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ANLISIS MICROBIOLGICO DE LOS NIVELES DE

CONTAMINACIN DE LA SALMONELLA spp EN PESCADO


FRESCO

JUSTIFICACIN
El siguiente trabajo de investigacin tiene el propsito de dar a conocer a la poblacin
de Llallagua sobre la presencia bacteriana Salmonella Spp en muestras de pescado
fresco del criadero del sector aguas calientes del municipio de Llallagua del
departamento de Potos, expendio pblico de Llallagua y expendio pblico de la ciudad
de La Paz las mismas que sern analizadas mediante el medio de cultivo agar ss,
caldo tetrationato, tcnica de tincin Gram y diferentes pruebas bioqumicas.
Con los resultados obtenidos nos servirn para plantear a la poblacin consumidora
propuestas de medidas preventivas necesarias de sanidad e higiene, para as retardar
el deterioro de la muestra de pescado y evitar el desarrollo de la bacteria Salmonella
Spp.
Evitando posibles infecciones y enfermedades que afectaran a la poblacin
consumidora. Puesto que los pescados son un recurso muy consumido por los seres
humanos debido a la presencia de omegas, propiedades nutritivas y aportan un
balance de protenas de alto valor biolgico, vitaminas, minerales como el Fosforo.
Aplicar medidas de inspeccin que garanticen un control eficiente por parte de las
alcaldas a los diferentes puntos de venta as incrementando la confianza del
consumidor.
PLANTEAMIENTO DE PROBLEMA
Cmo realizar el anlisis microbiolgico de los niveles de contaminacin de la
Salmonella spp en pescado fresco en el laboratorio de microbiologa de la carrera
Bioqumica Farmacia durante la gestin 2017?

METODOLOGA DE ESTUDIO:
Es un estudio descriptivo y experimental porque el presente trabajo requiere de una
investigacin-anlisis microbiolgica.
Poblacin: criadero del sector aguas calientes del municipio de Llallagua, expendio
pblico del municipio de Llallagua y expendio pblico de la ciudad de La Paz.
Muestra: pescados frescos.
OBJETIVOS
Objetivo General
Determinar el anlisis microbiolgico de los niveles de contaminacin de la Salmonella
spp en pescado fresco en el laboratorio de microbiologa de la carrera Bioqumica
Farmacia durante la gestin 2017.
Objetivos especficos
Identificar la Salmonella spp en la muestra de pescado fresco del sector aguas
calientes mediante el medio de cultivo agar ss y el caldo Tetrationato.
Realizar la tcnica de Tincin Gram para comprobar la presencia de la bacteria
Salmonella spp en muestra de pescado fresco del expendio pblico de la ciudad
de la Paz.
Emplear las diferentes pruebas bioqumicas para identificar la presencia de la
bacteria Salmonella spp en muestra de pescado fresco del expendio pblico de
la ciudad del Municipio de Llallagua.
Describir el fundamento del Agar ss , Caldo Tetrationato , Tincin Gram utilizados
para la identificacin de la bacteria Salmonella spp en muestra de pescado
fresco.
INTRODUCCIN
El pescado aporta un buen balance de protenas de alto valor biolgico, vitaminas tanto
hidrosolubles como liposolubles, algunos elementos minerales y un contenido calrico
relativamente bajo. Las ventajas que presenta el consumo habitual de pescado estn
bien demostradas pero hay que considerar dos aspectos importantes; uno, su
durabilidad y otro, la posibilidad de que sea vehculo de organismos agentes de
infecciones e intoxicaciones alimentarias. Es bien sabido que los pescados son de los
primeros en las listas de alimentos relacionados con enfermedades de origen
alimentario aunque una gran proporcin corresponde a intoxicaciones por biotoxinas e
histamina (aprox. 80%) o a infecciones por virus. Sin embargo, los productos de la
pesca tambin pueden ser vehculo de muchas de las bacterias patgenas que causan
enfermedades en el hombre va los alimentos. Son las bacterias las que ms influyen
en la vida til del pescado aunque no todas las que estn presentes en el momento de
la captura o recogida van a ser capaces de multiplicarse durante el almacenamiento.
Slo una parte de stas acabar dominando y ser, en ltima instancia, responsable de
la alteracin. La alimentacin, la poca del ao, el rea geogrfica, la especie de
pescado y el sistema de captura son determinantes del nmero y tipo de bacterias
presentes inicialmente; mientras que las condiciones de almacenamiento van a
seleccionar la flora alterante. Evidentemente, todas las manipulaciones de que sea
objeto la pescadora la captura o recogida van a afectar de forma notable a la calidad
microbiolgica del mismo.
Los riesgos asociados al consumo de pescado y productos de la pesca pueden ser de
naturaleza biolgica o qumica. Entre los primeros se pueden diferenciar los causados
por microorganismos, bacterias y virus, y por parsitos. Las bacterias patgenas
humanas transmitidas por el pescado se pueden dividir en dos grupos: uno constituido
por gneros y especies cuyo hbitat natural es el agua (Vibrio parahaemolyticus, Vibrio
cholerae Plesiomonas shigelloides, Edwardsiella tarda,
Aeromonas mviles, etc.) Y otro que incluye bacterias presentes en el agua pero
procedentes de contaminacin de origen fecal y/o asociadas con el procesado y la
manipulacin posterior del pescado (Salmonella spp, Listeria monocytogenes,
Staphylococcus aureus). Salmonella spp. Se encuentra distribuida a nivel mundial. Es
un agente zoontico importante y ha sido aislada a partir de una gran variedad de
peces y crustceos capturados en aguas contaminadas con heces pueden portar este
microorganismo.
HIPOTESIS:
Alternativa:
Las muestras analizadas de pescado fresco (trucha) mediante el medio de cultivo agar
ss y caldo tetrationato evidentemente dieron un resultado positivo en Salmonella spp
en comparacin al agar TSI, agar SIM analizadas en el laboratorio de microbiologa de
la carrera Bioqumica Farmacia.
Nula:
Las muestras analizadas de pescado fresco (trucha) mediante el medio de cultivo agar
TSI, agar SIM dieron un resultado negativo en Salmonella spp en comparacin del agar
ss y caldo tetrationato analizadas en el laboratorio de microbiologa de la carrera
Bioqumica Farmacia.

