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VacciMonitor 2013;22(2):30-39

www.finlay.sld.cu/vaccimonitor.htm

Estrategias de obtencin de protenas recombinantes en Escherichia


coli
Jos Garca,1* Zeila Santana,1 Lourdes Zumalacrregui,2 Marisel Quintana,1 Diamil Gonzlez,1 Gustavo Furrazola,1
Oscar Cruz1
1
Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa. Ave 31 e/ 158 y 190. La Habana, Cuba. CP 10600.
2
Facultad de Ingeniera Qumica Instituto Superior Politcnico Jos Antonio Echeverra. Calle 114 No 11901 entre Ciclova
y Rotonda. La Habana, Cuba. CP 19390.

email: jose.garcia@cigb.edu.cu

La expresin de protenas recombinantes se ha favorecido con el uso de Escherichia coli debido a su relativo bajo
costo, alta densidad de cultivo, su fcil manipulacin gentica y a las diversas herramientas biotecnolgicas
disponibles que son compatibles. En este artculo se presentan algunas estrategias para la expresin de
Escherichia coli; se destacan factores genticos y fisiolgicos que incluyen: nmero de copias del vector de
expresin, caractersticas del gen, estabilidad del cido ribonucleico mensajero, promotor empleado, cepa utilizada,
composicin del medio de cultivo, parmetros de operacin en el fermentador y tambin se abordan la conservacin
de cepas y la estrategia de cultivo y purificacin.

Palabras clave: protena recombinante, Escherichia coli, factores genticos, factores fisiolgicos, fermentacin.

Introduccin limitada. Pese a estas desventajas, numerosas protenas


complejas se obtienen en este hospedero con la actividad
La bacteria Escherichia coli (E. coli) es ampliamente utilizada
biolgica requerida para ser utilizadas (5).
en la industria biotecnolgica para la produccin de protenas
recombinantes con fines diagnsticos, teraputicos o
En las ltimas dcadas se han desarrollado cepas de E. coli
vacunales, por procedimientos relativamente baratos, ya que
modificadas genticamente para solucionar algunas de sus
ha sido muy bien caracterizada desde el punto de vista
desventajas. Entre ellas se encuentran varias cepas mutantes
gentico y fisiolgico (1). Es un bacilo corto gramnegativo
de los genes lonA y ompT, para disminuir la degradacin
que se localiza en las heces fecales; habita en el conducto
proteoltica de los productos recombinantes; tambin se han
intestinal normal del hombre y de los animales y en algunos
obtenido cepas deficientes, o bien de la tioredoxina reductasa
casos puede ocasionar enfermedades como: hepatitis,
(trxB), o de la glutatin reductasa (gor), o de ambas a la vez,
septicemia, cistitis y otras (2).
por lo cual en ellas se favorece la correcta formacin de
puentes disulfuro en el citoplasma. En otras cepas
Entre las ventajas que este microorganismo brinda como
desarrolladas pueden obtenerse protenas complejas, con
hospedero estn: mayor velocidad especfica de crecimiento
modificaciones postraduccionales propias de clulas
que las levaduras y clulas de mamferos; fcil manipulacin
eucariotas, como es el caso de las que portan el gen de la
gentica, no posee requerimientos costosos asociados a
tirosina kinasa para producir protenas fosforiladas por la
medios de cultivo o equipamiento a diferencia de las clulas
tirosina (6, 7).
de organismos superiores; existencia de gran variedad de
vectores de expresin estables, y ser un microorganismo
Para aprovechar las ventajas que ofrece el periplasma, en
aprobado por las entidades reguladoras para su utilizacin
comparacin con el citosol, para la expresin de protenas
como hospedero en la produccin de biofrmacos (3,4).
recombinantes se han desarrollado vectores plasmdicos en
los cuales es posible clonar los genes recombinantes
Es conocido que las proteasas producidas en el
fusionados a seales de secrecin que posibilitan el
microorganismo pueden destruir las protenas recombinantes
transporte de la protena de inters a este compartimento
obtenidas. Su empleo para producir protenas tiles en la
(8).
industria alimentaria no est permitido, segrega toxinas, por
lo que se considera un patgeno moderado; es incapaz de Expresin de protenas recombinantes en
realizar muchas de las modificaciones postraduccionales que
Escherichia coli
son comunes en protenas de origen eucariota; no es un
eficiente secretor de protenas al medio de cultivo, es una Entre los parmetros ms importantes en la produccin
fuente potencial de pirgenos y su habilidad para promover exitosa de protenas recombinantes en E. coli se encuentran:
la formacin correcta de numerosos puentes disulfuro es la eficiencia transcripcional y traduccional, la estabilidad del

* Ingeniero Qumico, Mster en Ciencias, Profesor Auxiliar, Investigador Auxiliar.

