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Abstract

This assay was carried out to extract bixine, a colorant attached to achiote
seeds, widely used in food industry, by a method which may offer besides good
yields, a toxin free product. The process is based on the use of cellulolytic
microorganisms able to degrade the seeds cellular wall, where the pigment is
attached, in order to facilitate the pigments liberation in a watery medium. 81% of
the pigment was recovered, this percentage is higher than the one offered by the
aqueous treatment and lower than the one offered by the acid-basic procedure, not
well accepted by the European community. The final paste obtained showed peaks
near to 1600 cm-1 representative of the carbonyl groups characteristic of the bixine
structure.
Key words: Bixine, achiote, cellulolytic microorganisms

Introduccin

El color de los alimentos es un atributo que tiene mucho peso dentro del
juicio del consumidor, este puede llegar a ser determinante para que un comestible
sea aceptado o rechazado. (Badui, 1993). La industria alimentaria utiliza una serie
de sustancias , mejor conocidas como aditivos; que tienen como funcin primordial
impartir alguna coloracin en particular o simplemente resaltar la que por la
naturaleza tienen las materias primas o, en su caso, de los procesos tecnolgicos
en la coloracin del producto final.
Los aditivos que son utilizados como sustancias colorantes pueden ser
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1 Universidad Autnoma Agraria Antonio Narro, 2 Universidad Autnoma de Coahuila

obtenidos
por sntesis qumica en la industria (colorantes sintticos) o provenir de fuentes
naturales como los vegetales (colorantes o pigmentos naturales). En los ltimos
tiempos los colorantes sintticos han sido cuestionados debido a sus efectos
toxicolgicos, inclusive algunos han sido eliminados de algunas legislaciones. Lo
anterior aunado a la tendencia que tienen los consumidores, sobre todo en los
pases desarrollados, a consumir alimentos con un mnimo o nulo contenido de
sustancias sintticas; ello ha provocado que el uso de colorantes naturales vaya
en aumento y sustituyendo a los sintticos (Salas, 2003).
Para abastecer la creciente demanda de colorantes naturales sin problemas
de legislacin, se procede a la extraccin de los pigmentos presentes en los
tejidos vegetales o animales por medio de diferentes mtodos, cada uno presenta
sus limitantes y ventajas.
El colorante obtenido de las semillas de achiote (Bixa orellana), esta
compuesto en su mayora por el carotenoide bixina, que se utiliza en la industria
lctica, crnica, condimentara, cosmtica, farmacutica, etc.; es un colorante
natural exento de certificacin. La extraccin ms rudimentaria se basa en un
lavado con agua en ebullicin y a escala industrial se ha implementado un proceso
de extraccin alcalino que es de fcil aplicacin, pero que tiene el inconveniente
de que el producto final contiene al mximo 30 a 40% de pigmentos (Vzquez,
2001).

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Las posibilidades de incrementar el rendimiento y la pureza del colorante
obtenido del achiote siguen siendo tema de estudio, se debe buscar un mtodo de
extraccin de fcil aplicacin, que eleve el grado de rendimiento, dando como
resultado un extracto exento o con un mnimo de impurezas qumicas, que
disminuya los riesgos que implica al consumidor el uso de solventes o los
tratamientos cido alcalinos.

Metodologa experimental

Se trabaj con semillas enteras de achiote procedentes del estado de Chiapas,


adquiridas en un mercado del municipio de Acala. Las semillas fueron mantenidas en
envases plsticos y almacenados en condiciones de oscuridad.
Para los objetivos de la investigacin, se procedi a realizar anlisis de
ceniza, humedad, grasa, fibra cruda, celulosa, lignina y bixina. Todas las
determinaciones se realizaron en base a los mtodos establecidos por la AOAC en
1980, excepto las de celulosa, lignina, y fibra que se hicieron de acuerdo a
Vansoest, et al. (1968), y la de bixina se realiz de acuerdo a las normas oficiales
mexicanas.
Una vez efectuada la caracterizacin de la semilla se procedi a seleccionar e
identificar y seleccionar cepas fngicas con probada actividad celuloltica.
Se evaluaron 7 cepas, las cuales fueron proporcionadas por la Facultad de
Ciencias Qumicas de la Universidad Autnoma de Coahuila, en funcin a la produccin
de celulasas.
Los hongos fueron viabilizados en un medio lquido y posteriormente
inoculados en placas de agar carboximelticelulosa (CMC). Despus de 7 das de
incubacin a 28C se evalu su actividad sobre la celulosa aplicando la tcnica del
rojo congo de acuerdo con los lineamientos propuestos por Ilin (2002). De esta
etapa se logr seleccionar tres cepas para su posterior caracterizacin.