7. MARCO TERICO:

Taxonoma
Dominio: Bacteria

Filo: Proteobacteria
Clase: Gammaproteobacteria
Orden: Enterobacteriales
Familia: Enterobacteriaceae
Gnero: Salmonella

Caractersticas del Pescado.- El pescado, en general, es un alimento rico en


protenas de alto valor biolgico, las cuales contienen todos los aminocidos
esenciales, tambin es rico en grasas que contienen una alta proporcin de cidos
grasos insaturados, as como en vitaminas y minerales.

Esta composicin tan adecuada para la nutricin humana, lo es tambin para los
microorganismos que normalmente se localizan a nivel de las branquias, mucus que
recubre la piel y contenido abdominal y que, durante su crecimiento tras la muerte del
animal, lo iran descomponiendo progresivamente, si no se le pusiese freno al proceso.
En este proceso de descomposicin tambin intervienen las propias enzimas del
animal que, del mismo modo que los microorganismos, degradan las protenas, grasas,
etc,..

Por todos estos motivos se dice que el pescado (al igual que la carne, leche, etc.) es un
alimento muy perecedero, es decir que se altera rpidamente, lo que requiere que sea
mantenido en las debidas condiciones de conservacin hasta que sea consumido y que
sea adquirido lo ms fresco posible.

El grado de frescura con que el producto llega al mercado y por tanto se pone al
alcance del consumidor, es un factor de gran importancia en relacin con la calidad del
pescado.

Las caractersticas se pueden apreciar fcilmente a travs de los sentidos, como la


vista, olfato, tacto, etc., (por lo que se denominan caractersticas organolpticas),
observando su aspecto general, consistencia, color, olor, etc.

Respiracin a travs de branquias, un grupo muy reducido cuenta con


respiracin pulmonar.
Sus ojos carecen de prpados.
Inexistencia de rganos sexuales externos, generalmente las gnadas se
encuentran en el interior de su cuerpo a excepcin de algunas especies.
La mayora de ejemplares poseen una excelente capacidad visual, su olfato, en
cambio, est menos desarrollado, aunque cuentan con rganos sensoriales muy
desarrollados para detectar vibraciones, presencia de enemigos
Son heterotermos, es decir, no pueden regular su temperatura corporal sin la
ayuda de un medio externo.
Carecen de miembros para la locomocin, stos son sustituidos por aletas con
diversidad de funciones.
En la mayora de los casos su cerebro es pequeo en comparacin con el
cuerpo.
Su piel est revestida de escamas, aunque existen excepciones.
El cuerpo es fusiforme en la mayora de especies.
Cuentan con esqueleto interno.

CARACTERSTICAS MORFOLOGICAS DE LA SALMONELA spp.

Son bacilos gran negativos


Miden de 0,7-1,5um de ancho por 2-5um de largo
Mviles flagelos
No desarrollan capsula ni forman esporas
La parad celular posee el antgeno Ag somatico O
Los flagelos representan el Ag flagelar H
Algunas salmonelas poseen capsula.
Antgeno K en la capsula
Salmonella puede crecer entre7-49 grados y sobrevive a una temperatura de 3
grados pero no se multiplica
Crese a un pH que vara entre 4-9
TAXONOMIA
Dominio: bacteria
Filo: proteobacteria
Clase: gammaproteobacteria
Orden: enterobacteriales
Familia: enterobacteriaceae
Gnero: Salmonella
Especie: Salmonella spp.

Salmonella pertenece a un grupo de bacterias que estn presentes en el intestino de


personas y animales sanos, de forma que las heces son el principal foco de
contaminacin a los alimentos y al agua. La transmisin tiene lugar por va fecal
oral por medio de la cual el contenido intestinal de un animal infectado es ingerido con
un alimento o con el agua. Cuando llega a los alimentos frescos, tiene la habilidad de
multiplicarse muy rpidamente y cuando una persona ingiere dicho alimento
contaminando el gran nmero de bacterias provoca salmonelosis infeccin
gastrointestinal provocada por dicha bacteria.

Los factores que cooperan en los brotes son principalmente el tiempo de uso
incorrecto de la temperatura y un tratamiento trmico insuficiente.