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vector de expresin y de los cidos ribonucleicos (ARN) hasta en un 50% del total de protena sintetizada. Esto puede
transcriptos, la estabilidad de las molculas ante el ambiente originar una terminacin prematura de la sntesis de la
proteoltico del hospedero y la localizacin y plegamiento de protena recombinante o alterar completamente la
la protena (3). Tambin es necesario hacer un estudio con informacin gentica (11).
diferentes cepas del organismo hospedero, con vistas a
seleccionar la ms adecuada para la expresin de la protena Otra caracterstica del gen heterlogo determinante de los
recombinante deseada, ya que estudios muestran que esta niveles de expresin es la presencia de estructuras
puede variar al usar una cepa determinada u otra (9). secundarias en el ARNm, que pueden afectar el inicio de la
transcripcin y de la traduccin al bloquear la unin de la
Con el objetivo de alcanzar altos niveles de expresin de la ARN polimerasa al promotor, o de las subunidades
protena de inters es necesario estudiar la influencia de ribosmicas al sitio de inicio de la traduccin, respectivamente
diferentes factores en el proceso de produccin, los cuales (13).
pueden agruparse en genticos y fisiolgicos.
Estabilidad del ARN mensajero (ARNm)
Factores genticos
Una vez sintetizado el ARNm correspondiente al gen de
Entre los factores genticos a considerar se encuentran: inters, la estabilidad del transcripto permite un control
nmero de copias del vector de expresin, caractersticas flexible y muy eficiente de los niveles de sntesis proteica.
del gen, estabilidad del cido ribonucleico mensajero (ARNm), Por lo general los ARNm bacterianos tienen una vida media
promotor empleado y cepa utilizada. corta. En clulas bacterianas que crecen y se dividen cada
20 o 30 min, algunos ARNm deben renovarse de 5 a 10 veces
Nmero de copias del vector de expresin o plasmidio en cada generacin. La vida media del ARNm est regulada
por el control del inicio de la transcripcin y la velocidad de
En la seleccin del sistema de expresin que permita obtener degradacin del mismo. La velocidad de degradacin de los
altos niveles de produccin de la protena recombinante, un ARNm provenientes de algunos genes heterlogos es muy
aspecto importante es el nmero de copias del vector dentro alta, siendo muy bajos o nulos los niveles de sntesis de las
de la cepa hospedera. El nmero de copias del plasmidio en protenas recombinantes (14).
E. coli puede variar desde 1 hasta 2 000 por clula, en
dependencia de su origen de replicacin en la bacteria. Tipo de promotor bajo el cual se encuentra situado
Generalmente la sntesis proteica aumenta linealmente con el gen de inters
el nmero de copias del plasmidio hasta aproximadamente
600 copias por clula (10). Este aumento depende de la El sistema de expresin es la unidad transcripcional que se
naturaleza de la protena y del ambiente celular, en el que se inserta en un vector de cido desoxirribonucleico (ADN)
incluye el balance de sntesis/degradacin que puede ser extracromosomal. Si el mismo es inducible, las clulas pueden
afectado por elevadas cargas gnicas del vector. crecer hasta altas densidades y obtener cantidades del
producto hasta de un 30% de la protena total de la clulas
Por otro lado, un alto nmero de copias incrementa las (15).
complicaciones relacionadas con la replicacin y expresin
intensivas como son las mutaciones, disminucin de la Algunos de los promotores ms empleados son:
estabilidad del vector, problemas con el control de la
regulacin del promotor y dificultades en la purificacin de la Promotor triptfano: Es el responsable de la transcripcin
protena de inters al incrementar tambin los niveles de de los genes trpE, D, C, B, A, los cuales codifican para las
protenas codificadas por otros genes plasmdicos, por enzimas que intervienen en la sntesis del triptfano. Se
ejemplo, genes de resistencia a antibiticos (11). reprime por la presencia de este aminocido en el medio
de cultivo y se induce por su ausencia o al aadir cido
Caractersticas del gen heterlogo 3-indolacrlico. Constituye un promotor fuerte y
ampliamente utilizado (16, 17).
Entre las caractersticas del gen heterlogo que pueden influir Promotor pL (Brazo izquierdo del fago lambda): Es inducible
en los niveles de expresin se menciona el uso de por cambios de temperatura, ya que existe un represor
determinados codones especficos en el gen que son poco termolbil que a temperaturas entre 28-30 C se une al
usados en E. coli, denominados codones raros. Se ha promotor impidiendo la transcripcin del gen. Su
observado que la presencia de estos, que codifican el utilizacin ha confrontado problemas en algunos
aminocido arginina en genes heterlogos, afectan hospederos, ya que ante un cambio sbito de
considerablemente los niveles de sntesis de la protena (12). temperatura, hasta aproximadamente 42 C, el represor
Adems, pueden existir determinados codones, sufre un cambio estructural que impide su unin al
fundamentalmente, los que codifican arginina y prolina, en promotor, permitiendo la transcripcin y la expresin de
los genes que favorecen el corrimiento del marco de lectura la protena de inters (18). Este sistema tiene dos
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desventajas fundamentales: la primera, es que solamente


