Tpicos en Biofsica Molecular

2do Cuatrimestre de 2011

Docentes: La Pietrasanta y Catalina von Bilderling

Prctica de laboratorio n 3: Microscopa de Fluorescencia

OBJETIVOS

Identificar las partes y familiarizarse con el funcionamiento del microscopio de

fluorescencia. Observar muestras de nanopartculas (quantum dots) y microesferas
fluorescentes. Analizar una muestra de clulas marcada con tres sondas
fluorescentes. Discutir la configuracin de los cubos (filtro de excitacin, espejo
dicroico y filtro de emisin) para cada muestra comparando los espectros de los
fluorforos utilizados y de los cubos disponibles en el microscopio. Estudiar cmo
afecta la resolucin del microscopio en la visualizacin de los tres tipos de
muestras.

INTRODUCCIN

1. Microscopa de Fluorescencia

La fluorescencia refiere al proceso mediante el cual un espcimen absorbe y

subsecuentemente irradia luz, en un intervalo de tiempo (entre la absorcin de la
luz de excitacin y la emisin de la luz fluorescente) que es usualmente de pocos
nanosegundos. La Microscopa de Fluorescencia es la herramienta que permite
estudiar materiales fluorescentes, ya sea de manera natural (materiales
autofluorescentes) o tratados con sondas fluorescentes.
El Microscopio de Fluorescencia fue desarrollado a principios del siglo veinte por
August Khler, Carl Reichert, y Heinrich Lehmann, entre otros. Sin embargo no
fue sino hasta dcadas despus que se descubri su potencial, siendo hoy una
tcnica indispensable en biologa celular. La principal diferencia del Microscopio
de Fluorescencia es que permite irradiar al espcimen con la luz de excitacin y
separar la luz fluorescente emitida, que es mucho ms dbil, de la luz de excitacin.
As, slo la luz emitida por el espcimen es detectada por el ojo o el detector
(usualmente una cmara digital). Como resultado, las partes fluorescentes de la
muestra brillan contra un fondo (background) oscuro con suficiente contraste como
para permitir la deteccin. Cuanto ms oscuro es el fondo, ms eficiente ser el
instrumento. La Figura 1 presenta un esquema de lo que ocurre cuando un
espcimen fluorescente es observado a travs de un Microscopio de Fluorescencia.

La microscopa de fluorescencia es una herramienta de inestimable valor ya que

permite alcanzar altos niveles de sensibilidad y resolucin microscpica,
permitiendo una apreciacin diferente de la informacin que se puede obtener de
los especmenes y que generalmente pasa desapercibida. El uso de fluorforos ha
permitido identificar clulas, componentes celulares sub-micromtricos y otras
entidades con un alto grado de especificidad. Ms an, esta microscopa permite la
deteccin del material fluorescente con una altsima sensibilidad: puede ser
detectada una cantidad muy pequea de molculas fluorescentes (unas 50
molculas por micrn cbico). En una misma muestra, diferentes sondas
fluorescentes permiten apreciar distintos tipos de molculas gracias a las tcnicas
de marcado especfico.

Figura 1. Representacin de una muestra en el Microscopio de Fluorescencia. Por medio de un filtro de

excitacin se seleccionan las longitudes de onda especficas de la luz de una fuente UV-visible. Un filtro
de barrera permite el paso de la luz fluorescente emitida bloqueando la luz UV reflejada. La fluorescencia
se irradia en todas las direcciones independientemente de la direccin de la luz de excitacin. Tomado de
Davison M, Abramowitz M, Introduction to Fluorescence. Olympus Microscopy Resource Center.

2. Filtros para Fluorescencia

Los filtros juegan un papel muy importante en un Microscopio de Fluorescencia ya

que son los que permiten separar la luz emitida de la luz de excitacin.
Bsicamente hay tres categoras de filtros: filtros de excitacin, filtros de barrera y
espejos dicroicos usualmente combinados para producir un cubo de filtros como el
de la Figura 2a. La seleccin de los filtros apropiados es la clave para que esta
microscopa funcione.