Tambin en alimentos sin pasteurizar como leche y sobre todo en la cscara de los
huevos frescos de aves de corral ya que contienen heces o materia fecal de la cloaca
de la gallina.

Los productos vegetales como por ejemplo las hortalizas que se utilizan para
preparar ensaladas, han sido relacionados con brotes accidentales de fiebre tifoidea y
salmonelosis, debido a la utilizacin de agua de riego contaminada o de deyecciones
humanas y de estircol de los animales como abono.

FUNDAMENTO DE SALMONELLA SHIGELLA AGAR. ( AGAR SS)

Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. Y de algunas especies


de Shigella spp. A partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se
sospeche su presencia.
Es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La selectividad, est dada por la sales
biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la
mayora de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp.
Es diferencial debido a la fermentacin de la lactosa, y a la formacin de cido
sulfhdrico a partir del tiosulfato de sodio.
Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar,
acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obtenindose colonias
rosadas o rojas sobre un fondo rojizo.
Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen bien
en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes.
La produccin de cido sulfhdrico se evidencia como colonias con centro negro debido
a la formacin de sulfuro de hierro.
Para aumentar la selectividad, se recomienda incubar previamente la muestra en
Selenito caldo (B02-120-05).

COMPOSICION:

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones


Pluripeptona 5.0 Suspender 60 g del polvo por litro de agua
Extracto de carne 5.0
destilada. Reposar 5 minutos y mezclar
Lactosa 10.0
Mezcla de sales biliares 8.5 hasta homogeneizar. Calentar a ebullicin
Citrato de sodio 8.5 durante 2 o 3 minutos. NO ESTERILIZAR
Tiosulfato de sodio 8.5 EN AUTOCLAVE. Enfriar a 45-50C y
Citrato frrico 1.0 distribuir unos 20 ml por placa. Secar la
Agar 13.5
superficie del medio unos minutos en la
Verde brillante 0.00033
Rojo neutro 0.025 estufa.
pH final: 7.0 0.2

SIEMBRA:

Sembrar por estriado la superficie del medio de cultivo.

INCUBACIN:

Durante 24-48 horas a 35-37 C, en aerobiosis.

CONSERVACIN Y CADUCIDAD

Todos los contenedores de medios de cultivo deshidratados deben permanecer


hermticamente cerrados y almacenados en un lugar seco a 10 a 25C hasta la fecha
de caducidad indicada en la etiqueta del envase.

INTERPRETACIN DE RESULTADOS

Despus de la incubacin, registrar el crecimiento de microorganismos. Las


caractersticas tpicas a observar incluyen: tamao de la Colonia, color y morfologa.
Despus del crecimiento nocturno, los no fermentadores de lactosa, aparecern como
colonias sin color mientras que cualquier comensal fermentador de lactosa que sea
hbil para crecer en el medio aparecer en forma de colonias rosa o rojas. La mayora
de las Salmonella y Shigella son no-lactosa fermentantes y aparecen como colonias sin
color. Las Salmonella a menudo aparecern con un punto negro en el centro que indica
produccin de H2S.

FUNDAMENTO DE AGAR TETRATIONATO CALDO.

Medio de cultivo utilizado para el enriquecimiento selectivo de Salmonella spp. a partir


de heces, orina, alimentos y otros materiales de importancia sanitaria.
El medio de cultivo contiene peptona que provee los nutrientes necesarios para el
desarrollo bacteriano, y carbonato de sodio que neutraliza y absorbe metabolitos
txicos.
La selectividad est dada por la presencia de tiosulfato de sodio, tetrationato (generado
en el medio por el agregado de la solucin iodo-iodurada) y sales biliares, los cuales
permiten el desarrollo de bacterias que contienen la enzima tetrationato reductasa,
como ser la Salmonella spp. e inhiben el desarrollo de la flora acompaante.
Para evitar la proliferacin de especies de Proteus spp., se recomienda agregar 40 mg/l
de Novobiocina, antes de la solucin iodada

COMPOSICION:

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones


Peptona 5.0 Suspender 46 g del polvo en 1 litro
Sales biliares 1.0 de agua destilada. Mezclar
Carbonato de calcio 10.0
vigorosamente y llevar a ebullicin.
Tiosulfato de sodio 30.0
pH final: 8.4 0.2 Enfriar a 45C o menos. Agregar 20
Solucin iodo iodurada ml de solucin iodurada. Mezclar y
Iodo 6.0 distribuir 10 ml por tubo, en tubos
Ioduro de potasio 5.0
estriles. No debe calentarse luego
de agregar la solucin iodada. El
medio base puede mantenerse a
Agua 20.0 4C , dura varios meses, pero una
vez agregada la solucin iodada
debe usarse en el mismo da.

SIEMBRA

Puede realizarse la siembra partiendo de un caldo de preenriquecimiento o en forma


directa conservando la proporcin 1:10.

INCUBACIN

Durante 12-24 horas a 35-37 C, en aerobiosis.

FUNDAMENTO DE TINCION GRAM

El fundamento de esta tcnica se basa en la diferenciacin entre las paredes celulares


de Las bacterias Gram positivas y Gram negativas.
La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de
peptidoglicano adems de acidos teicoicos.

