Modelado del proceso de hidrlisis

enzimtica de almidones
gelatinizados del fruto de la planta de
banano

Kevin Alonso Cruz Ruiz

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Minas, Escuela de Procesos y Energa
Medelln, Colombia
2012

-1-
 Modelado del proceso de hidrlisis
enzimtica de almidones
gelatinizados del fruto de la planta de
banano

Kevin Alonso Cruz Ruiz

Tesis presentada como requisito parcial para optar al ttulo de:

Magister en Ingeniera Ingeniera Qumica

Directora:
Ph. D. ngela Adriana Ruiz Colorado
Codirector:
M. Sc. Camilo Alberto Surez Mndez

Grupo de Investigacin de Bioprocesos y Flujos Reactivos (BIO-FR)

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Minas, Escuela de Procesos y Energa
Medelln, Colombia
2012

-2-
Agradecimientos
Guardo un inmenso agradecimiento a mi codirector de Tesis, Camilo A. Suarez, ya que su
gua y consejo fueron invaluables.

La Asociacin de Bananeros de Colombia AUGURA suministr el banano para la

realizacin de los ensayos

Agradezco a las profesoras Tina Jeoh y Diane Beckles por su asesora durante mi
pasanta en la Universidad de Davis, California, quienes me dieron la oportunidad de
trabajar en sus laboratorios y cuya experiencia aportaron a este trabajo y a mi formacin
profesional. Gracias a la profesora ngela Adriana Ruiz Colorado, por sus consejos,
gestiones y oportunas asesoras.

Adicionalmente agradezco a Merquiand (Representante de Genencor) por proporcionar

las enzimas utilizadas en esta investigacin.

Al grupo de investigacin BIO-FR, la Universidad Nacional, DIME y Colciencias en su

programa de Jvenes investigadores aos 2009 y 2010 por su apoyo moral y econmico.
A todos los anteriores y a mi familia por su apoyo emocional.

-3-
Resumen

Se estudi la cintica de hidrlisis enzimtica del almidn de banano a glucosa. Se realiz

un anlisis DSC para conocer la temperatura de gelatinizacin de este almidn; a partir de
estos resultados se evalu del cambio estructural y composicional del material amilceo y
el proceso de pretratamiento trmico, resultando un tiempo de 15min y una temperatura
de 121C como una combinacin para esta etapa previa a la digestin del material
amilceo mediante enzimas.

Para la optimizacin del proceso de hidrlisis enzimtica se utiliz un enfoque estadstico

y fisicoqumico consistente en un diseo factorial exploratorio inicial, un diseo central
compuesto y un anlisis de superficie de respuesta. Como enzima amiloglucosidasa
(AMG) se uso Optidex L400 y como pululanasa Optimax L1000 de Genencor. Las mejores
condiciones para estas enzimas fueron temperatura de 58.9C, pH 4.37, dosis de Optidex
L400 0.47L/gr almidn y dosis de Optimax L1000 0,40L/gr almidn. Para la
caracterizacin de las enzimas, se utiliz la tcnica de electroforesis y cromatografa
lquida para protenas FPLC para la separacin y purificacin de las enzimas
comerciales. En la enzima AMG (Optidex L400) se encontraron dos protenas de 66kDa y
100kDa respectivamente. En la enzima pululanasa (Optimax L1000) se encontr solo una
protena de 90kDa.

Se utiliz la tcnica de HPLC para estudiar la cintica y modelar la degradacin del

almidn por las amilasas en glucosa, maltosa, maltotriosa y dextrinas. Especficamente se
utiliz la AMG de mayor tamao molecular, pues posee mayor actividad sobre el almidn
de banano gelatinizado y la pululanasa sin necesidad de ser purificada, con respecto a la
cintica de degradacin utilizando el modelo cintico de Michaelis-Menten. Se ajustaron
los puntos experimentales a los del modelo para determinar, por medio de una
optimizacin, las constantes cinticas del modelo. El modelo sigue la degradacin de
oligmeros a glucosa teniendo como intermediarios la maltosa, maltotriosa y dextrinas,
siendo este ltimo la fuente principal de produccin del sacrido. El modelo representa
correctamente la fenomenologa de la cintica de los compuestos.

Palabras Claves: fruto del banano, hidrlisis enzimtica, modelamiento matemtico,

almidn

Abstract
The kinetics of enzymatic hydrolysis of banana starch to glucose was studied. A DSC
analysis was performed to determine the starch gelatinization temperature; from these
results the structural and compositional change of the starchy material was assessed by a
thermal treatment process, resulting in a time of 15min and a temperature of 121C as a
combination for this stage prior to the digestion of starchy material by enzymes.

I
To optimize the enzymatic hydrolysis process a statistical and a physicochemical
approach was used, consisting of an initial exploratory factorial design and a central
composite design with response surface analysis. As amyloglucosidase the enzyme
Optidex L400 was used and as pullulanase the enzyme Optimax L1000 was used, both of
them from Genencor. The best conditions for these enzymes were a temperature of
58.9C, pH 4.37, dose of Optidex L400 0.47 L/gr starch and dose of Optimax L1000 0.40
L/g starch. For the characterization of enzymes, we used the electrophoresis technique
and fast protein liquid chromatography or FPLC for separation and purification of the
commercial enzymes. The enzyme AMG (Optidex L400) had two proteins of 66kDa
and100kDa respectively. The enzyme pullulanase (Optimax L1000) had only a 90kDa
protein.

We used the HPLC technique to model and study the kinetics of starch degradation by
amylases into glucose, maltose, maltotriose and dextrins. Specifically, we used the larger
molecular AMG, since it has greater activity on gelatinized banana starch and the
pullulanase without being purified with respect to the kinetics of degradation following a
Michaelis-Menten kinetics model. Experimental and modeled points were adjusted by
optimization in order to determine the model kinetic constants. The model follows the
degradation of oligomers to glucose, with maltose, maltotriose and dextrins as
intermediaries; the last one being the most important source of the sacharide. The model
represents correctly the phenomenology of the kinetic of products.

Keywords: banana fruit, enzymatic hydrolysis, mathematical modeling, starch

II
Contenido

Resumen ............................................................................................................................... I
Lista de Figuras ................................................................................................................... V
Lista de Tablas .................................................................................................................. VII
1. INTRODUCCIN ..................................................................................................... - 1 -
2. OBJETIVOS ............................................................................................................ - 3 -
Objetivo General.......................................................................................................... - 3 -
Objetivos Especficos .................................................................................................. - 3 -
3. ESTADO DEL ARTE ............................................................................................... - 4 -
3.1 Almidn ............................................................................................................. - 4 -
Generalidades ......................................................................................................... - 4 -
Almidn de Banano ................................................................................................. - 6 -
3.2 Hidrlisis de Almidn......................................................................................... - 7 -
Enzimas ................................................................................................................... - 8 -
3.3 Modelamiento de la Hidrlisis Enzimtica....................................................... - 10 -
3.4 Estadstica para la Investigacin..................................................................... - 12 -
Superficie de Respuesta ....................................................................................... - 12 -
4. METODOLOGA .................................................................................................... - 15 -
4.1 Mtodos de caracterizacin ............................................................................ - 16 -
4.1.1 Caracterizacin de la fruta de banano ..................................................... - 16 -
4.1.2 Caracterizacin de enzimas comerciales ................................................ - 16 -
4.2 Pretratamientos ............................................................................................... - 16 -
4.3 Optimizacin de la hidrlisis enzimtica ......................................................... - 17 -
4.3.1 Diseo Experimental ................................................................................ - 17 -
4.3.2 Cintica de hidrlisis enzimtica .............................................................. - 17 -
4.4 Modelado Matemtico de la Hidrlisis Enzimtica .......................................... - 18 -
4.4.1 Modelado de la gelatinizacin de almidn de banano ............................. - 18 -

III
 4.4.2 Modelado de la hidrlisis enzimtica ....................................................... - 19 -
4.4.3 Prueba Estadstica de Ajuste del Modelo ................................................ - 24 -
5. RESULTADOS ...................................................................................................... - 25 -
5.1 Caracterizacin de la Materia Prima ............................................................... - 25 -
5.1.1 Caracterizacin del fruto del Banano ....................................................... - 25 -
5.1.2 Caracterizacin de las enzimas Comerciales .......................................... - 25 -
5.2 Pre-tratamiento del Material Amilceo ............................................................ - 26 -
5.2.1 Temperatura de gelatinizacin................................................................. - 26 -
5.3 Optimizacin del proceso de hidrlisis enzimtica.......................................... - 28 -
5.3.1 Diseo Factorial ....................................................................................... - 28 -
5.3.2 Diseo Central Compuesto ...................................................................... - 31 -
5.3.3 Cintica del proceso de hidrlisis enzimtica. ......................................... - 35 -
5.4 Modelado matemtico de la hidrlisis enzimtica ........................................... - 39 -
5.4.1 Modelado de la Gelatinizacin de Almidn de Banano ........................... - 39 -
5.4.2 Modelado de la Hidrlisis Enzimtica ...................................................... - 42 -
5.4.3 Prueba de Ajuste del Modelo ................................................................... - 50 -
6. CONCLUSIONES .................................................................................................. - 52 -
7. RECOMENDACIONES ............................................................................................. - 54 -
ANEXO 1 ....................................................................................................................... - 55 -
ANEXO 2 ....................................................................................................................... - 57 -
ANEXO 3 ....................................................................................................................... - 59 -
7. REFERENCIAS ..................................................................................................... - 61 -

IV
Lista de Figuras
Figura 1. Molcula de amilosa ........................................................................................ - 5 -
Figura 2.Molcula de amilopectina .................................................................................. - 5 -
Figura 3. Esquema de reaccin, Brandam et al [6]. ...................................................... - 11 -
Figura 4. Diagrama de proceso ..................................................................................... - 15 -
Figura 5. Esquema de reaccin para gelatinizacin de almidn ................................... - 19 -
Figura 6. Esquema de reaccin para la hidrlisis enzimtica de almidn ..................... - 20 -
Figura 7. SDS-PAGE de Optimax L1000 sin purificar por triplicado de Bacillus
licheniformis (comassie protein stain). Lineas: M, marcadores estndares de peso
molecular; 1,2 y 3, ptimax L1000. ............................................................................... - 25 -
Figura 8. SDS-PAGE de Optidex L400 sin purificar Aspergillus niger (comassie protein
stain). Lineas: M, marcadores estndares de peso molecular (BSA); 7, ptidex L400M; 6-
4 Enzima principal; 3-1 Enzima menor. ......................................................................... - 26 -
Figura 9. Calorimetra de barrido diferencial (DSC) para almidn de banano. ............. - 27 -
Figura 10. Fotografas grnulos de almidn de Banano Cavendish, magnificacin 1000X:
(a) 25C, (b) 60C, (c) 75C, (d) 94C y (e) 121C ........................................................ - 27 -
Figura 11. a) Grfica Normal de efectos estandarizados b) Grfica de Pareto de efectos
estandarizados. ............................................................................................................. - 31 -
Figura 12. Grficas de Superficie de Respuesta, teniendo variable de respuesta azcares
reductores. a) TempDosis Enzima, b) pHDosis de Enzima c) TemppH.................. - 32 -
Figura 13. Valores ptimos para las variables del proceso de hidrlisis enzimtica de
materiales amilceos optimizada por Minitab................................................................ - 34 -
Figura 14. Cintica hidrlisis enzimtica () Azcares reductores gr/L. ....................... - 36 -
Figura 15. Cintica hidrlisis enzimtica () Glucosa, () Maltosa y () Maltotriosa
(mg/mL) ......................................................................................................................... - 37 -
Figura 16. Relacin entre la temperatura y el logaritmo de parmetros cinticos para la
gelatinizacin de almidn de banano para 15min de reaccin...................................... - 39 -
Figura 17. Modelamiento de la etapa de gelatinizacin del almidn de banano. a)
Gelatinizacin para 5min a 90 y 80C. b) Gelatinizacin para 10min a 90 y 80C. c)
Gelatinizacin para 5,10 y 15 min a 80, 85, 90 y 95C. ................................................ - 41 -

V
Figura 18. Cromatograma, enzima Optimax L1000. FPLC ........................................... - 42 -
Figura 19. Cromatograma enzima Optidex L400. FPLC ............................................... - 43 -
Figura 20. Cinticas de Michaelis-Menten para Vmax,n y Km,n. ....................................... - 45 -
Figura 21.Esquema de reaccin para la hidrlisis enzimtica. Tomado de Brandam y
Meyer, 2002 [79]. .......................................................................................................... - 47 -
Figura 22. Ajuste de parmetros experimentales para la determinacin de las constantes
cinticas kcat,n (n=1,2 y 4). ............................................................................................. - 48 -

VI
Lista de Tablas
Tabla 1. Propiedades a diferentes etapas de maduracin, adaptado de [25]. ................ - 6 -
Tabla 2. Condiciones para purificacin de enzimas y organismo utilizado. .................... - 9 -
Tabla 3. Efecto desarrollado y cintica de Michaelis-Menten para la hidrlisis de almidn .. -
12 -
Tabla 4. Anlisis de Varianza ........................................................................................ - 13 -
Tabla 5. Niveles y factores diseo factorial central compuesto de la hidrlisis enzimtica. .. -
17 -
Tabla 6. Anlisis Bromatolgico harina de Banano. ...................................................... - 25 -
Tabla 7. Resumen caracterizacin de las enzimas comerciales. .................................. - 26 -
Tabla 8. Diseo factorial exploratorio 24 con 4 puntos centrales. Respuesta, Azcares
Reductores (Az Red) ..................................................................................................... - 28 -
Tabla 9. ANOVA. Efectos y coeficientes estimados para el diseo factorial. ................ - 29 -
Tabla 10. Superficie de Respuesta. Orden de corrida, niveles, valores observados y
predichos. ...................................................................................................................... - 33 -
Tabla 11. ANOVA Sup. de Respuesta, hidrlisis enzimtica de material amilceo. ..... - 33 -
Tabla 12. Resumen valores ptimos del proceso de hidrlisis enzimtica de materiales
amilceos. ..................................................................................................................... - 35 -
Tabla 13. Productividad actual frente a otras referencias de procesos de hidrlisis
enzimtica. .................................................................................................................... - 36 -
Tabla 14. Valor de los parmetros y niveles de confianza determinados para los valores
experimentales. ............................................................................................................. - 40 -
Tabla 15. Valores experimentales, modelados y residuales para la velocidad de
gelatinizacin del almidn de banano. .......................................................................... - 40 -
Tabla 16. Caracterizacin de las protenas encontradas en Optidex L400 y Optimax
L1000. ........................................................................................................................... - 43 -
Tabla 17. Parmetros cinticos y desviacin determinados experimentalmente para la
hidrlisis enzimtica. ..................................................................................................... - 46 -
Tabla 18. Constantes kcat,n para el ajuste de datos experimentales y modelados. ....... - 49 -

VII
Tabla 19. Concentracin de azcares experimentales y modeladas para el clculo de Chi-
cuadro ........................................................................................................................... - 51 -

VIII
 1. INTRODUCCIN
Los biocombustibles se estn convirtiendo en una alternativa viable desde el punto de
vista econmico y ambiental. Es por esto que nace la necesidad de desarrollar proyectos
que contribuyan con el progreso de stos en una regin que posee tantos recursos
naturales disponibles como la nuestra. Un paso en la direccin correcta para sobreponer
los problemas medioambientales sera remplazar los combustibles fsiles con
biocombustibles. El bioetanol sera un buen sustituto de combustibles fsiles ya que
reduce considerablemente la liberacin de dixido de carbono a la atmsfera debido a su
origen renovable [1-3]

Amrica Latina y las Islas del Caribe suministran ms del 90% de las exportaciones
mundiales de banano, Musa Paradisiaca (ms de 16 millones TM), siendo los principales
pases exportadores Ecuador, Costa Rica, Filipinas y Colombia, representando el 60% de
las exportaciones mundiales [4]. Etimolgicamente la palabra Pltano hace referencia a la
planta herbcea de gnero Musa. En Colombia llamamos Pltano el fruto de esta planta,
llamados tambin Banano o Banana, fruto perteneciente a la familia de los pltanos pero,
con diferencias relativas de tamao, color y sabor.

Una quinta parte de todos los bananos cosechados son rechazados, y generalmente su
disposicin se realiza de manera inadecuada, en los ros. Un uso industrial exitoso de los
bananos de rechazo aliviara el problema de disposicin, ofreciendo empleo y retorno
financiero en las zonas afectadas [5]. El fruto de banano tiene potencial energtico para la
produccin de etanol debido a su contenido de almidn. La pulpa del fruto de banano
verde contiene entre 70-80% (peso seco) de almidn, comparable con el trigo, maz y
papa, utilizados para la produccin de bioetanol.

Para la produccin de etanol a partir de almidn, este puede ser hidrolizado en unidades
de glucosa mediante enzimas antes del proceso de fermentacin alcohlica. Usualmente
la hidrlisis enzimtica es realizada mediante procesos secuenciales: gelatinizacin del
almidn, licuefaccin y sacarificacin. Estas dos ltimas mediante el uso de dos enzimas,
-amilasas y amiloglucosidasas (AMG). Cuando el almidn se encuentra en su forma
granular estas enzimas son ineficientes actuando solamente sobre el almidn
gelatinizado [5, 6]. Los principales productos despus del proceso de licuefaccin por la -
amilasa (Bacillus Licheniformis), son oligosacridos con grado de polimerizacin (GP)
menor a 7, entre ellos, la maltosa, maltotriosa y dextrinas como los mayores productos de
degradacin [6-8]. Consecutivamente, la sacarificacin por AMG tiene como principal
producto la glucosa.

La degradacin de polisacridos en unidades de glucosa por va enzimtica puede ser

representada mediante modelos matemticos que permiten predecir el comportamiento
de la reaccin. El modelamiento y la simulacin de procesos han sido herramientas
invaluables en el diseo, control y optimizacin de los procesos qumicos y/o
biotecnolgicos, siendo especialmente importante la simulacin de procesos con base en
modelos fenomenolgicos [9, 10]. Los Modelos Semifsicos de base fenomenolgica,
MSBF se obtienen con base en la fenomenologa subyacente al proceso que se estudia;

-1-
fenomenologa basada en balances de materia, energa (trmica) y cantidad de
movimiento, con los cuales se pueden obtener y relacionar las variables ms significativas
del proceso. La mayora de los MSBF utilizan relaciones constitutivas (es decir,
ecuaciones algebraicas que se formulan a partir del conocimiento del diseo, el control, la
termodinmica fundamental e incluso datos de operacin) [10].

El objetivo de este trabajo incluye la seleccin de condiciones para el pretratamiento

trmico (gelatinizacin) y la optimizacin del proceso de hidrlisis enzimtica de almidn
de banano utilizando enzimas comerciales, ya que presenta un rol importante en la mejora
de la conversin eficiente de almidn a glucosa. Por lo tanto, con este fin se realiza un
diseo factorial exploratorio y un diseo central compuesto con metodologa de superficie
de respuesta. Estas herramientas estadsticas para la optimizacin de procesos fueron
reportadas como exitosas para algunos tipos de procesos de degradacin enzimtica ya
que estas se ajustan muy bien al estudio de los principales efectos e interacciones de las
variables de estudio [11, 12]. La optimizacin del proceso de hidrlisis enzimtica del
material amilceo tuvo como principales variables la temperatura, la dosis de enzimas y
pH, manteniendo la produccin de azcares reductores como variable de respuesta
(dependiente).

