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2014

Microbiologa
Gua de prcticas
Este documento es una herramienta de consulta para los estudiantes de
Medicina que incursionan en las prcticas de microbiologa

Universidad de Cuenca
Facultad de Ciencias Mdicas
30/07/2014
Gua de Prcticas Microbiologa

Introduccin

La siguiente gua de prcticas de Microbiologa, est dirigida a los estudiantes de tercer ciclo de
la carrera de Medicina de la Universidad de Cuenca, como una herramienta de consulta de
gran utilidad para quienes estn encaminndose al diagnstico microbiolgico. Tiene como
funcin principal orientar al alumno en la realizacin de sus actividades acadmicas en el
laboratorio de Microbiologa.

La Microbiologa es una ciencia en progreso que va de la mano con el avance de la tecnologa.


Durante dcadas, hemos menospreciado el conocimiento del mundo microbiano que nos
rodea. Felizmente hoy, nos damos cuenta que los microorganismos son de vital importancia
en el ciclo de vida planetario y en los seres que lo habitan; as que vale la pena estudiar a
fondo los agentes biolgicos y los mecanismos que emplea nuestro organismo para
relacionarse con ellos.

Se debe mencionar que dentro de los criterios de evaluacin, para la aprobacin de la materia,
es necesario que los estudiantes demuestren ciertas aptitudes como la capacidad investigativa
y creativa, en donde cada par de alumnos (son dos generalmente) deben exponer la prctica
asignada. La nota obtenida en prcticas toma en cuenta el manejo de material, informes,
desenvolvimiento durante el seminario, iniciativa, habilidades o pericias demostradas1. El
informe debe contener una revisin bibliogrfica adecuada al tema. El ayudante de prcticas
de la asignatura es el responsable de organizar y coordinar con los alumnos sobre cada uno de
los temas sugeridos en el slabo de Microbiologa. Sin embargo tiene plena apertura a realizar
cualquier cambio que crea pertinente, para el beneficio de los estudiantes. En cuanto al
desarrollo de prcticas en el rea de Parasitologa, existe ya un texto gua bastante didctico
que se puede consultar as como el libro de la Dra. Anita Maldonado docente jubilada del rea.

Con estos antecedentes ponemos a consideracin de los docentes y alumnos de las prcticas
de Microbiologa la siguiente gua.

Md. Sofa Adriana Narvez Morales

Prof. Ctedra Microbiologa

1
SILABO DE MICROBIOLOGIA Y PARASITOLOGIA. Marzo-Julio 2014.

1
Tema1: Normas de bioseguridad en el laboratorio de microbiologa.

Objetivo General:
Describir la organizacin de un laboratorio de microbiologa y las normas de
bioseguridad que se establecen en el mismo.

Objetivos especficos:
1. Describir la estructura general de un laboratorio de microbiologa clnica
2. Aplicar las normas de bioseguridad que deben establecerse en el laboratorio
para evitar la trasmisin de infecciones
3. Reconocer la importancia de estas normas para la proteccin personal y de la
comunidad.
4. Conocer los materiales y equipos de uso frecuente.

Justificacin.-

Los estudiantes deben conocer y aplicar las normas de bioseguridad para evitar cualquier
accidente en el laboratorio, las destrezas que se adquieran en el trascurso de las prcticas
depende directamente de este tema fundamental.

Marco terico.-

La organizacin de un laboratorio depende de microbiologa depende de las caractersticas y el


tamao del mismo, disponibilidad del personal y del espacio fsico. 2

Estructura de un laboratorio de microbiologa.-

Dependiendo de las caractersticas de cada laboratorio, el mismo cuenta con las siguientes
secciones o reas bsicas, a ms de reas especializadas:

1) Seccin de la toma de muestras


2) Seccin de recepcin y registro de muestras
3) Seccin de siembra de muestras
4) Seccin de medios de cultivo
5) Seccin de lavado y esterilizacin
6) rea de almacn o depsito
7) Seccin de bacteriologa
8) reas especializadas: seccin de micobacterias, seccin de micologa, seccin de
antibiticos, seccin de serologa, seccin de virologa seccin de biologa molecular.

Normas de bioseguridad:

Conjunto de medidas preventivas destinadas a evitar el riesgo de infeccin del personal que
trabaja en l, as como su extensin a la comunidad. El propsito bsico es obtener un
ambiente de trabajo seguro y ordenado.

2
Manual prctico de bacteriologa general. Ramrez Ana. Et al. Universidad de los Andes. 2010

2
Elementos de contencin:

Equipos de seguridad
Diseo del laboratorio
Prcticas de trabajo

Equipos de seguridad.- (contencin primaria)


Permiten al operador la preparacin y trasferencia del material potencialmente infeccioso sin
romper la barrera. Estos incluyen: guantes, bata, mascarilla, tubos de centrfuga con tapn,
etc.

Diseo del laboratorio.- (contencin secundaria)


Debe estar pensado para proteger al personal del laboratorio, a las personas que trabajan en
otras reas de la institucin y a la comunidad. Debe ser de acceso restringido, los materiales
que contiene debe ser de fcil limpieza.

Prcticas de trabajo.-
Corresponde a la utilizacin estricta de los procedimientos y tcnicas, especialmente diseadas
para disminuir el riesgo. Es el elemento de contencin ms importante en cuanto a la
prevencin de infeccin en el laboratorio.

Niveles de seguridad biolgica.-


Existen cuatro niveles, segn las tcnicas utilizadas, los equipos de seguridad, y la estructura
del laboratorio3.

Nivel 1.-
Vlido para los laboratorios de enseanza para los que se trabaja con microorganismos no
patgenos bien conocidos y patgenos oportunistas.

3
Riesgos Especficos Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. 01- Principios generales.

3
Nivel 2.-
Permite el trabajo con microorganismos potencial moderada. Es el caso de laboratorios de
hospitales o centros de salud a nivel primario.

Nivel 3.-
Adecuado para trabajar con microorganismos de alto riesgo.

Nivel 4.-
Solo se establece en laboratorios de experimentacin, se manejan microorganismos de
altsimo riesgo.

Actividad a realizarse:
Los responsables de la prctica deben ampliar los conocimientos investigando:
- los microorganismos que se estudian segn el nivel de seguridad biolgico
- normas a cumplirse en cada uno de los niveles
- materiales a usarse en cada uno de los niveles de contencin.
- elaborar actividades didcticas para la comprensin y aplicacin del tema de
bioseguridad.
- Ejemplo 1: realizar un plano del laboratorio de microbiologa y colocar las reas o
secciones correspondientes.
- Ejemplo 2 : Nombrar los significados de estos smbolos

4
Tema 2: Materiales y equipos en el laboratorio de Microbiologa.

Objetivo General:
Manejar adecuadamente los materiales que se encuentran en el laboratorio de
microbiologa.

Objetivos especficos:
1. identificar los elementos que componen un microscopio ptico
2. manejar adecuadamente los materiales que componen el laboratorio de
microbiologa
3. mencionar los cuidados de los materiales de uso frecuente en el laboratorio de
microbiologa.

Justificacin.- luego de conocer el espacio en donde se realizarn las prcticas los estudiantes
deben familiarizarse con los materiales de uso frecuente en un laboratorio microbiolgico, asi
como el manejo y funcionamiento de algunos de los equipos con los que contamos.

Marco terico.-

Los laboratorios debern disponer de los aparatos e instrumental necesario para el correcto
desarrollo de las actividades acadmicas. Debe existir un procedimiento de control de calidad
en el laboratorio de Microbiologa que implique la monitorizacin de los medios e
instrumentos, con el fin de asegurar la adecuada realizacin de los aislamientos, identificacin
y caracterizacin de los patgenos as como la realizacin de las pruebas de sensibilidad a los
antimicrobianos como referencia teraputica. El sistema de la calidad deber contemplar la
existencia de registros de formacin del personal.

Es imprescindible la existencia de un procedimiento sobre medidas de proteccin personal en


el manejo de equipos y aparatos.

Los equipos del laboratorio deben funcionar de forma que se asegure la reproducibilidad de
los resultados de las pruebas diagnsticas.

El personal tcnico y sanitario del laboratorio deber disponer la titulacin adecuada para las
funciones que desarrolla de conformidad con la legislacin vigente.

Elementos y materiales ms frecuentes de un laboratorio de Microbiologa Clnica

2.1. Mesas de laboratorio, fregadero, vitrinas, armarios.

5
2.2. Mechero Bunsen

Recuerda!:
- Todas las manipulaciones deben realizarse en un radio de 10-15cm de la llama del
mechero (zona asptica).
- En caso de utilizar mechero nunca se debe coger material por encima de la llama
- Antes de comenzar a trabajar se procurar disponer de todo el material necesario para
el procesamiento de la muestra
- Tomar las medidas necesarias para evitar la contaminacin de las muestras o/ y cultivo
por microorganismos ambientales4

2.3. Gradillas

2.4. Estufa de incubacin


Es una cmara de temperatura controlada para cultivo de microorganismos. Se utiliza para
facilitar el desarrollo de los microorganismos a su temperatura ptima de crecimiento
(generalmente 35-37).

2.5. Frigorfico o cmaras refrigeradas


Se utilizan para conservar tanto materiales (medios de cultivo, reactivos) como
microorganismos. Generalmente estn a una temperatura fija de 4C.

4
Microbiologa General y Bucal. Prcticas. El laboratorio de Microbiologa. Universidad de Salamanca

6
2.6. Congeladores
Se utilizan para la conservacin de reactivos y microorganismos a temperaturas inferiores a
0C, llegando a -80C (los ms frecuentes son -20, -40 y -80).

2.7. Microscopio ptico

2.8. Centrfuga
Aparato que aplica sobre los tubos una fuerza centrfuga lo que permite la separacin de los
distintos componentes de la muestra mediante la precipitacin en el fondo del tubo de las
partculas en suspensin.

7
2.9. Cmaras de seguridad biolgica

2.10. Desionizador de agua.


La mayor parte de los trabajos que se realizan en un laboratorio de Microbiologa Clnica
necesitan la utilizacin de agua pura con el fin de evitar cualquier tipo de interferencia. Entre
otras caractersticas debe: estar exenta de materiales en suspensin o un pH comprendido
entre 5,0 y 7,5. Durante aos se ha utilizado agua destilada, en la actualidad los destiladores se
han ido abandonando para dar paso a desionizadores que funcionan con resinas de
intercambio inico. Tambin se pueden utilizar otras tcnicas como la smosis inversa5.

2.11. Contador de colonias: Es un aparato que mediante la iluminacin de la placa y una lupa,
nos permite observar con mayor nitidez las colonias y por tanto facilita su recuento.

2.12. Balanzas

5
Microbiologa General y Bucal. Prctica 1: El laboratorio de Microbiologa. Universidad de Salamanca

8
2.13. Baos termostticos: son recipientes que contienen agua y un sistema de regulacin de
la temperatura. Se utilizan para atemperar medios de cultivo o incluso para incubar cultivos de
microorganismos.

2.14. Agitador/ mezclador

Vrtex Agitador horizontal

2.15. Jarras de anaerobios:


Recipientes que se usan para conseguir una atmsfera libre de oxgeno para el cultivo de
microorganismos anaerobios.

2.16. Asas de siembra:


Se utilizan para sembrar. Pueden ser metlicas o de plstico, curvas o rectas (para la siembra
por picadura).

2.17. Material fungible


Placas de Petri: recipientes para la preparacin de medios de cultivo slidos

9
Placas de Petri con medio slido

Tubos con medio lquido

Tubos con medio slido

Recuerda!: los tubos con medio lquido se deja enfriar en una gradilla, para que solidifique y
forme el bisel que se mira en el grfico superior. O se deja enfriar a temperatura ambiente de
forma horizontal
En el caso de las placas de petri, una vez solidificadas las placas se conservan en posicin
invertida

Pipetas de vidrio, de plstico y pipeteadores

Pipeteador automtico Pipeteador manual

Pipetas automticas (micropipetas) y puntas de pipeta:


Se utilizan para pipetear pequeas cantidades de lquidos.
Se utilizan con puntas desechables de distinto tamao y color segn la micropipeta. Existen
cuatro tamaos: de 0,5-2m; de 2-20 m; de 20-200 m y de 200-1000 m.

10
Asas acodadas o Asas de Digralsky:
Se utilizan para la extensin de microorganismos sobre la superficie de un medio de cultivo en
placa Petri.

Portas y cubres
Para realizar las observaciones al microscopio.

Vasos de precipitados y matraces

Cucharas y esptulas:
Se utilizan para pesar muestras o medios de cultivo.

Autoclave
Es el equipo ms utilizado.
Es un procedimiento de esterilizacin mediante calor hmedo. Se realiza en al autoclave
durante 15 o 20 min, segn el volumen, a 115C o 121C, segn la naturaleza del material que
se desee esterilizar.

11
Auto clavado: es un procedimiento en el que se emplea vapor a presin (a 1 atmsfera). Como
tiene gran poder de penetracin la temperatura y el tiempo utilizado es menor que los que se
emplean con el horno Pasteur (121 C, 15-20 minutos). Se utiliza para esterilizar: Medios de
cultivo, ropa, material de plstico resistente al calor hmedo, objetos de metal que no se
alteren con la humedad y sobre todo material de vidrio.

Horno de Pasteur: Emplea altas temperaturas (160-180 C) durante un tiempo prolongado (1.5
a 3 horas). Debido a su poca capacidad de penetracin se usa para esterilizar vidrio y metales.
Acta principalmente desnaturalizando las protenas y secundariamente oxidando los
compuestos celulares.

Actividad a realizarse: Esta prctica se puede sumar con la primera, dependiendo del nmero
de sesiones, la organizacin de los grupos y la factibilidad del ayudante de prcticas.
Al finalizar la prctica se aconseja realizar una autoevaluacin a los estudiantes identificando
cada una de las partes del microscopio y sus funciones; asi como los cuidados de los materiales
y equipos una vez utilizados, en especial con el lente de inmersin del microscopio ptico.
Se debe recordar las partes del microscopio ptico.
Por ejemplo:

Imagen tomada del manual prctico de bacteriologa general. Ramrez Ana.


Universidad de los Andes

12
Tema 3: Desinfeccin y Esterilizacin

Objetivo General:
Comprender la importancia de la desinfeccin y la esterilizacin del laboratorio de
microbiologa

Objetivos especficos:
1. Mencionar las principales definiciones relacionados con la Desinfeccin y la
Esterilizacin
2. Conocer y diferenciar los conceptos de: Agentes esterilizantes, desinfectantes
y antispticos
3. Aplicar un adecuado manejo de residuos/desechos biolgicos y qumicos.

Justificacin.- una vez terminadas las prcticas los estudiantes deben saber con qu solucin se
debe limpiar los mesones de trabajo y cual se debe usar en caso de derrames. Esto es
importante pues se debe mantener en orden el rea de trabajo.

Marco terico.-

Se debe recordar las normas de bioseguridad en el momento de deshacerse del material


contaminado pues se deben utilizar recipientes adecuados que deben ser esterilizados
posteriormente.