Por el contrario, la capa de peptidoglicano de las Gram negativas es delgada y se


encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior por medio de
lipoprotenas la membrana exterior est compuesta de protena, fosfolpido y
lipopolisacarido.

La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a que la


membrana externa de las gram negativas es soluble en solventes orgnicos (mezcla de
alcohol acetona).

La capa de pptido glicano que posee es delgada como para poder retener el primer
colorante el cristal violeta y por lo tanto se pierde la coloracin azul violcea. Pero por
el contrario, las Gram positivas poseen una pared celular gruesa en pptidoglicano, no
son susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando
los poros cerrndolos, lo que impide que pueda escapar el primer colorante y mantiene
la coloracin azul violceo.

RESULTADOS

Bacterias Gram Positivas = Color Violeta

Formas redondeadas abastonadas.

Bacterias Gram Negativas = Color Rojo o Rosado

Formas redondeadas abastonadas.

PRUEBAS BIOQUMICAS:
Para identificar el gnero Salmonella spp. Se realiza dos pruebas bioqumicas de
tamizaje:
1. Agar Lisina Hierro (LIA).
2. Agar Simmons Citrato.
3. Agar SIM.
4. Agar Triple Azcar Hierro (TSI).
FUNDAMENTO DE AGAR LISINA HIERRO (LIA).
Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella
spp., basado en la decarboxilacin / desaminacin de la lisina y en la produccin de
cido sulfhdrico.
En el LIA hay glucosa en escasa cantidad y la lisina es la principal fuente de energa.
Para aprovechar la lisina la bacteria necesita tener alguna de las enzimas que la pueda
degradar.
Enzima lisina descarboxilasa (anaerobios).
Enzima lisina desaminasa (aerobios).
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para
el desarrollo bacteriano. La glucosa es el carbohidrato fermentable, y la lisina es el
sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y
desaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores
de la produccin de cido sulfhdrico.
El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual
o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.
Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el
medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta.
La produccin de sulfuro de hidrgeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio
debido a la formacin de sulfuro de hierro.
COMPOSICION:

Frmula (en gramos por litro)


Peptona de gelatina 5.0
Extracto de levadura 3.0
Glucosa 1.0
Lisina 10.0
Citrato de hierro y amonio 0.5
Tiosulfato de sodio 0.04
Prpura de bromocresol 0.02
Agar 15.0
pH final: 6.7 0.2
FUNDAMENTO DE AGAR SIMMONS CITRATO.

Medio utilizado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la capacidad de


usar citrato como nica fuente de carbono y energa.

Fundamento

En el medio de cultivo, el fosfato monoamnico es la nica fuente de nitrgeno y el


citrato de sodio es la nica fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios
para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el
magnesio es cofactor enzimtico. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y
el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El
medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar
citrato como nica fuente de carbono, usan sales de amonio como nica fuente de
nitrgeno, con la consiguiente produccin de alcalinidad.

El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato


permeasa, a travs del ciclo del cido tricarboxlico. El desdoblamiento del citrato da
progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este ltimo, en presencia de un medio
alcalino, da origen a cidos orgnicos que, al ser utilizados como fuente de carbono,
producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es
indicativo de la produccin de citrato permeasa.

Frmula

Suspender 24,2 g del medio deshidratado por litro de agua destilada. Dejar reposar 5
minutos y mezclar calentando a ebullicin durante 1 o 2 minutos. Distribuir en tubos y
esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Enfriar en posicin inclinada.

Siembra

A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar en superficie un inculo ligero ,


usando una ansa sin arrastrar el agar.

Incubacin

A 35-37 C, durante 24-48 horas, en aerobiosis.

Algunos microorganismos pueden requerir hasta 4 das de incubacin.

Resultados

-Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.


-Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo
bacteriano y no hay cambio de color

Limitaciones

-Si se usa un inculo denso para sembl medio de cultivo, puede variar el color del pico
del verde al amarillo-amarronado.

Esto no afecta el color verde del resto del medio de cultivo, pero puede afectar la
visualizacin azul de un resultado positivo.

-Inculos muy densos, pueden originar resultados falsos positivos.

-Cuando se siembra una serie de pruebas bioqumicas a partir del mismo cultivo, se
debe esterilizar la aguja de inoculacin antes de inocular la prueba del citrato o sino
inocularla primero. Cualquier arrastre de materia orgnica puede originar resultados
falsos positivos.

Caractersticas del medio

Medio preparado: verde.

Almacenamiento

Medio deshidratado: a 10-35 C.

Medio preparado: a 2-8 C.


FUNDAMENTO DE AGAR SIM (SULFURO-INDOL-MOTILIDAD):
Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol y de
sulfuro de hidrgeno en un mismo tubo. Es til para diferenciar miembros de la familia
Enterobacteriaceae.
El triptfano es un aminocido
Frmula (en gramos por litro)
constituyente de muchas
Triptena 20.0
peptonas, y Particular-
Peptona 6.1
mente de la Sulfato de hierro y amonio 0.2 triptena,
que puede ser Tiosulfato de sodio 0.2 oxidado por
algunas bacterias Agar 3.5 para formar
indol. En el pH final: 7.3 0.2 proceso
interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina
con el aldehido del reactivo de Kovacs o de Erlich, para originar un compuesto de color
rojo. Las cepas mviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen
alrededor de la puncin de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de
sulfhdrico se distinguen por la formacin de un precipitado negro de sulfuro de hierro a
partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.
FUNDAMENTO DE AGAR TSI

Medio universalmente empleado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la


fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de cido sulfhdrico.
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes
adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los
hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la
produccin de cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe 3+
, los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color
negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance
osmtico.
Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del
indicador rojo de fenol,el cual vira al color amarillo en medio cido. El tiosulfato de
sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro
proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro.