La caracterizacin de las cepas se realiz observando los microorganismos


tanto macroscpica como microscpicamente, mediante anlisis de morfologa,
esporulacin y asimilacin de nutrientes. Todos los anlisis fueron realizados de
acuerdo a los lineamientos propuestos por Barnett et al., (1987) y Romero (1993).
Una vez seleccionadas e identificadas las cepas fngicas se procedi a
establecer un proceso fermentativo aerbico en medio acuoso, el cual contena
0.6 g. de NaNO3, 0.1 g. de KH2PO4, 0.1 g. de MgSO4, 0.1 g de KCl y 0.02 g. de
K2SO4 y 2.0 g. de semillas de achiote, como nica fuente de carbono en 200 ml de
Buffer a pH de 5, 3 y 7 preparado de acuerdo a la tcnica propuesta por Lynch et
al (1987). Posteriormente se inocul cada unidad experimental con un inculo que
contena 2,000,000 de esporas/ml., y se mantuvo en baos Mara para el control
de la temperatura a 25, 30 y 35 C, durante 144 hrs. Durante este tiempo se
monitore la formacin de azcares totales y reductores, los primeros se
determinaron de acuerdo a los lineamientos propuestos por Dubois (1956) con
fenol sulfrico, los azcares reductores se analizaron de acuerdo con Miller
(1959).
Terminado el proceso de biocatlisis, cada sistema fue esterilizado en
autoclave, para detener el crecimiento y actividad fngica. Despus del proceso de

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esterilizacin se recuper el colorante mediante tratamientos en medio acuoso por
calentamiento, prensado y filtrado, hasta obtener la mayor cantidad de colorante
posible.
El material obtenido en las operaciones antes citadas, fue sometido a
un proceso final de evaporacin en horno a una temperatura entre 60-65C hasta
la eliminacin completa de la humedad residual. La determinacin del rendimiento
se realiz por anlisis gravimtrico.
Los datos arrojados por el anlisis gravimtrico fueron sometidos a un
anlisis de varianza factorial con p>0.05, esto, para determinar las condiciones
que ofrecen una mayor liberacin de colorante.
A fin de determinar la pureza del extracto recuperado, se procedi a aplicar
un anlisis por espectroscopia infrarroja (IR) a los extractos obtenidos, mediante la
preparacin de la pastilla de KBr con la muestra del colorante en polvo y se
analiza en un espectrofotmetro Perkin Elmer.

Resultados y discusin

Los resultados arrojados por el anlisis qumico efectuado a la semilla


muestran 1.4% de bixina, 1.61% de humedad, 9.74% de celulosa, 3.76% de
lignina, 16.9% de fibra cruda, 3.51% de cenizas y 4.52% de grasa, Se puede
observar que el menor componente de la semilla utilizada en la presente
investigacin fue el agua, esto se traduce en un elevado contenido de materia
seca que se caracteriza por su alto contenido en fibras, por lo cual la semilla pude
funcionar en el proceso de Biocatlisis como una fuente de carbono caracterizada
por fibras que pueden ser desdobladas por complejos enzimticos presentes en
organismos como los hongos.
Los resultados obtenidos aplicando la tcnica del rojo congo, para
seleccionar la cepa con mayor actividad celuloltica, fueron sometidos a un anlisis
de varianza con una p<0.05; esto con la finalidad de elegir con mayor seguridad
cual o cuales microorganismo son los que ms se adecuan a la investigacin. Los
resultados del anlisis se reportan en el cuadro nmero 1, como las medias
analizadas por la prueba de t-Student (p<0.05).

Cuadro 1. Resultados de rojo congo analizados mediante t-Student (p<0.05)

CEPA PROMEDIOS DE MNIMOS


CUADRADOS
Cepa 7 A 3,90 cm.
Cepa 5 B 3,40 cm.
Cepa 2 B C 3,23 cm.
Cepa 8 C D 3,10 cm.
Cepa 1 C D 3,05 cm.
Cepa 4 D 2,91 cm.
Cepa 3 E 2,63 cm.
Cepa 9 E 2,43 cm.

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El anlisis de medias permite concluir que la cepa con mayor produccin de
celulasas es la cepa 7, ya que en el anlisis estadstico fue la mejor, existiendo
diferencia significativa con el resto. Por otro lado, la cepa 5 y la cepa 2 resultaron
estadsticamente iguales, presentando menor actividad que la cepa 7, pero mayor
que el resto de las cepas.
Las cepas 7 y 5 fueron identificadas como genero Aspergillus ssp. y la 2
como una mezcla entre Aspergillus y Penicilium por lo cual solo las dos primeras
fueron probadas en el proceso de biocatlisis.
Finalmente fue posible establecer que las mejores condiciones para
degradar la pared celular de la semilla del achiote fue la interaccin presentada
entre la cepa 7 a pH 7 y temperatura de 35C, ya que as se manifest en el
monitoreo de azcares el cual mostraba constante formacin y consumo de los
mismos a diferencia de las dems interacciones.
En la figura 1 se pueden observar los pesos de pasta de achiote obtenidos
despus de terminado el tiempo en cada tratamiento. Se observa que la cepa 7
ofrece los mayores rendimientos bajo todas las condiciones de trabajo.