puede ser empleado en cepas de E. coli que contengan Conservacin de cepas
en su genoma el gen que codifica para el represor cI 857
del fago lambda y, la segunda, es que al trabajar a los Bancos celulares / Sistema de lotes de semilla
niveles de temperatura de induccin es posible la
degradacin de la protena heterloga. Una de las Los bancos de clulas son elementos fundamentales en el
alternativas para disminuir el efecto de la primera desarrollo y produccin de productos biotecnolgicos, ya que
desventaja es el empleo de cepas comerciales que constituyen los seres vivos que transforman los sustratos y
contengan el gen del represor o cotransformar con un en condiciones predeterminadas llevan a cabo la sntesis del
vector que lo incluya. producto de inters (23).
Promotor Lac (lactosa): Este promotor se reprime en
presencia de glucosa y se induce en presencia de lactosa Una de las ventajas en la produccin de biotecnolgicos/
o su anlogo isopropil-tiogalactosido (IPTG) (19). La biolgicos es la aplicacin de un sistema de lote semilla,
primera puede ser empleada solamente en cepas que donde se utilizan subcultivos de clulas seriadas, las cuales
contengan en su genoma los genes que codifican para tienen una fuente de partida caracterizada y comn para
las tres enzimas involucradas en el metabolismo de la cada lote de produccin. Este sistema se utiliza para prevenir
lactosa (permeasa, beta galactosidasa y transacetilasa). los cambios posibles de las propiedades bioqumicas y
IPTG es un reactivo caro, por lo que su empleo se reduce genticas que se producen con subcultivos repetidos o de
fundamentalmente a las escalas de laboratorio y piloto. generaciones mltiples (24). Los fabricantes pueden preparar
Promotor Tac: Es un hbrido del promotor Lac y el promotor sus propios bancos u obtenerlos de fuentes externas. Ellos
Trp y su funcin es similar a la del promotor Lac (20). son responsables de asegurar la calidad de su preparacin y
de la ejecucin de los ensayos de control.
Cepa hospedera
Bancos de clulas primarias (BCP) / Bancos de reserva
La cepa hospedera, la cual es transformada con el vector de
expresin, debe ser deficiente en la mayora de las proteasas El banco de clulas primarias es una suspensin homognea
naturales, mantener la estabilidad plasmdica y contener los de clulas iniciales ya transformadas por el vector de
elementos genticos necesarios, de acuerdo con el sistema expresin, almacenadas en envases individuales y en
de expresin utilizado. condiciones que garanticen su estabilidad gentica.

Se recomienda el empleo de cepas robustas capaces de Para llevar a cabo la preparacin de un BCP se debern
crecer en medios de cultivo con un mnimo de nutrientes y realizar los pasos siguientes: seleccionar el clon de mayor
que no sean patognicas (21). expresin; tomar el cultivo en la fase logartmica de
crecimiento; lavar las clulas, resuspender en el medio de
Una vez que se han establecido los factores genticos cultivo y adicionar crioprotectores (glicerol, dimetil-sulfxido);
adecuados, se debe garantizar la estabilidad del clon distribuir en viales estriles y hermticos; almacenar las
productor, evitando que existan mutaciones, alcuotas a -70 C y mantenerlas bajo custodia y control
contaminaciones y prdida de informacin gentica. Por lo continuo de la temperatura. Adems, se debe trabajar en
anterior se debe garantizar una forma correcta de ambientes controlados, bajo gabinetes de seguridad biolgica
conservacin del microorganismo productor. Para ello se y evidenciar los estudios de estabilidad y de recobrado de
desarrollan los bancos de clulas. semillas y bancos, los cuales deben estar documentados.

Estrategias de clonaje Control de calidad a los bancos de clulas primarias

A lo largo de ms de dos dcadas se han ido mejorando las Para la caracterizacin de los BCP se deben realizar
estrategias genticas, con el objetivo de aumentar los niveles diferentes ensayos como: pureza microbiana, viabilidad,
de expresin de protenas, as como simplificar los procesos anlisis de restriccin, secuencia nucleotdica del gen,
de recobrado. Estas abarcan desde el diseo de vectores, estabilidad plasmdica, reconocimiento inmunolgico,
multimerizacin de genes, mejoramiento de cepas basadas actividad biolgica y nivel de expresin de la protena a escala
en diferentes principios como la delecin de genes que de banco.
codifican para proteasas, sobreexpresin de codones raros
para E. coli. Banco de clulas de trabajo

Tambin es posible adaptar la estructura de la molcula El Banco de clulas de trabajo ((BCT) se prepara a partir del
recombinante para potenciar una propiedad especfica que BCP bajo condiciones definidas de cultivo. Estas clulas se
facilite su purificacin, ya sea modificando su punto utilizan directamente en el proceso productivo (24)) . La
isoelctrico o sus constantes de afinidad (22).