Tener presente que nunca se puede tirar nada contaminado por el fregadero o al cubo de la
basura comn sin haber sido esterilizado previamente. Existe riesgo potencial de
contaminacin y pinchazos accidentales con material corto punzante por parte del personal
de laboratorio como aquellos que recogen la basura, por ello se recomienda aplicar ciertas
normas de precaucin para evitar accidentes.

En el laboratorio deben existir unas recomendaciones generales de limpieza y en caso de


vertidos:

Procedimientos de limpieza de superficies externas mediante papel humedecido con


solucin desinfectante (alcohol 70%, desinfectante fenlico diluido, etc.). Aclarar con
agua los restos de desinfectante.
En caso de usar soluciones de hipoclorito en zonas metlicas, limpiar posteriormente
para evitar el efecto corrosivo.
En caso de derramamientos de material peligroso o formacin de aerosoles: evitar
inspiraciones de esos aerosoles, esperar 30 minutos hasta que las partculas se hayan
depositado y limpiar con mascarilla, guantes y otros tiles protectores.
En caso de vertido de materiales, cubrir la superficie con desinfectante y
posteriormente cubrir con papel humedecido con desinfectante. Dejar durante 15
minutos y limpiar. En caso necesario aclarar con agua.
En caso de derramamientos menores limpiar el material vertido mediante papel
humedecido y posteriormente aclarar, cuando sea necesario.

13
Mtodos Fsicos y Qumicos Generalidades

Imagen tomada del tema terico: Agentes antimicrobianos y quimioterapia. Silabo Bacteriologa. 2014.

Definicin de trminos:

Desinfeccin: Es el conjunto de operaciones que tiene como objetivo la reduccin temporal


del nmero total de microorganismos vivos y la destruccin de los patgenos y alterantes; sin
embargo, la esterilizacin busca la obtencin definitiva de un medio completamente exento de
grmenes
Desinfectante: Cualquier agente que limite la infeccin inhibiendo la germinacin y
proliferacin de esporas de los microorganismos. (Esporostticos)
Antisptico: Biocida o producto que destruye o inhibe el desarrollo de los microorganismos en
un tejido vivo. Por ejemplo la piel. 6
Detergente: Material tenso activo diseado para remover y eliminar la contaminacin
indeseada de alguna superficie de algn material
Esterilizacin: Es la destruccin o eliminacin de todas formas de vida. Puede llevarse a cabo
por procesos fsicos o qumicos.
Higiene: Todas las medidas necesarias para garantizar la sanidad e inocuidad
Limpieza: Es el conjunto de operaciones que permiten eliminar la suciedad visible o
microscpica. Estas operaciones se realizan mediante productos detergentes elegidos en
funcin del tipo de suciedad y las superficies donde se deposita
Solucin: Combinacin de un slido o de un producto concentrado con agua, para obtener una
distribucin homognea de cada uno de los componentes.

Agentes esterilizantes, desinfectantes y antispticos

La accin antimicrobiana de los desinfectantes depende de su concentracin, el tiempo y la


temperatura y la valoracin de su efecto es compleja.

6
Microbiologa mdica. Jawetz. 25 edicin

14
Desinfeccin del ambiente Desinfeccin de la piel o
inanimado heridas

Formaldehido Hexaclorofeno
Amonio cuaternario Clorhexidina
Hipoclorito de sodio Alcohol
Propilenglicol Perxido de hidrgeno
xido de etileno Yodo povidona
Imagen tomada del tema terico: Agentes antimicrobianos y quimioterapia. Silabo Bacteriologa. 2014.

Preparacin de desinfectantes
Para la preparacin de los agentes desinfectantes a las concentraciones deseadas se emplea la
siguiente formula7:

V1C1=V2C2

DONDE:
V1= V2*C2/ C1
V1= Volumen deseado
C1= Concentracin conocida
V2= Volumen conocido
C2= Concentracin deseada

Ejemplo: Hipoclorito comercial al 13% y se desea preparar al 6% un volumen de 50 mililitros =


50cc de hipoclorito al 6%.
V1C1=V2C2
V1 (13%) = (50ml) (6%)
V1= (50ml) (6%)
(13)%
V1= 24 ml

Respuesta: Se debe agregar 24 ml. de hipoclorito de sodio a 26 ml. de agua destilada para
tener 50 ml. de una solucin al 6%

Manejo de desechos.
En los laboratorios tanto la descontaminacin como la eliminacin de desechos son
procedimientos ntimamente relacionados. En el trabajo cotidiano hay que eliminar parte del
material que se utiliza y el resto se aprovecha para volver a utilizarlo, como ocurre con la
cristalera, el instrumental y la ropa de laboratorio.

Descontaminacin.- el material destinado a la descontaminacin y eliminacin debe


introducirse en recipientes, por ejemplo: bolsas de plstico susceptibles de tratamiento con
autoclave que tengan un cdigo de color que indique si el contenido ha de pasar al autoclave o
la incineracin.

7
Universidad de Pamplona. Centro de Preparacin de Medios. Manual de Limpieza y
Desinfeccin

15
El tratamiento con autoclave constituye el mtodo de eleccin para todos los procesos de
descontaminacin.

Eliminacin de desechos.- hay que establecer un sistema de identificacin y separacin de


material contaminado (y sus recipientes). Puede hacerse la siguiente divisin:
a) Desechos no contaminados que pueden eliminarse con la basura
b) Objetos cortantes: agujas hipodrmicas, bisturs, vidrios rotos, etc.
c) Material contaminado para el tratamiento en autoclave y reutilizacin
d) Material contaminado para eliminacin
e) Desechos anatmicos: tejidos humanos y animales8

Actividad a realizar: Al finalizar la prctica los estudiantes deben conocer los colores de
identificacin para la eliminacin correcta de los desechos, se recomienda realizar actividades
que fomenten el buen uso de los basureros as como la realizacin de ejercicios para la
preparacin de desinfectantes.

8
Manual prctico de bacteriologa general. Ramrez Ana. Et al. Universidad de los Andes. 2010

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Tema 4.- Toma de Muestras. Normas bsicas generales

Objetivo General:
Entender la importancia de la toma de muestras como un paso previo indispensable
dentro de la fase pre analtica de un examen microbiolgico.

Objetivos especficos:
1. Conocer las normas bsicas generales en el momento de tomar una muestra,
para conocer el agente responsable de un cuadro clnico infeccioso.
2. Distinguir las diversas formas de rechazo de una muestra, para evitar
resultados errneos.
3. Recordar las caractersticas anatmicas de cada sistema para la toma de
muestras de manera especfica.

Justificacin.- si bien el estudiante de medicina promedio no se dedicar en su vida profesional


al laboratorio clnico, si manejar las muestras que sern enviadas al laboratorio para su
anlisis, este paso fundamental conocido como la fase pre analtica es de vital importancia
para la interpretacin y el diagnstico de las enfermedades infecciosas, como se ver a
continuacin.

Marco terico.-

El diagnstico de las enfermedades infecciosas se basa en el estudio de los sntomas y signos


clnicos, as como en la demostracin de la presencia del agente microbiano. El diagnstico
clnico es, en muchos casos, orientador luego de evaluar los datos que ofrecen la historia
clnica y la exploracin pero, la confirmacin de un diagnstico clnico requiere en
enfermedades infecciosas del diagnstico etiolgico que confiere el Laboratorio de
Microbiologa Clnica.

El trabajo a realizarse en el laboratorio de Microbiologa debe llevarse a cabo de acuerdo con


los estndares tcnicos y de seguridad propios. Las muestras que analicemos para determinar
los microorganismos presentes deben ser manejadas con extrema precaucin para evitar
contaminaciones que den lugar a resultados equvocos a ms de evitar infecciones por su
potencial patogenicidad.

Toda la informacin diagnstica que el laboratorio de microbiologa puede proporcionar,


depende de la calidad de la muestra recibida. Por ello, una toma mal realizada, pobremente
recogida o mal transportada determinar un posible fallo en la recuperacin de los agentes
patgenos, que puede inducir a errores diagnsticos, e incluso a un tratamiento inadecuado
del enfermo. Este hecho es bien conocido por los microbilogos, no obstante la mayora de las
muestras son obtenidas por otros profesionales de la salud en diversos servicios clnicos, por lo
que es necesaria la educacin continua de dicho personal sanitario, al que hay que advertir del
gasto intil y el error de los datos obtenidos a partir de un estudio realizado de forma
inadecuada.

17
Normas generales.-

IDENTIFICACION

TRANSPORTE Y
ASEPSIA
CONSERVACION

OBTENCION O
TOMA DE LA
MUESTRA

1. Obtencin de muestras:
Deben realizarse en condiciones de mxima asepsia, evitando contaminaciones
ambientales, del personal mdico y del propio enfermo.
No debe estar en contacto con sustancias desinfectantes.

2. La Orden de solicitud de examen. Precisa:


Identificacin del paciente.
Identificacin del mdico.
Datos de la muestra (hora de recogida, tipo de muestra, Diagnstico, localizacin
anatmica, procedimiento de obtencin de la muestra).
Determinaciones solicitadas.

3. Identificacin de la muestra:
Cada muestra debe estar acompaada siempre de una orden. El paciente debe identificarse
con nombre y apellidos, tipo de muestra, fecha, y hora de extraccin. La orden y la muestra
deberan tener etiqueta de color segn su conservacin:
Rojo: en estufa.35C
Azul: en refrigeracin a 4C.
Amarillo: a Temperatura ambiente.
Conservacin de las muestras:
Muestras para virus: en refrigerador, salvo sangre, mdula sea, y Ag CMV
(citomegalovirus).
Muestras para hongos: en refrigerador, salvo LCR, piel, pelo, uas, vaginal y balano
prepucial.
Muestras para anaerobios: a Temperatura ambiente.
Muestras para micobacterias: en refrigerador, salvo contenido gstrico.

Muestras para Bacteriologa:


A temperatura ambiente: mdula sea, lquidos estriles (pleural, peritoneal,
articular,...), muestras oculares, muestras de cavidad oral, heridas, abscesos, fstulas,
adenopatas, del tracto genital, y biopsias.
En refrigerador: orinas, heces, catteres.
En ESTUFA: hemocultivos, LCR, placas y tubos inoculados.

Criterios de rechazo de una muestra


Muestras sin orden o con rdenes incompletas y/o fallo de identificacin de la
muestra.

18
Muestras derramadas, o rotas, con recipiente fuera del periodo que indica la fecha de
caducidad
Muestra no adecuada para la prueba solicitada.
Muestras sin medio de transporte adecuado o incorrectamente conservadas
Muestras duplicadas en el trascurso de 24 horas.
Muestras con agujas o cualquier otro material corto punzante9

Tracto respiratorio superior.-

El tracto respiratorio superior (TRS) se inicia con las fosas nasales y la boca y se contina con la
nasofaringe y orofaringe. Junto a stas se encuentran los senos paranasales y el odo medio.
Las infecciones del tracto respiratorio superior constituyen una de las consultas mdicas ms
frecuentes, a pesar de que tienen un curso benigno y autolimitado, producen inconvenientes
laborales o escolares por ausentismo e incluso pueden originar complicaciones supurativas y
no supurativas de variada gravedad. En este grupo se encuentran la faringitis, otitis y sinusitis.

Toma de muestra.-
Nariz:
Muestra: frotis de fosas nasales.
Volumen: 1ml aproximadamente
Recipiente: medio de transporte Stuart.

Garganta:
Muestra: frotis de faringe posterior, de lceras, o lesiones purulentas.
Volumen: 1ml
Recipiente: medio de transporte Stuart (figura 1).

Figura 1: Medio de transporte comercial con medio de cultivo Stuart.

Procedimiento.-

Para la toma de muestra de los exudados faringo-amigdalinos se necesita una buena fuente de
luz, un hisopo de Dacron o que contenga alginato de calcio y un baja lenguas. Se coloca el
cuello del paciente en hiperextensin y se ilumina la garganta deslizando y rodando el hisopo
por ambas amgdalas (o los pilares en caso de no haber amgdalas) procurando que en ningn
momento toque la lengua o el paladar. Si hay exudado o membranas se deben tomar stas.
En caso de nios pequeos la madre debe sentar al nio en su regazo y cruzar sus brazos sobre
los del nio de tal forma que sujete al nio. Una vez tomada la muestra se coloca el hisopo en
el medio de transporte y se enva al laboratorio dentro de las 4 horas siguientes, si va a tardar
ms se debe utilizar medios de transporte adecuados, pues estos mantienen viables los
microorganismos y evitan el sobre crecimiento de los contaminantes como las bacterias de la
saliva, lengua o paladar que pueden proliferar mejor o competir.

9
Recoleccin y trasporte de muestras en microbiologa Clnica. Zurita Jeannete. OPS. 2004

19
TOMA Y TRANSPORTE DE LA MUESTRA NASOFARNGEA.
La toma de muestra nasofarngea es una toma muy til para VSR, otros virus respiratorios, y
para las bacterias como Chlamydia spp. y Bordetella pertussis. El espcimen debe ser tomado
de tal manera que evite la contaminacin con la flora nasal y oral y es realizada por el mdico
especialista. La nasofaringe es alcanzada insertando un pequeo y delgado hisopo a travs ya
sea de la nariz o de la garganta. Si es por va nasal se recomienda el uso del espculo nasal;
esta toma puede ser realizada mediante:
1. Hisopo o escobilln delgado flexible (menor rendimiento). Debe introducirse con cuidado a
travs del orificio nasal hasta alcanzar la nasofaringe, en donde se deja unos 30 a 60 segundos
para que los microorganismos se absorban.
2. Una alternativa es tomar la muestra a travs de una sonda tratando de llegar hasta la parte
posterior de las fosas nasales
3. El lavado nasofarngeo es la tcnica que ofrece una mayor capacidad de recuperacin del
microorganismo.
Remueva las secreciones nasales o exudados que se encuentren en las fosas anteriores, inserte
el espculo nasal (opcional). Suavemente pase a travs de la nariz y llegue hasta la
nasofaringe. Rote el hisopo sobre la membrana nasofarngea y djelo por 10 a 15 segundos
para que absorba los microorganismos. Retire suavemente el hisopo y colquelo en un medio
de transporte de acuerdo al microorganismo que desee se investigue (bacterias o virus)10.