Para el modelado del proceso de hidrlisis enzimtica, se requiri de la purificacin y

cuantificacin de las enzimas para la determinacin adecuada de los parmetros
cinticos. Se presenta entonces un modelo matemtico para el proceso simultneo de
licuefaccin y sacarificacin basado en un esquema de reaccin que representa la
produccin de azcares mediante la actividad individual de cada enzima sobre el almidn
gelatinizado.

-2-
 2. OBJETIVOS

Objetivo General

Generar un modelo para la hidrlisis enzimtica que permita representar

matemticamente el rompimiento de enlaces glucosdicos presentes en el almidn
gelatinizado del fruto de banano.

Objetivos Especficos

Caracterizar y cuantificar la composicin y la estructura del material amilceo.

Seleccionar entre los pretratamientos planteados, el mtodo que presente mayor
conversin de azcares con el fin de obtener un material con las caractersticas
necesarias para una eficiente accin enzimtica.
Determinar las condiciones ptimas de hidrlisis enzimtica para las enzimas
seleccionadas, utilizando un diseo experimental factorial y caracterizando una
superficie de respuesta.
Describir la cintica y determinar el rendimiento del proceso de hidrlisis
enzimtica a las condiciones ptimas encontradas.
Construir un modelo que represente la cintica de hidrlisis enzimtica de enlaces
glucosdicos presentes en el almidn gelatinizado del fruto del banano.
Validar el modelo matemtico comparando los resultados de produccin de
azcares obtenidos mediante la simulacin en Matlab y los datos experimentales
obtenidos.

-3-
 3. ESTADO DEL ARTE
En Colombia aparece la produccin de alcohol carburante como una alternativa de
mejoramiento de la calidad del aire de las principales ciudades del pas y, adems, como
una solucin parcial a los problemas de insuficiencia petrolera. Se le llama bioetanol de
segunda generacin al etanol obtenido a partir de biomasa. Esto quiere decir material de
origen biolgico que contiene azcares, pero es clasificado como desecho.

Antioquia cuenta con 850.000 t/ao de banano excedente en la regin de Urab [13] parte
de los cuales generan contaminacin despus de la cosecha y pueden ser aprovechados
mediante procesos biotecnolgicos como materia prima disponible para la produccin de
jarabe azucarado y su posterior fermentacin hasta obtener alcohol. La obtencin de
etanol de segunda generacin presenta un gran desafo en la mejora de su competitividad
a largo plazo con relacin a los costos del proceso, lo cual hace necesario la bsqueda de
materias primas de bajo costo y el empleo de procesos que incrementen la eficiencia de
conversin de la biomasa a azcares fermentables. La optimizacin de procesos entra
como una herramienta til cuando se quiere lograr altas conversiones en estos procesos.

Para la produccin de etanol a partir de material amilceo, es necesario realizar

pretratamientos que faciliten la conversin de los polisacridos de la materia prima a
monmeros de azcares para el proceso de fermentacin. Estos tratamientos sobre la
biomasa son el objeto de estudio de esta investigacin. La particin de polisacridos en
carbohidratos de menor tamao se denomina hidrlisis y se realiz este proceso por va
enzimtica para material amilceo del fruto de la planta del banano.

3.1 Almidn

Generalidades
El principal carbohidrato de reserva sintetizado por las plantas es el almidn, llegando a
constituir una fuente esencial de energa para todos los organismos vivientes,
especialmente el hombre. [14]. Los almidones representan un componente importante en
un largo nmero de productos agroindustriales como el cereal (maz, arroz, trigo) cuyo
contenido de polisacridos vara de 30 a 80%; legumbres (frijol, guisantes, haba) con 25
50%; tubrculos (papa, tapioca) con 6090%, como tambin algunas frutas tropicales
como el banano, cuyo contenido en base seca cuando est verde puede llegar a ser de
70% [15-17]. Qumicamente, el almidn est integrado por dos polmeros de diferente
estructura: la amilosa y la amilopectina. Ambas son molculas de alto peso molecular
organizadas en grnulos semicristalinos (1-100m) y que influyen de manera
determinante en las propiedades sensoriales y reologicas del almidn, principalmente en
su capacidad de hidratacin y gelatinizacin [5].

En la amilosa las unidades de D-glucosa se presentan como anillos de piranos unidos en

-1,4, la unidad de disacrido que se repite es la maltosa. Ver Figura1. Es un polmero de
cadena lineal o recta. El peso molecular de la amilosa vara segn su clase botnica, el

-4-
cuidado puesto en su aislamiento y el mtodo utilizado. La amilopectina, con mayor peso
molecular, es un polmero de unidades de D-glucosa de cadenas ramificadas de longitud
mediana (24 a 30 unidades por ramificacin) con enlaces glucosdicos en la cadena
principal del tipo -1,4 y con enlaces en los puntos de ramificacin del tipo -1,6 formando
de esta manera una estructura ramificada [18,19] (ver Figura 2).

Figura 1. Molcula de amilosa

Gelatinizacin

Los grnulos de almidn son prcticamente insolubles en agua fra, pero a medida que se
incrementa la temperatura cuando estos se encuentran en una solucin acuosa, se
retiene agua y el grnulo empieza a hincharse aumentando de volumen. Cuando se
alcanza una determinada temperatura, el grnulo alcanza su volumen mximo, si se
administra ms calor, el grnulo hinchado incapacitado para retener el lquido se rompe
parcialmente, as la amilosa y la amilopectina se dispersan en el seno de la disolucin. La
gelatinizacin transforma los grnulos de almidn insolubles en una solucin de las
molculas constituyentes en forma individual.

Figura 2.Molcula de amilopectina

A medida que aumenta el volumen de los grnulos, aumenta la viscosidad de la

dispersin acuosa. Cuando los grnulos se rompen, la viscosidad se reduce hasta un
valor estable en el que se produce un gel cuyas caractersticas fsicas y qumicas son
diferentes en cada almidn. La temperatura de gelatinizacin es aquella en la cual se
alcanza el mximo de viscosidad y se pierden la birrefringencia (ndice de refraccin de
los grnulos) y el patrn de difraccin de rayos X. Esta temperatura es realmente un
intervalo, porque as los grnulos provengan de la misma fuente botnica, tienen diferente
composicin y organizacin, lo que origina que unos sean ms resistentes que otros [20,
21].

-5-
 Almidn de Banano
El banano pertenece al orden Zingiberales, familia Musaceae y gnero Musa. Las
especies ms destacadas son: la Musa acuminata que ha dado origen a las variedades
comerciales, Musa balbisiana y Musa acuminata diploide [22]. La palabra banano es un
trmino general que involucra un nmero de especies o hbridos en el gnero Musa, tanto
hbridos obtenidos horticulturalmente a partir de las especies silvestres del gnero Musa
acuminata y Musa balbisiana como cultivares genticamente puros de estas especies.
Convencionalmente, las contribuciones haploides de las especies respectivas a los
cultivares se denotan con las letras A y B. El grupo Cavendish de los cultivares de banano
(M. cavendishii), es el ms utilizado en exportacin (grupo AAA) [5].

Tabla 1. Propiedades a diferentes etapas de maduracin, adaptado de [25].

Etapa Color cascara Almidn Tamao del Azcares Sacarosa Temp. de

(%) grnulo (m)* Reductores (%) (%) gelatinizacin (C)
1 Verde 61.7 6-60 0.2 1.2 74-81
2 Verde 58.6 9-66 1.3 6.0 75-80
3 Verde/traza de 42.4 18-60 10.8 18.4 77-81
amarillo
4 Mas verde que 39.8 18-60 11.5 21.4 75-78
amarillo
5 Mas amarillo 37.6 18-75 12.4 27.9 76-81
que verde
6 Amarillo con 9.7 20-60 15.0 53.1 76-80
puntas verdes
7 Amarillo 6.3 18-60 31.2 51.9 76-83
8 Amarillo/pocos 3.3 15-61 33.8 52.0 79-83
puntos marrn
9 Amarillo/muchos 2.6 -- 33.6 53.2 --
puntos marrn
*Tomado de [ 26]

La composicin del banano cambia dramticamente durante su maduracin. Von

Loesecke [23] clasific la maduracin del banano en 8 etapas de acuerdo a su color de
cscara. El almidn es el principal componente del banano, el cual tiene cambios
importantes durante su maduracin. El promedio del contenido de almidn cae de 70 a
80% durante el periodo de pre-climaterio a menos de 1% al final del periodo de climaterio,
mientras que azcares, principalmente sacarosa, acumula ms de un 10% en el peso en
base seca de la fruta. Los contenidos de azcares solubles totales pueden alcanzar 16%
o ms en el peso en base seca de la fruta (80% en el contenido de humedad), indicando
altas conversiones [24]. En esta hidrlisis del almidn participan principalmente las
amilasas, pero probablemente estas no estn relacionadas a la sntesis de sacarosa [5].

De acuerdo con Velsquez et al [17] la pulpa de banano (Grupo AAA Cavendish)

proveniente de la zona de Urab antioqueo posee un contenido de 74.61.1% de
humedad y un contenido en base seca de almidn del 53.21.1%. Con respecto al
contenido de amilosa en el almidn banano, reportes indican que se encuentra entre 15-
40%. Para banano del grupo Cavendish, Kayisu [27] report un contenido de 16% en
amilosa y Ling [28] un contenido de 19.5%. Para el almidn de banano del grupo Valery,
Garcia [29] report un contenido de 17% y Waliszewski [30] de 40.7% para la amilosa. Por
otro lado almidones de cereal, tpicamente tienen contenidos de amilosa en un rango de

-6-
2025%. El contenido de amilopectina reportado se encuentra con relacin a las cadenas
ramificadas de este polmero con respecto a la amilosa. Las ramificaciones caractersticas
presentadas en la amilopectina de los almidones del banano tienen poblaciones de
cadenas en una relacin molar de 1:6 con respecto a la amilosa [27].

Gelatinizacin en Almidn de Banano

El almidn, cuando se calienta en exceso de agua entra en una fase de transicin de

cambio de orden en su estructura llamada gelatinizacin. Este cambio de fase est
asociado con la difusin de agua dentro del grnulo, hidratacin e hinchazn radial del
grnulo, prdida de birrefringencia entre otras [20]. La temperatura de gelatinizacin
reportada para almidones de banano del grupo Valery se encuentra entre 6770C [30,
31]. Para almidones del grupo Cavendish fue reportado el rango de 70.174.6 C [28].
Para almidones de banano del grupo Macho y Criollo, las temperaturas de gelatinizacin
de 77 y 74C han sido reportadas respectivamente [32, 33].

3.2 Hidrlisis de Almidn

La hidrlisis industrial del almidn comprende 3 etapas sucesivas:

Gelatinizacin: Cuando el almidn es calentado en agua en exceso, este cae en

una fase de transicin; esta fase est asociada con una difusin de agua dentro
del grnulo y posterior regin amorfa, hidratacin e hinchazn radial, prdida de
birrefringencia, prdida del orden de regin cristalina y lixiviacin de la amilosa y
amilopectina.
La licuefaccin o dextrinizacin: es el proceso mediante el cual a partir de un
almidn gelatinizado se obtiene una rpida disminucin de la viscosidad en virtud
de una hidrlisis parcial. En esta etapa se producen polisacridos de longitud
intermedia (maltodextrinas con 5 a 10 unidades de glucosa) y pequeas
cantidades de polisacridos de alto peso molecular, como tambin algunos de bajo
peso molecular (glucosa, maltosa entre otros).
Sacarificacin: a partir de las maltodextrinas de la etapa anterior se completa la
hidrlisis total del almidn a glucosa. En la digestibilidad de almidones como
materia prima, muchos factores como el tamao de particular, relacin de
amilosa:amilopectina, extensin de la asociacin molecular entre los componentes
del almidn, grado de cristalinidad, longitud de la cadena de amilosa y presencia
de complejos lpidos-amilosa, juegan un papel importante en la degradacin
hidroltica [34].

La catlisis enzimtica slamente afecta el almidn gelatinizado. El almidn del banano

parece ser muy resistente a la hidrlisis de enzimas [35-37]. Observaciones
microscpicas revelan que los grnulos del banano estn formados por una forma
irregular con superficies lisas. Esta densa y lisa superficie en los almidones nativos del
banano podran ser parcialmente los responsables de esta resistencia. Mediante estudios
de SEM, Gallant et al [38] demostr que el grnulo de almidn tiene una capa delgada de
bloques que impide la accin de la enzima y reduce la velocidad de hidrlisis. Adems de

-7-
esto, los grnulos de almidn podran estar atrapados en una pared celular residual, y
protegerlos de los ataques enzimticos [5]. De esta forma, se puede concluir que tanto la
resistencia por forma y encapsulado de los grnulos de almidn pueden ser los
responsables de la baja digestibilidad y resistencia al ataque enzimtico, requiriendo ser
gelatinizados para poder ser degradados por enzimas. Los principales almidones
comerciales, como el almidn de maz, son hidrolizados por enzimas (amilasas) las cuales
acceden al interior del grnulo por medio de canales. Los almidones que no contienen
poros, tales como los de la papa y ame, sufren una erosin de la superficie del grnulo.
Los almidones del banano se encuentran en esta ltima categora [5].

Enzimas
El proceso de conversin de almidn gelatinizado a un jarabe glucosado generalmente
est representado en 2 etapas: licuefaccin y sacarificacin. La licuefaccin se presenta
cuando se emplea la enzima -amilasa (durante o despus de gelatinizar el almidn),
cortando las cadenas de los polmeros amilosa y amilopectina en cadenas de tamao
regular, dando como resultado dextrinas, maltosa, maltotriosa y maltopentosa. Para la
produccin de glucosa, se requiere de una segunda etapa consecutiva a la licuefaccin
denominada sacarificacin, adicionando la enzima amiloglucosidasa (AMG) dando como
principal producto la glucosa.

Alfamilasa
La -amilasa, tambin conocida como -1,4glucanohidrolasa; EC 3.2.1.1 es una
glucanasa endoactiva que catalizan la hidrlisis al azar de los enlaces -(1,4) glicosdicos
de la regin central de las cadenas de amilosa y amilopectina excepto en las
proximidades de los puntos de ramificacin [39]. Suckling et al [40] report que la
velocidad de hidrlisis es ms lenta en los enlaces cercanos a los puntos de ramificacin.
La hidrlisis de la amilopectina por esta enzima produce glucosa, maltosa y una serie de
dextrinas que contienen enlaces ramificados conformados por 4 o ms residuos de
molculas de glucosa que presentan enlaces -1,6 provenientes de las uniones
glucosidicas de la estructura original. Los productos obtenidos en mayor concentracin
son maltosa, maltotriosa y maltopentosa, hidrolizando completamente la maltohexosa
[41]. El peso molecular reportado para las -amilasas provenientes de Bacillus
Licheniformis se encuentra alrededor de los 60kDa [41-44].

Pululanasa
Tambin conocida como pulalan 6 glucanohidrolasa, EC: 3.2.1.41 hidroliza los enlaces
glucosdicos -1,6 en el pululan y tiene como producto principal la maltotriosa y maltosa e
hidroliza el almidn para dar como producto principal maltosa [45]. Esta es usada como
enzima complementaria para la hidrlisis de amilopectina junto con la -amilasa. Existen
dos tipos de pululanasas. La pululanasa de tipo I nicamente hidroliza los enlaces -1,6
del pululan [46] y la pululanasa de tipo II que hidrolizan los enlaces -1,6 en el pululan
como tambin los enlaces -1,4 de otros polisacridos. Las pululanasas tienen un peso
molecular que flucta entre 70 y 110kDa [45-47].

Amiloglucosidasa AMG
Conocida como glucoamilasa o amiloglucosidasa EC: 3.2.1.3 es empleada en la
produccin de jarabes glucosados, ya que tiene la capacidad de hidrolizar los enlaces -
1,4 de extremos no reductores de polisacridos para la formacin de glucosa. Esta

-8-
enzima tambin posee la capacidad de hidrolizar enlaces -1,6 a ms baja velocidad,
pudindose completar la hidrlisis de almidn con la combinacin de las tres enzimas -
amilasa, pululanasa y AMG de manera completa. El peso molecular de la AMG puede
variar dependiendo de su fuente. Existen dos tipos de AMG, tipo I y II. Las AMG tipo II
tienden a tener un peso molecular mayor a los 100kDa. Las AMG tipo 1 poseen pesos
moleculares cercanos a 60kDa [48]. El peso molecular de las AMG fngicas tambin
depende de la fuente. Para AMG formadas a partir de Aspergillus niger, su peso
molecular se encuentra entre 60 y 70kDa [8,49-51].

Purificacin de enzimas
En general, las enzimas comerciales se encuentran formando parte un complejo de
mezclas de actividades, formando parte de agregados moleculares, protenas inertes,
cidos nucleicos, polisacridos o lpidos. Para estudiar una en particular, es necesario un
proceso de purificacin. Por muchos aos, enzimas a partir de Aspergillus niger y Bacillus
Licheniformis han sido sujetas a estudio con el fin de entender sus propiedades, procesos
de sntesis, secrecin y produccin. Sus propiedades catalticas especficas han sido
deducidas a travs de la purificacin y separacin mediante tcnicas de cromatografa
liquida de protenas y caracterizadas con electroforesis. La siguiente tabla resume la
metodologa y el organismo usado en la purificacin para cada enzima:

Tabla 2. Condiciones para purificacin de enzimas y organismo utilizado.

-Amilasa
Buffer MW(kDa) pH Columna Organismo Referencia
(50mM Tris) y (50mM 62 8 Q-Sepharose E. coli [52], [53]
Tris, 2M NaCl)
0.01 M fosfato de sodio 28 6.4 Carboximetil B. licheniformis [54]
celulosa
0.025 M Tris-HCl 58 7.3 Sephadex G-100 B. licheniformis [42]
30 mM fosfato de sodio -- 6 -- B. licheniformis [55]
NaCl
20mM fosfato 58 6.8 Starch-Sepharose B. licheniformis [43]
Pululanasa
Buffer MW(kDa) pH Columna Organismo Referencia
fostato, 50 mM. 106 6 DEAE-Cellulose Bacillus sp. [46]
0.01 M fosfato - 0.1 M 92 8 Sephadex G-200 Bacillus sp [47]
50mM NaCl.
Tris-HCl 120 8 DEAE - MonoQ Bacillus sp [48]
NaCl 0.5 M 81.1 8.1 Hiload Q-Sepharose Bacillus [56]
subtilis
AMG Amiloglucosidasa
Buffer MW(kDa) pH Columna Organismo Referencia
0.02 M Acetato de sodio 63 4.5 CM-BIO-GEL A A.niger [8]
citrato/fosfato 63-57 6 acrylamide A.niger [50]
20 mM Acetato de sodio - 0.3 77 4.5 Q-Sepharose A.niger [51]
0.5 M de NaC
100 mM Acetato de sodio -- 6 Filtron tangential A.niger [57]
ultraltration
Acetato de sodio -- 4.5 Sephadex G-25 A.niger [58]

-9-
 3.3 Modelamiento de la Hidrlisis Enzimtica

Un modelo se puede definir como una representacin ms o menos aproximada de un

sistema de proceso [59], bien sea de tipo material (como las "maquetas") o intangible
como matemtico. El modelado matemtico se ha constituido en una poderosa
herramienta del ingeniero para el estudio de los procesos, ya que permite convertir
problemas reales a un lenguaje matemtico y, de esta manera, interpretarlos. Muchos de
los modelos matemticos se construyen mediante experimentacin y observacin, y luego
usan los datos experimentales; stos son los llamados modelos empricos o caja negra
[60]. Las suposiciones que se efectan cuando se establece el modelo estn
determinadas por las bases fundamentales de la descripcin matemtica del proceso, la
cual, a su vez, determina las relaciones matemticas entre las variables del modelo, las
ecuaciones, las constantes o los parmetros en ecuaciones diferenciales, algebraicas u
ordinarias [61].