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cantidad de viales va a depender del uso, tiempo de vida y de las materias primas y que conduce al mejoramiento de las
condiciones de almacenamiento. Cada vez que se utilice un tecnologas y a la bsqueda de nuevas cepas (9).
vial, este debe ser desechado, ya que los cambios de
temperatura pueden afectar la estabilidad gentica del banco, Composicin del medio de cultivo
as como aumentar los riesgos de contaminacin.
Requerimientos nutricionales del crecimiento
Control de calidad a los bancos de clulas de trabajo
Fuente de carbono y energa
Para el control de los BCT se deben realizar los mismos
ensayos que a los BCP, pero el nivel de expresin de la Aproximadamente el 50% del peso seco del material celular
protena se realiza a la escala productiva y se adiciona el es carbono, por lo que en todo medio de cultivo debe existir
cumplimiento de las especificaciones de calidad del un sustrato que proporcione el esqueleto carbonado bsico
ingrediente farmacutico activo (IFA) y la integridad de la para la sntesis de las unidades estructurales que dan origen
protena (secuencia de los extremos amino y carboxilo). a las macromolculas y estructuras de la clula. En la mayora
de los casos este compuesto es de origen orgnico y entre
En este caso se mantienen los lotes en cuarentena y se los ms usados se encuentran los azcares como: glucosa,
aprueban despus de la revisin del expediente por parte de sacarosa, fructosa, lactosa, entre otros. Por lo general en los
la Direccin de Aseguramiento de la Calidad. Despus de procesos degradativos o catablicos de estos compuestos
liberados los lotes se termina el expediente del banco y se se produce tambin la energa necesaria para los procesos
entrega al productor para su custodia. biosintticos y el funcionamiento general de la clula.

Se recomienda dividir los lotes de semillas y bancos celulares La respiracin de las bacterias es un proceso complejo que
y almacenar las partes en lugares diferentes, lo cual minimiza se acompaa del desprendimiento de energa que es
los riesgos de prdida totales de los bancos en caso de indispensable para la sntesis de diferentes compuestos
catstrofes. orgnicos. Segn el tipo de respiracin los microorganismos
se dividen en: aerobios estrictos, microaerfilos, anaerobios
Durante la preparacin de los bancos primarios o bancos de facultativos y anaerobios estrictos.
reserva, los bancos de trabajo o cultivos de trabajo, se debe
evitar o minimizar los riesgos de contaminacin o alteracin, Un representante tpico de los anaerobios facultativos es
confirmar su viabilidad, pureza e identidad antes de su uso y E. coli, la cual en los medios que contienen fuentes de
conformar el expediente de la cepa que debe reflejar la carbono, se desarrolla como bacteria anaerobia al comienzo
historia de las mismas, as como su control sistemtico segn del proceso; desintegra los hidratos de carbono mediante la
los procedimientos establecidos (25). fermentacin, para despus comenzar a asimilar el oxgeno;
crece como aerobia y oxida los productos de la fermentacin
Factores fisiolgicos hasta formar CO2 y H2O. Este tipo de microorganismo posee
importantes ventajas, puesto que puede vivir tanto en
Los factores fisiolgicos asociados a la expresin y ausencia como en presencia de oxgeno.
crecimiento celular de la protena de inters se ponen de
manifiesto en el proceso de fermentacin. Entre los ms Fuente de nitrgeno
importantes se encuentran: composicin del medio de cultivo,
parmetros de operacin en el fermentador y estrategia de En orden consecutivo es el segundo elemento en importancia
cultivo. que debe formar parte del medio de cultivo, ya que juega un
papel fundamental en la composicin de las estructuras
Proceso de fermentacin principales de la clula. Al nitrgeno le corresponde del 8 al
15% del residuo seco.
Los microorganismos y las clulas en general presentan una
identidad propia, especificada por su integracin gentica y Es un factor esencial de las protenas y forma parte de los
manifestada en su funcionamiento con las enzimas que cidos nucleicos, la pared celular, la membrana celular y otros
contienen. Para que los individuos y las especies que ellos componentes importantes (26). En la mayora de los casos
forman sobrevivan y sean perpetuados esta especificacin se suministra en forma de amonio o de algunas de sus sales,
gentica y su sistema de funcionamiento se deben mantener aunque existen otros que requieren aminocidos, purinas,
y reproducir a travs del crecimiento. pirimidinas y vitaminas.

El primer objetivo de una fermentacin industrial es la Los requerimientos orgnicos de nitrgeno son relativamente
obtencin de un producto de calidad a un costo de produccin caros, por lo que a veces se trata de encontrar la satisfaccin
tan bajo como sea posible. La necesidad de minimizar los de esta demanda en subproductos industriales (suero de
costos de produccin es el factor que controla la seleccin leche) o en productos ms baratos (soya, extracto de
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levadura), los cuales pueden aportar algunos factores del Efecto de la concentracin de sustrato
crecimiento que se requieren en cantidades muy reducidas
(27). La dependencia de la velocidad especfica de crecimiento
() sobre la concentracin de sustrato limitante se obtiene
Velocidad especfica de crecimiento por primera vez por J. Monod (28).

La velocidad especfica de crecimiento (m) es funcin de: = mxS/(Ks+S)