Infecciones del tracto respiratorio inferior.-

ESPUTO
Si bien el esputo es la muestra respiratoria que se obtiene por metodologa menos agresiva, es
tambin una muestra que inevitablemente se encuentra contaminada por flora de la oro-
faringe por lo que su valoracin e interpretacin de los hallazgos debe ser siempre cuidadosa;
a pesar de ello, en muchos casos el esputo sigue siendo una ayuda para el diagnstico. Para
que sea til el sembrar una muestra de esputo se debe cumplir con los algunos requisitos,
segn la OPS:
La muestra de esputo debe ser enviada al laboratorio para su procesamiento dentro
de las 2 horas de recolectada, en un recipiente estril de boca ancha y tapa rosca.
Si esto no es posible refrigerarlo (4 a 8C) pero no ms de 24 horas, para evitar la
proliferacin de flora comensal y evitar la prdida de viabilidad de microorganismos
como S. pneumoniae y H. influenzae.
Una muestra adecuada para cultivo en un paciente inmunocompetente es la que tiene
en la tincin Gram o Giemsa, ms de 25 polimorfonucleares y menos de 10 clulas
epiteliales de descamacin por campo (bajo aumento 100X)
Para estudios bacterianos enve una muestra de ms de 1 ml de esputo.
Para investigacin de Mycobacterium realice un seriado de 3 das consecutivos. Estas
pueden almacenarse hasta 5 das en refrigeracin sin perder la viabilidad. Enviar
aproximadamente 5 a 10 ml

10
Recoleccin y trasporte de muestras en microbiologa Clnica. Zurita Jeannete. OPS. 2004

20
No enve la muestra de esputo para cultivos de anaerobios.
No recolecte el esputo en 12 o 24 horas para cultivo, ni para ninguna otra prueba,
debido al crecimiento bacteriano excesivo y a la prdida consecuente de su valor
diagnstico.

Para la obtencin de la muestra de esputo se necesita que el paciente est alerta y colabore
con la recoleccin. Es importante indicar al paciente que la muestra debe ser obtenida por
expectoracin o tos profunda y no recoger saliva (escupir). El esputo se obtiene luego de una
expectoracin profunda despus de haberse enjuagado la boca con agua, e incluso puede
haber un cepillado previo de los dientes. Despus de esta sencilla higiene oral, la muestra debe
ser recolectada en un frasco estril de boca ancha y tapa de rosca. Los recipientes para la
recoleccin de orina son apropiados; se deben rechazar las muestras que vienen en cajas para
heces u otro tipo de cajas, envases caseros, etc.

Muestra: esputo no saliva (ver imagen superior).


Volumen: 2 ml aproximadamente.
Recipiente: envase estril de boca ancha.

Orina, heces, secreciones genitales.-

TOMA DE MUESTRA
El diagnstico de ITU (infeccin del tracto urinario) se basa en la demostracin del agente
causal. Tomando en cuenta una recogida adecuada de orina y su remisin inmediata al
laboratorio. Si la muestra de orina no puede ser procesada y cultivada en la media hora
siguiente a su obtencin debe ser refrigerada para evitar la multiplicacin de los
microorganismos contaminantes. La orina, al igual que la mayora de muestras destinadas al
estudio bacteriolgico, debe recogerse antes de la instauracin del tratamiento antibitico. Es
preferible obtener la muestra de la primera miccin de la maana. En este momento los
recuentos bacterianos sern ms elevados debido a la posibilidad que tienen las bacterias de
multiplicarse durante la incubacin nocturna (cada 20 minutos). En caso contrario se
esperarn 4 horas despus de la ltima miccin antes de recoger la muestra. No se debe forzar
la miccin con lquidos y si esto sucede debe constar en la hoja del pedido. La uretra est
fisiolgicamente habitada por una flora bacteriana saprfita y la orina vesical estril del
individuo sano puede contaminarse al pasar por la uretra o al entrar en contacto con
secreciones vaginales o del prepucio. Por lo tanto la orina recogida sin precaucin de limpieza
previa de los genitales puede suministrar resultados falsamente positivos11.

11
Manual Micro diagnstica. Tercera parte. Toma de muestras. LABORATORIO LINSAN S.A.

21
MICCION ESPONTANEA
Este mtodo de recoleccin de orina es posible en adultos y en los nios que ya pueden
controlar esfnteres. En el caso de las mujeres adultas el mtodo idneo de recogida es el
siguiente:
1. Lavado de las manos
2. Lavado de los genitales externos suavemente empleando compresas o gasas humedecidas
con agua y jabn; no utilizar antispticos pues pueden mezclarse con la orina y dar resultados
falsos negativos.
3. Despus del lavado hay que aclarar con agua y secar con una toalla
4. Con los labios an separados se iniciar la miccin desechando el primer chorro de orina,
que por arrastre mecnico limpia el canal uretral. Se recoger la segunda parte de la miccin
(chorro medio) en un recipiente estril de boca ancha, que inmediatamente se cerrar y se
entregar al laboratorio para su procesamiento.
En el varn la recogida de la orina es ms sencilla. Hay que dar instrucciones a los varones no
circuncidados para que retraigan la piel del prepucio. Una vez que se ha realizado la limpieza
del glande y posteriormente a su secado con la gasa o compresa, se recoger igualmente la
orina a mitad de la miccin descartando la primera parte de la misma.

Resumen:
Envase estril de boca ancha adultos, recolector para muestras peditricas
Muestra: miccin media.
Volumen: 0,5 ml mnimo
Recipiente: envase estril de boca ancha.
Consideraciones: primera miccin de la maana., segundo chorro o mitad del chorro.

Heces.-
Las muestras de heces son recogidas habitualmente en la casa del paciente y si est
hospitalizado en el servicio en el que est internado. La muestra puede ser recolectada por
evacuacin espontnea directamente en un recipiente de recoleccin de heces o en una
bacinilla de cama, papel plstico o un dispositivo de recoleccin. Nunca tome la muestra del
agua del inodoro y no permita que se contamine con orina. Es de particular valor el examen
fsico de una muestra de heces, esta valoracin de las heces permite la:
1. Determinacin objetiva de las quejas subjetivas del paciente.
2. Observacin de la calidad de las heces; acuosa, mucosa, sanguinolenta, espumosa, grasosa,
etc., que ayuda al diagnstico.

No se deben procesar las muestras si stas:


1. No vienen en el recipiente apropiado (limpio, boca ancha, tapa rosca)
2. Estn mezcladas con orina
3. Vienen en paales.
4. Han sido recolectadas de los inodoros o retretes
5. Estn contaminadas con agua
6. Contengan purgantes de aceite, bario o sustancias radiopacas, o con carbn o supositorios
de glicerina, etc.
7. No estn en medio de transporte (Cary Blair), en el caso de solicitarse coprocultivo.

Todas las muestras deben ir acompaadas de la siguiente informacin: Nombre del paciente,
nombre del mdico, fecha y hora de la recoleccin de la muestra, diagnstico presuntivo,
historia de viajes relevantes.

22
Recuerda!:
Las heces destinadas a cultivarse para la bsqueda de bacterias enteropatgenas deben ser
diarreicas, caso contrario no se justifica la realizacin de un coprocultivo, (una excepcin, es la
bsqueda de Salmonella typhi). La diarrea es un sntoma comn que puede variar de
intensidad de una molestia aguda autolimitada a una enfermedad grave que pone en peligro la
vida del paciente. La diarrea puede ser aguda o crnica, la primera es de inicio agudo y persiste
menos de dos semanas, mientras que la crnica es mayor a este perodo. La diarrea aguda es
causada comnmente por agentes infecciosos, en su mayora por toxinas bacterianas (ya sea
preformadas ingeridas, en alimentos o producidas en el intestino). La informacin
epidemiolgica puede proporcionar indicios sobre el agente etiolgico, as, el consumo de
mariscos en el caso de Vibrio parahemolyticus, tratamiento antimicrobiano en el caso de
Clostridium difficile.
81
Para la toma de la secrecin uretral.-
Se recoge directamente el pus con el hisopo. En caso de que no hubiere secrecin purulenta
evidente se debe proceder a introducir un hisopo delgado de algodn en la uretra (unos 2-3
cm) y se hace girar suavemente. Tambin se puede exprimir la uretra desde atrs hacia
delante para evacuar el exudado.

Para la toma de muestra del endocrvix.-


Es necesaria la colocacin de un espculo vaginal para la observacin del cuello uterino. Este
no debe contener lubricante alguno. Una vez localizado visualmente el cuello se debe limpiar
el exocrvix para eliminar el moco, mediante una gasa estril sujeta con unas pinzas. Introducir
el escobilln hasta 2 cm en el interior del conducto cervical, hacerlo girar y mover suavemente.
Retirar y colocar inmediatamente en el medio de transporte. La toma de secrecin vaginal para
la investigacin de N. gonorrhoeae est indicada nicamente en mujeres que han sido
sometidas a una histerectoma y en las prepberes. En las primeras se deber utilizar un
espculo vaginal para tomar la muestra del fondo de saco posterior y en el caso de las
prepberes es suficiente la toma del exudado sin el uso de espculo.

Imagen tomada en internet: Universidad de Michigan. Caren Stalburg, M.D. 2009

Resumen:
Muestra: secreciones vaginales o uretrales, torundas de crvix, lquido prosttico,...
Volumen: 1 o 0,5 ml.
Recipiente: medio de transporte Stuart (en muestras lquidas usa el tubo estril, o Frasco
Transporte PE-Lin).
Consideraciones: para estudio de Chlamydias utilizar medio de transporte especfico.

23
Otras muestras de importancia medica.-

Sangre
Fluido ms utilizado dentro de la actividad mdica diaria. Los valores hematolgicos dependen
de la edad, sexo, hbito de fumar, hora de da, posicin erecta o supina del paciente durante la
toma, administracin de lquidos y drogas.
Los 3 mtodos ms importantes para obtenerlo son:
1) Puncin venosa.
2) Puncin capilar
3) Puncin arterial.

OBTENCION DE SANGRE VENOSA:


La facilidad de la obtencin de la muestra venosa hace que este sea el mtodo principal de
extraccin. Se debe tomar en cuenta lo siguiente:
Se debe indicar al paciente el procedimiento a realizar.
Buscar la comodidad del paciente, debe estar sentado con el brazo en extensin y sin
ropa que ajuste el miembro.
Escoja el brazo derecho o izquierdo del paciente de acuerdo a la mejor presentacin
de las venas.
Ajustar el torniquete en el brazo ms o menos 7 cm por encima del sitio escogido para
la puncin.
Permita que el paciente abra y cierre la mano varias veces. Utilice tambin ligeros
golpes hasta que la vena se haga visible. A veces es ms evidente al tacto.
Escoja preferiblemente la vena mediana ceflica o mediana baslica.
Asepsia con torunda de algodn con alcohol del sitio de la puncin.
Realice una puncin rpidamente, cateterizando la vena a 45 de la piel. La sangre
debe fluir fcilmente,
Extraiga la sangre necesaria e inmediatamente suelte el torniquete.
Ponga la torunda de algodn con alcohol sobre la aguja. Con un solo movimiento
squela de la vena. Comprima con el algodn la zona de extraccin.

LCR.-
El paciente se acuesta de lado con las rodillas encogidas hacia el abdomen y la barbilla pegada
al trax. Algunas veces, este procedimiento se realiza con la persona sentada, pero doblada
hacia adelante. Despus de limpiar la espalda, el mdico inyectar anestsico local en la
regin lumbar. Se introduce una aguja espinal, generalmente en el rea lumbar. Una vez que
se ha ubicado la aguja adecuadamente, se mide la presin del lquido cefalorraqudeo y se
recoge la muestra. Luego, se retira la aguja, se limpia el rea y se aplica un vendaje sobre el

24
sitio. Con frecuencia, se le pide a la persona permanecer acostada por un corto perodo de
tiempo despus del examen.
Contraindicaciones:
Pacientes con presin intracraneal elevada
Pacientes con enfermedad articular vertebral degenerativa (Artrosis Intensa)
Pacientes con focos infecciosos cercanos al sitio de puncin
Pacientes con problemas en la coagulacin

http://raulcalasanz.wordpress.com/

Resumen:
Muestra: lquido cefalorraqudeo.
Volumen: 1 ml habitualmente, 5 ml para micobacterias.
Recipiente: tuvo estril.
Consideraciones: el primer tubo puede verse hemtico como en la imagen, se debe
diferenciar entre hemorragia y trauma.

Actividades a realizar: al finalizar la prctica el par responsable debe ahondar ms sobre la


toma de muestras de lquidos biolgicos y patolgicos, mostrando de ser posible videos sobre
los procedimientos ms comunes. Haciendo hincapi en la tcnica como en los materiales a
usarse.

La prctica puede dividirse en dos partes dado el contenido del tema, para facilitar el
entendimiento de los estudiantes.

Se debe investigar sobre los microorganismos que se encuentran en las diferentes zonas
anatmicas, para no confundir la microbiota de un agente patgeno.

Se proceder a sacar muestras de los propios compaeros recordando las medidas de


bioseguridad y obteniendo un consentimiento informado previo.

Se debe completar el trabajo revisando el procedimiento y uso de la puncin capilar y arterial


en sangre.

25
Tema 5: Tinciones

Objetivo General:
Conocer el fundamento y aplicar las tinciones que se usan con ms frecuencia en el
laboratorio de microbiologa. (Gram y Zielh Neelsen)

Objetivos especficos:
1. Diferenciar las caractersticas de las tinciones segn el nmero de colorantes a
usarse.
2. Recordar los componentes de la pared bacteriana para el fundamento
cientfico de las tinciones de Gram y Zielh Neelsen
3. Aplicar las tinciones y reportar los resultados obtenidos.

Justificacin.- dado que la mayora de las veces que se mencionen a las bacterias sern como
gram positivas y gram negativas es necesario que los estudiantes sepan el origen de estos
trminos para que lo manejen con soltura a lo largo de su carrera.

Marco terico.-

Tincin:
Es el proceso por el cual las molculas de un colorante se adsorben a una superficie. El uso de
colorantes permite cambiar el color de las clulas de los microorganismos y poder realizar la
observacin en microscopio ptico. Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan
contraste con el medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden observarse
claramente sin algn tratamiento previo.
De acuerdo a la reaccin que ocurre, existen diferentes tipos de tincin:

a) Tincin simple:
El colorante utilizado sirve solo para denotar la morfologa celular.

b) Tincin negativa:
Es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se dejan sin teir, pero se colorea
en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las clulas. La
sustancia utilizada para la tincin negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los
constituyentes celulares y que simplemente rodea las clulas, tal como la tinta china (que es
una suspensin de partculas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble
en agua). La tincin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas
en la microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la presencia de cpsulas
alrededor de las clulas bacterianas. Ejemplo: Criptococo neoformans12.

12
Microbiologa General y Bucal. Prctica 4: Diagnstico Microbiolgico Directo. Universidad de
Salamanca

26
c) Tincin compuesta:
El colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre clulas bacterianas o entre partes
de una misma clula. Estas tcnicas utilizan ms de un colorante o bien ciertos reactivos
complementarios para la tincin. Ejemplos: Tincin de Gram, Tincin de Ziehl-Neelsen, etc.

Colorantes
Los colorantes ms utilizados: azul de metileno, cristal violeta, safranina, son catinicos y se
combinan fuertemente con componentes celulares cargados negativamente, como los cidos
nucleicos y los polisacridos cidos (las envueltas externas de los microorganismos estn por lo
general cargadas negativamente).

Materiales y reactivos:
Portaobjetos
Cubreobjetos
Microscopio ptico
Solucin de cristal violeta al 1 %
Solucin de azul de metileno al 1 %
Solucin de safranina al 1 %
Solucin decolorante (alcohol etlico y acetona 1:1)
Solucin de I2 / I- (yodo / yoduro al 0.1 %)
Cultivo (caldo o agar) a teir.
Asa de punta y asa redonda.
Mecheros
Alcohol etlico
Gasa

Tincin de Gram.-
Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la desarroll
en 1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en
dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los trminos positivo y negativo no
tiene nada que ver con carga elctrica, sino simplemente designan dos grupos morfolgicos
distintos de bacterias).