Brandam et al [6] y Verlinden [62] presentaron un modelo con una constante cintica de
primer orden para la dinmica de gelatinizacin del almidn, con una constante de
velocidad expresada por la ley de Arrhenius con energas de activacin, basadas en la
temperatura del agua y el punto de gelatinizacin de la fuente. La ecuacin que
representa este proceso viene dada por la expresin:

(1)

(2)

Donde representa la velocidad de reaccin para la gelatinizacin de almidn,

concentracin de almidn no gelatinizado, el factor pre-exponencial, energa de
activacin para la gelatinizacin de grnulos de almidn, R la constante de gases ideales
(8.31 J/mol K) y T como temperatura. Los valores de la pendiente de los datos
experimentales de vs temperatura, daran indicio del valor de la energa de
activacin y el factor pre-exponencial .

Para la hidrlisis enzimtica de almidn, varios autores han presentado modelos

determinsticos utilizando la accin de la -amilasa y glucoamilasa representada por
Michaelis-Menten para describir la accin de las enzimas sobre el sustrato [7, 63-67]. En
estos modelos, la accin de la -amilasa tiene como producto principal la formacin de
oligosacridos hasta un Grado de Polimerizacion (GP) GP7 sin incluir la formacin de
dextrinas ramificadas. Por otro lado la accin de la glucoamilasa nicamente tiene como
producto la glucosa.

Lee et al [7] y Akerberg et al [64] consideraron que la licuefaccin por la -amilasa tiene
como productos principales oligosacridos de GP7 siendo la maltosa, maltotriosa y
maltopentosa los compuestos mayoritarios. La consecuente accin de la AMG en la
sacarificacin tiene como producto la glucosa. Los parmetros cinticos de Michaelis-
Menten (Km) y las actividades cinticas de los oligosacridos fueron obtenidos por
subsite mapping theory o teora de subsitios activos, donde la expresin para la

- 10 -
velocidad de reaccin para la liberacin de unidades de glucosa a partir de oligosacridos
es:

(3)

Donde representa la constante de inhibicin por glucosa, es la concentracin del n-

oligosacrido y la constante de Michaelis-Menten para el n-oligosacrido.
Wojciechowski et al [68] present un modelo estocstico mediante un algoritmo de
programacin que simula la hidrlisis de almidn mediante enzimas amilolticas. Este tuvo
como base el mtodo de Monte Carlo y un modelo iterativo cintico para las reacciones
multi-enzimticas con mltiples substratos.

Figura 3. Esquema de reaccin, Brandam et al [6].

El esquema de reaccin de la Figura 3 presentado por Brandam et al [6], propone un

modelo cintico para representar el proceso de degradacin del almidn con enzimas
durante su modificacin trmica para la produccin de cerveza. Se determin el rol
especfico de cada enzima que permiti sugerir un nuevo esquema de reaccin para la
hidrlisis de almidn. Este modelo, permite predecir el progreso de la actividad enzimtica
y -amilasa y la concentracin de carbohidratos fermentables para tres diferentes tipos
de malta. Se encontr que la produccin de carbohidratos se debe al resultado de dos
reacciones simultaneas: una degradacin rpida del almidn gelatinizado a azcares
fermentables y dextrinas por la accin de la -amilasa, catalizando el rompimiento de los
enlaces -1,4 de la amilosa y la amilopectina, y una degradacin ms lenta de las
dextrinas producidas en azcares fermentables.

Cintica de Michaelis-Menten

La cintica de Michaelis-Menten representa la velocidad de reaccin de reacciones

enzimticas. Este modelo es vlido cuando la concentracin del sustrato es mayor que la
de enzima y para cuando la concentracin del complejo enzima-sustrato es constante
(estado estacionario). Para determinar la velocidad mxima (Vmax) de una reaccin
enzimtica, la concentracin de sustrato [S] se aumenta con el fin de saturar los sitios
activos de la enzima y as alcanzar una velocidad constante de formacin de producto.

- 11 -
Yankov et al [69] determin las condiciones optimas de una -amilasa termoestable,
determinando las constantes cinticas de Michaelis-Menten en trminos de la
concentracin del sustrato y la dextrosa equivalente como producto. Se encontr que la
actividad enzimtica es inhibida por altas concentraciones de sustrato y producto. Las
velocidades iniciales se midieron a diferentes concentraciones de sustrato dentro de un
rango de 66-400 gr/L. Desde el dato inicial de velocidad de reaccin para cada
concentracin de sustrato, una lnea recta se obtuvo mediante la grfica de Lineweaver-
Burk. De aqu se obtiene la constante de Michaelis-Menten y la velocidad mxima de
reaccin.

Tabla 3. Efecto desarrollado y cintica de Michaelis-Menten para la hidrlisis de almidn

Efecto desarrollado Cintica propuesta Enzima Autor

Expresin cintica para la Modelo semi-emprico que Exo--amilasa Paolucci
concentracin de oligosacridos describe la concentracin de Jeanjean et
con grado de polimerizacin entre 1 oligosacridos. al. (2000)
y 7.
Cintica para la produccin de Modelo de Michaelis-Menten -amilasa y Lee et al.
glucosa a partir de oligosacridos modificado amiloglucosidasa (1992)
con GP7.
Sacarificacin de trigo a Modelo basado en la cintica -amilasa y Akerberg et
Maltoheptosa como oligosacrido de MichaelisMenten amiloglucosidasa al. (2000)
de mayor unidad, a glucosa por la considerando hidrlisis por caracterizadas por
AMG. ambas enzimas, con HPAEC
dependencia de pH.
Hidrlisis de varias fuentes de Modelo basado en la cintica -amilasa y Dona et al.
almidn, usando resonancia de MichaelisMenten para amiloglucosidasa. (2011)
magntica nuclear oligosacridos de hasta 7
unidades de glucosa.
Para una larga variedad de Modelo basado en la cintica Utilizando el mtodo Baks et al.
carbohidratos, nicamente de MichaelisMenten de Ceralpha para la (2006)
requiriendo un experimento simple actividad de la -
para cada determinacin de Km. amilasa.

3.4 Estadstica para la Investigacin

Superficie de Respuesta
La Metodologa de Superficies de Respuesta es un conjunto de tcnicas matemticas y
estadsticas utilizadas para modelar y analizar problemas en los que una variable de
inters es influenciada por otras. El objetivo es optimizar la variable de inters. Esto se
logra al determinar las condiciones ptimas de operacin del sistema.

Polinomio de segundo orden:

El modelo de segundo orden es el siguiente [71]:

(4)

- 12 -
En ste los son los coeficientes de regresin para los trminos de primer orden, los
son los coeficientes para los trminos cuadrticos puros, los son los coeficientes para
los trminos de producto cruz y es el trmino del error aleatorio. Los trminos
cuadrticos puros y los de producto cruz son de segundo orden. Los parmetros del
modelo se estiman mediante el mtodo de mnimos cuadrados. Una vez que se tienen los
estimadores se sustituyen en la ecuacin y obtenemos el modelo ajustado en el
vecindario del valor ptimo de la respuesta [71]:

(5)

La significancia de los coeficientes estimados y el ajuste del modelo se prueban con el

estadstico F. Este modelo se utiliza cuando queremos estudiar el comportamiento de la
variable de respuesta nicamente en la regin y cuando no conocemos la forma de la
superficie.

Prueba de la significancia de los coeficientes estimados en el modelo ajustado

De acuerdo a Montgomery (2001) [71], para estimar los coeficientes se requieren N k+1
valores de respuesta (Y). El anlisis de los datos de las corridas se presenta en una tabla
de anlisis de varianza. La tabla presenta las diferentes fuentes de variacin que
contribuyen a la variacin total de los datos. La variacin total recibe el nombre de suma
de cuadrados total SST, se calcula de la siguiente manera [71]:

(6)

donde es el valor observado en la u-sima corrida. La suma de cuadrados se compone

por la suma de cuadrados debido a la regresin y la suma de cuadrados no tomada en
cuenta por el modelo ajustado. La frmula de la suma de cuadrados debido a la regresin
es [71]:
(7)

La suma de cuadrados residual, que corresponde a la no tomada en cuenta, se calcula de

la siguiente forma [71]:
(8)

En la Tabla 4 se observa una tabla de anlisis de varianza [71], en ella p representa el

nmero de trminos del modelo ajustado.
Tabla 4. Anlisis de Varianza

Fuente Grados de libertad Suma de cuadrados Media de cuadrados

Regresin p-1 SSR SSR/p-1
Residuo N-p SSE SSE/N-p
Total N-1 SST

La prueba de significancia de la ecuacin de regresin ajustada tiene la siguiente

hiptesis nula H0: Todas las (excluyendo ) son cero contra la alternativa HA: Al menos
una de las (excluyendo ) es diferente de cero. La prueba supone que el error se

- 13 -
comporta normalmente, en sta se utiliza el estadstico de prueba F, el cual se calcula
[71]:
(9)

Este se compara con una F(p-1, N-p), si F calculada excede este valor la hiptesis nula se
rechaza con un nivel de confianza de . Esto significa que la variacin explicada por el
modelo es significativamente mayor que la variacin inexplicable. Adems de esta prueba
se puede hacer un anlisis del ajuste del modelo con la R2, que es la proporcin total de la
variacin de las YuS con respecto a la media que se puede explicar con la ecuacin de
regresin ajustada. Esta se calcula de la siguiente manera [71]:

(10)

- 14 -
 4. METODOLOGA
Se caracteriz fruta de banano luego del ser secada y molida en almidn, y se realiz la
evaluacin del cambio estructural y composicional de la materia prima amilcea para
evaluar el proceso de pretratamiento trmico (gelatinizacin) como opcin previa a la
digestin del material amilceo. La Figura 4 resume el proceso utilizado para la
gelatinizacin e hidrlisis enzimtica. Para la optimizacin del proceso de hidrlisis
enzimtica se utiliz un enfoque estadstico y fisicoqumico consistente en un diseo
factorial exploratorio inicial, un diseo central compuesto y un anlisis de superficie de
respuesta seguido de un estudio de la cintica de reaccin a las condiciones de operacin
que reportaron los mayores rendimientos. Para el modelamiento, se hizo necesario la
purificacin y separacin de las enzimas para luego estudiar la cintica de degradacin
del almidn en oligmeros. Se construy un modelo segn la actividad de cada enzima
sobre el sustrato, la determinacin de parmetros cinticos y validacin del modelo.

Figura 4. Diagrama de proceso

- 15 -
 4.1 Mtodos de caracterizacin

4.1.1 Caracterizacin de la fruta de banano

La materia prima empleada fue Musa (Grupo Cavendish) cultivada en la regin de Urab
en el departamento de Antioquia (Col), en un estado de maduracin entre 0 2 segn
escala de color que comprende 8 etapas, donde cero es totalmente verde, y 8 maduro [5].

El material amilceo se someti a un lavado, reduccin de tamao (tamao promedio:

5mm), secado (60C por 3 das) y pulverizacin con el fin de obtener un polvo de almidn
de banano. La caracterizacin del material amilceo (fruta) se realiz utilizando la tcnica
de Polarimetra durante el anlisis bromatolgico.

4.1.2 Caracterizacin de enzimas comerciales

Se utilizaron las enzimas OPTIMAX L-1000 (pululanasa tipo II, ver ficha tcnica, Anexo
2) que cataliza la hidrlisis de enlaces glucosdicos ramificados (1,6--D) en la
amilopectina y dextrina para producir oligosacridos lineales con cadenas de enlaces
glucosdicos (1,4--D) y OPTIDEX L-400 (ver ficha tcnica, Anexo 3) que cataliza la
liberacin de unidades sucesivas de unidades de glucosa partir de terminales no
reductoras de dextrinas y cadenas de oligosacridos mediante la hidrlisis de enlaces
glucosdicos lineales (1,4--D) y ramificados (1,6--D).

Para determinar la concentracin de las enzimas comerciales, se uso el reactivo Bradford

Reagent de Sigma Aldrich, utilizado por Bradford (1976) [73] y concentraciones (0,3 0,8
mg/mL protena) de Albmina de Suero Bovino o BSA (por siglas en ingls) como
estndar.

Para determinar el peso molecular de las enzimas, se utiliz la electroforesis de protenas,

realizada en una celda con un sistema discontinuo XCell SureLockTM de 600mL para la
cmara de buffer inferior y de 200mL para la cmara de buffer superior. Para este
propsito se usaron geles en buffer 10x Tris/Glicina NuPAGE con una concentracin del
12% Tris/HCl SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato
sdico) durante 50min a 200V y 100mA. La muestra se desnaturaliz usando el buffer
para muestras NuPAGE LDS y el agente reductor de NuPAGE. Luego de la
electroforesis el gel fue incubado por 12h y teido con Coomassie Blue (Bio-Rad) a
temperatura ambiente. Los geles fueron fotografiados con Molecular Imager Gel Doc
XR System para un mejor contraste y para determinar el peso molecular, se utiliz el
marcador Precision Plus Protein Dual Color Standards #161-0374 (Bio-Rad).

4.2 Pretratamientos

Las muestras se prepararon mezclando la harina de banano (10gr), agua destilada

(200mL) y ajustando el pH a 4,3 para luego gelificar esta mezcla liquida por 20min y 25-
60-75-94-121C. Las anteriores condiciones se ajustaron mediante pre-ensayos. Con

- 16 -
esto, se estudi el cambio estructural del almidn durante el pretratamiento trmico con
un microscopio ptico (1000X) y la tcnica de Calormetro de Barrido Diferencial, DSC
por sus siglas en ingles, con el fin de obtener un material con las caractersticas
necesarias para una eficiente accin enzimtica.

4.3 Optimizacin de la hidrlisis enzimtica

4.3.1 Diseo Experimental

Para la optimizacin del proceso de hidrlisis enzimtica se utiliz un enfoque estadstico
y fisicoqumico consistente en un diseo factorial exploratorio inicial, un diseo central
compuesto y un anlisis de superficie de respuesta seguido de un estudio de la cintica
de reaccin a las condiciones de operacin que reportaron los mayores rendimientos. La
prueba estadstica se aplic a los valores residuales para determinar si hay alguna
correlacin significante basada en su orden de ocurrencia de acuerdo a los datos. La
optimizacin del proceso de hidrlisis enzimtica tuvo como principales variables la
temperatura, la dosis de enzimas y pH, manteniendo la produccin de azcares
reductores como variable dependiente, para la degradacin del almidn. Se utilizaron 10gr
de harina de banano aforados a 200mL de agua destilada, ajustando los factores al nivel
de la prueba.

Tabla 5. Niveles y factores diseo factorial central compuesto de la hidrlisis enzimtica.

Diseo Factorial Diseo Central Compuesto

Factor Nivel Nivel
Temperatura(C) 55 65 58 62
pH 3.5 5.0 4.0 4.5
E/S (l/g) Optidex 0.2 0.6 0.3 0.5
E/S (l/g) ptimax 0.2 0.6 -- * -- *
*Para el diseo central compuesto el factor E/S Optimax no se evalu debido a que result no
significativo durante el estudio exploratorio de los factores (ver en el captulo de resultados)

4.3.2 Cintica de hidrlisis enzimtica

Se realizaron dos cinticas bajos las condiciones ptimas encontradas.

Cintica 1: Las muestras se prepararon mezclando la harina de banano (10gr) y agua

destilada aforando hasta 200mL y ajustando el pH con el nivel de la prueba luego de ser
optimizado (pH: 4.35, ver capitulo de resultados) con H2SO4 (0.03%p/p), para luego
gelificar esta mezcla liquida durante 20min y 121C. Las anteriores condiciones se
ajustaron mediante el proceso de optimizacin. Se mantuvo la esterilidad de la mezcla
reaccionante en una cabina de flujo laminar y se esper a que la temperatura alcanzara
los valores correspondientes al resultado optimo del diseo experimental (Temp: 58.9C,
ver capitulo de resultados), momento en que se dosificaron las enzimas PTIMAX L-
1000 y OPTIDEX L-400 (3.37L y 3.96L respectivamente). Finalmente la mezcla fue
llevada a un bao de mara con agitacin constante de 200RPM durante un tiempo de 5
horas a la temperatura propuesta.

- 17 -
Cintica 2: Las muestras se prepararon mezclando la harina de banano (12.5gr) y agua
destilada aforando hasta 250mL y ajustando el pH y la temperatura con el nivel de la
prueba luego de ser optimizado (pH: 4.35 y Temp=58.9C, ver capitulo de resultados). Se
realiz un experimento por triplicado bajo las condiciones optimas del proceso de
hidrlisis enzimtica para describir la cintica del proceso y la productividad del proceso,
estimada con respecto a la concentracin de glucosa, como:

(11)

[Glui] = concentracin inicial de Glucosa antes de empezar la hidrlisis en g/L.

[Glut] = concentracin de Glucosa en el tiempo elegido para calcular la productividad en

g/L

[Alm]i = concentracin de almidn inicial.

t (h) = tiempo con el cual se calcul la productividad en horas.

Para determinar la glucosa, maltosa y maltotriosa al final de la reaccin, se us un

sistema de HPLC Shimadzu, software Shimadzu LC Solution, equipado con un ndice de
refraccin RID-10A. Se us una columna Biorad Aminex HPX-87H 300x78mm, con una
fase mvil de 5mM H2SO4 en agua MilliQ, con un flujo de 0,6mL/min utilizando como
estndares las mismas usadas en los sustratos de las reacciones

4.4 Modelado Matemtico de la Hidrlisis

Enzimtica

4.4.1 Modelado de la gelatinizacin de almidn de banano

Las enzimas no pueden actuar sobre los grnulos slidos de almidn. La catlisis de las
enzimas solo afecta el almidn gelatinizado. El proceso de gelatinizacin es representado
por una reaccin de primer orden (Ecuaciones 1 y 2), de acuerdo con la literatura [6,62]:

(12)

(13)

Donde representa la velocidad de reaccin para la gelatinizacin de almidn,

concentracin de almidn no gelatinizado, el factor pre-exponencial, energa de
activacin para la gelatinizacin de grnulos de almidn, R la constante de gases ideales
(8.31 J/mol K) y T como temperatura.