tipo de microorganismo, composicin del medio de cultivo,
temperatura, pH, concentracin de sustrato, velocidad de donde:
agitacin y aireacin. En general se puede plantear que:
mx: Velocidad especfica mxima de crecimiento que se
= f (T, pH, S, variables de operacin). alcanza en la fase exponencial y depende del tipo de sustrato
limitante empleado y de las variables de operacin (h-1).
Con el objetivo de mejorar la productividad de la protena de S: Concentracin de sustrato limitante (g.L-1).
inters, obtenida al usar una cepa de E. coli, se puede Ks: Constante de saturacin (g.L-1). Esta constante da una
correlacionar la velocidad especfica de crecimiento con la medida de la afinidad del microorganismo hacia el sustrato.
velocidad de produccin del producto de inters. De esta Mientras ms pequeo sea Ks, ms afn es el microorganismo
manera se conoce que manteniendo la velocidad especfica al sustrato en cuestin.
de crecimiento cerca del valor ptimo para la formacin del
producto despus de la induccin, se obtienen altos niveles Actualmente existen numerosos modelos que relacionan la
de expresin de protena. Utilizando la alimentacin velocidad especfica de crecimiento con la concentracin de
escalonada o constante, despus de la induccin del cultivo sustrato, pero el de Monod sigue teniendo gran utilidad.
por elevacin de la temperatura, se obtiene una extensin
del perodo de produccin de la protena de manera Estrategias de cultivo
significativa.
Existen diferentes tipos de estrategias para las
Efecto de la temperatura y el pH fermentaciones microbianas: fermentacin discontinua,
fermentacin discontinua incrementada y fermentacin
La temperatura de crecimiento ptima para diferentes continua.
microorganismos vara en un amplio intervalo. Por ejemplo:
microorganismos psicrfilos: 0-25 C; microorganismos Fermentacin discontinua
mesfilos: 25-45 C, y microorganismos termfilos: > 45 C.
La dependencia de la temperatura de crecimiento microbiano La fermentacin discontinua sigue siendo actualmente el
se podra comprender como el efecto de la temperatura sobre mtodo ms usado en la industria farmacutica y
las distintas reacciones enzimticas que ocurren en las biotecnolgica. Esta operacin consiste en que se cargan el
clulas. Este efecto se describe por la ecuacin de Arrhenius: medio de cultivo y el inculo en un tanque con agitacin y
aireacin, si el proceso lo requiere, donde ocurre una
=Ae-E/RT transformacin biolgica. Teniendo esto se est en presencia
de un fermentador o un biorreactor. La fermentacin
donde: discontinua tiene entre sus ventajas: el ser una operacin
simple, presentar bajo riesgo de contaminacin y facilidad
A : Constante de Arrhenius (h-1). para ser utilizada como patrn para estudios previos. Como
E : energa de activacin (kJ kmol-1) desventaja se encuentra que con su uso, se obtiene baja
T : temperatura absoluta (K) productividad.
R : constante de los gases (kJ kmol-1K-1).
Limitaciones de la operacin discontinua
El efecto del pH es similar al efecto de la temperatura. La
velocidad de las reacciones enzimticas depende del valor Existe una concentracin de sustrato limitante inhibitoria al
del pH y vara de un microorganismo a otro. crecimiento. Esto se conoce comnmente como efecto Crabb
Tree y consiste en que el microorganismo en vez de consumir
La mayora de las bacterias crecen a una temperatura la fuente de carbono para crecer, produce cido actico y
alrededor de 37 C y un pH neutro. Manteniendo el cultivo a otros metabolitos que son txicos para las clulas, por lo que
estas condiciones se logra que la velocidad especfica de se limita la obtencin de altas densidades celulares (29).
crecimiento dependa solamente de la concentracin de En la fermentacin discontinua existe una contradiccin, al
sustrato y de las variables de operacin. inicio habitan pocas clulas y existe alta concentracin de
sustrato, mientras que al final ocurre lo contrario.

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En numerosas ocasiones en la produccin de protenas fundamental para la obtencin de buenos resultados, ya que
recombinantes la velocidad especfica mxima de crecimiento no solo afecta a la concentracin celular sino tambin a la
no es la ptima para la formacin del producto. Se conoce productividad del proceso y a la cantidad de productos de
como critica a la velocidad especfica a la que se elimina casi inters a obtener.
totalmente la produccin de cido actico, la cual perjudica
tanto al crecimiento como a la formacin del producto. Esto A flujos constantes la adicin se realiza a una velocidad
puede variar de una cepa a otra (si es auxotrfica o prottrofa), predeterminada y el volumen del cultivo y la densidad celular
como tambin influye el medio en que se cultivan (si es medio aumentan, mientras la velocidad especfica de crecimiento
complejo o definido). Kleman reporta que en un medio disminuye constantemente (33).
definido o salino: crit 0,35 h-1 mientras en un medio complejo:
crit 0,2 h-1 (29). El flujo escalonado o gradual permite que se incremente la
velocidad de adicin en la medida que aumenta la
Medio complejo se le llama a los medios ricos en extractos, concentracin celular. En este caso las clulas pueden crecer
suplementados con fuentes orgnicas, aminocidos, exponencialmente durante todo el tiempo de cultivo siempre
vitaminas y trazas. Son medios muy ricos por lo que los que la velocidad de adicin del sustrato limitante se aumente
microorganismos tienden a producir ms metabolitos que en proporcionalmente al crecimiento celular.
un medio salino definido.
El mtodo de adicin mediante un flujo exponencial permite
Por otra parte, se requiere conocer la velocidad especfica de el crecimiento a una velocidad especfica constante
crecimiento para la formacin del producto (prod). Existen (generalmente, entre 0,1 y 0,3 h-1). A travs de este control se
tres formas de determinarla: puede minimizar la produccin de acetato (34).