Proceso:
Preparacin de la extensin en la placa
Fijacin con calor o metanol
El Frotis fijado con calor se tie 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con
solucin Yodada durante 1 - 2 min y se lava de nuevo con agua (chorro fino),
Se decolora con una mezcla de alcohol etlico/acetona por 30 segundos mximo.
Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 1 2 min. Lavar, secar al ambiente
y observar en el microscopio.

Fundamento:
Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a las diferencias
constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula bacteriana sirve
para dar su tamao y forma al organismo as como para prevenir la lisis osmtica. El material
de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la clula
gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano as como
algo de cido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula gram-positiva es
peptidoglicano. La pared de la clula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho

27
ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior
compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la
clula gram-negativa es peptidoglicano13.

Reporte de resultados:
La tincin de Gram es usada para clasificar bacterias sobre la base de sus formas, tamaos,
morfologas celulares y reaccin Gram (color). A nivel del laboratorio es til como test para un
rpido diagnstico presuntivo de agentes infecciosos, tanto en muestras como en cultivos en
crecimiento, y adicionalmente sirve para valorar la calidad de la muestra clnica. Las bacterias
se tien gram positivas (+), gram negativas () o no se tien debido a sus diferencias en la
composicin de su pared y arquitectura celular.

Existen una serie de puntos con respecto a un buen control de calidad de las tinciones de
Gram, y que deben ser tenidas en cuenta antes de su realizacin, a saber:
Diariamente se debe comprobar que no existen precipitados ni cristales en la solucin
de cristal violeta. Si los hay, filtrar antes de su uso.
La estabilidad de la solucin de cristal violeta, alcohol y/o acetona, safranina o fucsina
bsica es de 1 ao y la de la solucin de lugol de 6 meses, todas ellas conservadas en
frascos cerrados (la evaporacin puede alterar su efectividad) a temperatura
ambiente.
Ciertos procedimientos de laboratorio pueden dificultar la interpretacin microscpica
de la tincin, como son la preparacin de extensiones demasiado gruesas, uso de
portas que no han sido prelavados o desengrasados, sobrecalentamiento en la fijacin
y excesivos lavados durante la tincin. Todos los anteriores son causas comunes de
pobres resultados en la tincin de Gram.
Debe tenerse en cuenta que no todos los microorganismos observados en una tincin
pueden ser cultivados, y al contrario, algunos no observados pero presentes consiguen
ser recuperados en el cultivo.
Supervisin diaria de unas cuantas tinciones elegidas al azar por personal
especializado, para confirmacin de coincidencias y posibles discrepancias14.

13
Microbiologa mdica. Jawetz. 25 edicin
14
Dr. Adrin Navarro Domnguez. Especialista en microbiologa

28
Ejemplos:

Bacillus antrhacis (gram positivo) Pseudomona auruginosa (gram negativo)

Tincin de Zielh Neelsen.-


Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos (cidos
miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad
de resistir la decoloracin con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes
bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol resistentes (BAAR).

PROCEDIMIENTO:
Preparacin del extendido
1. Ordenar las muestras
2. Marcar los portaobjetos
3. Partir el aplicador
4. Seleccionar la partcula ms purulenta
5. Depositar en el portaobjetos
6. Extender la muestra uniformemente, en forma de valo sin tocar los bordes
del portaobjetos
7. Fijar el extendido cuando est totalmente seco

Tincin de Ziehl Neelsen15


1. Cubrir con fucsina filtrada
2. Calentar hasta emisin de vapores tres veces durante 5 Minutos
3. Lavar con agua
4. Cubrir con decolorante durante 3 minutos (alcohol etlico 95% con un 3% de
ClH concentrado)
5. Lavar con agua
6. Cubrir con azul de metileno durante 1 minuto
7. Lavar con agua
8. Secar al aire
9. Observar al microscopio con lente de inmersin
Ejemplos:

15
MANUAL PARA EL DIAGNSTICO BACTERIOLGICO DE LA TUBERCULOSIS. NORMAS Y GUA TCNICA
PARTE I. Baciloscopia. 2008. OPS

29
REPORTE DE RESULTADOS16
Resultado del examen microscpico Informe

No se encuentran BAAR en los 100 No se observan bacilos cido alcohol


campos observados resistentes
Se observan de 1 a 9 BAAR N exacto de bacilos en 100 campos
en 100 campos observados
Se observa entre 10 y 99 BAAR Positivo (+)
en 100 campos observados
Se observan de 1 a 10 BAAR por Positivo (++)
campo en 50 campos observados
Se observan ms de 10 BAAR por Positivo (+++)
campo en 20 campos observados

Recuerda!:
- Si observa BAAR que se mueven en forma anormal, pueden ser bacilos
provenientes de otra baciloscopia que fueron arrastrados por el aceite de
inmersin y es necesario reemplazarlo y repetir la baciloscopia.
- Si se observan cuerpos extraos (artefactos) que se mueven cuando se
desplaza el portaobjetos, pueden ser restos de alimentos, precipitados o
cristales. Si slo se mueven cuando se gira el ocular, se trata de suciedad que
est en el ocular y hay que proceder a limpiarlo.
- Si no se mueven, la suciedad o bacilos contaminantes puede estar en los
objetivos, el condensador, el espejo o la fuente de iluminacin; proceder a
limpiarlos.
Se debe contar el nmero de campos que se ha ledo y el nmero de BAAR que se ha
identificado. Se puede utilizar una cuadrcula de 10 cuadrados por 10 cuadrados, que
representan los 100 campos microscpicos, como ayuda para registrar la cuenta. En
cada cuadrado anotar el nmero de BAAR que se observa. Si no observa BAAR
consignar 0.

DERIVACIN DE MUESTRAS PARA CULTIVO


El cultivo incrementa la posibilidad de detectar el bacilo de la tuberculosis en las
muestras de casos que estn afectados por un bajo nmero de bacilos, como los nios
(tuberculosis primaria) o pacientes con tuberculosis extrapulmonar. Adems, permite
diferenciar el bacilo de la tuberculosis de otras micobacterias en muestras donde se
pueden encontrar ambos, como en orina, contenido gstrico, o las de pacientes que
viven con VIH. Por ltimo, permite conocer la sensibilidad de bacilos a drogas
antituberculosas e identificar los casos que pueden no responder al esquema de
tratamiento de primera lnea.

Actividades a realizar: la tincin de Gram, la baciloscopia y la tincin de Zielh Neelsen


son de mucha importancia para el diagnstico de enfermedades infecciosas, estos dos
ltimos en especial para la tuberculosis. Es necesario que los estudiantes realicen una
investigacin previa de los datos estadsticos sobre este tema tanto a nivel nacional
como mundial, para concientizarse sobre la problemtica de esta patologa y se
familiaricen con el esquema de tratamiento de primera lnea.

16
MANUAL PARA EL DIAGNSTICO BACTERIOLGICO DE LA TUBERCULOSIS. NORMAS Y GUA TCNICA
PARTE I. Baciloscopia. 2008. OPS

30
Se realizar la prctica sobre tinciones y se proceder a graficar en los siguientes
cuadros el reporte de lo que se observe para presentar al finalizar la misma:

Tincin de: Placa 1 Placa 2


Esquema de campo
microscpico representativo

Descripcin:

Muestra:

Forma:

Agrupamiento de clulas:

Bacteria encontrada:

Observaciones:

Tincin de: Placa 3 Placa 4


Esquema de campo
microscpico representativo

Descripcin:

Muestra:

Forma:

Agrupamiento de clulas:

Bacteria encontrada:

Observaciones:

31
Tema 6: Medios de Cultivo

Objetivo General:
Identificar los medios de cultivo ms utilizados en el laboratorio de microbiologa

Objetivos especficos:
1. Conocer los tipos bsicos de medios de cultivos segn su naturaleza, estado
fsico y funciones.
2. Conceptualizar los medios de cultivo
3. Definir la importancia de su uso en un laboratorio microbiolgico.
4. Conocer su composicin bsica y especfica de los medios de mayor uso.
5. Conocer su preparacin y conservacin.

Justificacin.- La mayora de las enfermedades infecciosas a travs de la clnica llegan a un


diagnstico presuntivo, y para alcanzar al diagnstico etiolgico es necesario el aporte del
laboratorio microbiolgico donde se realizan diversas pruebas diagnsticas directas e
indirectas, entre las primeras estn los cultivos.

Marco terico.-

Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar su


crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material
alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los
microorganismos es el Cultivo. Se han preparado ms de 10.000 medios de cultivo diferentes.

Condiciones generales para el cultivo de microorganismos:

Disponibilidad de nutrientes adecuados


Consistencia adecuada del medio
Presencia o ausencia de oxgeno y otros gases
Condiciones adecuadas de humedad
Luz ambiental
pH
temperatura
esterilidad del medio

Para crecer, un microorganismo necesita nutrientes que le aporten energa y elementos


qumicos para la sntesis de sus constituyentes celulares. La mayora de las bacterias patgenas
requieren nutrientes complejos similares en composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo
humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y
Peptona a la que se aadirn otros ingredientes indispensables para la vida como: Oxgeno,
Nitrgeno, Hidrgeno, Carbono, Fe, S, Na, K, etc.

32
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de cultivo.
Se lica completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40.
Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado
por aquellas que crecen en l17.

En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento


como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se
adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para
detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El
suero y la sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los microorganismos
menos resistentes.

Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores de pH para detectar, por ejemplo,
la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el
Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH bsico y amarillo en pH cido. La Violeta
de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayora de las bacterias
Gram-positivas).

De acuerdo con lo antes mencionado los medios de cultivo se pueden clasificar:

Segn su estado fsico:


Lquidos
Solidos
Semislidos

Segn su condicin:
Animados (huevos de gallinas, lneas celulares HELA, animales: cobayos, ratas, etc.)
En estos medios crecen los virus y bacterias muy pequeas como las Rickettsias y las
Clamidias
Inanimados (origen vegetal, mineral o animal (sangre, leche, suero, etc.))
Sintticos o construidos en el laboratorio de frmula conocida como por ejemplo un
caldo nutritivo puede tener: agua 1000 ml, CL Na 9 gr, peptona 15 gr, glucosa 50 gr.

Segn sus funciones:


Medios bsicos.- Contienen los nutrientes indispensables para el crecimiento del
microorganismo. Utilidad: transporte (Medios que garantizan que los microorganismos
permanecen viables desde el momento de la toma de la muestra hasta su
procesamiento en el laboratorio.) y conservacin de una muestra, realizar
antibiogramas y usarlos como base para construir medios especficos o complejos.
Medios especficos.- A ms de su contenido nutricional bsico se los agrega otras
sustancias que cumplirn funciones determinadas, obteniendo tres clases de medios
especficos:
Enriquecidos,
Selectivos,
Diferenciales.

17
Manual Micro diagnstica III parte. TOMA DE MUESTRAS, MEDIOS DE TRANSPORTE, MEDIOS DE
CULTIVO, y PRUEBAS DIFERENCIALES. LABORATORIO LINSAN S.A. M. Loreto Gardeweg M.

33
Enriquecidos.- Suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal, potenciando el
cultivo y crecimiento deseado. Ejemplo. Agar base sangre + sangre de oveja = Agar
sangre. Estos medios nos sirven para favorecer el crecimiento de bacterias exigentes
como los Estreptococos y Haemophilus.
Selectivos.- Se agrega sustancias que favorecen el desarrollo de unos
microorganismos e inhiben el crecimiento de otros. Ejemplo: Mc Conkey a ms de los
nutrientes bsicos contiene cristal violeta y sales biliares que inhiben a bacterias
Gram-positivas y favorecen el desarrollo de Bacilos Gramnegativos especialmente los
miembros de la familia Enterobacteriaceae (Escherichia coli).
Diferenciales.- til para el estudio de peculiaridades fisiolgicas especficas para cada
especie pues contiene sustancias que permiten la diferenciacin de unas bacterias con
otras. Ejemplo: Mc Conkey tambin es diferencial y contiene lactosa como sustrato y
rojo neutro como indicador y as los diferencia a las fermentadoras de lactosa que
forman colonias rosadas de las no fermentadoras como los Proteus y Salmonellas que
forman colonias no rosadas blanca, grises o negras.

Segn su utilidad prctica:

Para aislamientos especializados.- formulaciones nutritivas especiales que satisfacen


requerimientos de grupos especficos de bacterias, ayudando a su identificacin (medio de
Lowestein)
Principales medios utilizados en microbiologa18

18
Diagnstico microbiolgico. Bailey & Scott. 12 edicin.

34
Desarrollo de la prctica.-

Materiales necesarios
. Medios liofilizados en frascos
. Medios preparados en cajas, frascos y en tubos.
. Probetas, Pipetas, Frascos de Erlenmeyer, Balanza, Agua destilada, Sangre fresca desfibrinada
de oveja, Cocina, Autoclave y refrigeradora.

Tcnicas y procedimientos:

El docente, ayudante o estudiante asignado realizar una presentacin demostrativa de los


diferentes medios de mayor utilidad en el laboratorio. Presentar ejemplos de medios
animados e inanimados sea en forma grfica o en forma directa. Adems de medios slidos
(agar nutritivo), semislidos (SIM), lquidos (caldo nutritivo).

Actividades a realizar:

El estudiante de medicina no necesariamente debe realizar la preparacin de los medios sin


embargo es importante conocer los diferentes medios preparados y los usos que se los dar de
acuerdo a sus requerimientos para un cultivo como mtodo diagnostico directo.

35
Cuestionario de Evaluacin de la prctica.

.Defina que es un medio de cultivo, su importancia y usos.

.Que es un medio bsico y los usos se los da en un laboratorio.

.Clasifique los medios de cultivo segn sus funciones.

De qu medio de cultivo se tratan los siguientes grficos y que bacterias pueden crecer en
cada uno de estos medios?

Grafico 1: Grafico 2: Grafico 3:

Nombre: Nombre: Nombre:

Bacterias a crecer: Bacterias a crecer: Bacterias a crecer:

36
Tema 7: Cultivos

Objetivo general:
Entender la importancia de un cultivo bacteriano como mtodo diagnstico directo.

Objetivos especficos:
1. Conocer las etapas de un cultivo.
2. Ejecutar las tcnicas y procedimientos de un cultivo.
3. Leer e interpretar un crecimiento primario.
4. Entender los aislamientos y resiembras.
5. Conocer las pruebas de identificacin aplicadas.
6. Relacionar los resultados con el estado clnico del paciente.

Justificacin.- El cultivo como mtodo diagnstico directo en las infecciones bacterianas es de


gran importancia por su mayor especificidad y sensibilidad en relacin con la microscopia, a
travs del cultivo se identifican a las bacterias por gneros y hasta por especies, adems con
el aislamiento del agente nos permite determinar la sensibilidad o resistencia del
microorganismo con los antibiticos de eleccin.