- 18 -
 Figura 5. Esquema de reaccin para gelatinizacin de almidn

La Figura 5 muestra un esquema del diseo experimental realizado para determinar las
constantes cinticas del modelo. En este, muestras de almidn de banano (2gr de harina)
se aforaron hasta 40mL con agua destilada precalentada a las temperaturas de
gelatinizacin (80C, 85C, 90C y 95C) y se dejaron reaccionar en un Bao de Mara
durante los tiempos de reaccin 5-10-15min respectivamente. La reaccin se detuvo
enfrindola lentamente con un bao de agua y se centrifug, luego se separ la parte
lquida de la slida utilizando un filtro con malla a vacio. El % de almidn en la parte slida
da indicio de cunto almidn se gelatiniz y cunto se encuentra diluido en la parte lquida
apto para el ataque enzimtico. Los ensayos se realizaron por triplicado. Para el
modelado del proceso, se cuantific el almidn inicial segn el mtodo Stitt et al [72].

Estimacin de parmetros

Se hace necesaria la integracin matemtica de la Ecuacin 13, as:

(14)

Donde [Ss]=Sinicial Sgel

(15)

De esta forma, =

(16)

El clculo de los valores de la pendiente de los datos experimentales de vs

temperatura, dan el valor de la energa de activacin y el factor pre-exponencial .

4.4.2 Modelado de la hidrlisis enzimtica

Se propone entonces un nuevo esquema de reaccin (Figura 6) para la hidrlisis
enzimtica donde se involucra la actividad especfica de ambas enzimas y los principales
compuestos formados:

- 19 -
 Figura 6. Esquema de reaccin para la hidrlisis enzimtica de almidn

El esquema de reaccin presenta la degradacin enzimtica del almidn gelatinizado,

donde se considera el rompimiento de los enlaces del almidn por medio de una endo-
amilasa que catalizan la hidrlisis de enlaces glucosdicos ramificados (1,6--D) en la
amilopectina y endo-(1,4--D) en la amilosa para producir cadenas de oligosacridos
lineales de menor tamao con terminales no reductoras, compuestos principalmente por
dextrinas, maltotriosa y maltosa. Por otro lado, una exo-amilasa cataliza la liberacin de
unidades sucesivas de glucosa de terminales no reductores de dextrinas y cadenas de
oligosacridos mediante la hidrlisis de enlaces glucosdicos lineales (1,4--D).

Actividad amiloltica y consideraciones de modelado

Las principales consideraciones luego de pre-ensayos son las siguientes:

El almidn es gelatinizado bajo los efectos de la temperatura.

Las enzimas, carbohidratos iniciales y el almidn gelatinizado pueden ser
considerados como completamente disueltos en la fase liquida de reaccin.
Las enzimas solo actan sobre el almidn gelatinizado.
La accin de la endo-amilasa sobre el almidn gelatinizado solo produce dextrinas,
maltosa y maltotriosa.
La accin de la endo-amilasa sobre dextrinas solo produce maltotriosa y maltosa.
La accin de la exo-amilasa sobre almidn gelatinizado, dextrinas, maltotriosa y
maltosa solo produce glucosa.
El modelo no considera efectos de desnaturalizacin de la enzima o efectos
inhibitorios por sustrato o producto.

Produccin de carbohidratos

La endo-amilasa (pululanasa tipo II) es una enzima capaz de hidrolizar los enlaces (1,6-
-D) en la amilopectina y endo-(1,4--D) en la amilosa para producir cadenas de
oligosacridos lineales de menor tamao. De forma general, la hidrlisis de estos enlaces
puede ser descrita como:

- 20 -
 (17)

Por otro lado, la amiloglucosidasa es una exo-enzima capaz de hidrolizar los enlaces exo-
(1,4--D) en oligosacridos para la formacin de glucosa, representada por:

(18)

Siendo la concentracin del almidn gelatinizado (soluble) con n unidades de

glucosa, la concentracin de la endo-amilasa, la concentracin de la AMG
con actividad exgena, el complejo enzima-sustrato, la concentracin de
unidades de glucosa y consistente de m unidades de glucosa.

A partir del modelo de reaccin de la Figura 6 y el proceso de degradacin a glucosa a

partir de los dems oligosacridos (dextrinas, maltotriosa y maltosa), tenemos, siguiendo
cada ecuacin numerada:

1A:

2A:

3A:

4A:

5A:

6A:

7A:

8A:

9A:

En el Anexo 1 se presentan los balances de masa para cada una de las reacciones (1A a
9A) del sistema. Para la determinacin de las constantes kcat,n, kd,n y ka,n (n=1-9) se
purificaron las enzimas mediante cromatografa de protenas y se determin el peso
molecular de las enzimas purificadas por electroforesis.

- 21 -
Cromatografa lquida de protenas (FPLC)

25mL de AMG (OPTIDEX L-400) fueron diluidos en 500mL de 10mM NaOAc (Acetato
de Sodio) pH: 4.3 mediante un sistema de intercambio de buffer Amicon Millipore,
utilizando nitrgeno como gas inerte y un filtro de poli ter sulfona (NMWL=10,000 y
25mm dimetro). Este proceso se repiti hasta que la conductividad elctrica de la enzima
fuera igual a la del buffer de NaOAc. Este proceso fue realizado bajo condiciones de
refrigeracin durante todo el tiempo.

De igual forma, 25mL de OPTIMAX L-1000 se diluyeron en 500mL de buffer 50mM HCl-
Tris pH: 8 mediante un sistema Amicon Millipore, hasta que las conductividades del
buffer y la enzima fueras iguales.

La cromatografa lquida de protenas (FPLC) de la muestra con AMG (OPTIDEX L-400)

fue llevada a cabo en un sistema GE Healtcare ktaexplorer usando una columna
Resource Q empacada de 1mL. La velocidad de flujo fue de 1mL/min. Luego de la
inyeccin de la muestra, se utiliz un gradiente linear de 100% buffer A/0% buffer B, a 0%
buffer A/100% buffer B [buffer A [(10mM NaOAc pH 4,3)], buffer B [(10mM NaOAc pH
4,3), 0,5M NaCl)]. De igual forma, la cromatografa lquida de la OPTIMAX L-1000 como
endo-amilasa fue llevada a cabo en un sistema GE Healtcare ktaexplorer usando una
columna Resource Q empacada de 1mL. La velocidad de flujo fue de 1mL/min. Luego de
la inyeccin de la muestra se utiliz un gradiente linear de 100% buffer A/0% buffer B, a
55% buffer A/45% buffer B en 20 volmenes. Buffer A [(50mMTris - HCl pH 8)], buffer B
[(50mM Tris -HCl pH 8, 2M NaCl)].

Electroforesis

Para determinar el peso molecular de las enzimas purificadas se llev a cabo

electroforesis de protenas en una celda con un sistema discontinuo XCell SureLockTM de
600mL para la cmara de buffer inferior y de 200mL para la cmara de buffer superior.
Para este propsito se usaron geles en buffer 10x Tris/Glicina NuPAGE con una
concentracin del 12% Tris/HCl SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con
dodecilsulfato sdico) durante 50min a 200V y 100mA. La muestra se desnaturaliz
usando el buffer para muestras NuPAGE LDS y el agente reductor de NuPAGE. Luego
de la electroforesis el gel fue incubado por 12h y teido con Coomassie Blue (Bio-Rad) a
temperatura ambiente. Los geles fueron fotografiados con Molecular Imager Gel Doc
XR System para un mejor contraste y para determinar el peso molecular, se utiliz el
marcador Precision Plus Protein Dual Color Standards #161-0374 (Bio-Rad).

Determinacin de las constantes cinticas (Modelo de Michaelis-Menten)

Se utiliz esta cintica para determinar experimentalmente las constantes cinticas de

Michaelis-Menten del modelo (kcat, KM y Vmax). El tiempo de reaccin para todas las
reacciones fue de 15min. Se emplearon concentraciones de sustrato de 2, 5, 10, 20, 40 y
80mg/mL, 1mL de volumen de reaccin (Tubos Eppendorf, 2mL) en buffer de NaOAc pH
4.38 a una temperatura de 58.9C en un bao de mara. Estas condiciones fueron
determinadas en la optimizacin de la hidrlisis enzimtica.

- 22 -
 AMG
Para la ecuacin 3 se utiliz nicamente la parte soluble luego de gelatinizar el
almidn; para las ecuaciones 6, 8 y 9 Maltosa Monohidratada (mezcla de
anomeros) Sigma Aldrich, 91% Pureza, Maltotriosa MP Biomedicals, 95% Pureza
y Dextrinas Acros Organics, 99% Pureza. Al final de cada reaccin se cuantific la
glucosa producida. A cada reaccin se le agreg la misma cantidad de enzima
purificada (0,001759mg).

Pullulanase
Para las ecuaciones 4 y 5 se utiliz Dextrinas Acros Organics, 99% Pureza. Al final
de cada reaccin se cuantificaron la maltosa y maltotriosa. A cada reaccin se le
agreg la misma cantidad de enzima (9,808e-5mg).

HPLC
Para determinar la glucosa, maltosa y maltotriosa luego de cada reaccin, se us
un sistema de HPLC Shimadzu, software Shimadzu LC Solution, equipado con
un ndice de refraccin RID-10A. Se us una columna Biorad Aminex HPX-87H
300x78mm, con una fase mvil de 5mM H2SO4 en agua MilliQ, con un flujo de
0,6mL/min utilizando como estndares las mismas usadas en los sustratos de las
reacciones.

Estimacin de Parmetros

La determinacin de las constantes cinticas de Michaelis-Menten mediante el desarrollo

experimental fue calculada mediante el diagrama de Lineweaver-Burk empleado como
herramienta grfica para calcular los parmetros cinticos de una enzima. La
representacin grfica de Lineweaver-Burk permite identificar el Km y Vmax; el
punto de corte con el eje de ordenadas es el equivalente a la inversa de Vmax, y el de
abscisas es el valor de -1/Km.

Para el clculo de kcat tenemos:

(19)

El modelo cintico propuesto, fue ajustado a los datos experimentales usando la funcin
para optimizacin fminsearch de Matlab, mediante la minimizacin del cuadrado de la
diferencia entre los valores experimentales de la cintica agregando ambas enzimas y
valores predichos.

Los parmetros fueron obtenidos de manera secuencial, donde fueron predichas las
constantes cinticas kcat, n (n=1,2-4), kd, n (n=1,9) y ka, n (n=1,9) a partir de las ecuaciones
de balance del Anexo 1. Con el objetivo de establecer la calidad del ajuste del modelo
cuando se realiza una optimizacin para los sistemas donde intervienen enzimas, se
seleccionaron estas constantes para su determinacin por medio del ajuste de
parmetros.

- 23 -
 4.4.3 Prueba Estadstica de Ajuste del Modelo
Las pruebas estadsticas constituyen una herramienta muy til para la evaluacin del
ajuste del modelo. El anlisis estadstico de los resultados de estimacin de parmetros
es de fundamental importancia debido a que las variables medidas estn sujetas a
incertidumbres inevitables. Como consecuencia, los valores de los parmetros y las
predicciones del modelo se corrompen por errores experimentales hasta cierto punto. A
pesar de esto, es importante destacar que las pruebas estadsticas se basan
generalmente en el supuesto de que las variables de medicin son sujetas a las
fluctuaciones normales, aunque esta hiptesis es raramente verificada en problemas de
tiempo real. Por lo tanto, si esta hiptesis es incorrecta y el nmero de experimentos es
pequeo, la validez de las pruebas estadsticas es muy cuestionable [81]. Se utiliz la
prueba estadstica de Chi cuadrado (2) siguiendo la metodologa propuesta por Fowler,
2008 [81].

Para los errores no correlacionados, Chi cuadrado es la suma de las proporciones de los
cuadrados de las diferencias entre el modelo y los valores observados, dividido por la
varianza de la incertidumbre:

El nmero de trminos independientes sumados, menos el nmero de parmetros

utilizados en el ajuste se llama el nmero de grados de libertad de de variable aleatoria,
DF, en este caso N-M. Como es una funcin de los errores aleatorios en yi, es de hecho
una variable aleatoria en s, con su propia funcin de densidad de probabilidad y de
distribucin acumulada. Las formas exactas de estas dos funciones dependen de DF, pero
hay dos caractersticas tiles que todos los tienen en comn, y es que la media es DF y
la varianza es 2DF. Por la expresin anterior como una forma rigurosa de definir , los
errores en yi debe ser verdaderamente Gaussianos. Afortunadamente, en la gran mayora
de las aplicaciones prcticas, tratar errores como Gaussianos incluso cuando no es del
todo cierto, es una aproximacin aceptable, especialmente cuando se trata slo de una
funcin de costo a minimizar en algn proceso de adaptacin [82].

- 24 -
 5. RESULTADOS

5.1 Caracterizacin de la Materia Prima

5.1.1 Caracterizacin del fruto del Banano

Mediante anlisis bromatolgico, se cuantific la composicin del producto amilceo
resultante luego de ser secado y molido. Claramente el mayor porcentaje de esta harina
corresponde a almidn, siendo la humedad y otras materiales voltiles quienes
representan un porcentaje menor en la harina, lquidos y slidos alquitranosos. A
continuacin se presenta el resultado bromatolgico realizado a la harina de banano:

Tabla 6. Anlisis Bromatolgico harina de Banano.

Tipo de Alimento Harina de Banano

Anlisis Resultado* Mtodo de Anlisis
Almidn % 84.31.1 Polarimetra
Humedad y Materias Voltiles 8.41.1 Termogravimtrico a 103C (Basado en ISO
6496)
*Resultados en base seca

5.1.2 Caracterizacin de las enzimas Comerciales

Optimax L1000

La caracterizacin de la enzima se resume en la Tabla 7. Se encontr que la pulunanasa

fue homognea por electroforesis bajo condiciones de desnaturalizacin (Fig. 7). Su peso
molecular fue de aprox. 90 kDa estimado por SDS-PAGE. (Fig. 7). Kim et al. [47]
reportaron que la enzima pululanasa derivada de Bacillus Sp tena un peso molecular de
92kD, determinado por SDS-PAGE.

Figura 7. SDS-PAGE de Optimax L1000 sin purificar por triplicado de Bacillus licheniformis (comassie protein
stain). Lineas: M, marcadores estndares de peso molecular; 1,2 y 3, ptimax L1000.

- 25 -
 Tabla 7. Resumen caracterizacin de las enzimas comerciales.

Enzima Actividad enzimtica Concentracin proteica Peso Molecular

especifica* (mg/mL) (kDa)
Optimax L1000 1000 ASPU/g 6,13950,0975 90
Optidex L400 350 GAU/g 93,5953,578 100 - 66
* Tomado de su ficha tcnica.

Optidex L400

La caracterizacin de esta enzima se encuentra en la Tabla 7. Se encontraron 2 protenas

en esta mezcla. Sus pesos moleculares fueron de aprox. 100 y 66 kDa respectivamente
estimados por SDS-PAGE. (Fig. 8) (Ver Fig. 19 para separacin por FPLC). Las AMG tipo
II tienden a tener un peso molecular mayor a los 100kDa. Para AMG formadas a partir de
Aspergillus niger su peso molecular se encuentra entre 60 y 70kDa [8,49-51]. De esto se
puede asumir que la protena de peso molecular 100kDa corresponde al tipo II y la otra
porcin protica al tipo I.

Figura 8. SDS-PAGE de Optidex L400 sin purificar Aspergillus niger (comassie protein stain). Lineas: M,
marcadores estndares de peso molecular (BSA); 7, ptidex L400M; 6-4 Enzima principal; 3-1 Enzima menor.

5.2 Pre-tratamiento del Material Amilceo

5.2.1 Temperatura de gelatinizacin

Los calormetros DSC son capaces de medir la cantidad de calor absorbido o eliminado
durante transiciones de fase de un material; estas transiciones son representadas por la
temperatura de gelatinizacin. En la Figura 9 se presenta un anlisis DSC para el almidn
de banano tipo Cavendish, presentando dos picos negativos de transicin (55C y 140C),
siendo ms significativa la transicin de fase a 120-140C. El pico de 55C indica que se
ha disipado la estructura cristalina del almidn, ms no la solubilizacin total de los
grnulos, acto que si se presenta en el rango de temperatura de 120-140C.

- 26 -
 Figura 9. Calorimetra de barrido diferencial (DSC) para almidn de banano.

Para confirmar la informacin suministrada en el anlisis DSC se realizaron pruebas en un

autoclave (Temp mxima 121C) a diferentes temperaturas (25C, 60C, 75C, 94C y
121C) durante 20 minutos en exceso de solucin acuosa. La Figura 10 muestra
fotografas de grnulos de almidn donde se observa un hinchamiento de los grnulos
entre las temperaturas de 60C y 75C, temperatura que da inicio al proceso de
gelatinizacin; progresivamente se deforma y presenta prdida de estructura a ms de
94C. A 121C la solubilidad de grnulos es total, confirmando la informacin suministrada
por el anlisis DSC, siendo esta ultima temperatura, la opcin de pretratamiento trmico
adoptaba en esta investigacin para la optimizacin de proceso, con el fin de aumentar la
cantidad de almidn soluble en el sistema y mejorar la interaccin enzima-sustrato.
Observaciones similares han sido reportadas por Ling et al. [28], quienes encontraron que
para grnulos de almidn provenientes de Cavendish estos varan tanto en forma como
en tamao al ser sometidos a tratamientos trmicos en soluciones acuosas.

a) b) c)

d) e)
Figura 10. Fotografas grnulos de almidn de Banano Cavendish, magnificacin 1000X: (a) 25C, (b) 60C,
(c) 75C, (d) 94C y (e) 121C

- 27 -
 5.3 Optimizacin del proceso de hidrlisis
enzimtica

5.3.1 Diseo Factorial

Se utiliz Minitab 15 versin estudiantil como software para el diseo experimental. Se
realiz un diseo factorial exploratorio para determinar el nivel de significancia de las
variables de proceso.

La tabla 8 presenta los datos de las 16 corridas con 4 puntos centrales (20 en total) de un
diseo factorial 2k. La primera columna muestra el orden estndar de cada corrida
aleatorizada, en la segunda columna el orden experimental seguido de los puntos
centrales (0, puntos centrales) y los niveles de cada factor.

Por ltimo se tienen los resultados de cada uno de los experimentos, la produccin de
azcares reductores luego de 5 horas de reaccin aadiendo ambas enzimas; se utiliz la
temperatura de 121C y 15min como pretratamiento previo (gelatinizacin) para todas las
reacciones. Se cuantific el almidn inicial en la harina de banano por polarimetra
encontrando un porcentaje de 861% y una cantidad de azcares reductores iniciales de
2.480.10% en peso seco.