Figura 1. Pasta colorante obtenida para cada tratamiento.


De la misma manera que en el anlisis de varianza, se observa que la
interaccin que ofrece el mayor rendimiento es cepa 7, pH 7 y temperatura de
35C, presentando 1.2 g de extracto colorante, los cuales contienen 0.022 g de
bixina total obtenidos a partir de una muestra de 2 g; por lo que se espera que de
100 g de semilla se obtengan 1.13 g de bixina lo que representa el 80.7 % de
extraccin ya que la semilla contiene 1.4 g de bixina por 100 g de semilla como se
cit anteriormente.
En la figura 2 se muestra un espectro infrarrojo (IR) para la pasta colorante
recuperada, destacndose un pico sobresaliente cercano a 1600 cm -1, el cual es
105.2
100
715.39
1974.96
825.88
90
879.51

80 m 'b' esporas

70
2927.12
1266.98 772.05
%T
60
3271.00

1373.24
50 1598.96

40 74
30 1048.10

25.0
4000.0 3000 2000 1500 1000 600.0
cm-1
representativo de los grupos carbonilos, as como un pico en el intervalo de los
1700 a 1880 cm-1 aproximadamente, representativo de los dobles enlaces
presentes en las estructuras orgnicas, caractersticas de la bixina.
Figura 2 Espectro de Infrarrojo para pasta obtenida.

Conclusiones

En los resultados obtenidos se observ que el mayor constituyente de de la


semilla de achiote (Bixa orellana) son las fibras, a las cuales se encuentra
adherido el pigmento de inters.
De las cepas evaluadas, la que present mayor actividad celuloltca, de
acuerdo a la tcnica del rojo congo, fue la designada como 7, identificada como
Aspergillus, lo cual fue confirmado al monitorear la formacin y consumo de
azcares totales y reductores presentando un comportamiento tpico para este tipo
de hongos excretando la enzima al medio para obtener carbohidratos simples y
asimilarlos constantemente.
Fue posible establecer que las condiciones para el ptimo desarrollo
fngico, con su consecuente efectividad en la degradacin de la materia en
cuestin para facilitar la liberacin del pigmento, fueron de pH 7 y temperatura de
35C, para la cepa 7 identificada como Aspergillus spp. Antes citado.
Comparando los procesos usando las otras cepas estudiadas y sin inculo,
el tratamiento con Aspergillus result un 30% mas efectivo que los antes
mencionados.
Las condiciones antes citadas ofrecen un rendimiento de extraccin de
bixina de hasta un 80 % comparado a lo obtenido con agua, e inferior al reportado
utilizando los mtodos alcalinos, sin contener los residuos qumicos txicos que se
presentan en dicha extraccin, cuestionados recientemente por la unin Europea.

Literatura citada

AOAC. 1980. Oficial Methods of Anlisis of the Association of Official Alytical Chemists. Thirteenth
edition. 353 p.
Badui, D. S. 1993. Qumica de los alimentos. Addison Wesley Longman de Mxico, S. A. DE C. V.
Mxico D. F., Mxico.
Dubois, M., Guilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A. and Smith, F. 1956. Colorimetric meted for
determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 28:530.
Ilin A. 2002. Manual de Prcticas de crdito 1 Introduccin a la Biotecnologa U. A. de C. 38 p.
Lynch, M. J. R., S. S. Mellor, D. L. Spare, D. P. Inwood, H. M. J. 1987. Mtodos de Laboratorio. 2
ed. Vol 2. Ed. Nueva editorial interamericana. Mxico, D. F. pp. 1446-1447.
Salas, G. L. 2003. Educacin Alimentaria, manual indispensable en educacin para la salud. Ed.
Trillas. Mxico, D. F. pp. 97.
Vansoest, P. J. y Wine, R. H.1968. Determinacin de fibra por el mtodo cido detergente/
determinacin de lignina, celulosa y silicio por el mtodo de permanganato. J. Anal. Chem.
51: 780 p

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Vzquez, H. C. 2001. Estudio preliminar de la degradacin de bixina en polvo en los diferentes
tipos de empaques y temperaturas establecidas. Tesis ING. Instituto Tecnolgico de Villahermosa.
Villahermosa, Tabasco, Mxico.

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