Marco terico.-

En el mbito mdico el cultivo bacteriano es un importante mtodo diagnstico directo que


nos permite el aislamiento e identificacin de los microorganismos causantes de un proceso
infeccioso. El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayora
de los casos, mediante la produccin de colonias aisladas en cultivos slidos. El crecimiento de
las bacterias produce un gran nmero a partir de una nica clula inicial de forma que, tras un
periodo de tiempo de incubacin en las condiciones ambientales adecuadas, se produce una
colonia de individuos iguales.

Los cultivos como procedimiento tcnico para la identificacin bacteriana, tiene diferentes
etapas, realizadas especficamente en medios slidos de amplia superficie o en medios
preparados en cajas de Petri.

Etapas de un cultivo19

1. Siembra: es colocar una parte de la muestra en el medio de cultivo. A la vez tiene dos
sub-etapas.
1.1. Inoculacin: es el acto de tomar una porcin representativa de la muestra con un
aplicador o asa estril y depositar en un rea delimitada del medio.
1.2. Diseminacin: Con asa bacteriolgica estril se dispersara la muestra en toda la
superficie del medio con el afn de permitir el crecimiento aislado de las colonias o
cepas bacterianas, esto facilitara la lectura e interpretacin del crecimiento as como el
aislamiento para las resiembras.
2. Incubacin: a ms de los nutrientes en los medios es la provisin de los factores
ambientales requeridos para el crecimiento bacteriano:
Temperatura ideal: 37oC,

19
Manual de Micro diagnstica. III parte: TOMA DE MUESTRAS, MEDIOS DE TRANSPORTE, MEDIOS DE
CULTIVO, y PRUEBAS DIFERENCIALES. LABORATORIO LINSAN S.A.

37
Aireacin segn los requerimientos: O2 aerbicos, No O2 anaerbicos, CO2 capnfilos,
poco O2 micro-aerobios.
Humedad, segn el microorganismo a cultivar.
Tiempo: 18 a 24 horas (la mayora de bacterias patgenas, existen excepciones).
3. Lectura e interpretacin primaria: Se basa en el crecimiento o la presencia de
microrganismos que se pueden detectar mediante visualizacin directa. Cambios
bioqumicos, crecimiento en medios selectivos, turbidez en medios lquidos o slidos,
cambios citopticos en cultivos celulares. Transcurrido el tiempo necesario se procede
a realizar la lectura del crecimiento primario y su interpretacin; esto variar segn el
tipo de muestra cultivada, muestra biolgicas con flora normal (exudado farngeo),
muestras normalmente estriles (sangre o LCR), Muestras patolgicas etc.
4. Aislamiento y resiembra para cultivo puro: luego de interpretar un crecimiento
bacteriano y considerarlo vlido o como una contaminacin se proceder a realizar el
aislamiento de las colonias presuntivas o sospechosas de pertenecer a un agente
relacionado con el proceso infeccioso, el mismo se ejecuta tomando una o parte de la
colonia con una aguja bacteriolgica estril y se traslada/ resiembra en otro medio
slido o liquido estril as se obtiene un cultivo puro.

Pasos de una Resiembra:

5. Pruebas de identificacin: Son reacciones bioqumicas y fisiolgicas que sirven para


diferenciar con otras bacterias y caracterizarlas como gnero o especie.

Mtodos tcnicas y procedimientos.-


La seleccin de un medio de cultivo se basa en los microorganismos con mayores
probabilidades de participacin en el proceso patolgico. En el caso de muestras
contaminadas, como en el caso de una fstula anal, se debe usar un medio selectivo
como el de CNA (agar Columbia con Colistina y cido nalidxico). Este inhibe las
bacterias gram negativas y permite el aislamiento de gram positivos y levaduras.

Tipos de Siembras:

38
Siembra por Dilucin.- Se toma el tubo de ensayo con medio lquido, como el caldo
simple. Se toma el material a diluir y se siembra en el tubo con el uso del asa cargada
con el material bacteriolgico, se agita, con movimientos moderados. Esta tcnica no
se utiliza al menos que sea imposible el cultivo en placa.

Medio de cultivo: lquido


Instrumento: asa
Finalidad: poner la bacteria en suspensin.

Siembra por estras de superficie.- Se siembra el material en la superficie del agar


inclinado en un tubo de ensayo, all se extiende por toda la superficie con el asa
bacteriolgica, previamente esterilizada y cargada con el material a sembrar, haciendo
estras. Se inicia por la parte ms profunda de la superficie inclinada y se termina la
estra en la parte ms cerca de la boca del tubo.

Medio de cultivo: agar base inclinado


Instrumento: asa o aguja bacteriolgica
Finalidad: obtener masa bacteriana

Siembra por estra por agotamiento.- Se puede separar las colonias y aislarlas
fcilmente. Con el asa esterilizada se toma material de un cultivo heterogneo y se
descarga sobre la superficie del medio formando estras.

Medio de cultivo: solido en placa de Petri


Instrumento: Asa
Finalidad: Obtener colonias aisladas

Siembra por picadura o puncin.- Con una aguja se toma el material que se quiere
sembrar y se lo introduce en el tubo, con medio semislido.
Introducir la aguja hasta el fondo, formando un canal de puncin, trayecto por el cual
la retiraremos luego.

Medio de cultivo: semislido


Instrumento: asa recta
Finalidad: estudiar la movilidad de las bacterias

39
En el aislamiento y resiembra para cultivo puro.-

Se puede aplicar el estriado de las placas inoculadas con una cantidad determinada de
muestra, al utilizar un asa calibrada para cuantificar las unidades formadoras de colonias
(UFC). Esto se aplica en los cultivos de orina, mediante la diseminacin del inculo sobre la
superficie completa del agar. Facilita el recuento de las colonias porque asegura que cada
clula bacteriana se disperse sobre la superficie del agar20.

Imagen tomada del Centro de Bachillerato Tecnolgico Industrial y de Servicios No. 134.
Especialidad Laboratorista clnico

Caractersticas de la colonia:
Es importante para la identificacin bacteriana, la tasa de xito posterior dependen de
estas observaciones:
Tamao de la colonia (en mm o con trminos como cabeza de alfiler, pequeo,
mediano, grande)
Pigmentacin de la colonia
Forma de la colonia (elevacin y bordes)
Aspecto de la superficie de la colonia (brillante, opaca, mate trasparente)
Cambios en los medios, como resultado del crecimiento (hemolisis, cambios
de color, etc.)
Olor (caracterstico en algunas de ellas)

Desarrollo de la prctica

Materiales necesarios:
Muestras biolgicas y patolgicas adecuadamente obtenidas (secreciones, orina, heces
fecales.
Medios de cultivo estriles preparados en cajas de Petri. (Agar sangre, Mc Conkey, SS
agar.)
Aplicadores estriles de algodn, asas y agujas bacteriolgica, mecheros de alcohol,
frascos de anaerobiosis, de capnofilia, incubadora calibrada a 37oC, guantes,
mascarillas, etc.

Tcnicas y Procedimientos.- Se ejecutar un prototipo de cultivo, siguiendo las normas


adecuadas; el docente, ayudante o estudiante disertador realizar un acto demostrativo
primero y participativo despus en la prctica, escogiendo algunas de los tipos de siembra
antes expuestos

20
Diagnstico microbiolgico. Bailey & Scott. 12 edicin.

40
Ejemplo: Coprocultivo.

1. Siembra: con aplicador estril se tomar una porcin de la muestra e inocular en una
pequea rea del medio y con asa estril se diseminara por zic zac en todo el campo
de los medios Mc Conkey/ EMB agar o SS agar, o TCBS agar segn el tipo de bacteria a
ser identificada. (las caractersticas de las heces determinar el procedimiento a
seguir)
2. Incubacin: Los medios sembrados, se colocarn en la incubadora a 37oC en
aerobiosis, anaerobiosis, microaerofilia segn el tipo de bacteria a ser identificada,
durante 18 a 24 horas.
3. Lectura e interpretacin primaria: transcurrido el tiempo necesario se dar lectura al
crecimiento bacteriano, al tratarse de heces fecales, exista o no infeccin hay
crecimiento por la abundante flora que contiene. En MacConkey las colonias son
bacilos Gram negativos: las colonias rosadas son de bacterias fermentadoras lactosa y
pueden ser Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, etc. y las no rosadas son de bacterias
no fermentadoras y pueden ser Salmonellas, Shigellas, Proteus, etc.
4. Aislamiento y resiembra: las colonias presuntivas se aislarn y resembrarn en otro
medio sea slido o caldo.
5. Pruebas de Identificacin: A fin de caracterizar determinada bacteria en coprocultivo
se ejecutara una batera de pruebas bioqumicas que nos permitir identificar un
gnero y hasta una especie.

Actividades a realizar:

La prctica puede ser vista junto a los medios de cultivo para su mejor entendimiento, segn
como lo considere el ayudante. Se recomienda completar el siguiente cuestionario:

Definir un cultivo
Describir las fases del cultivo.
Interpretar un crecimiento primario.
Mencionar bacterias de valor clnico en un coprocultivo.

En base al ejemplo descrito anteriormente se presenta esta imagen, mencione que es lo que
usted ve en este agar:

http://faculty.lacitycollege.edu/hicksdr/emb.htm

41
Tema 8: Pruebas de identificacin de cocos gram positivos y gram
negativos.
Objetivo General:
Conocer las pruebas bsicas de identificacin para bacterias cocos Gram positivos y
negativos de importancia mdica.

Objetivos especficos:
1. Entender el fundamento metablico de las pruebas.
2. Ejecutar las tcnicas y procedimientos de cada prueba.
3. Interpretar las reacciones bioqumicas de las pruebas a usar.
4. Relacionar el resultado con el estado clnico del paciente.

Justificacin.- Las pruebas de identificacin bsicas de cocos Gram positivos y negativos de


importancia clnica como los Staphylococcus aureus, saprofiticum y epidermidis, Estreptococos
pyogenes, agalactiae, enterococos, Streptococcus viridans, Neumococos y Neisserias. Es de
suma importancia para asociar a estas bacterias con los procesos infecciosos en el hombre.

Marco terico.-

LAS PRUEBAS BSICAS DE IDENTIFICACIN PARA COCOS GRAM POSITIVOS:

Prueba de la catalasa.- Diferencia los Staphylococcus (prueba positiva) de los Estreptococos


(prueba negativa); los Staphylococcus producen la catalasa que descompone al perxido de
hidrgeno (agua oxigenada) en agua y oxgeno voltil; se manifiesta con un burbujeo si la
reaccin es positiva.

Prueba de la coagulasa.- Diferencia al Staphylococcus aureus de los Staphylococcus


epidermidis y saprofiticum; S. aureus coagula el plasma y los S. epidermidis, saprofiticum, no
coagulan el plasma.

Prueba sensibilidad a la novobiocina.- Diferencia al Staphylococcus epidermidis del


Staphylococcus saprofiticum, siendo sensible el S. epidermidis y resistente el S. saprofiticum.

Prueba de la Bacitracina.- De no contar con antisueros especficos, esta prueba es importante


para diferenciar e identificar al Estreptococo beta hemoltico del grupo A de los otros grupos.
El Estreptococo pyogenes es sensible a la Bacitracina, los otros grupos son resistentes, esta
prueba es rpida y econmica tiene una especificidad del 97%.

42
Prueba de la Optoquina (clorhidrato d hidrocupreina), Sales biliares 10% y Desoxicolato Na
2%.- Es til para diferenciar al Estreptococo neumoniae (Neumococo) de los Estreptococos
viridans o Estreptococos alfa hemolticos, debido que estos dos grupos bacterianos son
similares tanto en las caractersticas morfotintoriales, como en los cultivos. A la microscopa
se presentan como cocos Grampositivos agrupados en pares y en cadenas y ambos forman
colonias pequeas alfa hemolticas. Los Neumococos son sensibles a la optoquina y lisados
por las sales biliares y el desoxicolato de sodio, en contraposicin los Estreptococos viridans o
alfa hemolticos son resistentes a la optoquina y no son lisados por las sales biliares y el
desoxicolato de sodio.

LAS PRUEBAS BSICAS DE IDENTIFICACIN PARA COCOS GRAM NEGATIVOS21:

Prueba de la Oxidasa y fermentacin de los azucares.- Es importante para caracterizar al


gnero Neisseria; un grupo bacteriano que a ms de presentarse como diplococos Gram-
negativos producen la enzima indofeniloxidasa, al no ser visible, se determina su presencia
con el reactivo indicador llamado tetrametilparafenilendiamina o simplemente reactivo de la
oxidasa, el mismo que al unirse con la enzima manifiesta un color desde violeta hasta negro.

Fermentacin de los azcares.- Todas las especies de Neisserias fermentan la glucosa


produciendo cido, la identificacin de las distintas especies se determinar por la capacidad
de fermentar adems otros carbohidratos, por ejemplo: N. gonorreae nicamente fermenta la
glucosa, la Neisseria meningitidis fermenta la glucosa y maltosa. etc.

Desarrollo de la prctica.

Materiales necesarios

Cultivos primarios en agar sangre con colonias presuntivas de Staphylococcus,


Estreptococos alfa y beta hemolticas.
Colonias presuntivas de Neisserias en agar chocolate.
Materiales de proteccin guantes y mascarillas.
Agujas y asas bacteriolgicas, mechero de alcohol.
Portaobjetos, tubos estriles con tapa rosca.
Perxido de hidrgeno 10 vol., plasma humano fresco, discos de Novobiocina,
Bacitracina, Optoquina, Oxidasa y azcares con indicadores preparados en tubos
pequeos, Incubadora.

Tcnicas; procedimientos e interpretacin.-

Prueba de la catalasa:
En un portaobjeto limpio sin melladuras se coloca
una gota perxido de hidrgeno
Sobre la gota se suspende una colonia.
S de inmediato presenta burbujeo; indica reaccin
positiva (STAPHYLOCOCOS), la reaccin negativa a
ESTREPTOCOCOS.

21
Manual de Micro diagnstica. III parte: TOMA DE MUESTRAS, MEDIOS DE TRANSPORTE, MEDIOS DE
CULTIVO, y PRUEBAS DIFERENCIALES. LABORATORIO LINSAN S.A.

43
Recuerda!: Para atribuir estas reacciones a Staphylococcus o Estreptococos, se debe cerciorar
previamente de que se trata de cocos Gram positivos ya que existen otras bacterias catalasa
positivas. El aislamiento de la colonia debe ser cuidadoso, no tocar la sangre que tambin tiene
catalasa y puede dar falsos positivos.

Prueba de la coagulasa: Diferencia al Staphylococcus aureus de los Staphylococcus


epidermidis y saprofiticum.

En un portaobjeto limpio se coloca una gota de


plasma, se suspende una colonia encima y en
pocos minutos se forma un grumo, si la reaccin es
positiva y significa presencia de Staphylococcus
aureus. Como alternativa se realiza la prueba en
tubo; en el mismo se coloca de 0,25 a 0,5 ml de
plasma fresco y se siembra 2 a 3 colonias, se incuba
a 37oC durante 1 a 4 horas, en cada hora se lee
inclinando el tubo y en caso de observar coagulo la
reaccin es positiva y si es negativa se espera hasta
24 horas, que define una reaccin tarda.