Figura 2. (a) Cubo de filtros de un Microscopio de Fluorescencia. (b) Espectros de los filtros que
conforman el cubo U-MWIBBP: excitacin BP 460-490, emisin BA 515-550 y dicroico DM 505. (c)
Espectros de los filtros del cubo U-MNG: excitacin BP 530-550, emisin BA 590 y dicroico DM 570.
Modificado de Davison M, Abramowitz M, Fluorescence Filters. Olympus Microscopy Resource Center.

Los filtros de excitacin permiten que slo las longitudes de onda seleccionadas de
la fuente de luz pasen a travs del camino de iluminacin del espcimen. Los filtros
de barrera o filtros de emisin estn diseados para suprimir o bloquear
(absorber) las longitudes de onda de excitacin en el paso hacia el detector. Los
espejos dicroicos son filtros especializados diseados para reflejar las longitudes de
onda de excitacin y dejar pasar las de emisin eficientemente. Los dicroicos se
posicionan en el camino ptico despus del filtro de excitacin pero antes del de
emisin, a un ngulo de 45 grados respecto de cada uno de ellos, como se ve en la
Figura 2a. Las caractersticas de cada filtro se pueden ver en su espectro, que
muestra el porcentaje de transmisin en fundn de la longitud de onda. En la
Figura 2b,c se presentan los espectros de los filtros de excitacin y emisin y filtros
dicroicos para dos cubos comerciales de la firma Olympus.

3. Algunos materiales y sondas fluorescentes

La Microscopa de Fluorescencia aprovecha principalmente el alto grado de

sensibilidad de la tcnica combinado con la habilidad de marcar componentes
estructurales y procesos dinmicos en clulas o tejidos ya sea vivos o fijados
qumicamente. Muchas sondas fluorescentes son construidas a partir de
compuestos aromticos sintticos y fueron diseadas para ligarse a una
macromolcula biolgica (por ejemplo una protena o un cido nucleico) o para
localizarse en una regin estructural especfica como citoesqueleto, mitocondria,
retculo endoplasmtico o ncleo. Otro tipo de sondas son empleadas para
monitorear procesos dinmicos y variables ambientales localizadas incluyendo
concentracin
Una de las sondas
de iones,
mspHutilizadas
y potencial
es de Fluorescena (Figura 3a), y su derivado
la mebrana.
FITC (fluorescein isothiocyanate) que se une a aminas primarias permitiendo
marcar componentes biolgicos. Como otro ejemplo, el fluorforo DAPI (o 4',6-
diamidino-2-phenylindole) se une a regiones del ADN ricas en bases A-T, y puede
pasar a travs de la membrana celular por lo que se usa para marcar clulas
fijadas o vivas (Figura 3b). En cuanto al marcado de organelas, se han
desarrollado fluorforos especficos como los de la serie MitoTracker (Figura 3c) y
MitoFluor de Molecular Probes, que presenta fluorforos para marcar
Mitocondria con diversas propiedades espectrales. El mecanismo de ligadura vara
en cada sonda de la serie, desde una unin covalente a la oxidacin en membranas
de mitocondrias respiratorias.

Figura 3. Estructura de los fluorforos Fluorescena (a), DAPI (b) y MitoTracker Red (c).

