos ejemplos.
7. Mencione algunos procesos industriales que se realizan basados en la
fermentacin.

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