Prueba de la Novobiocina:
Una cepa pura de Staphylococcus coagulasa negativo, se siembra en plateado para realizar
antibiograma por difusin, se coloca un disco de Novobiocina, se incuba a 37oC durante 24
horas, transcurrido este tiempo, si presenta halo de inhibicin es sensible y se define como
Staphylococcus epidermidis, si hay resistencia se define como Staphylococcus saprofiticum.

Prueba de la Optoquina y solubilidad en sales biliares:


A partir de colonias pequeas alfa hemolticas se prepara un inculo en caldo de cultivo y se
siembra en agar Mueller Hinton con sangre, colocndose un disco de Optoquina, se incuba a
37oC durante 24 horas, luego del este tiempo, si presenta un halo de inhibicin igual o mayor
de 14 mm de dimetro se trata de un Neumococo, si no forma halo de inhibicin hay
resistencia que le caracteriza a un Estreptococo viridans o alfa hemoltico y en caso de formar
un halo de inhibicin menor a 14 mm de dimetro, el diagnstico se define con la prueba de
lisis en sales biliares. Para este procedimiento se utiliza un inculo bacteriano en caldo, donde
la turbidez indica presencia de la bacteria, a este inculo se agrega uno a 2 ml de sales biliares
al 10%, se incuba unas 4 a 6 horas, transcurrido este tiempo se observa el tubo y en caso de
manifestar transparencia indica lisis bacteriana que confirma un Neumococo, y si se mantiene
la turbidez indica resistencia que confirma a un Estreptococo viridans.

44
Prueba de la Oxidasa para Neisserias:
El reactivo de la oxidasa viene liofilizado en papel filtro
el mismo que se humedece con agua estril y despus
se toma una a dos colonias friccionado cuidadosamente
el papel humedecido; si dentro de 60 segundos
presenta un color violeta a negro corresponde a una
reaccin positiva a la oxidasa, en caso contrario es una
reaccin negativa.
Recuerda!: Para definir como Neisseria previamente se
demostrar la presencia de diplococos Gram-negativos
al microscopio como mnimo fermente la glucosa.

Fermentacin de los azcares


Se utiliza una batera de azcares en caldo de cultivo con un indicador (rojo de fenol), una
batera base: glucosa, maltosa, lactosa, etc. En cada tubo se siembra 0,5 ml de un inculo de
Neisserias, se incuba a 37C durante 24 horas. Transcurrido este tiempo se da lectura a la
batera de azcares, si observamos un color amarillo indica acidez y significa fermentacin del
azcar, si se observa el color original naranja o rojo la fermentacin es negativa. Si fermenta
nicamente la glucosa se define Neisseria gonorreae, si fermenta solo glucosa y maltosa se
define Neisseria meningitidis, si fermenta glucosa y lactosa se define Neisseria lactamica, si no
fermenta ninguno posiblemente se trata de N. Catarralis

Actividad a realizar: Luego de prcticas investigar otras pruebas de utilidad para la


identificacin bacteriana como por ejemplo, las pruebas serolgicas: A.S.T.O.

45
Tema 9: Pruebas bioqumicas para bacilos gram negativos
(enterobacterias)

Objetivo general:
Conocer la importancia de las diferentes pruebas bioqumicas para la familia
Enterobacteriaceae.

Objetivos especficos:
1. Conocer el procedimiento y el fundamento de las pruebas a usarse.
2. Leer e interpretar los cambios bioqumicos en los medios diferenciales de uso
frecuente.
3. Relacionar los resultados con el estado clnico del paciente.

Justificacin.- Una vez obtenidas las colonias de un medio artificial, la tincin de Gram puede
poner en evidencia clulas de bacilos, cocos o cocobacilos gramnegativos o grampositivos,
grandes o pequeos. Sin embargo no es posible diferenciar las especies slo sobre la base de la
morfologa en la tincin de Gram. Es por ello que el conocimiento de las pruebas bioqumicas
es de importancia para la identificacin de un microorganismo.

Marco terico.-

La diferenciacin de las bacterias se basa principalmente en la presencia o ausencia de


diferentes enzimas codificadas por el material gentico del cromosoma bacteriano. Estas
enzimas dirigen el metabolismo bacteriano a lo largo de una de varias vas que puede
detectarse mediante medios especiales utilizados en tcnicas de cultivo en vitro. Se incorporan
al medio de cultivo sustratos sobre los cuales pueden reaccionar estas enzimas, junto con un
indicador que puede detectar la utilizacin del sustrato o la presencia de productos
metablicos especficos. Mediante la seleccin de una serie de medios que miden diferentes
caractersticas metablicas de los microorganismos por evaluar es posible determinar un perfil
bioqumico para la diferenciacin de la especie22.

MEDIO UREA DE CHRISTENSEN

Medio utilizado para la identificacin de microorganismos, en base a la actividad uresica. Es


particularmente til para diferenciar Proteus spp. de otros miembros de la familia
Enterobacteriaceae.

Fundamento

Este medio de cultivo, formulado por Rustigian y Stuart, presenta bajo contenido de nutrientes
y alta capacidad buffer. El extracto de levadura es la nica fuente de carbono, nitrgeno,
vitaminas y cofactores, y aporta los nutrientes esenciales para el desarrollo bacteriano.

Las sales de fosfatos constituyen el sistema buffer, el rojo de fenol es el indicador de pH y la


urea es el sustrato de la enzima ureasa. Aquellas bacterias que poseen la enzima ureasa,
pueden utilizar el nitrgeno proveniente de la urea, la hidrolizan, liberando amonaco y dixido
de carbono. Estos productos metablicos alcalinizan el medio, haciendo virar el indicador rojo
fenol del amarillo al rojo. Esta prueba puede ser usada como parte de la identificacin de
Enterobacteriaceae, incluyendo Proteus, Klebsiella y algunas especies de Yersinia y Citrobacter

22
Manual de Micro diagnstica. III parte: TOMA DE MUESTRAS, MEDIOS DE TRANSPORTE, MEDIOS DE
CULTIVO, y PRUEBAS DIFERENCIALES. LABORATORIO LINSAN S.A.

46
Procedimiento y materiales:
Permita que el medio con urea se atempere.
Use un asa estril, seleccione una colonia e inocule el agar en el bisel.
Incube con la tapa ligeramente cerrada en atmsfera aerobia a 35-37C.
Para no fermentadores incube a 30C.
Examine cambio de coloracin.
Control de calidad:
Proteus mirabilis ATCC 12453 Positivo.
Escherichia coli ATCC 25922 Negativo.
Interpretacin
Positivo: Desarrollo de un color intenso magenta o rosa brillante en 24 horas de incubacin.
Negativo: No hay cambio de coloracin.

Imagen tomada de: http://aprendeenlinea.udea.edu.co/

MEDIO TSI (Agar hierro triple azcar)


Medio universalmente empleado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a
la fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de cido sulfhdrico
(SH2).

Fundamento
Se basa en la fermentacin de los azucares del medio, despus de 18-24h de
incubacin.
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes
adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos
de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la
produccin de cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones
Fe3+ , los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de
color negro.
El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance
osmtico. Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por
medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio cido. El
tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal
de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro.

47
Recuerda!: La frmula del agar Kliger (KIA) es idntica al TSI, excepto porque la
segunda contiene sacarosa adems de glucosa y lactosa. El agregado de sacarosa al TSI
ayuda a investigar especies de Salmonella y Shigella ya que ninguna metaboliza ni
lactosa ni sacarosa; tambin sirve para eliminar bacterias no fermentadoras de lactosa
pero fermentadoras de sacarosa; por ejemplo: especies de Proteus y de Citrobacter,
asi como tambin Yersinia enterocolitica23.

Procedimientos y materiales:
Tomar una colonia bien aislada de una caja de agar, con un asa recta.
Inocular el medio de TSI picando la capa profunda hasta unos 3-5mm de fondo del tubo y se
retirar el asa delicadamente y se estra la superficie inclinada con un movimiento de ida y
vuelta.
Incubar a 35C por 18-24horas

Resultados:
Para leer las reacciones en el tubo, se anota primero la del pico de flauta o bisel (aerobia) y
en segundo lugar la del fondo o botn (anaerobia). El fondo y pico de flauta del tubo es de
aproximadamente 3cm cada uno. Las diversas maneras de interpretar son:

1. Tendido alcalino/fondo cido (K/A) (Tendido rojo/fondo amarillo): el microorganismo


solamente fermenta la glucosa.
2. Tendido cido/fondo cido (A/A) (Tendido amarillo/fondo amarillo): el microorganismo
fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa.
3. Tendido alcalino/fondo alcalino (K/K) (Tendido rojo/fondo rojo): el microorganismo es
no fermentador de azcares.
4. La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo
produce gas. (g)
5. El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce cido sulfhdrico.
(SH2)

Ejemplos:

Microorganismo Pico/Fondo Produccin de gas Produccin de cido


sulfhdrico
E. coli ATCC 25922 A/A + -
K. pneumoniae ATCC A/A + -
700603
P. mirabilis ATCC K/A + +
43071
S. typhimurium ATCC K/A - +
14028
S. enteritidis ATCC K/A + +
13076
S. flexneri ATCC 12022 K/A - -
P. aeruginosa ATCC K/K - -
27853

23
Mdulo de Bacteriologa. Universidad de Guayaquil. Programa de microbiologa avanzada 2010.

48
Grfico:

Imagen tomada de: http://web.clark.edu/tkibota/240/Unknowns/TSI.htm

MEDIO LIA (Lisine Iron Agar)


Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp.,
basado en la descarboxilacin / desaminacin de la lisina y en la produccin de cido
sulfhdrico.

Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el
desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato
utilizado para detectar la presencia de las enzimas descarboxilasa y deaminasa. El citrato de
hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la produccin de cido
sulfhdrico.
El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o
menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.
Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto
produce el viraje del indicador al color violeta.
La decarboxilacin de la lisina, tiene lugar en medio cido, por lo que es necesario que la
glucosa sea previamente fermentada.

Procedimiento y materiales:
Tomar con un asa recta, un colonia aislada y estriar la superficie inclinada y luego picar la capa
profunda a unos 3-5mm del fondo del tubo, se retira el asa delicadamente siguiendo el mismo
camino de entrada.

Resultados
Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la
glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24hs de
incubacin se observa el tendido de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el
fondo amarillo.
La produccin de sulfuro de hidrgeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a
la formacin de sulfuro de hierro.
Las cepas de los gneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la
lisina, esto produce un cido alfa-ceto-carbnico, el cual, con la sal de hierro y bajo la
influencia del oxgeno forma un color rojizo ladrillo en la superficie del medio.
1- Decarboxilacin de la lisina:
-Prueba Positiva: Tendido violeta/fondo violeta.
-Prueba Negativa: Tendido violeta/fondo amarillo.

49
2-Desaminacin de la lisina:
Tendido rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del gnero Proteus, Providencia y cepas
de Morganella spp.
3-Produccin de cido sulfhdrico:
-Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el lmite del Tendido y fondo)

Control de calidad:
Positivo: Escherichia coli ATCC 25922
Negativo: Citrobacter freundii

Grafico

Ejemplos:
Microorganismos Color del tendido Color en el fondo Ennegrecimiento del
medio
Proteus mirabilis ATCC Rojo Amarillo Negativo
43071
Salmonella Prpura Prpura Positivo
typhimurium ATCC
14028
Salmonella enteritidis Prpura Prpura Positivo
ATCC 13076
Providencia spp. Rojo Amarillo Negativo
Citrobacter freundii Prpura Amarillo Positivo
Morganella spp.* Rojo Amarillo Negativo
Edwardsiella spp. Prpura Prpura Positivo
Klebsiella pneumoniae Prpura Prpura Negativo
ATCC 700603
Escherichia coli ATCC Prpura Prpura Negativo
25922

CITRATO SIMMONS
Medio utilizado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la capacidad de usar
citrato como nica fuente de carbono y energa.

Fundamento
La utilizacin del citrato por la bacteria, se detecta en el medio por la produccin de
subproductos alcalinos por la accin de le enzima citratasa o citrato permeasa.
El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el azul de bromotimol es el indicador de
pH, que vira al color azul en medio alcalino. El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas
bacterias poseedoras de citrato permeasa, a travs del ciclo del cido tricarboxlico. El

50
desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este ltimo, en
presencia de un medio alcalino, da origen a cidos orgnicos que, al ser utilizados como fuente
de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y
esto es indicativo de la produccin de citrato permeasa.

Procedimiento y materiales:
Tomar una colonia aislada de una caja de petri con un asa recta e inocular estriando en el pico
de flauta del agar citrato (color verde).
Incubar a 35C durante 24-48 horas.

Recuerda!: no depositar un inculo muy cargado en el tubo porque los compuestos orgnicos
preformados de las bacterias, pueden liberar suficiente carbono y nitrgeno y dar un resultado
falso positivo24.

Resultados
-Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.
-Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no
hay cambio de color.

Grfico:

Ejemplos:
Microorganismo Citrato permeasa Color del medio
Klebsiella pneumoniae Positivo Azul
ATCC 700603
S. typhimurium ATCC Positivo Azul
14028
E. coli ATCC 25922 Negativo Verde
S. flexneri ATCC 12022 Negativo Verde

MEDIO MIO (Movilidad Indol Ornitina)


Medio usado para la identificacin de Enterobacterias en base a su movilidad, actividad de
ornitina decarboxilasa y produccin de indol.

Fundamento
Medio de cultivo semislido, altamente nutritivo debido a la presencia de extracto de
levadura, peptona y triptena. Adems, la triptena aporta grandes cantidades de triptfano,
sustrato de la enzima triptofanasa, para la realizacin de la prueba del indol.

24
Mdulo de Bacteriologa. Universidad de Guayaquil. Programa de microbiologa avanzada 2010.

51
La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la deteccin
de la enzima ornitina decarboxilasa, el prpura de bromocresol es el indicador de pH, que en
medio alcalino es de color prpura y en medio cido es amarillo.
Por su composicin, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo: movilidad, presencia
de ornitina decarboxilasa e indol.
La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde
ms all de la lnea de inoculacin.
La reaccin positiva a la ornitina est dada por un color prpura del medio.
Debido a la fermentacin de la glucosa se reduce el pH produciendo una condicin cida y
originando que el indicador de pH prpura de bromocresol vire al amarillo. La presencia de
acidez, otorga condiciones ptimas para la actividad de la enzima ornitina decarboxilasa, la
cual decarboxila la ornitina presente. Por decarboxilacin, se alcaliniza el medio, con el
consecuente viraje del indicador hacia el color prpura.
El indol, es producido a partir del triptfano por los microorganismos que contienen la enzima
triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de reactivo de Kovacs
o de Erlich, indica un resultado positivo.