Frmula (en gramos por litro)


Extracto de carne 3.0
Pluripeptona 20.0
Cloruro de sodio 5.0
Lactosa 10.0
Sacarosa 10.0
Glucosa 1.0
Sulfato de hierro y amonio 0.2
Tiosulfato de sodio 0.2
Rojo de fenol 0.025
Agar 13.0
pH final: 7.3 0.2

PARTE EXPERIMENTAL DE LA BIBLIOGRAFA CONSULTADA.


MATERIALES Y MTODOS
- Aislamiento de Salmonella spp: Se analizaron un total de 50 muestras de pescado
fresco expendido en diferentes lugares de venta de la ciudad de Pamplona, 25
correspondieron a muestras de lugares formalmente establecidos y las otras 25 fueron
obtenidas a partir de las ventas callejeras de la Ciudad.
Para el aislamiento de Salmonella spp. Se realiz la comparacin entre la tcnica
tradicional y la basada en el empleo del Caldo Salmosyst de la siguiente manera: para
el mtodo tradicional, se tomaron 25 g de la muestra y se homogeneizaron en 225 ml
de agua de peptona tamponada de Merck incubando a 37C por 18-20 horas.
Posteriormente se tomaron 0,1 ml y seinocularon en 10 ml de caldo Rappaport-
Vassiliadis de Merck, incubando a 42C/ 24 horas. Transcurrido este tiempo, se
transfiri una asada sobre placas con agar XLD y Rambach de Merck. Las colonias
presuntivas se transfirieron a placas con Agar Nutritivo y se identificaron como se
describe ms adelante.
Para el protocolo Salmosyst se siguieron las siguientes instrucciones: Tomar 25 g de la
muestra y homogeneizar en 225 ml de caldo base Salmosyst de Merck incubando a
37C por 5 horas. Transferir 10 ml de este caldo a un tubo estril y adicionar una
pastilla de Salmosyst y dejar 30 minutos en reposo. Posteriormente agitar
vigorosamente e incubar a 37C/ 18 - 22 horas. Luego tomar
0,1 ml o una asada sembrando sobre placas con agar XLD y Rambach de Merck
incubando a 37C por 24 horas. Con el fin de someterlas a pruebas de identificacin, se
recogieron colonias tpicas al azar que se
subcultivaron en agar nutritivo. Las colonias tpicas en Agar XLD, rojas con o sin centro
negro y en Rambach, rojas, se transfirieron a Agar Nutritivo.
- Identificacin:
A partir de las cepas crecidas sobre el agar nutritivo, se realizaron las pruebas de
tincin de Gram, oxidasa y catalasa. Las cepas que resultaron ser bacilos Gram
negativos, catalasa positiva y oxidasa negativas se identificaron mediante las
siguientes pruebas:
1. Siembra en TSI: La reaccin tpica de Salmonella en este medio es produccin o no
de H2S, pico alcalino y fondo cido.
3. Rojo de Metilo-Voges Proskauer: La mayora de
las cepas de Salmonella dan una reaccin positiva al rojo de metilo y negativa para la
del Voges Proskauer.
4. Siembra en SIM: La mayora de las cepas de Salmonella dan una reaccin positiva
al cido Sulfhdrico, negativa al indol (noproduccin de un anillo rojo en la superficie del
caldo) y positiva a la motilidad.
5. Siembra en Agar LIA: La reaccin tpica de Salmonella es fondo alcalino (prpura)
con o sin produccin de H2S.
6. Siembra en medio con Citrato: La mayora de las cepas de Salmonella son citrato
positivo.

PROCEDIMIENTO:
Esquematizacin del procedimiento del agar SS:
PROCEDIMIENTO DE TINCION
GRAM

1.-

2.-
Realizar el frotis bacteriolgico en
COLORANTE PRIMARIO:
forma circular, tomando de la placa
con la ayuda de una asa, de una Cubrir el frotis con violeta de
colonia representativa. genciana por 2 minutos,
luego lavar con agua
Fijar la muestra pasando el
corriente
portaobjetos sobre la llama del
mechero a una temperatura de 38-
40C.

2D

3.-
Cubrir el frotis con lugol por 1
minuto, luego lavar con agua
corriente.

4.-

Decolorar el frotis con alcohol


acetona al 95% por 1 minuto, luego
lavar con agua corriente.

5.-

COLORANTE SECUNDARIO:

Cubrir el frotis con fucsina bsica


por 2 minutos, luego lavar con agua
corriente.

Secar al medio ambiente


6.-

Observar al microscopio ptico con el


objetivo de 100X, con una gota de
aceite de inmersin al portaobjeto.