Tabla 8. Diseo factorial exploratorio 24 con 4 puntos centrales. Respuesta, Azcares Reductores (Az Red)

OrdenEst OrdenCorrida PuntoCentral Temp (C) pH Optimax Optidex Az Red (mg/mL)

5 1 1 55 3,5 0,6 0,2 33,90
3 2 1 55 5 0,2 0,2 30,97
18 3 0 60 4,25 0,4 0,4 41,96
10 4 1 65 3,5 0,2 0,6 36,83
4 5 1 65 5 0,2 0,2 22,72
9 6 1 55 3,5 0,2 0,6 39,11
7 7 1 55 5 0,6 0,2 33,90
15 8 1 55 5 0,6 0,6 39,95
13 9 1 55 3,5 0,6 0,6 34,98
11 10 1 55 5 0,2 0,6 37,63
8 11 1 65 5 0,6 0,2 27,13
6 12 1 65 3,5 0,6 0,2 35,14
14 13 1 65 3,5 0,6 0,6 34,34
20 14 0 60 4,25 0,4 0,4 41,71
1 15 1 55 3,5 0,2 0,2 35,42
17 16 0 60 4,25 0,4 0,4 43,56
12 17 1 65 5 0,2 0,6 37,63
16 18 1 65 5 0,6 0,6 34,86
19 19 0 60 4,25 0,4 0,4 42,70
2 20 1 65 3,5 0,2 0,2 30,85

La ANOVA (tabla 9) muestra el efecto de las variables en el modelo para cada factor. En
la parte inferior de la tabla, la columna 5 muestra el estadstico-t en lugar de estadstico-F
para cada efecto. Un anlisis individual del estadstico-F es igual a un anlisis del
estadstico-t2. Los valores-p para los dos anlisis son estadsticamente iguales. De esta
forma es equivalente usar un estadstico-t o F para determinar la significancia de un
trmino. Sin embargo, el estadstico-t preserva el signo y por lo tanto la direccin del
efecto.

- 28 -
Anlisis de Varianza Diseo Factorial

Los valores (p) en la tabla de anlisis de varianza (Tabla 9) se utilizan para determinar
cules de los efectos en el modelo son estadsticamente significativos. Normalmente se
observan primero los efectos de interaccin del modelo, porque una interaccin
significativa influir en la manera de interpretar los efectos principales. El valor p es
comparado con el nivel =0,05.

Efectos de interaccin: el modelo contiene efectos de interaccin de dos, tres y cuatro

interacciones.

El valor p de 0.065 y 0,522 para el conjunto de interacciones de tres y cuatro factores

respectivamente no es menor que 0,05. Por lo tanto, no existe un efecto de interaccin
significativo. Es decir, no existe evidencia de que el efecto de tercer y cuarto orden de
cualquier factor dependa del nivel de cualquier otro factor.

Tabla 9. ANOVA. Efectos y coeficientes estimados para el diseo factorial.

Para las interacciones de 1er y segundo orden, el valor p es 0,003 y 0,015

respectivamente, por lo tanto existe un efecto de interaccin significativo. Es decir, existe

- 29 -
evidencia de que los efectos de primer y segundo orden de cualquier factor dependen del
nivel de cualquier otro factor.

Para nuestro caso, el diseo factorial fue propuesto para evaluar las interacciones de
primer orden. Segn la tabla nueve y la anterior conclusin, es adecuado sugerir cuales
de las variables son significativas.

Efectos principales: el modelo contiene cuatro efectos principales, que se pueden

evaluar sin dejar a un lado las interacciones significativas.

El valor p de 0.003 para el conjunto de efectos principales es menor que 0,05. Por lo
tanto, existe evidencia de un efecto significativo. En la parte inferior de la tabla 9
encontramos los efectos y coeficientes estimados para evaluar los efectos principales
individuales.

Para los datos sobre hidrlisis enzimtica, los efectos sugieren lo siguiente:

El efecto del trmino independiente (constante) ejerce por lejos el efecto ms significativo
en el sistema. (34,090). Este trmino es calculado como el promedio global de las
observaciones y cualquier efecto de los tratamientos es solo la diferencia entre el
promedio de los tratamientos y el promedio global. (Montgomery, 1997).

Tambin podra suceder que ninguno de los dems parmetros del modelo fuera
significativo (modelo no significativo), en cuyo caso, Beta cero representara la respuesta
media, con independencia del valor que pudiera tomar cualquiera de las variables
ensayadas como predictores en el modelo. Esta ltima interpretacin solamente sera
vlida para un modelo no significativo; en modelos significativos, esta interpretacin no es
adecuada.

La dosis de enzima Optidex L400 ejerce el efecto ms grande (efecto: 5.661) sobre la
produccin de azcares reductores. Cuando se adicion esta dosis de enzima en un nivel
alto se present una produccin de azcares ms alta que cuando se dosific en el nivel
bajo. De forma contrariamente significativa, la temperatura ejerce el efecto ms negativo
(efecto: -3.296) sobre la produccin azcares reductores. Cuando se configur la
temperatura en un nivel alto se obtiene una produccin de azcares ms baja que la
obtenida al configurar la temperatura en un nivel bajo. De igual forma, cuando se ajust el
pH (efecto: -1,974) en un nivel alto, se obtuvo una produccin de azcares ms baja que
al ajustarlo en un nivel bajo. La relacin fue inversamente proporcional para ambos casos.

La variable menos significativa de efecto principal individual fue la dosis de enzima

Optimax L1000 (efecto: 0,381). Esto lo podemos corroborar con la figuras 11a y 11b. Un
diagrama de Pareto muestra los efectos para comparar la magnitud relativa y la
significancia estadstica tanto de los efectos principales como de interaccin. Minitab
grfica los efectos colocando los valores absolutos de los efectos en orden decreciente.
La lnea de referencia en la grfica indica cules efectos son significativos. Minitab utiliza
un nivel de 0,05 para dibujar la lnea de referencia. Existen nueve efectos significativos (
= 0,05). Estos efectos significativos incluyen tres efectos principales: Temperatura (A), pH
(B) y dosis de enzima Optidex (D). Se puede observar que el efecto individual ms
pequeo es el de la dosis de enzima Optimax (C) porque es el que menos se extiende.

- 30 -
De igual forma la grfica Normal de Efectos Estandarizados, compara la magnitud relativa
y la significancia estadstica tanto de los efectos principales como de interaccin. Minitab
dibuja una lnea para indicar donde deberan estar ubicados los puntos si todos los
efectos fueran cero. Los puntos que no se sitan cerca de la lnea generalmente sealan
efectos significativos. Claramente los principales efectos de Temperatura, dosis de
enzima Optidex y la interaccin pH-Optidex son los ms significantes porque se
encuentran fuera de la lnea del promedio de efectos estandarizados. Como variable
individual, la dosis de enzima Optimax L1000 es la menos significativa.

De esta forma, a partir del anlisis de los resultados estadsticos se encontr que la
enzima ptimax L1000 no resulta ser un factor significativo como variable individual sobre
el rendimiento para la produccin de azcares reductores, aunque algunas de sus
interacciones con las dems variables s presenta significancia estadstica, especialmente
la interaccin con la dosis de enzima Optidex L400, esto probablemente debido a alguna
sinergia entre las dos enzimas y su accin combinada de actividad exo-endo lo que
generara una mayor cantidad de extremos con azcares terminales para el
funcionamiento correcto de la otra enzima. Por lo tanto en el diseo de superficie de
respuesta este factor (concentracin de enzima ptimax L1000) se fij en 0,4 E/S (l/g).
Las dems variables, temperatura y pH presentan efectos principales tanto de interaccin
como individuales.

Figura 11. a) Grfica Normal de efectos estandarizados b) Grfica de Pareto de efectos estandarizados.

5.3.2 Diseo Central Compuesto

Se realiz un diseo central compuesto para la obtencin de la regin de operacin y los
valores que optimizan el proceso. Los experimentos realizados de acuerdo al diseo
experimental (Tabla 5) tienen como variable de respuesta azcares reductores (mg/mL)
luego de 5 horas de hidrlisis. La tabla 10 muestra el orden de cada ensayo, el nivel
usado, el valor observado, predicho y residual. En la Figura 12 se presentan las
superficies de respuesta mostrando el efecto que tienen las variables temperatura, pH,
dosis de enzima (Optidex L400) y su efecto combinado sobre la produccin de azcares
reductores [mg/mL].

- 31 -
 a) b)

c)

Figura 12. Grficas de Superficie de Respuesta, teniendo variable de respuesta azcares reductores. a)
TempDosis Enzima, b) pHDosis de Enzima c) TemppH.

Los resultados de un modelo de superficie de respuesta de segundo orden son mostrados

por el anlisis de varianza de la tabla 11. El valor F [F = 13.52] con un valor de
probabilidad pmodel > F = 0.000 demuestra que la regresin del modelo es significativa
[11]. El ajuste del modelo fue comprobado mediante la determinacin del coeficiente de
ajuste (R2). En este caso, el valor de coeficiente (0,9240) indica que solo el 7,6% del total
de las variaciones no son explicadas por el modelo, a pesar de tener un coeficiente
ajustado bajo (0,8557) [11].

El coeficiente de correlacin de Pearson (R=0,9612) de igual manera justifica una

adecuada correlacin entre las variables independientes. Ahora, si bien este no es
considerado un valor alto, la falta de ajuste (variacin debido a lo inadecuado) del modelo
con un valor p de 0,173 mayor que 0,05 evidencia de que el modelo si explica
adecuadamente la variacin en las respuestas.

La aplicacin de la metodologa de superficie de respuesta resulta en la siguiente

regresin (Ec. 21), la cual es una relacin emprica entre las variables y la respuesta de
azcares reductores en unidades descodificadas [71]:

(21)

El valor negativo de B0 en la variable constante no est incluido en el rango de evaluacin.

En este caso no se tiene ninguna interpretacin y se dejar nicamente como un trmino
de ajuste del modelo. Cualquier intento de interpretarlo bajo tales condiciones (cuando no
se explor la regin cero de los predictores) constituira una extrapolacin.

- 32 -
 Tabla 10. Superficie de Respuesta. Orden de corrida, niveles, valores observados y predichos.

Corrida Temp C pH Optidex Valor Observado* Valor Estimado* Residual (yi- (i))2
1 60,00 3,84 0,40 31,18 32,63 1,44 2,09
2 56,73 4,25 0,40 36,77 37,26 0,49 0,24
3 60,00 4,25 0,40 41,47 41,47 0,01 0,00
4 60,00 4,66 0,40 35,37 37,78 2,41 5,81
5 60,00 4,25 0,56 39,10 41,02 1,92 3,70
6 63,27 4,25 0,40 31,01 34,38 3,37 11,34
7 60,00 4,25 0,40 40,37 41,47 1,11 1,23
8 60,00 4,25 0,24 35,79 37,72 1,93 3,37
9 60,00 4,25 0,40 40,79 41,47 0,68 0,47
10 58,00 4,00 0,50 34,32 35,44 1,13 1,27
11 60,00 4,25 0,40 40,96 41,47 0,52 0,27
12 62,00 4,00 0,50 35,08 35,92 0,85 0,72
13 62,00 4,00 0,30 34,87 34,92 0,05 0,00
14 62,00 4,50 0,30 34,36 34,82 0,46 0,21
15 58,00 4,50 0,50 40,32 41,86 1,53 2,35
16 60,00 4,25 0,40 39,35 41,47 2,12 4,51
17 58,00 4,00 0,30 30,51 32,26 1,75 3,08
18 62,00 4,50 0,50 35,84 35,68 -0,16 0,03
19 60,00 4,25 0,40 38,88 41,47 2,59 6,70
20 58,00 4,50 0,30 38,08 38,82 0,74 0,55
PRESS 48,27
* Valores en Azcares Reductores (mg/mL)

Tabla 11. ANOVA Sup. de Respuesta, hidrlisis enzimtica de material amilceo.

Allen, 1971, sugiri el uso de la Suma de Cuadrados del Error de Prediccin (estadstico
PRESS), definida como la suma de residuales PRESS al cuadrado como medida de la
calidad del modelo, definido como:

(22)

- 33 -
Con el estadstico PRESS se puede calcular un estadstico parecido a R2 para la
prediccin, de la siguiente forma:

(23)

De acuerdo con la Tabla 11, la suma de cuadrados totales es 225,182. Tenemos de la

ecuacin 22 y 23:

Por consiguiente, cabria esperar que este modelo explicara un 78% de la variabilidad
cuando se predigan nuevas observaciones. Parece satisfactoria la capacidad predictiva
del modelo en general, sin embargo recurdese que los residuales PRESS individuales
indicaron que puede ser que las observaciones parecidas a la corrida 6 de la tabla 10 no
sean bien pronosticadas (residual 3,37), esto es, cuando la temperatura se encuentra en
los niveles altos.

Figura 13. Valores ptimos para las variables del proceso de hidrlisis enzimtica de materiales amilceos
optimizada por Minitab.

Las grficas de la metodologa de superficie de respuesta en funcin de dos factores a la

vez son tiles en la comprensin de los efectos principales y de interaccin de cada uno
de los dos factores analizados. Estos grficos se pueden obtener resolviendo el modelo
de regresin. En las figuras 12a y 12c para cada variable, muestra que las pendientes de
cada curva dependen del nivel de la otra, mientras que la grfica 12b muestra que el pH
es casi independiente del nivel de enzima. Comparando las figuras 12a y 12b, parece ser
que el efecto de la enzima es ms importante cuando se combina con la temperatura ms
que con el pH, donde es casi una lnea horizontal durante la relacin de dosis. As, se
muestra que la dosis de enzima ptima se encuentra entre 0,4-0,5 uls de enzima por
gramo de almidn, para la temperatura alrededor de 60C y pH 4,35 respectivamente.

- 34 -
 Tabla 12. Resumen valores ptimos del proceso de hidrlisis enzimtica de materiales amilceos.

Variable Temperatura pH Dosis Optidex L400 Dosis ptimax L1000

Valor ptimo 58,9C 4,37 0,47L/gr almidn 0,4 L/gr almidn

Los valores ptimos de cada variable fueron obtenidos resolviendo la ecuacin de

regresin 21. Los valores ptimos calculados por medio de esta ecuacin son
presentados para el proceso de hidrlisis enzimtica en la Tabla 12 y representados en la
figura 13. Para el modelo estadstico representado por la ecuacin 21 el valor
correspondiente al valor predicho es de 41,25gr AzR/L, con un nivel de confianza en la
representacin de variaciones del 92,40%.

5.3.3 Cintica del proceso de hidrlisis enzimtica.

Para verificar la optimizacin y dar explicacin al fenmeno de la hidrlisis enzimtica, dos
tcnicas de caracterizacin fueron aplicadas a los hidrolizados. Ambas cinticas fueron
llevadas a cabo con las condiciones ptimas encontradas.

Cintica 1. Tcnica de Anlisis con Azcares Reductores

En la figura 14 se presenta la cintica de hidrlisis enzimtica para materiales amilceos

de la planta de banano, usando azcares reductores como variable de respuesta a las
condiciones de operacin ptimas. Las molculas de azcar actan como agentes
reductores siempre y cuando contengan un grupo aldehdo y existan en una estructura de
cadena abierta [76]. La base de la reaccin del DNS es la reduccin del cido 3,5-
dinitrosalicilico al cido 3-amino-5-nitro-salicilico (ANS) y durante este proceso oxidar el
grupo aldehdo del azcar al su respectivo cido del grupo carboxlico [77].

En polmeros de glucosa, tales como almidn y derivados de almidn, encontramos

azcares tales como glucosa, maltosa y macromolculas como maltodextrinas y dextrinas
las cuales inician su estructura con un azcar reductor, un aldehdo libre. De esta forma,
es claro que azcares reductores pueden ser maltosa, maltotriosa, glucosa, dextrinas y
cualquier oligosacrido con diferente tamao molecular, por lo tanto con la determinacin
de azcares reductores no podemos establecer qu tipo de azcares se estn generando.

Luego de 5 horas de hidrlisis se alcanz una concentracin de 40,76gr AzR/L,

obteniendo una diferencia del 1,18% con respecto al valor predicho por el modelo y un
rendimiento del 91.90% con respecto a la cantidad inicial de almidn. Ambos resultados
fueron satisfactorios al ser comparados con el balance de materia del proceso, el cual
muestra que el almidn inicial (42gr/L) es degradado casi en su totalidad en azcares
reductores.

- 35 -
 Figura 14. Cintica hidrlisis enzimtica () Azcares reductores gr/L.

La productividad del proceso, calculada con base en azcares reductores y al almidn

inicial, para 5 horas de proceso resulto en:

Es claro que este proceso presenta altas productividades comparadas con otras fuentes
bibliogrficas (Tabla 13) donde trabajan la hidrlisis enzimtica. Cabe resaltar que en el
trabajo realizado por Montes y Crdoba, 2004 tambin se utiliz banano verde de
rechazo, siendo las condiciones de proceso utilizadas en el presente estudio ms
favorable en trminos de productividades, mientras que la alta productividad encontrada
por Flrez y Uribe, 2000 se debe principalmente al uso de maltodextrina pura para la
produccin de glucosa con glucoamilasa libre e inmovilizada. El uso de un sustrato
susceptible al ataque enzimtico incrementa la conversin a azcares finales.

Tabla 13. Productividad actual frente a otras referencias de procesos de hidrlisis enzimtica.

Trabajo Montes y Botero y Alzate, Flrez y

Fuente actual Crdoba, 2004 Prez, 1993 2003 Uribe, 2000
Productividad (mg/mg-h) 17,09a 12,130 13,33 17,22 19,44
18,81b
a
Determinado con HPLC
b
Determinado con azcares reductores

Cintica 2. Tcnica de Anlisis con HPLC

Para la siguiente prueba se cuantific el contenido de almidn en la muestra inicial

siguiendo el mtodo de Stitt et al [72]. Para 100mg harina de banano, se encontr que
esta tena 67.250,0513mg de almidn. En la Figura 15 se presenta la cintica de

- 36 -
hidrlisis enzimtica para el material amilceo de la planta de banano, usando las
condiciones de operacin encontradas como puntos ptimos para las variables del
proceso (Tabla 12). Luego de 5 horas de hidrlisis se alcanz una concentracin de
29,0280,708 mg glucosa/mL, obteniendo una conversin del 86% con respecto a la
cantidad inicial de almidn. La cantidad inicial de glucosa fue de 0,3150,0218mg
glucosa/mL. El experimento se realiz por triplicado.

Los resultados fueron satisfactorios al ser comparados con el balance de materia del
proceso, el cual muestra que el almidn inicial (8.4gr, para 12.5gr de harina de banano) es
degradado casi en su totalidad en glucosa. Los dems compuestos, maltosa y maltotriosa,
resultaron en una concentracin de 1.110,664 y 0.290,056 mg/mL respectivamente. La
conversin sumando la cantidad en gramos de maltosa y maltotriosa, conllevan a un
porcentaje de 90.49%. El 9.51% restante, podra corresponder ya sea a las fracciones de
almidn cristalizadas no gelatinizadas o a la fraccin hidrolizada de almidn que se
convirti en dextrinas u oligosacridos. Los picos en concentracin de Maltosa y
Maltotriosa se logran entre 120 y 180 minutos (Maltosa: 0,678mg/mL y Maltotriosa:
0,619mg/mL) aunque al cabo de 15 minutos ya se haya logrado casi el 60% de esta
concentracin para maltosa y del 70% a los 30 minutos para maltotriosa.