Procedimiento y materiales:
Tomar una colonia con un asa recta y realizar una siembra en picadura en el agar, hasta
5mm del fondo del tubo y retirar el asa suavemente, siguiendo la lnea inicial de inoculacin
sin perforar el fondo
Incubar a 35C por 18-24 horas.

Resultados.-
1-Movilidad:
-Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento ms all de la lnea de siembra.
-Resultado negativo: crecimiento solamente en la lnea de siembra.
2-Ornitina decarboxilasa:
-Resultado positivo: color prpura.
-Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede desarrollar un color violceo en la
superficie del medio.
3-Prueba del indol:
La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad y la prueba de
ornitina.
-Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador.
-Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloro o amarillento.

Caractersticas del medio


Medio preparado: prpura transparente a ligeramente opalescente
Grfico:

52
INDOL
La prueba del indol es una prueba bioqumica realizada en especies bacterianas para
determinar la habilidad del organismo de romper el indol del aminocido triptfano. Esta
divisin molecular es lograda por una serie de enzimas intracelulares diferentes, un sistema
que en conjunto se le llama con frecuencia triptofanasa. Los productos finales de la reaccin
son el indol, cido pirvico, amonaco (NH3) y energa. Como coenzima de la reaccin se
requiere al fosfato de piridoxal.
Tal como ocurre con muchas pruebas bioqumicas, los resultados de una prueba de indol se
indican con el cambio de color que sigue a la reaccin. El cultivo bacteriano puro debe ser
sembrado en un medio con triptfano o peptona estriles o ambos por 24 a 48 horas antes de
realizar la prueba. Luego de la incubacin, se aaden cinco gotas de reactivo Kovacs al medio
de cultivo. Una variante de la prueba se realiza usando el reactivo de Ehrlich's (usando alcohol
etlico en lugar del alcohol isoamilo, desarrollado por Paul Erlich), en especial si se tiene un
organismo que no sea fermentador y en organismos anaerbicos.
Los resultados positivos se muestran por la presencia de un color rojo o rojo-violeta en la
superficie de la capa de alcohol en el cultivo. Un resultado negativo se muestra amarillo. Un
resultado variable puede ocurrir cuando se muestra un color anaranjado. Ello es debido a la
presencia de escatol, tambin conocido como metil-indol o indol metilado, otro posible
producto de la degradacin del triptfano.

Grfico:

Control de calidad:
Positivo: Escherichia coli ATCC 25922
Negativo: Klebsiella pneumoniae ATCC 700603

Actividades a realizar:
Investigar las bacterias indol positivas, asi como las negativas, comparar realizando un cuadro
resumen como los ejemplos vistos.

Investigar el procedimiento Voges Proskauer, Rojo de metilo, SIM. Y otros de importancia


microbiolgica.

Haciendo hincapi en:


- Fundamento
- Materiales
- Interpretacin de resultados

53
Dibujar los siguientes resultados segn el TSI:

A/A K/A, SH2 K/A (g) K/K

Dibujar los siguientes medios con ejemplos de bacterias con resultado positivo:

Citrato Urea Motilidad Lisina

54
Tema 10: Protocolos (Tcnica, aplicacin, interpretacin) para
Urocultivos, Hemocultivos y Coprocultivos.

Objetivo general:
Aplicar los mtodos convencionales para el diagnstico microbiolgico de infecciones del
tracto urinario (ITU), en aparato circulatorio, y en enfermedad diarreica aguda.

Objetivos especficos:
1. Recordar las condiciones adecuadas para la toma de las muestras.
2. Realizar las siembras en los medios de cultivo adecuados
3. Sembrar la muestra de orina por el mtodo del asa calibrada.
4. Identificar el (los) microorganismo(s) aislado(s).
5. Relacionar los resultados con el estado clnico del paciente.

Justificacin.- Para interpretar correctamente el resultado de los Urocultivos, hemocultivos, y


coprocultivos es importante conocer la epidemiologa, condiciones generales y la clnica del
paciente. En estos casos una buena relacin entre el mdico y el microbilogo es determinante
para un diagnstico preciso.

Marco terico.-

UROCULTIVO

Las infecciones del tracto urinario (ITU) son unas de las infecciones ms comunes en humanos,
puede ocurrir a toda edad desde neonatos hasta ancianos, en personas sanas o
inmunocomprometidos. En general un limitado nmero de especies bacterianas son
responsables de la mayora de estas infecciones. La presencia de microorganismos en orina se
denomina bacteriuria, sean o no, causantes de infeccin.

Fase pre analtica: recordar la toma adecuada de la muestra en el sexo masculino y femenino,
asi como en procedimientos especiales como la toma supra pbica, por catter, etc. Adems
es importante acordarse sobre las normas para un adecuado traslado de la muestra y los
criterios de rechazo. (As en todos los protocolos)

Fase analtica:
Examen directo
1. Examen macroscpico: olor, color, aspecto, pH, densidad.
2. Examen microscpico: estudio del sedimento (en fresco): se centrifuga entre 10 - 15 ml de
orina a 3000 rpm durante 10 min, el sedimento obtenido se coloca entre lmina y laminilla y se
observa al microscopio con objetivo de 40X.

Cultivo y recuento de colonias:


Permite diferenciar la verdadera bacteriuria de una contaminacin. Se conocen varios
mtodos para determinar la cantidad de microorganismos. Como ejemplo:
Mtodo del asa calibrada: Es un mtodo prctico, sencillo y econmico, que consiste en
sembrar la orina sin centrifugar con un asa calibrada a 0.001 ml (3mm de dimetro) o 0,01 ml
(4mm de dimetro).

En la eleccin de los medios de cultivo debe considerarse la recuperacin de la mayora de los


patgenos, con el menor costo posible. Generalmente se recomienda la utilizacin de un agar

55
sangre (AS) y un agar CLED o un medio selectivo diferencial como MK o EMB. En nios incluir
un agar chocolate suplementado para la recuperacin de Haemophilus25.

Procedimiento
1. Mezclar cuidadosamente la orina restante.
2. Insertar el asa estril verticalmente en la muestra y luego diseminarla sobre la superficie de
la placa desde el centro, formando una lnea y posteriormente hacer estras sobre la placa
cruzando la lnea del inculo varias veces.
3. Incubar las placas durante 1824 horas a 37C en aerobiosis y el AS (Agar sangre) en
microaerofilia y en anaerobiosis si la muestra as lo exigiera. En caso de tener cultivos
negativos a las 24 horas, se deben incubar 2448 horas ms.

Grfico:

Imagen tomada del manual Prctico de Bacteriologa Clnica. Universidad de los Andes. 2008

Anlisis cualitativo
La identificacin de los agentes se hace mediante el estudio de las caractersticas
microscpicas de las colonias y la utilizacin de los sustratos del medio, ejemplo: lactosa,
hemlisis y la identificacin final a travs de pruebas fisiolgicas diferenciales, como la prueba
de la oxidasa, accin sobre azcares.
Anlisis cuantitativo
Contar el nmero de colonias y multiplicar por el factor 1000 o 100, de acuerdo a la capacidad
del asa utilizada, para determinar las unidades formadoras de colonia por mililitro de orina
(UFC/ml).

DIAGNOSTICO BACTERIOLOGICO26
La estrategia primordial para el xito de un protocolo de urocultivo es aislar al patgeno ms
probable y diferenciarlo de los organismos contaminantes.

25
Manual Prctico de Bacteriologa Clnica. Universidad de los Andes. 2008
26
Manual Micro diagnstica. LABORATORIO LINSAN S.A. Primera parte Diagnstico de Infecciones
Bacterianas. tercera edicin. 2012

56
1.- ORGANISMOS QUE SON UROPATGENOS RECONOCIDOS Y CRECEN BIEN EN MEDIOS DE
RUTINA EN 24 HRS. Estos incluyen E. coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, y
Pseudomona aeruginosa. Estos patgenos constituyen la causa del 80% de los bacilos gram
negativos aislados. Enterobacter y Citrobacter son tambin comnmente aislados.
Enterococcus, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus aureus y Streptococcus agalactiae
son los gram positivos ms frecuente-mente aislados.

2.-ORGANISMOS QUE SON UROPATOGENOS RECONOCIDOS Y NO CRECEN EN MEDIOS DE


RUTINA: Mycobacterium tuberculosis, es un uropatgeno infrecuente que se asocia a altos
recuentos de leucocitos. Chlamydia trachomatis se desarrolla solamente en cultivos celulares y
se asocia a uretritis y salpingitis pudiendo provocar ITU. Ureaplasma urealyticum, se asocia a
otros uropatgenos. Neisseria gonorrhoeae se desarrolla en Medio Thayer Martin.

3.-ORGANISMOS QUE PUEDEN SER UROPATOGENOS, PUEDEN REQUERIR MEDIOS ESPECIALES


Y MS DE 24 HRS. Hay microorganismos pertenecientes a la flora normal y que aislados en
recuentos altos se han asociado a ITU entre ellos se encuentran: Corynebacterium urealyticum,
Corynebacterium seminale stos se desarrollan en A. Sangre CNA.; Haemophilus influenzae, H.
parainfluenza, estos de desarrollan en A. chocolate Gardenella vaginalis en altos recuentos se
ha asociado a ITU ste se desarrolla en Human Blood Agar. Todos estos medios especiales
deben incubarse por 48 hrs. En CO2.

4.-ORGANISMOS QUE NO SON UROPATOGENOS PERO PUEDEN AISLARSE DE URETRA Y ORINA:


Gran variedad de grmenes colonizan la uretra y el rea genitourinaria, estos incluyen
anaerobios, Actinomyces spp, Lactobacillus, Streptococcus alfa-hemolticos, Staphylococcus
coagulasa negativa, y pequeos nmeros de gram negativos.

Fase post analtica:

INTERPRETACION DEL RECUENTO


El recuento bacteriano de la muestra es la parte ms importante del urocultivo, porque indica
la presencia de bacteriuria clnicamente significativa. La muestra se siembra con asa calibrada
de 0,01 ml y/o 0,001 ml. Un recuento mayor de 100.000 UFC/ml es indicativo de ITU.
Recuentos menores de 10.000 UFC/ml son indicativos de contaminacin uretral o vaginal.
Recuentos entre 10.000 y 100.000 UFC/ml. Deben ser evaluados basados en la informacin
clnica, el tipo de muestra enviada, tiempo de obtencin de la muestra.
La gran mayora de los casos de cistitis y pielonefritis pueden ser correctamente interpretados
usando stos parmetros.

Grfico:

Imagen tomada del Manual Prctico de Bacteriologa Clnica. Universidad de los Andes. 2008

57
HEMOCULTIVO

La deteccin de microorganismos viables en muestras de sangre tiene una gran importancia


diagnstica. Cuando bacterias u hongos se multiplican a una razn que supera la capacidad del
sistema reticuloendotelial de remover stas del torrente sanguneo, se produce bacteriemia o
fungemia.
Los microorganismos usualmente entran al sistema sanguneo a travs de los vasos linfticos.
La entrada directa de bacterias al torrente sanguneo ocurre en infecciones intravasculares
como: endocarditis, fstulas arteriovenosas, aneurismas micticas, flebitis supurativa, catteres
intra-venosos infectados, y catteres arteriales permanentes.

Indicaciones:
Las muestras de sangre para hemocultivo deben ser obtenidas antes de la administracin de
cualquier terapia antimicrobiana de cualquier paciente con fiebre mayor de 38C o hipotermia,
menor de 36C, leucocitosis de ms de 10,000 leucocitos por Lt., especialmente con desviacin
a la izquierda con aumento significativo de clulas inmaduras .
El hemocultivo complementa Urocultivos y cultivos de LCR en la evaluacin de neonatos con
sospecha de sepsis, cuyo nico signo clnico en adicin a fiebre o hipotermia, es mala nutricin
y decaimiento.

OBTENCIN DE LA MUESTRA
La dificultad en la interpretacin del hemocultivo es la contaminacin con flora normal de la
piel. Debido a que la endocarditis infecciosa puede ser causada por microorganismos
habitualmente encontrados en la piel como Staphylococcus epidermidis o Corynebacterium spp
la contaminacin de la muestra debe ser reducida a un mnimo. Las muestras para
hemocultivo nunca deben ser obtenidas a travs de catteres intravenosos o intra arteriales.

Procedimiento:
1. Luego de obtener la muestra con las medidas de bioseguridad sealadas captulos
atrs. Se procede a
2. Limpiar el tapn de goma de la botella de hemocultivo con alcohol o solucin yodada e
inocular las botellas.
3. Mezclar suavemente la sangre en el medio de cultivo.
4. Mandar las botellas inmediatamente al Laboratorio, sin refrigerar.

Recuerda!
El volumen ptimo de sangre por muestra corresponde a 20 a 30 ml para adultos y 10 ml para
nios menores. Un nmero significativo de bacteriemias pueden ser no diagnosticadas con
muestras menores de 10 ml. en adultos.
Las botellas de hemocultivo no deben llenarse, ya que siempre debe existir atmsfera y
espacio para la produccin de gases.

MUESTRAS: NMERO Y TIEMPO DE OBTENCION


El nmero de muestras y el tiempo en que se obtienen dependen de la fisiopatologa de la
bacteriemia. Mltiples botellas inoculadas de una puncin deben considerarse como un solo
hemocultivo. Dos o tres hemocultivos son suficientes para detectar la gran mayora de los
episodios de bacteriemia. Se recomienda la extraccin simultnea de 20 a 30 ml de sangre
para la evaluacin inicial.

Interpretacin
Las botellas deben observarse macroscpicamente a diario en busca de evidencia de
desarrollo bacteriano por un total de 7 das.

58
HEMOCULTIVOS POSITIVOS
El desarrollo bacteriano se detecta por turbidez del medio de cultivo; colonias visibles en la
capa sedimentada de sangre, o sobre sta. Hemlisis de la sangre, produccin de gas. Cuando
se obtiene un cultivo positivo se debe efectuar una tincin de Gram, que es particularmente
til para distinguir Streptococcus de Staphylococcus. Los medios de cultivo selectivos de
traspaso deben estar basados en el resultado de la tincin de Gram, segn la morfologa
encontrada es el medio selectivo para subcultivo.

Grfico:

Imagen tomada del Manual Prctico de Bacteriologa Clnica. Universidad de los Andes. 2008

Cultivo de catteres en infecciones endovasculares27


El cultivo de catteres asociados a infecciones endovasculares son tiles cuando un paciente
bajo terapia endovenosa desarrolla fiebre o bacteremia sin un foco infeccioso clnicamente
aparente. Un mtodo semicuantitativo de cultivo de los catteres puede ser til para distinguir
entre una contaminacin o infeccin microbiana.
El mtodo consiste en los siguientes pasos:
1. Realizar una antisepsia cuidadosa del sitio de insercin y retirar el catter.
2. Cortar con tcnica estril a 4 o 5 cm del extremo del catter.
3. Colocar la punta en un tubo estril para ser enviada al laboratorio.
4. Una vez en el laboratorio se procede a inocular mediante rodamiento en una placa de
agar sangre la punta del catter.
5. La placa de agar sangre debe ser incubada en microaerofilia a una temperatura de
36C durante un mximo de 72 horas con lecturas intermedias cada 24 horas.