En un cultivo discontinuo manipulando la aireacin y la En la actualidad se han desarrollado mtodos ms


agitacin. sofisticados de adicin que presuponen esquemas de control
En un cultivo discontinuo con alimentacin variando el por retroalimentacin, asociados a parmetros fsicos
flujo de incremento. medibles como: el oxgeno disuelto (35), el pH y la velocidad
En un cultivo continuo variando la velocidad de dilucin, de evolucin de CO2 (36).
siempre que no se pierda la informacin gentica.
Efecto inhibitorio del cido actico y el oxgeno en el
Fermentacin discontinua incrementada crecimiento de los cultivos incrementados

La produccin de protenas heterlogas en E. coli puede Es bien conocido que durante el proceso de crecimiento
incrementarse significativamente mediante la utilizacin de E. coli produce cido actico como subproducto (36). La
sistemas de cultivo incrementado, el cual permite obtener cantidad de acetato producido depende fundamentalmente
densidades celulares superiores a 100 g/L de peso seco (30) de la cepa (37), la velocidad especfica de crecimiento (29,
y disminuir drsticamente los costos de produccin de 34), el medio utilizado, pH (38), as como el tipo y la
protenas recombinantes (31). concentracin de la fuente de carbono (30).

Este sistema de fermentacin presupone resolver algunos La formacin de cido actico y su actividad inhibitoria puede
inconvenientes, como son: la inhibicin del crecimiento por ser controlada mediante estrategias de alimentacin
acumulacin de sustrato; la capacidad limitada de exponencial (38) y mediante sistemas de monitoreo de la
transferencia de oxgeno y la formacin de subproductos fuente de carbono y de oxgeno disuelto (39, 40). Existen
inhibitorios para el crecimiento como el cido actico. procedimientos en los que se combina el proceso de
fermentacin con mtodos de filtracin y dilisis (41), as como
Para cultivar clulas de E. coli a altas densidades es necesario la utilizacin de cepas con la enzima fosfotransacetilasa
el diseo de un medio de cultivo balanceado, que contenga mutadas (42). Otro de los elementos que puede provocar la
todos los componentes necesarios para el crecimiento celular inhibicin del crecimiento, as como la estabilidad y calidad
y evite la inhibicin por altas concentraciones de nutrientes. del producto de inters es la concentracin de oxgeno
Con este objetivo se ha propuesto ir incrementando disuelto en el medio. La escasez de oxgeno puede causar
lentamente el sustrato limitante, y con ello evitar la limitaciones en la produccin de aminocidos y problemas
acumulacin de nutrientes y obligar a crecer al con la estabilidad de los plsmidos (39).
microorganismo a una velocidad baja (32).
Desventajas del cultivo incrementado
Mtodos de adicin del incremento
La limitacin de este cultivo va a estar dada por el mayor
Los flujos de adicin del incremento pueden ser: constante, riesgo de contaminacin que presenta en comparacin con
escalonados y exponenciales, y constituyen un elemento los cultivos discontinuos, as como por la inestabilidad
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plasmdica que puede originarse debido al alto nmero de cualquier paso posterior. Este mtodo de purificacin por
duplicaciones que se generan durante el proceso. Este afinidad permite obtener elevados niveles de pureza
fenmeno puede influir significativamente en la disminucin empleando un solo paso cromatogrfico (44).
de los niveles de expresin de la protena de inters.
En el caso de las protenas solubles expresadas
Estrategias de purificacin intracelularmente es necesaria la ruptura de las clulas que
la contienen. Existen varios mtodos para lograr esto, como
El desarrollo de estos procesos ha requerido a la par el son: ciclos de congelacin/descongelacin repetidos,
desarrollo de procesos de purificacin. Las protenas ultrasonido, homogenizacin por alta presin o
teraputicas obtenidas por esta va deben cumplir no solo permeabilizacin con solventes orgnicos. El mtodo a
rigurosos requerimientos de calidad y seguridad establecidos escoger depender de cun frgil sea la protena y de cun
por las agencias regulatorias, sino tambin su camino hacia resistente sea la clula que se requiere romper. Los
el mercado debe ser corto. La estrategia fundamental de la contaminantes en los extractos proteicos pueden incluir una
purificacin de protenas es simple: remover todos los variedad de macromolculas (cidos nucleicos, lpidos,
contaminantes mientras se trata de retener en el mayor grado polisacridos y otras protenas) as como una serie de
posible la protena de inters. pequeas molculas. Estas ltimas se pueden fcilmente
separar de las protenas por mtodos basados en la talla
De forma general, la purificacin de protenas se puede dividir molecular, tales como la dilisis, la ultrafiltracin o la filtracin
a partir de su forma de expresin en dos grandes grupos que en gel.
determinan la estrategia a seguir: purificacin de protenas
solubles e insolubles. Las protenas recombinantes en E. coli Las macromolculas son ms difciles de eliminar,
pueden ser expresadas de dos formas fundamentales: especialmente cuando estn presentes en grandes
secretadas al medio extracelular (solubles) o expresadas en cantidades. Las bacterias lisadas liberan grandes cantidades
el interior de la clula, donde pueden ser localizadas en el de ADN, originando extractos con alta viscosidad y alta
espacio periplasmtico o en el citoplasma celular (Tabla 1). absorbancia a 280 y 260 nm. Este se puede eliminar por
Muchos de los polipptidos recombinantes producidos en precipitacin con sulfato de protamina (una protena natural
altos niveles en E. coli se localizan en el citoplasma en forma con propiedades de unin al ADN, la cual contiene un 70%
insoluble y compacta, formando cuerpos de inclusin, aunque de arginina y lisina) o por tratamiento con compuestos de
en ocasiones puede encontrarse de forma soluble (43). poliaminas sintticos. Tambin se emplea el tratamiento con
enzimas que ayuden a depolimerizar al ADN y ARN.
Tabla 1. Formas de expresin de las protenas intracelulares
en E. coli Cuerpos de inclusin