Figura 15. Cintica hidrlisis enzimtica () Glucosa, () Maltosa y () Maltotriosa (mg/mL)

Para 5 horas de proceso, se obtuvo una productividad de 17,09 mg/mg-h a las

condiciones de operacin ptimas para las variables del proceso (Tabla 11).

- 37 -
Las conversiones que son similares, es decir la cantidad de azcares reductores que se
obtienen al cabo de 5 horas (91,90%) comparado con la cantidad de glucosa, maltosa y
maltotriosa al cabo del mismo tiempo (90,49%), corroboran que la accin de ambas
enzimas independientemente de la cantidad de almidn inicial (la variable dosis de
enzima, se optimiz para la relacin enzima-sustrato), logran la hidrlisis del almidn en
azcares en ms del 90%. Ambas cinticas ayudan a concluir sobre cmo estn actuando
las enzimas sobre el almidn.

Si bien la tcnica de anlisis de azcares reductores da inicialmente una mayor velocidad

en la cintica, no podemos establecer el tamao de los azcares que se estn generando.
La enzima Optimax L1000, la cual fue seleccionada por su accin endgena, es la enzima
que ms rpido acta sobre el almidn, dando explicacin a porque no fue una variable
individual significativa en el diseo factorial, mas si una variable significativa por sus
interacciones, y lo podemos corroborar con la cintica de la tcnica de azcares
reductores, pues la pendiente inicial de esta curva de concentracin es mucho ms rpida
que la pendiente de la cintica usando la tcnica de HPLC. sta pendiente inicial alta de
concentracin es debido a la formacin de oligosacridos de tamaos GP10 formados
por la enzima Optimax L1000, y que no se determinaron por la tcnica HPLC la cual
muestra nicamente que la concentracin de azcares de menor tamao es apenas
mnima durante los primeros 30 minutos y durante toda la hidrlisis(maltosa y maltotriosa),
lo que nos lleva a definir que la hidrlisis por la enzima Optimax L1000 seleccionada para
la formacin de oligosacridos, tienen una velocidad de hidrlisis alta para la produccin
de polisacridos y baja para la produccin de oligosacridos de menor tamao (maltosa y
maltotriosa). Esto probablemente a que la velocidad de catlisis de esta enzima disminuye
conforme se est hidrolizando las cadenas de polisacridos que conforman el almidn,
as, a medida que la hidrlisis se desplaza a los extremos de la cadena glucosada, la
afinidad por el sustrato disminuye.

Por otro lado, la enzima Optidex L400 purificada, encargada de la formacin de Glucosa
parece tener el mismo inconveniente con la hidrlisis de maltosa y maltotriosa. La
concentracin relativamente constante de estos compuestos se debe a la pausada accin
de esta enzima, donde nicamente al final de las 5 horas se nota una disminucin en la
concentracin de maltosa y maltotriosa. Esto se debe a que la enzima tiene una afinidad
por oligomeros, y durante el transcurso de la reaccin los sitios activos de la enzima estn
ocupados con estos, y nicamente al final, se ve el cambio en la concentracin de
dmeros y trmeros.

Siendo la tcnica de HPLC ms confiable por su elevada resolucin permitiendo la

separacin de mezclas la cual no se consigue por la tcnica de DNS, nos ayuda a
determinar la cintica de produccin de glucosa, maltosa y maltotriosa y poder establecer
adecuadamente la forma en que las enzimas estn actuando sobre el substrato almidn.
De esta forma, el modelo matemtico ser alimentado por el anlisis de resultados
obtenidos en este estudio, permitiendo definir cmo acta cada enzima individual sobre el
almidn y dems substratos formados en el intermedio de las reacciones.

- 38 -
 5.4 Modelado matemtico de la hidrlisis enzimtica

5.4.1 Modelado de la Gelatinizacin de Almidn de Banano

La Figura 5 muestra un esquema del diseo experimental realizado para determinar las
constantes cinticas del modelo para un rango de temperaturas entre 80-95C y 15
minutos. El clculo de los valores de la pendiente de los datos experimentales de
vs temperatura, dan el valor de la energa de activacin y el factor pre-exponencial .
Los valores experimentales de Ln(Kg) grficados contra la temperatura (T) se muestran en
la Figura 16.

Figura 16. Relacin entre la temperatura y el logaritmo de parmetros cinticos para la gelatinizacin de
almidn de banano para 15min de reaccin.

Consecuentemente con estos resultados se calcularon los parmetros de las constantes

para la gelatinizacin: energa de activacin y el factor pre-exponencial a partir de
las ecuaciones 13, 14 y 16 para las concentraciones experimentales de almidn
gelatinizado. La tabla 14 resume los parmetros cinticos.

La ecuacin para la propagacin de errores, utilizada para el clculo de la desviacin

estndar de medidas indirectas, es [80]:

(24)

- 39 -
 Tabla 14. Valor de los parmetros y niveles de confianza determinados para los valores experimentales.

Parmetro Valor Desviacin estndar[1]

Gelatinizacin Banano
-1 6 6
kg (s ) 2,55x10 0,57x10
Eg (J/mol) 6,20x104 0,226x104
Gelatinizacin Malta [6]*
kg (s-1) 3,1x1014 0,08x1014
Eg (J/mol) 10,83x104 5,9x102
Gelatinizacin Papa [62]*
kg (s-1) 2,7x104 0,6x104
4
Eg (J/mol) 24,40x10 5,40x104
*temperatura de gelatinizacin > 67,5C
[1]
La medida de desviacin estndar indirecta fue calculada a partir de la ecuacin 24.

Un anlisis de la energa de activacin, nos indica que los parmetros reportados en la

tabla 14 para almidn de Malta estudiado por Brandam et al [6] y almidn de papa
estudiado por Verlinder et al [66] sugieren que la gelatinizacin para el almidn de Banano
requiere menos energa para que se presente la reaccin.

Siendo as, el bajo valor pre-exponencial para almidn de banano, apunta que la
gelatinizacin no se est presentando tan regularmente como para almidn de papa y
malta, requirindose de ms temperatura para lograr la gelatinizacin total de los grnulos
de almidn de banano. Esto debido a la naturaleza de este tipo de almidn. La energa de
activacin, la cual esta reportada por mol de almidn, depende de la naturaleza de la
fuente botnica. Recordemos que la temperatura y parmetros cinticos de gelatinizacin
son realmente un intervalo, porque as los grnulos provengan de la misma fuente
botnica, tienen diferente composicin y organizacin, lo que origina que unos sean ms
resistentes que otros [20, 21]. Con el fin de verificar la reproducibilidad de los datos con
los parmetros cinticos obtenidos para el rango de tiempo y temperatura planteados por
la metodologa, se realizaron experimentos a 5 y 10 minutos, para las temperaturas de 80
y 90C. La figura 17 es el resultado del modelamiento de la ecuacin 14 utilizando los
parmetros de la tabla 15 para almidn de banano, acompaado de los puntos
experimentales.

Tabla 15. Valores experimentales, modelados y residuales para la velocidad de gelatinizacin del almidn de
banano.

Temperatura Experimental (mg almidn gel/ml-s) Modelo (mg almidn gel/ml-s) Residual
Tiempo: 5min
80C 7,62 0,23 9,747 2,127
90C 15,20 0,28 15,525 0,325
Tiempo: 10min
80C 16,08 0,08 16,669 0,589
90C 24,86 0,16 23,882 -0,978
Tiempo: 15min
80C 21,87 0,32 21,585 -0,285
85C 25,20 0,28 25,226 0,026
90C 27,94 0,17 28,380 0,44
95C 31,07 0,28 30,778 -0,292

- 40 -
 a) b)

c)
Figura 17. Modelamiento de la etapa de gelatinizacin del almidn de banano. a) Gelatinizacin para 5min a
90 y 80C. b) Gelatinizacin para 10min a 90 y 80C. c) Gelatinizacin para 5,10 y 15 min a 80, 85, 90 y 95C.

La cintica de 1er orden se ajusta muy bien al modelo para los tiempos mayores a 10min.
El mayor valor residual (2,127) lo encontramos para la temperatura de 80C y 5min de
tiempo de gelatinizacin. Verlinder et al [66] representaron la dinmica de gelatinizacin
de almidn de papa como un modelo cintico de primer orden con dos energas de
activacin basadas en funcin de s la temperatura se encuentra por debajo o por encima
de 67,5C. Brendan et al [6] encontr una discontinuidad a los 67,5C de igual forma.
Ellos explicaron que el hecho de que los grnulos de almidn estn constituidos por
muchas regiones amorfas y cristalinas, y la temperatura de gelatinizacin en estas
regiones depende de la temperatura.

Para nuestro caso 80C y 5min es una relacin temperatura-tiempo aun baja para la
gelatinizacin del grnulo de almidn, en donde las regiones amorfas y cristalinas aun
conservan su estructura y donde la transferencia de calor cobra importancia pues la
temperatura al interior del grnulo no alcanza el punto de gelatinizacin en 5 minutos,
resultando en un modelo de primer orden que no se ajuste correctamente para este punto.
Se hace innecesario intentar gelatinizar a una temperatura por debajo de los 80C. Esto
corrobora el caso de la figura 10c, donde aun se observa en el microscopio que aun a
75C se encuentran grnulos de almidn luego de 20min de reaccin. Caso contrario
ocurre a partir de los valores observados de la tabla 15, donde el modelo representa

- 41 -
adecuadamente los valores de gelatinizacin para 10min y 15min independientemente de
la temperatura de gelatinizacin, siempre y cuando se encuentre entre 80 y 95C. En
trminos de rendimiento, la cantidad inicial de almidn para todos los ensayos fue de
33,5mg/mL; la combinacin 95C y 15min de reaccin gelatinizan aprox. el 93% del
almidn (31mg/mL).

5.4.2 Modelado de la Hidrlisis Enzimtica

Para la correcta obtencin de actividades especficas y parmetros cinticos, se hace
necesaria la purificacin de las enzimas comerciales mediante la tcnica de FPLC. A
continuacin se hace la separacin y la seleccin de las protenas contenidas en el coctel
enzimtico comercial para la obtencin de parmetros cinticos siguiendo la cintica de
Michaelis-Menten y el modelado del proceso de hidrlisis enzimtica.

Cromatografa Liquida de Protenas (Separacin de enzimas comerciales)

Optimax L1000

La figura 18 muestra el cromatograma de la enzima Optimax L1000 luego del cambio de

buffer y de ser sometida a la cromatografa de protenas. Se encontr que la pululanasa
nicamente contiene un pico proteico para los volmenes de retencin de 9-10mL.
Claramente se muestra que la mayor cantidad de protena se encuentra concentrada en el
mismo vrtice del pico del cromatograma. Parece que existen algunas colas a los lados
del pico (celdas A3 y A7), las cuales se hacen innecesarias separar, pues la mayor
cantidad de actividad enzimtica se encontrar concentrada en ese solo pico. Para esta
enzima no se hace necesaria la separacin o purificacin de la misma, por lo tanto ser
dosificada para el modelamiento en la cantidad optimizada. El peso molecular de esta
enzima, se fijo por la electroforesis (90kDa) estimado por SDS-PAGE (Tabla 16).

Figura 18. Cromatograma, enzima Optimax L1000. FPLC

- 42 -
Optidex L400

La figura 19 muestra el cromatograma de la enzima Optidex L400 luego del cambio de

buffer y de ser sometida a la cromatografa de protenas. La caracterizacin de esta
enzima se encuentra en la Tabla 7. Se encontraron 2 protenas en esta mezcla
(volmenes de retencin 17-19mL y 23-26mL). Sus pesos moleculares fueron de aprox.
100 y 66 kDa respectivamente estimados por SDS-PAGE. (Fig. 8). Es claro que se debe
seleccionar una de las dos protenas encontradas (celdas C4-6 y C7-12) en el
cromatograma para la adecuada estimacin de los parmetros cinticos que involucran la
enzima AMG, pues solo se necesita una actividad nica exgena, o de produccin de
glucosa.

Figura 19. Cromatograma enzima Optidex L400. FPLC

Para realizar la correcta seleccin de la protena, se recolectaron los volmenes

contenidos en las celdas C4-6 y C7-12 y se realizaron ensayos de actividad enzimtica
especficamente sobre almidn de banano, no sin antes determinar la concentracin de
ambos volmenes recolectados utilizando BSA. La tabla 16 resume la caracterizacin
realizada para las protenas de las celdas C4-6 y C7-12.

Tabla 16. Caracterizacin de las protenas encontradas en Optidex L400 y Optimax L1000.

Celdas Actividad Concentracin proteica Peso Molecular

enzimtica (mg/mL) (kDa)
Optimax L10001 especifica
94,05 U/mL 6,13950,0975 90
4-62 (Optidex L400) 63,43 U/mL 4,74060,4197 66
7-122 (Optidex L400) 448,58 U/mL 4,25680,1946 100
1 -1 -1
Actividad sobre Pululan (Unidad U en mg de pululan*min *mg Enzima )
2
Sobre almidn de banano gelatinizado (Unidad U en mol de glucosa*min-1*mg Enzima-1)

- 43 -
Se utilizaron las condiciones de operacin optimizadas para la determinacin de la
actividad especfica, durante 15min de reaccin (Temp= 58,9C, pH= 4,37, dosificacin
Optimax= 0,00245mg En/gr S y dosificacin Optidex= 0,0439mg En/gr S). La enzima
seleccionada para los ensayos que se presentan a continuacin fue la recolectada en las
celdas C7-12 por su mayor actividad sobre almidn de banano.

Cintica de Michaelis-Menten

A continuacin se describe la obtencin de las constantes cinticas kcat,n para el modelo

de reaccin de la Figura 6 y descrito por las ecuaciones 1A a 9A presentando para la
produccin de carbohidratos, asumiendo la cintica de Michaelis-Menten y linealizando
para conocer Vmax,n y Km,n.

1A:

2A:

3A:

4A:

5A:

6A:

7A:

8A:

9A:

- 44 -
A continuacin se describe la obtencin experimental de las constantes asumiendo la
cintica de Michaelis-Menten (Fig. 20).

Figura 20. Cinticas de Michaelis-Menten para Vmax,n y Km,n.

Con la ayuda de las grficas de la Figura 20, se contina con la metodologa y el clculo
de los parmetros siguiendo el diagrama de Lineweaver-Burk y el uso de la ecuacin 19.
La representacin grfica de Lineweaver-Burk permite identificar el Km y Vmax;
el punto de corte con el eje de ordenadas es el equivalente a la inversa de Vmax, y el de
abscisas es el valor de -1/Km.

Para el clculo de kcat tenemos:

(19)

- 45 -
En la tabla 17 se resumen las constantes kcat9, kcat8, kcat7, kcat6, kcat5 y kcat3
determinadas experimentalmente que alimentaran el modelo.

Tabla 17. Parmetros cinticos y desviacin determinados experimentalmente para la hidrlisis enzimtica.

Reaccin kcat,n (min-1) Km,n (mg Sus./mL) Vmax,n (mg Prod. /min mL) kcat,n / Km,n
3A 87,639,84 2,280,20 0,150,01 38,42
5A 4,440,05 0,760,05 0,00079,4x10-5 5,84
6A 795,66 3,390,59 0,13890,01 23,24
7A 0 0 0 0
8A 38,965,08 0,960,13 0,060,008 40,53
9A 18,101,34 1,360,38 0,030,002 13,27
a
Maltosa 180 0,410 -- 439
a
Maltotriosa 598 0,203 -- 2950
Maltosab 290 0,157 -- 1850
b -2
Maltotriosa 932 2,05x10 -- 45400
a
Tomado de Lee et al [7]
b
Tomado de Akerberg et al [64]

La constante de especificidad kcat,n/Km,n es una medida de cuan eficiente la enzima

convierte el substrato en producto. Esta constante refleja tanto la afinidad de la enzima
como la capacidad cataltica. El valor mximo terico, tambin llamado lmite de difusin
tiene un valor de 108-109 (litro mol-1 s-1) [78]. En este punto, cada vez que la enzima
colisiona con el sustrato da lugar a la catlisis, as, la velocidad de formacin de producto
no se ve limitada por la velocidad de reaccin, sino por la velocidad de difusin. Para
nuestro caso, todos los valores de la constante de especificidad (6,6x10-1 - 8,3x10-2 litro g-1
s-1) no son comparables en relacin con el valor del lmite de difusin.

Las constantes reflejan as, que la catlisis en este proceso de hidrlisis enzimtica es
controlada por la velocidad de reaccin (afinidad y capacidad cataltica de la enzima), en
unos casos ms que en otros. El tamao controlado del sistema (250mL) y la agitacin
constante (200RPM), sugiere que los problemas difusionales son controlados por la
agitacin del sistema y el eficiente pretratamiento realizado al almidn. La agitacin del
sistema no permite la formacin de capas estticas sobre las partculas; el grosor de la
capa tiene un efecto inversamente proporcional a la rapidez o velocidad de difusin de la
solucin. Un incremento en la velocidad de agitacin reduce la resistencia a la difusin y
el valor de Km desciende.

Las reacciones con ms afinidad al substrato (a mayor afinidad, menor valor de Km,n) son
las reacciones de la enzima AMG (exoglucanasa) con almidn y dextrinas (reacciones 3A
y 6A), siendo esta ltima quien posee una menor capacidad cataltica entre las dos. Por
otro lado, la afinidad de la enzima AMG con Maltotriosa (reaccin 8A) es compensada con
la ms alta capacidad cataltica del sistema. Las constantes de especificidad para las
reacciones 3A, 6A, 8A y 9A sugieren una velocidad media de catlisis de los productos a
glucosa, como lo muestra la figura 22, donde es notable que el sistema necesita de
tiempo (> 5 horas) para alcanzar el mximo de concentracin de azcares.

- 46 -
Referente a la enzima pululanasa, es quien tiene menor capacidad cataltica y de afinidad
para la formacin de Maltosa a partir de Dextrinas, como lo vemos en la constante 5A, y
nula para la reaccin de formacin de Maltotriosa. Una vez ms, se corrobora la teora de
la reduccin de velocidad de la enzima Optidex L1000 en la produccin de dmeros y
trmeros cuando se acerca a los extremos de una cadena glucosada. Este
comportamiento fue sugerido y anteriormente visto por Brandam y Meyer et al [79], donde
la enzima -amilasa nicamente produce Maltotriosa a partir de almidn gelatinizado
(figura 21). Nuestros resultados experimentales coinciden con la nica formacin de
maltotriosa a partir del modelo de la figura 21.

Figura 21.Esquema de reaccin para la hidrlisis enzimtica. Tomado de Brandam y Meyer, 2002 [79].