PRUEBAS BIOQUMICAS:

ESQUEMATIZACIN DEL PROCEDIMIENTO DEL AGAR LIA:


35g..1000ml
Realizar Clculos Matemticos:
X40ml

X= 1.40g para 40ml de H2O.

En un matraz Erlenmeyer suspender


1,40g del agar pesado + 40ml de agua
destilada. El medio del preparado es de
color violeta.

Dejar en reposo por 5 minutos. Llevar a


estufa, calentar agitando con frecuencia y
ebullicin por 2 minutos hasta la
disolucin completa. Dejar enfriar a 45C
con su respectivo capuchn el matraz.
Esterilizar a 121C durante 15 minutos y
distribuir en 10 tubos de ensayo a 4ml.
Enfriar en pico de flauta los tubos.

Realizar el sembrado con el asa


bacteriolgica la colonia positiva del
agar ss. En pico de flauta.

Esquematizacin del procedimiento del agar Simmons Citrato:


Realizar Clculos
Matemticos:
24.2g..1000ml
X40ml
X= 0.97 g para 40ml de H2O.

En un matraz Erlenmeyer
suspender 0.97g del agar
pesado + 40ml de agua
destilada.

Dejar en reposo por 5 minutos.


Llevar a estufa, calentar
agitando con frecuencia y
ebullicin por 2 minutos hasta
que la disolucin sea completa.
Llevar autoclave a 121C.
durante 15 minutos. Retirar y
dejar de enfria un poco.

Distribuir inmediatamente en
10 tubos de ensayo a 4ml,
Enfriar en pico de flauta los
tubos.
Realizar el sembrado con la
asa bacteriolgica por picadura
profunda con aguja y luego por
estras. luego incubar 24 a 48
horas. Posteriormente observar
la coloracin.

ESQUEMATIZACIN DEL PROCEDIMIENTO DEL AGAR SIM:


Realizar Clculos Matemticos:
30g..1000ml
X40ml
X= 1.2 g para 40ml de H2O.

En un matraz Erlenmeyer suspender 1,2g del


agar pesado + 40ml de agua destilada.

Dejar en reposo por 5 minutos. Llevar a


estufa, calentar agitando con frecuencia y
ebullicin por 2 minutos hasta que la
disolucin sea completa. Dejar enfriar a 45C
con su respectivo capuchn el matraz.
Distribuir en 10 tubos de ensayo a 4ml y
esterilizar a 121C durante 15 minutos.
Enfriar en pico de flauta los tubos.

Realizar el sembrado con la asa


bacteriolgica la colonia positiva del agar ss.
Realizar Clculos Matemticos:
en pico de flauta.
X= 2.5g
para 40ml de H2O.
Medio preparado: color ambar
62.5g..1000ml

X
ESQUEMATIZACIN DEL PROCEDIMIENTO DEL AGAR TSI:
40ml
X= 2,5 gr

En un matraz Erlenmeyer suspender 2,5g del agar


pesado + 40ml de agua destilada.

Dejar en reposo por 5 minutos. Llevar a estufa, calentar


agitando con frecuencia y ebullicin por 2 minutos hasta que la
disolucin sea completa. LLEVAR A AUTOCLAVE a 121C
durante 15 minutos. Dejar enfriar a 45C con su respectivo
capuchn el matraz.

Distribuir en 10 tubos de ensayo a 4ml . Enfriar en pico


de flauta los tubos.

Realizar el sembrado con la asa


bacteriolgica la colonia positiva del agar ss.
en pico de flauta.
RESULTADOS:
MEDIO DE CULTIVO AGAR SS.

MUESTRAS SEMBRADO CRECIMIENTO OBSERVACION INTERPRETACIN


BACTERIANO DE LAS DE
PLACAS RESULTADOS
MERCADO 17 Placas 2 Placas Presentan colonias
con Centro negro.
(Placas #2, #15)
(Productoras de
cido sulfrico)

LA PAZ 12 Placas 6 Placas Presencia del


cambio de color
Garachi Placas: ennegrecimiento del
medio debido a la
Ispi Garachi #4 ;#5
liberacin de
Mauri Ispi #2; #3; #4 sulfuros.