Las protenas recombinantes que se acumulan


intracelularmente en E. coli frecuentemente se depositan en
forma de cuerpos de inclusin. Estos son agregados
insolubles de protenas incorrectamente renaturalizadas, las
que carecen de actividad biolgica y pueden observarse por
Las extracelulares son generalmente ms estables (a microscopia de fase como partculas intracelulares oscuras.
menudo como resultado de los puentes disulfuro) y por lo El tamao de los cuerpos de la inclusin vara entre
general son molculas pequeas. Una alternativa importante 0,20,6 mm (45).
para la purificacin de estas protenas es la cromatografa de
lecho o cama expandida, una tcnica cromatogrfica en la La protena recombinante desnaturalizada es el componente
cual la protena es purificada a partir de un extracto crudo (la principal de los cuerpos de inclusin y la separacin inicial
muestra aplicada es particulada: medio de fermentacin que de los mismos por centrifugacin es un paso eficaz de
contiene clulas), donde se combina la preparacin de la purificacin. La molcula recombinante nativa se solubiliza
muestra y captura en un solo paso, muy adecuada para la usando agentes caotrpicos a travs de un proceso conocido
purificacin a gran escala. como extraccin. Posteriormente se restablece la estructura
terciaria de la protena mediante un paso de renaturalizacin,
Otro mtodo empleado para la purificacin de estas protenas que consiste en la disminucin de la concentracin de este
es el uso de marcadores de afinidad. Esta tcnica consiste agente por dilisis, dilucin directa o empleando una columna
en la adicin a las protenas (generalmente en su extremo cromatogrfica (46, 47). Mientras la renaturalizacin puede
carboxilo-terminal) de una cola de polihistidina que permite ser un proceso sencillo para las protenas pequeas que no
la purificacin de estas por medio de una cromatografa de contienen puentes disulfuro, este es un proceso complejo y
afinidad por iones metlicos (IMAC). La insercin de un sitio de bajos recobrados en muchos casos. Las condiciones
de corte de proteasa entre la cola de histidinas y la protena ptimas para la renaturalizacin son dependientes de cada
de inters permite la eliminacin de dicha cola antes de protena y por tanto no se pueden predecir. Sin embargo,
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existe mucha informacin en la literatura, disponible en bases ser producidas por algunas bacterias grampositivas,
de datos (48). micobacterias, hongos y tambin algunos virus, pero los
pirgenos producidos por las bacterias gramnegativas, las
Antes de la extraccin, los cuerpos insolubles colectados se endotoxinas, son un asunto a considerar en la industria
pueden lavar con soluciones que contienen farmacutica.
desnaturalizantes (1-4 mol/L de urea), sacarosa o
detergentes para reducir los niveles de contaminantes, pero Las endotoxinas bacterianas, encontradas en la membrana
a costa de incrementar los costos y la complejidad de los externa de las bacterias gramnegativas son miembros de
procesos. una clase de fosfolpidos llamados lipopolisacridos (LPS).
Los LPS no son productos exgenos de las bacterias
Empleo de los mtodos cromatogrficos gramnegativas. La liberacin de estos ocurre despus de la
muerte o de la lisis celular. Algunos ejemplos de bacterias
La introduccin de la cromatografa a comienzos de los aos gramnegativas productoras de pirgenos son la E. coli y
1960, principalmente la filtracin en gel y el intercambio miembros de los gneros Proteus, Pseudomonas,
inico, proporcionaron nuevas oportunidades para la Enterobacter y Klebsiella.
purificacin.
Pueden existir varias fuentes de pirgenos en los productos
Si bien en esta etapa los procesos se enfocaron en mejorar parenterales y en el equipamiento mdico. Entre estas
la precisin de los estudios estructura-funcin de las protenas encontramos el agua usada como solvente o en el
y los procesos de escalado se vieron limitados por las procesamiento, componentes de envase, reactivos, materias
caractersticas fsicas de los geles, a partir de los aos 1970, primas o equipamiento usado en la preparacin del producto.
con la aparicin de la tecnologa del ADN recombinante, el Las buenas prcticas incluyen el control de los niveles
desarrollo de las fermentaciones bacterianas y el cultivo de microbiolgicos y de endotoxinas en las fuentes potenciales
clulas de mamferos, los productos biofarmacuticos se mencionadas.
ajustaron a procesos de purificacin basados en los procesos
cromatogrficos como la herramienta fundamental y con Teniendo en cuenta la composicin de la molcula de LPS
tecnologas de membrana que proporcionaron materiales (una porcin de la molcula es hidrofbica y la molcula posee
limpios clarificados, cambio de soluciones, concentracin del carga negativa a pH neutro) tambin la cromatografa de
producto, eliminacin viral y filtracin estril (49). La intercambio aninico ha sido reportada para la eliminacin
estandarizacin permiti un enfoque ms sistemtico al de endotoxinas.
desarrollo de estos procesos y fue el basamento para la
introduccin del paradigma captura-purificacin-pulido, Chen y colaboradores reportan la reduccin de hasta dos mil
ahora extendido en todos los diseos de los esquemas de veces en los niveles de endotoxinas en un paso
purificacin de protenas. cromatogrfico, empleando una resina de intercambio
aninico: Q XL, de la firma GE Healthcare (50), la cual posee
La industria desarroll un nuevo y sistemtico diseo un grupo intercambiador amino cuaternario.
integrado de procesos, ingeniera y control, economa de
proceso e higiene y aspectos regulatorios. Los sistemas de Pureza versu
versuss recobrado
bioprocesos se introdujeron y el control computarizado se
impuso en esta tecnologa, previamente dominada por La mayora de los protocolos de purificacin de protenas a
operaciones manuales. La expansin de la cromatografa escala preparativa involucran varios pasos. Cada paso
como la herramienta fundamental en la purificacin de las permite alcanzar un grado de pureza pero un intervalo de
biomolculas se aprecia claramente en el incremento de los seleccin estrecho. En el caso de las fracciones con mayor
ingresos en bioprocesos para la divisin de Life Science de pureza, puede reducir grandemente el recobrado.
la firma GE Healthcare de aproximadamente 36 millones en
1986 a 461 millones en 2006 (50). Otras prdidas pueden venir de la unin irreversible de la
protena a la matriz cromatogrfica, de la desnaturalizacin,
Eliminacin de endotoxinas de la oxidacin de la protena, de condiciones drsticas
durante la unin o durante la elucin de las matrices
Otro problema confrontado durante la purificacin de cromatogrficas, exposicin a iones metlicos pesados y a la
protenas teraputicas expresadas en E. coli es la eliminacin separacin de cofactores, grupos prostticos y agentes
de las endotoxinas bacterianas. estabilizantes de la protena de inters.