La ingeniera de sondas fluorescentes tuvo un salto tecnolgico muy grande con el

descubrimiento de la protena verde fluorescente (GFP) y el desar rollo de sus
variantes mutantes espectrales, que abrieron la puerta a las investigaciones
multicolor no invasivas en localizacin de protenas, interacciones intermoleculares
y trfico en cultivos de clulas vivas. En la prctica de Cultivo Celular usaremos
vectores de expresin para marcar con este tipo de sondas distintas protenas en
clulas.
Por ltimo, como desarrollo ms reciente en sondas fluorescentes podemos
mencionar los quantum dots (QDs) o nanopartculas semiconductoras fluorescentes,
cuyas propiedades espectrales estn fuertemente determinadas por su tamao
(Figura 4). QDs con tamaos que difieren en decenas de un nammetro emiten en
diferentes longitudes de onda (menores tamaos emiten longitudes de onda ms
cortas y viceversa). Los materiales ms comunes de estas nanopartculas es el
Seleniuro de Cadmio (CdSe) o Sulfuro de Cadmio (CdS). Los QDs vienen
recubiertos con polmeros hidroflicos y conjugados a anticuerpos u otros pptidos
biolgicamente activos y carbohidratos para su aplicacin en protocolos de
inmunohistoqumica. Sus propiedades fotofsicas presentan ventajas significativas
respecto de otros fluorforos, como fotoestabilidad, altos niveles de fluorescencia y
emisin en mltiples colores con una nica longitud de onda de excitacin.

(a)
(b) (c)

Figura 4. (a), Estructura de un quantum dot y su funcionalizacin con biomolculas. Las soluciones de
QDs fluorescen en distintas longitudes de onda segn su tamao, como puede verse en (b) y en sus
caractersticas espectrales (c). Tomadas de http://www.invitrogen.com (075409_Qdot_brochure.pdf).

DESARROLLO DE LA PRCTICA

1. Identificar las partes especficas y familiarizarse con el funcionamiento del

Microscopio de Fluorescencia. Analizar los espectros de los cubos de filtros (filtro
de excitacin, espejo dicroico y filtro de emisin) disponibles en el microscopio.

El microscopio cuenta con cuatro posiciones para cubos de filtros, tres de ellas
estn dispuestas para fluorescencia:

(1) 450-490/ FT 510/ LP520 (Zeiss)

(2) Para transmisin
(3) Cubo QD 655 (Chroma)
(4) BP 365/ FT 395/ LP 397 (Zeiss)
2. Preparar muestras de:

- esferas de ltex fluorescentes de diferentes tamaos.

- quantum dots (nanopartculas semiconductoras fluorescentes)

Observarlas al microscopio (elegir el cubo indicado para cada fluorforo). Tomar

imgenes de ambas muestras. Se puede medir el tamao de las partculas a partir
de las imgenes tomadas?

3. Muestra biolgica: componentes del citoesqueleto y ncleo, marcados con

distintas sondas fluorescentes, en clulas endoteliales de arteria pulmonar bovina
5)
(FiguraActina: filamentos marcados con faloidina Texas Red-X
Tubulina: marcado con un anticuerpo primario contra -tubulina y
visualizado con un anticuerpo secundario conjugado a BODIPY
Ncleo: marcado con DAPI
Fluoresceina

Figura 5. Muestra comercial de clulas de arteria pulmonar bovina.

Proponer la configuracin de los cubos de acuerdo a cada fluorforo presente en la

muestra (Figura 6). Comparar la misma con los cubos disponibles en el
Microscopio. Observar la muestra en los diferentes canales, identificar los
componentes celulares marcados, su localizacin y distribucin. Adquirir una
imagen de cada canal.
 Figura 6. Espectros de excitacin (lnea de puntos) y emisin (lnea llena) de los tres fluorforos
presentes en la muestra: DAPI (azul), BODIPY (verde) y Texas Red (rojo). Tomado de
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Research-Tools/Fluorescence-SpectraViewer.html

REFERENCIAS

[1] Davison, M., Abramowitz, M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy

Resource Center. http://www.olympusmicro.com
[2] The future of fluorescence. Qdot nanocrystal technology (B-075409 Qdot
brochure) http://www.invitrogen.com
[3] Espectros de los fluorforos ms utilizados:
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Research-
Tools/Fluorescence-SpectraViewer.html