Por otro lado, se encontr que los valores reportados en la tabla 17 para kcat,n y Km por
Lee et al [7] y Akerberg et al [64] no son vlidos para la amiloglucosidasa usada en la
presente investigacin. Los datos reportados por Akerberg et al [64] fueron determinados
usando la mezcla de enzima comercial, SAN Super 240L (Novo Nordisk) para la etapa de
sacarificacin de los ensayos. Esta enzima consiste en una AMG (1,4--D-glucan,
glucanohidrolasa, EC 3.2.1.3) de Aspergillus niger y una -amilasa Fungamyl (1,4--D-
glucanohidrolasa EC 3.2.1.1) de Aspergillus oryzae. Esta no fue purificada y separada,
por tanto su actividad enzimtica y afinidad tambin incluye la produccin e hidrlisis
simultnea de maltosa y maltotriosa. Una comparacin realizada entre estos valores y los
del presente estudio (kcat,8A/Km,8A y kcat,9A/Km,9A), indican que la AMG, usada en esta
investigacin, tienen menos afinidad hacia la maltosa y la maltotriosa, e igualmente ocurre
con los datos reportados por Lee et al [7], que fueron determinados a partir de una AMG
de Rhizopus niveus.

Ajuste del Modelo (Optimizacin con fminsearch de Matlab)

Las constantes kcat,1, kcat,2 y kcat,4, definen las siguientes ecuaciones:

1A:

2A:

4A:

- 47 -
Las constantes kcat,n (n = 1,2 y 4) fueron calculadas mediante el ajuste de los puntos
experimentales y todas las ecuaciones diferenciales del sistema que resultan de las
ecuaciones 1A a 9A, minimizando una funcin objetivo (Ec. 25) mediante el comando
fminsearch de Matlab.

SSE = (yi - ymodelado)2 Ec. 25

Esto es, la diferencia de cada punto experimental con cada punto modelado, al cuadrado.
De esta forma, se calcularon las kcat,1, kcat,2 y kcat,4. La figura 22 es la cintica y el resultado
del ajuste de los parmetros y puntos experimentales a los parmetros y valores
modelados para cada compuesto del sistema de hidrlisis enzimtica.

Figura 22. Ajuste de parmetros experimentales para la determinacin de las constantes cinticas kcat,n (n=1,2
y 4).

El algoritmo modela la cintica de la etapa de licuefaccin y sacarificacin

simultneamente; las dextrinas, generalmente obtenidas en la etapa de licuefaccin, son
producidas en tamaos de n = 4 a n = 10 y fueron agrupadas en este grupo. La velocidad
de produccin de estos oligosacridos es realmente alta hasta los 130 minutos (pendiente
ms alta), donde se da lugar a su consumo. La tabla 18 se resume el valor de las
constantes calculadas como resultado de la optimizacin realizada para minimizar la
funcin objetivo. Estas dan informacin de la velocidad de catlisis del almidn a
dextrinas, maltosa y maltotriosa respectivamente. La constante kcat,1 (turnover de almidn
a dextrinas ) es aprox. 20 veces ms grande que las constantes kcat,2 y kcat,4 (formacin de
maltosa y maltotriosa a partir de banano), dando una idea de cuan superior es la

- 48 -
velocidad de catlisis de polisacridos por la enzima Optimax L1000, y acertando la
intencin por la cual fue seleccionada la enzima, para la licuefaccin, donde es notoria la
velocidad de hidrlisis del almidn, tal como fue reportado por Akerberg et al [64]. Ahora,
aunque la velocidad de hidrlisis de dextrinas es rpida, se haba mencionado
anteriormente, que la enzima pululanasa, es quien tiene menor capacidad cataltica y de
afinidad para la formacin de Maltosa a partir de Dextrinas, como lo vemos en la
constante 5A, y nula para la reaccin de formacin de Maltotriosa. Esto es un indicio de
que los oligosacridos agrupados en dextrinas, son principalmente hidrolizados por la
AMG (Optidex L400) para la formacin de glucosa, y se reitera la baja velocidad de la
enzima endoamilasa (Optimax L1000) cuando esta se acerca a los extremos de una
cadena de oligosacridos.

Tabla 18. Constantes kcat,n para el ajuste de datos experimentales y modelados.

Constante kcat,n Valor de la constante kcat,n (1/min) Mtodo

1A - kcat,1 1763,7273 Modelo
2A - kcat,2 544,7 Modelo
4A - kcat,4 1205,5 Modelo
SSE (Ec. 24) 55,4080,073 Modelo
3A 87,639,84 Experimental
5A 4,440,05 Experimental
6A 795,66 Experimental
7A 0 Experimental
8A 38,965,08 Experimental
9A 18,101,34 Experimental

El modelo sugiere que el bajo consumo y acumulacin de maltosa, que sigue la ruta de
las reacciones 2A+5A 9A es causado por el valor de las constantes de catlisis de
estas reacciones (2A+5A > 9A), las cuales determinan la baja produccin de glucosa a
partir de maltosa. Esto se ve reflejado en la velocidad de catlisis de la reaccin 9A en la
figura 22 donde se nota que el crecimiento acumulativo de la maltosa a lo largo de la
cintica se debe a que la suma de las reacciones 2A y 5A es mayor que el valor de la
constante 9A. De esta forma, la sobredimensin que el modelo presenta en la cintica de
maltosa es reflejada en el balance de masa en el sistema, permitiendo un aumento
acumulativo de este producto por la simulacin.

Por otro lado, el modelo representa la ruta que sigue la produccin de glucosa a partir de
maltotriosa (4A 8A). Gran parte de la produccin de glucosa, se debe a la catlisis de
maltotriosa a glucosa, teniendo el mayor valor de la constante de especificidad del
sistema, reflejando la afinidad por este sustrato para la rpida produccin de glucosa. De
igual manera, la acumulacin de dextrinas se presenta al inicio de la reaccin, al tener
mayor valor de produccin y menor degradacin a glucosa (1A 6A).

De la figura 22 observamos que las mayores pendientes al inicio de la reaccin son las de
formacin de glucosa y dextrinas. Igualmente la pendiente de degradacin de almidn es
quiz aun ms rpida que estas dos ltimas. De aqu que, la fuentes principales de
produccin de glucosa, son dextrinas y almidn, conclusin realizada por el valor de sus
constantes cinticas y reflejadas en la figura 22. Inicialmente la mayor fuente de

- 49 -
produccin de glucosa se presenta mediante la reaccin con el almidn (3A) y maltotriosa
(8A), reflejado en los mayores valores de las velocidades especficas (tabla 18). En este
momento se presenta una competicin por el sustrato (almidn gelatinizado) de ambas
enzimas (endo y exoamilasa), cada una ocupada principalmente de la produccin para la
cual fue seleccionada. Al cabo de 130 minutos, ocurre un cambio de pendiente en la
degradacin de almidn gelatinizado y de formacin de dextrinas. En este momento
empieza la produccin de glucosa principalmente de dextrinas (1A 6A).

Una de las restricciones de simulacin fue cerrar el balance de materia para las especies.
Es importante recordar que los valores de las constantes kcat,1, kcat,2 y kcat,4 deben ser
consideradas simplemente como resultados de un ajuste de parmetros y no
interpretados como valores de velocidad de catlisis hacia el producto, aunque se
justifiquen sus valores. Por otro lado, para toda simulacin realizada con el comando
fminsearch de Matlab, el usuario debe suponer valores iniciales para las constantes a
calcular. Para el clculo de la incertidumbre de estas constantes, se realizaron 50
iteraciones con valores iniciales aleatorios. De aqu, se determin la desviacin estndar
de las constantes de la funcin objetivo presentado en la tabla 18. Estos valores
demuestran el buen ajuste de los parmetros obtenidos, independiente del valor inicial
que tome la simulacin. Los valores de la desviacin estndar para las constantes k cat,2 y
kcat,4 no superan el 2%, mientras que para la constante no supera kcat el 8%. Por otro lado,
la funcin objetivo fue calculada siempre con una precisin que no superara el 1% de
error.

5.4.3 Prueba de Ajuste del Modelo

Se realiz la prueba estadstica de Chi cuadrado (2) siguiendo la metodologa de Fowler,
2008 [81] de la Ecuacin 20. Esta prueba estadstica se utiliza comnmente para la
interpretacin de resultados de la estimacin, anlisis de las incertidumbres de los
parmetros y verificacin del ajuste del modelo. La tabla 19 resumen los valores utilizados
para el clculo de Chi cuadrado (2).

Una vez evaluada la ecuacin 20 se verifica si el valor de 2 es razonable, es decir, cerca

de DF. "Cerca" significa generalmente dentro de varias desviaciones estndar [81], donde
el valor de la desviacin estndar es . Chi cuadrado se calcul como la sumatoria
para cada azcar de estadstico de prueba. El valor de 2 = 66,84 revela el valor obtenido
para el modelo.

Siendo 33 puntos experimentales, y 13 relaciones (ecuaciones de balance), los grados de

libertad del modelo son:

DF = N M = 20.

Es claro que el valor de la desviacin estndar de es 1/10 de veces el

valor de saliendo de la definicin de cerca o varias desviaciones estndar.
2

Siendo as, este ajuste del modelo a los datos experimentales no pareciera adecuado.
Como 2 es grande, se concluye que las desviaciones estndar en los datos originales
pudieron haber sido sub-estimadas.

- 50 -
 Las incertidumbres de ajuste reflejan slo si el ajuste resultante es el mejor ajuste posible
al modelo presentado, no si ese modelo en s es una buena representacin de los datos.
De aqu, que el modelo representa la fenomenologa del proceso adecuadamente, ms el
ajuste de los datos al modelo - puede no haber sido el ms adecuado.

Tabla 19. Concentracin de azcares experimentales y modeladas para el clculo de Chi-cuadro

Tiempo (min) 0 5 12 20 30 40 60 120 180 240 300

Concentracin (mg/mL)
Glucosa Exp. 0,315 0,453 1,429 3,017 4,292 6,041 8,633 15,144 20,448 23,231 25,606 Suma
Desv. Estan 0,022 0,251 0,303 0,263 0,416 0,450 0,887 1,654 1,352 2,089 2,467
Glucosa Modelo 0,315 0,942 1,815 2,807 4,038 5,259 7,671 14,646 21,167 27,054 31,665
((y-yi)/DE)^2 0,000 3,796 1,620 0,639 0,375 3,025 1,177 0,091 0,283 3,350 6,032 20,388

Maltosa Exp. 0,000 0,286 0,468 0,490 0,490 0,497 0,566 0,572 0,578 0,621 0,460
Desv. Estan 0,000 0,093 0,192 0,202 0,186 0,192 0,216 0,124 0,164 0,156 0,253
Maltosa Modelo 0,000 0,022 0,051 0,085 0,127 0,169 0,250 0,481 0,688 0,854 0,890
((y-yi)/DE)^2 0,000 8,035 4,711 4,010 3,782 2,934 2,138 0,548 0,451 2,220 2,902 31,731

Maltotriosa Exp. 0,000 0,000 0,000 0,299 0,424 0,448 0,468 0,507 0,455 0,435 0,439
Desv. Estan 0,000 0,000 0,000 0,092 0,123 0,158 0,195 0,129 0,135 0,143 0,186
Maltotriosa Modelo 0,000 0,047 0,111 0,180 0,261 0,337 0,470 0,729 0,776 0,623 0,308
((y-yi)/DE)^2 0,000 0,000 0,000 1,654 1,754 0,499 0,000 2,936 5,654 1,738 0,497 14,731

Se pueden formular tanto diferentes funciones objetivo como formas de ajuste de datos
experimentales dependiendo de la naturaleza de los errores experimentales. Sin
embargo, las desviaciones estndar experimentales raramente se evalan, lo que
significa que esta prueba estadstica puede proporcionar resultados falsos. A pesar de
ello, estas herramientas estadsticas se utilizan a menudo para evaluar la el ajuste del
modelo y discriminar el desempeo de los modelos planteados. Mediante un ajuste
manual del modelo, se ajustaron el valor de las constantes kcat,2 y kcat,4. Se encontr, que el
error absoluto ms significativo entre los puntos experimentales y los modelados se
presenta en los 2 ltimos puntos de la cintica de glucosa (tiempo = 300min; Glu exp,t=240 -
Glumod,t=240 = 3,823 y Gluexp,t=300 - Glumod,t=300 =6,059 ) y es reflejado en la figura 22 donde el
modelo sobrestima el valor de glucosa. Estos valores son los que ms aportan
numricamente a la funcin objetivo de la ecuacin 25. El valor de la constante kcat,2 =
280min-1 y kcat,4 = 400min-1 minimizan la funcin objetivo hasta 37,21. Aunque se minimiza
la funcin objetivo 2 veces, este valor no ayudara a concluir que el ajuste del modelo a
los datos experimentales es adecuado, pues el valor de 2 se incrementa hasta 285. As,
se opt por el valor de las constantes calculadas por el cdigo y reportadas en la tabla 18,
pues los valores de las constantes kcat,2 y kcat,4 calculadas manualmente no representan la
fenomenologa del proceso, sobrestimando la constante de velocidad especifica de
produccin de maltosa y maltotriosa a partir de almidn gelatinizado, siendo
fenomenolgicamente valores que no representan qumicamente la cintica de produccin
de estos 2 azcares, adems el hecho de disminuir el valor de la funcin objetivo, no
implica disminucin del valor de 2 y por lo tanto mejora en el ajuste del modelo.

- 51 -
 6. CONCLUSIONES
Con un contenido del mas del 60% (base seca) de almidn y con rendimientos del mas
del 90% en hidrlisis enzimtica de almidn gelatinizado, se reitera la viabilidad del
proceso de produccin de azcares fermentables del fruto del banano como una
alternativa para la produccin de biocombustibles.

El grupo de Bioprocesos y Flujos Reactivos (BIO-FR) fortaleci su conocimiento en el

rea de produccin de biocombustibles, extendiendo su capacidad de crear proyectos
que involucren fuentes amilceas para la produccin de bioetanol.

El uso de la gelatinizacin como pretratamiento trmico, aument la accesibilidad al

material amilceo, vindose esto reflejado en las productividades encontradas por las
condiciones ptimas. De esta forma, se lograron establecer las condiciones ptimas para
la produccin de jarabe glucosado a partir del material amilceo de la planta de banano,
mediante hidrlisis enzimtica y el montaje de un diseo experimental satisfactorio. Para
la optimizacin del proceso de hidrlisis, se us la enzima Optidex L400 (exoamilasa) y
Optimax L1000 (endoamilasa) de Genencor como amilasas. Las mejores condiciones
para estas enzimas fueron temperatura de 58.9C, pH 4.37, dosis de Optidex L400
0.47L/gr almidn y dosis de Optimax L1000 0,40L/gr almidn.

Del anlisis factorial, la enzima con ms significancia estadstica como variable individual
fue la Optidex L400, pues el rendimiento del proceso depende de la concentracin
(actividad y afinidad) de esta enzima.

En el diseo central compuesto, la variable la Optidex L400 resulto como la menos

significativa. Esto se debe a la reduccin del rango de valores seleccionados para el
diseo de superficie de respuesta, aunque siendo as, se determin un valor que mejora
el proceso, optimizando aun ms la dosis de esta enzima.

La hidrlisis de la enzima Optimax L1000 seleccionada para la formacin de

oligosacridos, tienen una velocidad de hidrlisis alta para la produccin de polisacridos
y baja para oligosacridos de menor tamao (maltosa y maltotriosa). Probablemente la
velocidad de catlisis de esta enzima disminuye a medida que la hidrlisis se desplaza a
los extremos de la cadena glucosada. La enzima Optidex L400 purificada, encargada de
la formacin de Glucosa, logra una disminucin en la concentracin de maltosa y
maltotriosa nicamente al final de 5 horas de reaccin.

Para el modelado de la gelatinizacin del almidn de banano, se encontr que la cintica

de 1er orden es representada por una constante cintica de 2,55X106 s-1 que representa
adecuadamente el 96% de los valores de gelatinizacin para 10min y 15min
independientemente de la temperatura de gelatinizacin, siempre y cuando se encuentre
entre 80 y 95C. Para tiempos menores a 5min la relacin temperatura-tiempo es aun baja
para la gelatinizacin del grnulo de almidn, resultando en un modelo de primer orden
que no se ajusta correctamente para estos puntos. Esto, debido principalmente a

- 52 -
problemas de transferencia de calor y posterior transferencia de masa entre el lquido y el
grano solubilizado parcialmente.

Se encontr que la pululanasa (Optimax L1000) es una enzima pura, la cual contiene un
pico proteico y no se hizo necesaria la purificacin; sus constates de velocidad para la
produccin de dextrinas y maltotriosa a partir de almidn de banano determinadas
mediante optimizacin (kcat,1=1763.7min-1 y kcat,4=120min-1) indican que posee la mayor
velocidad de produccin de azcares del sistema, por encima de la produccin de glucosa
por la enzima Optidex L400 (exo-glucanasa).

En la enzima Optidex L400 se encontraron 2 protenas en esta mezcla y fue necesaria su

purificacin. Sus pesos moleculares fueron de aprox. 100 y 66 kDa respectivamente
estimados por SDS-PAGE. Se escogi la enzima con un peso molecular de 100kDa por
su mayor afinidad sobre almidn de banano para producir glucosa. El efecto de la fraccin
de la enzima con menor tamao molecular (que celda) que no se tuvo en cuenta
claramente afecto la produccin final de glucosa reducindose en un porcentaje de
11,7%.

El modelo fenomenolgicamente representa adecuadamente la produccin de azcares,

pues representa la velocidad de reaccin de las enzimas individuales. Las reacciones de
la enzima Optimax L1000 (endglucanasa) son las que poseen una mayor velocidad de
reaccin, representndose en el modelado de produccin de dextrinas, maltosa y
maltotriosa.

La cintica de produccin de maltosa al final de la reaccin fue sobrestimada en el modelo

cuando inicialmente se presenta la mayor velocidad de produccin de maltosa. Esto se
debe a el valor de las constantes cinticas que en el modelo sugieren que la maltosa se
acumula (2A+5A > 9A) durante las primeras horas de reaccin.

El almidn es principalmente hidrolizado por la Optidex L400 y Optimax L1000 para la

formacin de glucosa y los oligosacridos agrupados en dextrinas respectivamente al
inicio de la reaccin (t130min).

La prueba estadstica de ajuste del modelo Chi cuadrado, revel que el modelo no ajusta
adecuadamente los datos experimentales debido a una sub-estimacin de las
incertidumbres experimentales, ms el modelo constituye en s una buena representacin
fenomenolgica del esquema de reaccin planteado.

- 53 -
 7. RECOMENDACIONES
Los porcentajes de conversin que superan el 90% a las 5 horas de hidrlisis,
independientes de la tcnica de anlisis, fortalecen la seleccin del proceso enzimtico
factible, lmpio y econmico al escalado para el proceso de obtencin de etanol. La
fraccin disuelta que aun no ha reaccionado al cabo de una hora se podra recircular
favoreciendo aun ms la productividad del proceso.

Estudiar las propiedades del sistema de gelatinizacin que afectan el fenmeno de

trasporte del sistema, aumentando el entendimiento de este proceso.

Se sugiere aumentar los niveles de la dosis de enzima Optidex L400 para el anlisis de
superficie de respuesta. Probablemente se encuentren valores superiores en azcares
reductores por el aumento en la dosis de la enzima, tal como lo revel el anlisis factorial.