Mauri #1

AGUAS 20 Placas 1 Placas Cambio de color


CALIENTES negruzco debido a la
(Placa # 5) liberacin de
Trucha sulfuros

TOTAL 49 Placas 9 Placas


TINCIN GRAM:
PROCEDENCIA NMERO OBSERVACIN INTERPRETACION DE LA
DE LA DE MICROSCPICA OBSERVACIN
MUESTRA MUESTRA MICROSCPICA
LA PAZ Karachi Se observ bacilos Gram (-).
Placa N4 De color rosado debido al
Placa N5 segundo colorante fucsina
bsica, adems tienen la
capacidad de retener el
segundo colorante debido a a
la presencia de la capa
externa compuesta de
lipopolisacaridos, no retienen
el primer colorante debido a la
capa delgada de
peptidoglicanos.
LLALLAGUA Trucha Se observ bacilos Gram (-) y
Placa N2 cocos aislados de color
Placa N15 rosado debido al segundo
colorante fucsina bsica,
adems tienen la capacidad
de retener el segundo
colorante debido a a la
presencia de la capa externa
compuesta de
lipopolisacaridos, no retienen
el primer colorante debido a la
capa delgada de
peptidoglicanos.
AGUAS Trucha Se observ cocos Gram (-)
CALIENTES Placa N5 de color rosado debido al
segundo colorante fucsina
bsica, adems tienen la
capacidad de retener el
segundo colorante debido a a
la presencia de la capa
externa compuesta de
lipopolisacaridos, no retienen
el primer colorante debido a la
capa delgada de
peptidoglicanos.
PRUEBAS BIOQUMICAS:
Resultados de la prueba bioqumica agar LIA:
Procedencia Numero de resultados Interpretacin de resultados
de la muestra muestras
de pescado. positivas
Criadero del Muestra N 5 La muestra N 5 de pescado
sector aguas (TRUCHA) trucha del criadero del sector
calientes aguas calientes dio un resultado
positivo, porque la la bacteria
Salmonella spp. utilizo la lisina
como su fuente de energa lo
cual se evidencio mediante la
presencia de la enzima lisina
descarboxilasa dando una
coloracin de pico violeta/fondo
Lisina positiva violeta.
Expendio Muestra N 2 La muestra N 2 de pescado
pblico (PEJERREY) especie pejerrey del expendio
Llallagua pblico Llallagua dio un resultado
positivo, porque la bacteria
Salmonella spp. utilizo la lisina
como su fuente de energa lo
cual se evidencio mediante la
presencia de la enzima lisina
descarboxilasa dando una
coloracin de pico violeta/fondo
violeta.

Lisina positiva
Expendio Muestra N 15 La muestra N 15 de pescado
pblico (PEJERREY) especie pejerrey del expendio
Llallagua pblico Llallagua dio un resultado
positivo, porque la bacteria
Salmonella spp. utilizo la lisina
como su fuente de energa lo
cual se evidencio mediante la
presencia de la enzima lisina
descarboxilasa dando una
coloracin de pico violeta/fondo
violeta.

Lisina positiva
Expendio Muestra N 4 La muestra N 4 de pescado
pblico de La (QARACHI) especie qarachi del expendio
Paz pblico de La Paz dio un
resultado positivo, porque la la
bacteria Salmonella spp. utilizo la
lisina como su fuente de energa
lo cual se evidencio mediante la
presencia de la enzima lisina
descarboxilasa dando una
coloracin de pico violeta/fondo
Lisina positiva violeta.
Expendio Muestra N 5 La muestra N 5 de pescado
pblico de La (QARACHI) Lisina positiva especie qarachi del expendio
Paz pblico de La Paz dio un
resultado positivo, porque la la
AGAR CITRATO SIMMONS.
MUESTRTA RESULTADO OBSERVACIONES
Muestra 1 negativo La bacteria no consume
La paz(mauri) el citrato como fuente de
carbono
Muestra2 Positivo La bacteria consume el
La paz(Ispi) citrato como fuente de
carbono
Muestra 3 positivo La bacteria consume el
La paz (Ispi) citrato como fuente de
carbono
Muestra4 positivo La bacteria consume el
La paz (Ispi) citrato como fuente de
carbono
Muestra4 positivo La bacteria consume el
La paz(carachi) citrato como fuente de
carbono
Muestra5 positivo La bacteria consume el
La paz(carachi) citrato como fuente de
carbono
Muestra5 positivo La bacteria consume el
Aguas calientes(trucha) citrato como fuente de
carbono
Muestra 15 positivo La bacteria consume el
Mercado ( pejerrey) citrato como fuente de
carbono
Muestra 2
positivo La bacteria consume el
Mercado pejerrey)
citrato como fuente de
carbono

Resultados de la prueba bioqumica agar SIM:


Procedencia Numero de Resultados Interpretacin de resultados
de la muestra muestras
de pescado. positivas
Criadero del Muestra N 5 Positivo Cambio de color negruzco debido
sector aguas (TRUCHA) (+) a la liberacin de sulfuros
calientes
Expendio Muestra N 2 Positivo Presencia del cambio de color
pblico (PEJERREY) (+) ennegrecimiento del medio debido
Llallagua a la liberacin de sulfuros.

Expendio Muestra N 3 Positivo Presencia del cambio de color


pblico (PEJERREY) (+) ennegrecimiento del medio debido
Llallagua a la liberacin de sulfuros.

Expendio Muestra N 5 Positivo Presencia del cambio de color


pblico de La (QARACHI) (+) ennegrecimiento del medio en el
Paz pico del tubo color fuccia por la
formacion de de un complejo entre
el indol y el p-
dimetilaminobenzaldehido.

Expendio Muestra N 2 Positivo Presencia del cambio de color


pblico de La (ISPI) (+) ennegrecimiento del medio debido
Paz a la liberacin de sulfuros.

Expendio Muestra N 3 Positivo Presencia del cambio de color


pblico de La (ISPI) (+) ennegrecimiento del medio debido
Paz a la liberacin de sulfuros.