El trmino pirgeno microbiano en oposicin a endotoxinas Conclusiones


de las bacterias gramnegativas se ha convertido en un
Por ltimo, uno de los objetivos de los investigadores fue
trmino descriptivo general para muchas sustancias
alcanzar altos rendimientos en la produccin de productos
diferentes. Sin embargo, las sustancias pirognicas pueden
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biotecnolgicos expresados en E. coli, con vistas a hacer burden associate with recombinant bacteria. Biotechnol
estos procesos ms factibles econmicamente y cumplir con Bioeng 1990;35:668-81.
las regulaciones vigentes en esta rama de la industria. 12. Lee CP, Li P, Inouye H, Brickman ER, Beckwith J. Genetic
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Las estrategias han estado encaminadas desde el across the Escherichia coli cytoplasmatic membrane.
mejoramiento gentico de la cepa y los vectores de expresin J Bacteriol 1989;171:4609-16.
hasta los mtodos de cultivo y purificacin de estas protenas. 13. Kane JF. Effects of rare codon clusters on high-level
No obstante, existen retos que deben abordarse en un futuro, expressions of heterologous protein in Escherichia coli. Curr.
entre los que se encuentran: superar los niveles de expresin Opin. Biotechnol. 1995;6:494-500.
de protenas alcanzados; realizar un adecuado estudio del 14. Bechhofer D. 5 m RNA stabilizers. In Belasco JG, Brawerman
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parmetros que influyen significativamente en su eficiencia; 15. Hanning G, Makrides S C. Strategies for optimizing
realizar una adecuada seleccin del medio de cultivo que heterologous protein expression in Escherichia coli. Trends
facilite tanto la expresin como el crecimiento celular. Biotechnol 1998; 16:54-60.
16. Espinosa R, Caballero E, Musacchio A, Silva R. Production of
Aunque en este artculo se han dado consideraciones a recombinant, immunogenic protein, P64k, of Neisseria
generales, el desarrollo de cada producto requerir un estudio meningitidis in Escherichia coli in fed-batch fermenters.
de las caractersticas particulares de las molculas Biotechnology Letters 2002;24(5):343-6.
recombinantes y de las cepas productoras. 17. Chevalet L, Robert A, Gueneau F, Bonnefoy, JY y Ngugen T.
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Strategies to obtain recombinant proteins in Escherichia coli

Abstract

Recombinant protein expression has been favored by the use of Escherichia coli due to its relatively low costs,
high-density culture, easy genetic manipulation and also to compatible biotechnological tools. Strategies for
recombinant expression in E. coli are presented in this paper. Genetic and physiologic factors are presented:
number of copies of the expression vector, characteristic of the gene, ribonucleic acid (messenger) stability,
promoter, host strain, clone stability, composition of the cultivation media, operation parameters in the bioreactor
and cultivation and purification strategies.

Key words
words: recombinant protein, Escherichia coli, genetic factors, physiologic factors, fermentation.

Recibido: Septiembre de 2012 Aceptado: Diciembre de 2012

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