Para la simulacin del proceso de hidrlisis enzimtica, se sugiere el clculo de las

constantes cinticas variando la temperatura y calculando el valor de las constantes con
la ecuacin de Arrenius.

Se propone buscar herramientas ms robustas que permitan realizar una optimizacin

mas precisa, dado que fminsearch tiene limitaciones al restringir el problema.

Sera adecuado incluir trminos en el modelo de inhibicin por producto, tiempo y

sustrato, realizando una mayor investigacin en trminos de mecanismos de reaccin,
especialmente para las reacciones 1A, 2A y 4A.

Modelar el proceso de hidrlisis enzimtica junto con el proceso de gelatinizacin en una

sola etapa utilizando enzimas termoflicas. Esto ayudara a aumentar la cantidad inicial de
almidn, pues a medida que se va gelatinizando el almidn, las enzimas consumiran la
amilopectina, fuente principal de la formacin de geles que no permite concentraciones
iniciales superiores a los 40mg/mL.

- 54 -
 ANEXO 1

Balances de Masa

Para la ecuacin 1A:

Para la ecuacin 2A:

Para la ecuacin 3A:

Para la ecuacin 4A:

- 55 -
Para la ecuacin 5A:

Para la ecuacin 6A:

Para la ecuacin 7A:

Para la ecuacin 8A:

Para la ecuacin 9A:

- 56 -
ANEXO 2

- 57 -
- 58 -
ANEXO 3

- 59 -
- 60 -
 7. REFERENCIAS
[1] Ljunggren M. Kinetic analysis and modeling of enzymatic hydrolysis and SS,
Department of Chemical Engineering, Lund Institute of Technology, Lund, Sweden. 2005

[2] Mann MK, Spath PL. Life cycle assessment of a biomass gasification combined cycle
system. In: Life cycle assessment. National Renewable Energy Laboratory. 1997; p-160.

[3] Kadam KL. Environmental benefits on a life cycle basis of using bagasse derived
ethanol as a gasoline oxygenate in India. Energy Pol. 2002; 30:371 e 84.

[4] FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations). FAOSTAT Statistics
Database (last updated 2008), 2011.

[5] Pingyi Zhang, Roy L. Whistler, James N. BeMiller, Bruce R. Hamaker. Banana starch:
production, physicochemical properties, and digestibility-a review. Carbohydrate Polymers.
2005; 59, 443458.

[6] Brandam C., X.M. Meyer, J. Proth, P. Strehaiano, H. Pingaud. An original kinetic model
for the enzymatic hydrolysis of starch during mashing. Biochemical Engineering Journal.
2003; 13, 4352.

[7] Lee, C.G., Kim, C.H., Rhee, S.K. A kinetic model and simulation of starch
saccharification and simultaneous ethanol fermentation by amyloglucosidase and
Zymomonas mobilis. Bioprocess Engineering. 1992; 7, 335-341.

[8] Fogarty W.M, Benson C. P. Purification and Properties of a Thermophilic

Amyloglucosidase from Aspergillus niger. Eur J Appl Microbiol Biotechnol. 1983; 18:271-
278

[9] Morales V., Sonia P. Simulacin de un bioproceso para la obtencin de jarabes

glucosados y fructosados a partir de almidn de yuca. Tesis de Maestra. Biblioteca EFE
Gmez, Universidad Nacional de Colombia 2004.

[10] Ruiz C., ngela A. Factores de escala para la produccin biotecnolgica de etanol
carburante. Tesis de Doctorado. Biblioteca Facultad de Minas, Universidad Nacional de
Colombia, 2009.

[11] Adinarayana, K., Suren, S. Response surface optimization of enzymatic hydrolysis of

maize starch for higher glucose production. Biochemical Engineering. 2005; Journal 27,
179190.

[12] Elibol M., Ozer D. (2002) Response surface analysis of lipase production by freely
suspended Rhizopus arrhizus, Process Biochem. 2002; 38, 367372

- 61 -
[13] Hoyos LM, Prez YM. Pretratamiento de Banano de Rechazo de la Zona de Urab
para la Obtencin de un Jarabe Azucarado. Medelln: Facultad de Minas, Universidad
Nacional de Colombia- sede Medelln; 2005. p. 156.

[14] Bulon, A., Colonna, P., & Leloup, V. Les amidons et leurs derives dans les
industries des cereales. Industries Alimentaires et Agroindustrielles. 1990; Juin, 515
532.

[15] Guilbot, A., & Mercier, C. Starch. In O. Aspinall (Ed.), The polysaccharides. 1985; pp.
209282.

[16] Olivier Gibert, Andres Giraldo, Jos-Ricardo Ucls-Santos. A kinetic approach to

textural changes of different banana genotypes (Musa sp). Journal of Food Engineering.
2010; 98, 471479

[17] H.I. Velsquez-Arredondo, A.A.Ruiz-Colorado, S.De Oliveira Junior. Ethanol

production process from banana fruit and its lignocellulosic residues: Energy analysis.
Energy. 2010; 35, 3081 e 3087

[18] Hyun-Jung Chung, Qiang Liu. Impact of molecular structure of amylopectin and
amylose on amylose chain association during cooling. Carbohydrate Polymers. 2009; 77,
807815.

[19] Hongsheng Liu, Fengwei Xie, Long Yu, Ling Chen, Lin Li. Thermal processing of
starch-based polymers. Progress in Polymer Science. 2009; 34, 13481368.

[20] Donovan, J. W. Phase transitions of starchwater systems. Biopolymers. 1979; 18,

263275.

[21] Evans, J. D., & Haismann, D. R. The effect of solutes on the gelatinization
temperature of potato starch. Starch/Staerke. 1982; 34, 224231.

[22] Hctor Ciro V., Mary Montoya L. y Leonidas Milln C. Caracterizacin de propiedades
mecnicas del banano (Cavendish Valery). Rev.Fac.Nal.Agr.Medelln. 2005; Vol.58,
No.2976 2.p.2975-2988.

[23] Von Loesecke, H. W. Bananas (2nd ed). New York: Interscience Publishers. 1950;
(pp. 5266).

[24] Cordenunsi, B. R., & Lajolo, F. M. Starch breakdown during banana ripening: Sucrose
synthase and sucrose phosphate synthase. Journal of Agricultural and Food Chemistry.
1995; 43, 347351.

[25] Lii, C. Y., Chang, S. M., & Young, Y. L. Investigation of the physical and chemical
properties of banana starches. Journal of Food Science. 1982; 47, 14931497.

[26] Soto Ballestero, Moiss. Bananos, cultivo y comercializacin. San Jos, Costa Rica:
550 p. Litografa e imprenta LIL, S.A 1985.

- 62 -
[27] Kayisu, K., & Hood, L. F. Molecular structure of banana starch. Journal of Food
Science. 1981; 46, 18941897.

[28] Ling, L. H., Osman, E. M., Fernandes, J. B., & Reilly, P. J. Physical properties of
starch from Cavendish banana fruit. Starch/Staerke. 1982; 34, 184188.

[29] Garcia, E., & Lajolo, F. M. Starch transformation during banana ripening: The amylase
and glucosidase behavior. Journal of Food Science. 1988; 53, 11811186.

[30] Waliszewski, K. N., Aparicio, M. A., Bello, L. A., & Monroy, J. A. X. Changes of
banana starch by chemical and physical modification. Carbohydrate Polymers. 2003; 52,
237242.

[31] Kayisu, K., Hood, L. F., & Vansoest, P. J. Characterization of starch and fiber of
banana fruit. Journal of Food Science. 1981; 46, 18851890.

[32] Bello-Perez, L. A., Romero-Manilla, R., & Paredes-Lopez, O. Preparation and

properties of physically modified banana starch prepared by alcoholic-alkaline treatment.
Starch/Staerke. 2000; 52, 154159.

[33] Bello-Perez, l. A., Agama-Acevedo, Sanchez-Hernandez, l., & Paredes-Lopez,O.

Isolation and partial characterization of banana starches. Journal of Agricultural and Food
Chemistry. 1999; 47, 854857.

[34] Cummings, J. H., & Englyst, H. N. Gastrointestinal effects of food carbohydrate.

American Journal of Clinical Nutrition. 1995; 61, 938S945S.

[35] Faisant, N., Gallant, D. J., Bouchet, B., & Champ, M. Banana starch breakdown in the
human small intestine studied by electron microscopy. European Journal of Clinical
Nutrition. 1995; 49, 98104.

[36] Sugimoto, Y., Fujita, S., Takaya, T., & Fuwa, H. In vivo digestin of banana starch
granules. Starch/Staerke. 1980; 32, 290294.

[37] Teixeira, M. A. V., Ciacco, C. F., TavareS, D. Q., & Bonezzi, A. N. Occurrence and
characterization of resistant starch from corn and banana starch. Ciencia y Tecnologia de
Alimentos. 1998; 18, 246253. Chemical Abstracts 130: 196031.

[38] Gallant, O. J., Bouchet, B., Buleon, A., & Perez, S. Physical characteristics of starch
granules and susceptibility to enzymic degradation. European Journal of Clinical Nutrition.
1992; 46(Suppl. 2), S3S16.

[39] Van Der Maarel, Marc J.E.C. Properties and applications of starchconverting enzymes
of the -amylase family. Journal of biotechnology. 2002; No 94; p. 137-155.

[40] Suckling C. Enzyme Chemistry: Impact and applications. Chapman and Hall. Second
Edition. London. 1990; p: 310-312; 315-318

- 63 -
[41] Cheetham P. Aplicacion de las enzimas en las hindustria, en Manual de biotecnologia
de las enzimas, Wiseman A. Segunda edicin. Editorial Acribia S.A, Zaragoza-Espaa.
1991; P:319-322; 325-330.

[42] Viara N. Ivanova, Elena P. Dobreva and Elka I. Emanuilova. Purification and
characterization of a thermostable alpha-amylase from Bacillus licheniformis. Journal of
Btotechnology. 1993; 28, 277-289

[43] Damodara Rao Mendu, B.V.V. Ratnam, A. Purnima, C. Ayyanna. Affinity

chromatography of -amylase from Bacillus licheniformis. Enzyme and Microbial
Technology. 2005; 37, 712717.

[44] Fitter J, Herrmann R, Dencher NA, Blume A, Hauss T. Activity and stability of a
thermostable alpha amylase compared to its mesophilic homologue: mechanisms of
thermal adaptation. Biochemistry. 2001 Sep 4;40(35):10723-31.

[45] Adinarayana Kunamneni, Suren Singh. Improved high thermal stability of pullulanase
from a newly isolated thermophilic Bacillus sp. AN-7. Enzyme and Microbial Technology.
2006; 39, 13991404

[46] Nakamura N, Watanabe K, Horikoshi K. Purification and some properties of alkaline

pullulanase from a strain of bacillus no. 202-1, an alkalophilic microorganism. Biochim
Biophys Acta. 1975 Jul 27;397(1):188-93.

[47] Kim CH, Choi HI, Lee DS. Purification and biochemical properties of an alkaline
pullulanase from alkalophilic Bacillus sp. S-1. Biosci Biotechnol Biochem. 1993 Oct;
57(10):1632-7.

[48] Sebnem Harsa, Shintaro Furusaki. Chromatographic separation of amyloglucosidase

from the mixtures of enzymes. Biochemical Engineering Journal. 2001; 8, 25726.

[49] Andrzei Paszczvdski. Irena Miedziak, Jerzy tobarzewski. A simple method of affinity
chromatography for the purification of glucoamylase obtained from Aspergilhs niger C.
Volume 149, number 1 FEBS LETTERS November 1982.

[50] Irwin M. Freedberg, Yehuda Levin, Cyril M. Kay, William D. Mccubbin, and Ephraim
Katchalski-Katzir. Purification And Characterization Of Aspergillus Niger Exo-1,4-
Glucosidase. Biochimica et Biophysica Acta. 1975; 391, 361381.

[51] Pornpong Sutthirak, Saovanee Dharmsthiti, Sittiwat Lertsiri. Effect of glycation on

stability and kinetic parameters of thermostable glucoamylase from Aspergillus niger.
Process Biochemistry. 2005; 40, 28212826.

[52] Monica C. Santa-Maria and Craig G. Yencho. Starch Self-Processing in Transgenic

Sweet Potato Roots Expressing a Hyperthermophilic a-Amylase. DOI 10.1002/btpr.573.
2011 American Institute of Chemical Engineers

[53] Monica C. Santa-Maria, Chung-Jung Chou, G. Craig Yencho, Candace H.

Haigler,William F. Thompson, Robert M. Kelly, Bryon Sosinsk. Plant Cell Calcium-Rich

- 64 -
Environment Enhances Thermostability of Recombinantly Produced a-Amylase From the
Hyperthermophilic Bacterium Thermotoga maritime. Biotechnology and Bioengineering,
Vol. 104, No. 5, December 1, 2009.

[54] T. Krishnan and a. K. Chandra. Purification and characterization of cx-amylase from

bacillus Licheniformis cumc305. Applied and environmental microbiology, aug. 1983, p.
430-437.

[55] Ikram-ul-haq, hamad ashraf, sikander ali, and m. A. Qadeer. Kinetic characterization
of extracellular -amylase from a derepressed mutant of bacillus licheniformis. Applied
biochemistry and biotechnology. Vol. 141, 2007.

[56] Malle,D.; Itoh, T.; Hashimoto, W.; Murata, K.; Utsumi, S.; Mikami, B.; Overexpression,
purification and preliminary X-ray analysis of pullulanase from Bacillus subtilis strain 168.
Acta Crystallogr. Sect. F 62, 381-384 (2006)

[57] Paldi T, Levy I, Shoseyov O. Glucoamylase starch-binding domain of Aspergillus niger

B1: molecular cloning and functional characterization. Biochem J. 2003 Jun 15;372(Pt
3):905-10.

[58] Tholath Emilia Abraham, Jegan Roy Joseph, Laxmi Bai Vasanthakumari Bindhu and
Kizakoottu Kunjunny Jayakuma. Crosslinked enzyme crystals of glucoamylase as a
potent catalyst for biotransformations. Carbohydrate Research 339 (2004) 10991104

[59] Bisio, A., and Kabel, R., 1985. Scale-up of chemical processes. John Wiley and Sons.

[60] Gmez, L. y lvarez, H., 2004. Los modelos fenomenolgicos como generadores de
estructura en la obtencin de modelos semifsicos (en imprenta). Caracas: Grupo de
Automtica de la Universidad Nacional (GAUNAL). Escuela de Procesos y Energa.
Escuela de Materiales. Facultad de Minas, Universidad Nacional de Colombia.
Equinoccio. Ediciones de la Universidad Simn Bolvar. Caracas.

[61] Hangos, K., and Cameron, I., 2001. Process Modeling and model analysis. Academic
Press.

[62] Verlinden B.E., B.M. Nicolai, J. De Baerdemaeker. J. Food Eng. 1985; 24, 165179.

[63] Anthony C. Dona, Guilhem Pages, Robert G. Gilbert, Philip W. Kuchel. Starch granule
characterization by kinetic analysis of their stages during enzymic hydrolysis: 1H nuclear
magnetic resonance studies. Carbohydrate Polymers. 2011; 83, 17751786.

[64] Akerberg, C., Zacchi, G., Torto, N., & Gorton, L. A kinetic model for enzymatic wheat
starch saccharification. Journal of Chemical and Biotechnology. 2000; 75, 306314.

[65] Amato, M. E., Ansanelli, G., Fisichella, S., Lamanna, R., Scarlata, G., Sobolev, A. P.
Wheat flour enzymatic amylolysis monitored by in situ 1H NMR spectroscopy. Journal of
Agricultural and Food Chemistry. 2004; 52, 823831.

- 65 -
[66] Paolucci-Jeanjean D., M.P. Belleville, G.M. Rios; N. Zakhia. Kinetics of continuous
starch hydrolysis in a membrane reactor. Biochemical Engineering Journal 6 (2000) 233
238.

[67] Fujii M, Homma T; Taniguchi M. Synergism of -amylase and glucoamylase on

hydrolysis of native starch granules. Biotechnol Bioeng. 1988; 32:910-915.

[68] Piotr M. Wojciechowski, Antoni Koziol, Andrzej Noworyta. Iteration Model of Starch
Hydrolysis by Amylolytic Enzymes. Biotechnology and Bioengineering. 2001; Vol 75, No.
5, December 5.

[69] D. Yankov, E. Dobreva, V. Beschkov and E. Emanuilova. Study of optimum conditions

and kinetics of starch hydrolysis by means of thermostable a-amylase. Enzyme and
Microbial Technology. Volume 8, Issue 11, November 1986, Pages 665667.

[70] Tim Baks, Anja E.M. Janssen, Remko M. Boom. The effect of carbohydrates on -
amylase activity measurements. Enzyme and Microbial Technology 39 (2006) 114119.

[71] Montgomery, Douglas C. Design and Analysis of experiment. Fifth Edition, 2001. John
Wiley & Sons, Inc.

[72] Mark Stitt, Paul V. Bulpin , T. Ap Rees. Pathway of starch breakdown in

photosynthetic tissues of Pisum sativum. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General
Subjects Volume 544, Issue 1, 15 November 1978, Pages 200-214

[73] Marion M. Bradford. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry.
Volume 72, Issues 12, 7 May 1976, Pages 248254

[74] Miller G.L., Use of DNSA reagent for determination of reducing sugars, Anal. Chem.
1959; 32: 426428

[75] Nouri, M. Catlisis cida VS hidrlisis enzimtica en la industria del almidn.

Alimentacin, equipos y tecnologa. 1991; Oct. p. 141-145.

[76] Abdul Aala Najmus Saqib, Philip John Whitney. Differential behaviour of the
dinitrosalicylic acid (DNS) reagent towards mono- and di-saccharide sugars. Biomass and
Bioenergy 35, 2011. 4748-4750.

[77] Hostettler VF, Borel E, Deuel H. Uber die reduction der 3,5-dinitrosalicylsaure durch
zucker. Helv Chim Acta 1951; 35(257):2133-9.

[78] Robert J. Whitehurst, Maarten Van Oort. Enzymes in Food Technology. Second
Edition. Wiley-Blackwell. 2010.

[79] Brandam C., Meyer X.M., Proth J., Strehaiano P. and Pingaud H. A new reaction
scheme for the starch hydrolysis and temperature policy influence during mashing. Food
Sci. Biotechnol. Vol. 11, No. 1, pp. 40 47. 2002

- 66 -
[80] Taylor J., An Introduction to Error Analysis: The Study of Uncertainties in Physical
Measurements, University Science Books, California, 1997.

[81] Fowler John. Chi-Square Minimization. Statistical References, CalTech.12 March

2008

[82] Jose Carlos Pinto, Marcos W. Lobao, Andre L. Alberton, Marcio Schwaab,Marcelo
Embirucu, and Silvio Vieira de Melo. Critical Analysis of Kinetic Modeling Procedures.
International journal of chemical reactor engineering. Volumen 9, Article A87, 2011.

- 67 -