Expendio Muestra N 1 Negativo No se observ ningn cambio de


pblico de La (MAURI) (-) color en la muestra como en todo
Paz el tubo de ensayo
RESULTADOS DE LA PUEBA BIOQUIMICA AGAR TSI

PROCEDENCI NUMERO DE INTERPRETACIN DE


A DE LA MUESTRAS RESULTADOS RESULTADOS
MUESTRA DE
PESCADO.
Muestra N 5 Positivo
CRIADERO (TRUCHA)
DEL SECTOR
(+) Se produjo el cambio de
AGUAS color negro, debido a la
CALIENTES liberacin de sulfuros.
Muestra N 2 Positivo
(PEJERREY)
EXPENDIO
(+) Se produjo el cambio de
PBLICO color a color negro, debido
LLALLAGUA a la liberacin de sulfuros.

Muestra N 3 Positivo
(PEJERREY)
EXPENDIO
(+) Se produjo el cambio de
PBLICO color negro.
LLALLAGUA

Muestra N 5 Positivo
(QARACHI)
EXPENDIO
(+) Hubo cambio de color a
PBLICO DE color negruzco.
LA PAZ

Muestra N 2 Positivo Presencia del cambio de


EXPENDIO (ISPI) color a color negro del
PBLICO DE
(+) medio debido a la
LA PAZ liberacin de sulfuros.
Muestra N 3 Positivo cambio de color a color
EXPENDIO (ISPI) (+) negruzco, debido a la
PBLICO DE liberacin de sulfuros.
LA PAZ

Expendio Muestra N 1 Negativo No hubo ningn cambio de


pblico de La (MAURI) (-) color, por tal razn dio un
Paz resultado negativo.
ESTADSTICA DE RESULTADOS:
MEDIO DE CULTIVO AGAR SS:

PRUEBAS BIOQUMICAS.
RESULTADOS DE AGAR LIA:

N de muestras: 45 pescados

Procedencia de la muestra N de Muestras positivas de


muestra Salmonella spp. en Agar
LIA
Expendio pblico de La Paz 15 5
Expendio pblico de Llallagua 15 2
Criadero del Sector Aguas Calientes 15 1
Nmero total 45 8

Interpretacin de resultados:

Del expendio pblico de La Paz de las 15 muestras de pescado (especies


qarachi, ispi) 5 muestras dieron un resultado positivo y 1 muestra de pescado
(especie mauri) dio un resultado negativo en Salmonella spp.
Del Expendio pblico de Llallagua de las 15 muestras de pescado (pejerrey), 2
muestras dieron un resultado positivo en Salmonella spp.
Del Criadero del Sector Aguas Calientes de las 15 muestras (trucha) de
pescado,1 muestras dio un resultado positivo en Salmonella spp.

RESULTADOS DE AGAR CITRATO SIMMONS:


N de muestras: 45 pescados

Procedencia de la muestra N de Muestras positivas de


muestra Salmonella spp. en Agar
Citrato Simmons
Expendio pblico de La Paz 15 5
Expendio pblico de Llallagua 15 2
Criadero del Sector Aguas Calientes 15 1
Nmero total 45 8

Interpretacin de resultados:

Del expendio pblico de La Paz de las 15 muestras de pescado (especies


qarachi, ispi) 5 muestras dieron un resultado positivo y 1 muestra de pescado
(especie mauri) dio un resultado negativo en Salmonella spp.
Del Expendio pblico de Llallagua de las 15 muestras de pescado (pejerrey), 2
muestras dieron un resultado positivo en Salmonella spp.
Del Criadero del Sector Aguas Calientes de las 15 muestras de pescado
(trucha),1 muestras dio un resultado positivo en Salmonella spp.

AGAR SIM:

N de muestras: 45 pescados
Procedencia de la muestra N de Muestras positivas de salmonella
muestra spp. en Agar LIA

Expendio pblico de La Paz 15 4

Expendio pblico de Llallagua 15 2

Criadero del sector aguas Calientes 15 1

Nmero total 45 7

I
nterpretacin de resultados:

Del expendio pblico de La Paz de las 15 muestras de pescado (especies


qarachi, ispi) 5 muestras dieron un resultado positivo y 1 muestra de pescado
(especie mauri) dio un resultado negativo en Salmonella spp.
Del Expendio pblico de Llallagua de las 15 muestras de pescado (pejerrey), 2
muestras dieron un resultado positivo en Salmonella spp.
Del Criadero del Sector Aguas Calientes de las 15 muestras de pescado
(trucha),1 muestras dio un resultado positivo en Salmonella spp.

PRUEBAS BIOQUMICAS.
RESULTADOS DE AGAR TSI:

N de muestras: 45 pescados

Procedencia de la muestra N de Muestras positivas de


Salmonella spp. en Agar Citrato
muestra
Simmons
Expendio pblico de La Paz 15 4
Expendio pblico de Llallagua 15 2
Criadero del Sector Aguas Calientes 15 1
Nmero total 45 7
Interpretacin de resultados:

Del expendio pblico de La Paz de las 15 muestras de pescado (especies


qarachi, ispi) 5 muestras dieron un resultado positivo y 1 muestra de pescado
(especie mauri) dio un resultado negativo en Salmonella spp.
Del Expendio pblico de Llallagua de las 15 muestras de pescado (pejerrey), 2
muestras dieron un resultado positivo en Salmonella spp.
Del Criadero del Sector Aguas Calientes de las 15 muestras de pescado
(trucha),1 muestras dio un resultado positivo en Salmonella spp.