27
Manual Prctico de Bacteriologa Clnica. Universidad de los Andes. 2008. Diagnstico microbiolgico de las
infecciones del aparato circulatorio. Hemocultivo

59
6. Despus de la incubacin, realizar contaje del nmero de colonias bacterianas y si el
nmero de colonias en la placa es igual o mayor de 15, la posibilidad de septicemia con
este punto de origen es alta.
7. Identificacin de los microorganismos aislados mediante la realizacin de la coloracin
de Gram y pruebas bioqumicas diferenciales.
8. Realizar las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana de acuerdo al microorganismo
identificado.

COPROCULTIVO

Las diarreas siguen constituyendo uno de los mayores problemas de salud en los tiempos
actuales. Se estima que 1 billn de episodios de diarrea ocurre anualmente en todo el mundo
en nios menores de 5 aos; resultando en 5 millones de casos fatales. Nios en pases en vas
de desarrollo presentan 3 a 5 veces ms episodios de diarrea que los nios en pases
desarrollados. La deteccin de los patgenos entricos est muy dificultada por la presencia de
una flora normal intestinal compleja y abundante, que se desarrolla prontamente despus del
nacimiento.

RECOLECCION Y TRANSPORTE DE MUESTRAS


La muestra de preferencia para el coprocultivo y el aislamiento de agentes bacterianos en
diarrea es la muestra de heces recolectada durante el perodo agudo de la enfermedad. La
muestra debe ser enviada inmediatamente al laboratorio despus de obtenida. Si la demora
entre la toma de muestra y el procesamiento de sta es mayor a dos horas, se debe enviar la
muestra en Medio de transporte (Cary Blair).
Hasta tres muestras es el nmero ptimo de coprocultivos para obtener un buen resultado en
el aislamiento del agente infeccioso, especialmente cuando los sntomas no son claros y
definitivos.

Examen directo
Examen macroscpico: consistencia, color, olor, presencia o ausencia de moco y/o sangre.
Examen microscpico: para determinar rpidamente la naturaleza de una enfermedad
diarreica es de gran ayuda y tiene un alto grado de confiabilidad la Investigacin de leucocitos
fecales, que consiste en determinar el tipo de clulas inflamatorias presentes en las heces; esta
informacin orienta sobre la naturaleza del proceso infeccioso, ejemplo, en la Shigelosis hay
abundancia de neutrfilos polimorfonucleares.

Procedimiento:
Deteccin de leucocitos fecales
1. Colocar una pequea cantidad de moco o de heces en una lmina y mezclar con 2-3 gotas de
azul de metileno al 1%.
2. Cubrir con una laminilla y esperar 2 a 3 minutos con la finalidad de obtener una buena
coloracin nuclear.
3. Observar al microscopio con los objetivos secos (10X y 40X).
Nota: Tambin se puede realizar un frotis y colorearlo con una coloracin simple o compuesta.

Grfico:

60
Imagen tomada del Manual Prctico de Bacteriologa Clnica. Universidad de los Andes. 2008

Interpretacin
La presencia de 5 o ms leucocitos por campo microscpico sugiere la presencia de un agente
entero invasor. La ausencia de clulas inflamatorias sugiere la presencia de un agente
toxignico.

Aislamiento bacteriano
En las muestras de heces, las bacterias entricas patgenas se encuentran siempre asociadas a
una gran variedad de bacterias comensales, es por ello, que para facilitar el aislamiento y
posterior identificacin de estas bacterias, se emplean diferentes medios de enriquecimiento,
selectivos y selectivos diferenciales

Recuerda!
El perfil clnico del paciente ser determinante en la eleccin de los medios de cultivo a
inocular. En casos de pacientes ambulatorios se deben inocular medios selectivos para
Salmonella, Shigella, y Campylobacter spp. Dos medios de preferencia para stos patgenos
son: Hektoen y XLD. Mac Conkey y Levine es recomendable cuando no es necesario un medio
tan selectivo. En adicin a estos medios se debe utilizar Medios especiales para Campylobacter
como el Agar Skirrow. Se debe agregar un medio no selectivo Agar Sangre al 5%, este medio es
til para detectar Staphylococcus aureus, levaduras o Pseudomona aeruginosa.
Dada la gran cantidad de agentes etiolgicos en las diarreas es importante identificar las de
mayor importancia mdica. En nios se debe identificar y serotipificar las cepas aisladas y
efectuar pruebas de sensibilidad28.

28
Manual Micro diagnstica. LABORATORIO LINSAN S.A. Primera parte Diagnstico de Infecciones
Bacterianas. tercera edicin. 2012

61
Imagen tomada del manual de Micro diagnstica. Primera parte. Diagnstico de infecciones bacterianas

Actividades a realizar:
1. Mencionar en orden de frecuencia las especies bacterianas productoras de ITU.
2. Definir los siguientes trminos: disuria, poliaquiuria, piuria, cistitis, pielonefritis.
3. Describa los pasos a seguir en la toma de muestra para un hemocultivo.
4. Establezca la diferencia entre un sitio anatmico naturalmente estril y naturalmente
contaminado
5. Mencionar en orden de frecuencia los microorganismos productores de EDA.
6. Explicar la utilidad de cada uno de los medios utilizados en el coprocultivo.

62
Tema 11: Antibiograma.

Objetivo general:
Determinar la importancia clnica y microbiolgica de las pruebas de susceptibilidad
antimicrobiana

Objetivos especficos:
1. Elaborar correctamente un antibiograma de acuerdo al mtodo de difusin del disco.
2. Conocer los criterios que permiten la escogencia adecuada de los discos de
antibiticos a probar en un antibiograma.
3. Interpretar y elaborar correctamente el reporte de un antibiograma.

Justificacin.- En la actualidad muchas son las enfermedades infecciosas que requieren de


dosis cada vez ms intensas de antibiticos para ser tratadas, este fenmeno nos ensea que
las bacterias y otros microorganismos han desarrollado mltiples mecanismos que les
permiten resistir a la accin de los ms nuevos y potentes agentes antimicrobianos. Entonces
cabe preguntarse quin ataca a quin?

Marco terico.-

Como no se puede predecir la susceptibilidad de las bacterias a los antimicrobianos, en la


actualidad se dispone de varios mtodos para determinar el patrn de susceptibilidad de una
bacteria a los antibiticos. Entre los mtodos ms utilizados podemos mencionar:

1. Mtodo de difusin del disco en agar (prueba de Kirby-Bauer).


2. Antibiograma ATB Rapid (bioMrieux).
3. Mtodo de dilucin en caldo o en agar (Concentracin Inhibitoria Mnima [CIM]).
4. Mtodo de la cinta o Epsilmetro EtestR (AB BIODISK)29.

Fundamento

El antibiograma consiste en depositar en la superficie de agar de una caja de petri previamente


inoculada con el microorganismo, discos de papel filtro impregnados con los diferentes
antibiticos. Cuando el antibitico se pone en contacto con la superficie hmeda del agar
(Mueller-Hinton), el papel filtro absorbe el agua y el antibitico se difunde. Trascurridas 18-24
horas de incubacin los discos aparecen rodeados por una zona de inhibicin.

El mtodo utilizado con mayor frecuencia para evaluar la sensibilidad de las bacterias a los
agentes antimicrobianos es la denominada prueba de difusin del disco. Esta tcnica fue
estandarizada por Kirby y Bauer en 1966, de all que dicho mtodo tambin se le conozca con
el nombre de prueba de Kirby-Bauer. Es un mtodo sencillo y fcil de realizar en los
laboratorios de rutina que slo brinda informacin cualitativa o semicuantitativa sobre la
sensibilidad de un microorganismo a un antibitico determinado. Sin embargo, los resultados
obtenidos son de gran valor clnico para iniciar, mantener o modificar una Antibioticoterapia.

Materiales:

Tubos con solucin salina (0,85 g NaCl en 100ml agua destilada estril)
Torundas de algodn estriles

29
Manual Prctico de Bacteriologa Clnica. Universidad de los Andes. 2008. Dr. Mara del Carmen
Araque.

63
Placas con Agar Mueller Hinton (pH 7,2-7,4)
Discos de antibiticos (temperatura ambiente 1 hora antes de su uso)
Tubo 0,5 de la escala de McFarland
Pinzas
Regla milimetrada
Tablas de los criterios estandarizados del CLSI.

Procedimiento:

Tomar varias colonias con un asa y colocar en un tubo con 3ml de solucin salina, ajustar el
inculo a una turbidez equivalente al 0,5 de la escala de McFarland (medio de estandarizacin,
representa una concentracin aproximada de 1-2 x 10 UFC/ml). Agitar por 15-20 segundos en
el vrtex.

Introducir la torunda dentro del tubo y eliminar el exceso del inculo rotando varias veces
contra la pared del tubo. Luego inocular las placas de Mueller Hinton sin dejar zonas libres,
deslizando la torunda por la superficie del agar en tres direcciones para conseguir una siembra
uniforme y rotando la placa unos 60 cada vez. Dejar secar de 3-5 minutos antes de depositar
los discos.

Colocar los discos con la ayuda de pinzas estriles, presionando ligeramente el disco en el agar;
flameando la pinza con cada uno. Los discos han de colocarse de manera que no se produzca
superposicin de los halos de inhibicin. Placas de 150mm 10 discos y de 100mm no ms de 5.

Incubar las placas invertidas a 35C en atmsfera aerbica (antes de que trascurran 15
minutos) por 18-24 horas.

Leer el dimetro de las zonas de completa inhibicin con una regla milimetrada.

Recuerda! Las zonas de los medios transparentes se miden sobre el reverso de la placa y los
medios que contienen sangre sobre la superficie del agar30.

Imagen tomada de la gua de prcticas de microbiologa. Universidad Complutense de Madrid. 2008

Interpretacin:

Medir la zona clara alrededor del disco. Para la interpretacin de resultados se seguirn las
normas establecidas por el CLSI (antes NCCLS) y sus respectivas tablas.

Las tres categoras segn los halos de inhibicin son: Sensible (S) Intermedia (I) y Resistente (R)

30
Mdulo de Bacteriologa. Programa de Microbiologa Avanzada. Universidad de Guayaquil. 2010

64
Sensible: Indica que puede usarse para el tratamiento empleando dosis habituales de
antimicrobiano, segn su halo de inhibicin. El mdico debe tomar en cuenta la fisiopatologa
del cuadro, la edad del paciente, etc.

Intermedio: Indica que puede esperarse eficacia al usarse en localizaciones en las que se
alcanzan altas concentraciones del antimicrobiano o cuando se emplean dosis ms elevadas. El
mdico debe evitar usar estos antibiticos en la medida de lo posible.

Resistente: Indica que los microorganismos poseen mecanismos de resistencia para ese
antimicrobiano y/o que no se inhiben por las concentraciones habituales en sangre y tejidos,
sea cual sea el tipo de tratamiento. Se aconseja realizar otras pruebas de suceptibilidad
adicional ante el aislamiento de un microorganismo multirresistente.

Recuerda! El antibiograma es un instrumento de gran utilidad para la elaboracin de un plan


teraputico eficaz contra el patgeno, seleccionando la droga menos txica para el paciente, y
con las caractersticas farmacocinticas ms apropiadas segn la naturaleza y gravedad de la
infeccin.

Fuentes de error ms comunes en la realizacin de un antibiograma

1. Falta del control de calidad de los medios de cultivo a utilizar, patrn de McFarland y
los discos de antibiticos.
2. Trabajar con cepas bacterianas que no estn puras.
3. Inadecuada estandarizacin de la concentracin del inculo.
4. Utilizacin de un nmero excesivo de discos de antibiticos por placa.
5. Utilizacin de medios de cultivo no aptos para las pruebas de susceptibilidad.
6. Lectura prematura o extempornea de las pruebas de susceptibilidad.
7. Medicin incorrecta de los halos de inhibicin por una iluminacin deficiente o reglilla
inadecuada.
8. Incubacin en atmsfera inadecuada.
9. Error en la transcripcin de los resultados en la hoja de reporte.

Actividades a realizar:

Elabore el reporte de un antibiograma:

Microorganismo aislado:.

Disco del antibitico Dimetro en milmetros Interpretacin

Observaciones:

Conteste:

1. Cul es la finalidad de las pruebas de susceptibilidad?


2. Qu significa sensibilidad y resistencia cuando se interpreta un antibiograma?
3. En qu casos, las pruebas de susceptibilidad requerirn de medios de cultivos
distintos al de Mueller Hinton?

65
4. La imagen inferior muestra dos fenmenos especiales de resistencia, investigue de que
se trata:

Imagen tomada del www.elsevier.es/eimc

Tabla 1: CRITERIOS PARA ESTABLECER CATEGORAS EN ANTIBIOGRAMAS31

31
Gua de prcticas de microbiologa. Universidad Complutense de Madrid. 2008

66
Tema 12: Mtodos diagnsticos de infecciones virales y micticas

Objetivo general:
Conocimiento de las tcnicas bsicas utilizadas en el laboratorio para la investigacin de
hongos y virus de importancia mdica.

Objetivos especficos:
1. Reconocimiento de las distintas estructuras que tienen los hongos cuando se
desarrollan sobre medios de cultivo.
2. Conocer las caractersticas morfolgicas (macro y microscpicas) de los distintos
grupos taxonmicos.
3. Observar la tcnica de PCR en el laboratorio molecular de la facultad
4. Identificar mohos por la tcnica de microcultivo.
5. Analizar casos clnicos para relacionar la parte terica con la prctica.

Justificacin.- Es causa habitual de consulta las molestias descritas como prurito y eritema,
caracterstica de una micosis superficial, que pueden ser difciles de distinguir de otras lesiones
cutneas y derivar a un mal tratamiento por el uso de corticoides que generarn cuadros
clnicos atpicos difciles de diagnosticar y tratar posteriormente. Asi mismo estan en auge las
micosis oportunistas que afectan a individuos inmunocomprometidos, tal es el caso de los
pacientes VIH, causando cuadros clnicos inespecficos que requieren de un diagnstico precoz
para aumentar la tasa de xito en la adicin al tratamiento.

Marco Terico.-
VIROLOGIA
El estudio de los virus siempre requiere el uso de clulas vivas. Afortunadamente, en la
actualidad se dispone de lneas celulares continuas: clulas que se multiplican en un medio
adecuado en frascos de cultivo en el laboratorio. Las clulas as mantenidas son muy
susceptibles a contaminaciones, variaciones de temperatura, de pH, de presin de oxgeno,
etc. Han de ser cultivadas en unos ambientes muy restringidos, manteniendo las condiciones
lo ms constantes posible. Por este motivo, el acceso a la sala de cultivos debe ser
restringido y no es aconsejable incluir en las prcticas el manejo de las clulas, bien infectadas
o bien sin infectar por virus.
Los virus son demasiado pequeos para ser observados con el microscopio ptico32. Sin
embargo, al desarrollar su ciclo de replicacin utilizan productos celulares y alteran la vida de
la clula, y en muchas ocasiones esto s que se puede observar con el microscopio ptico, ste
es el llamado efecto citoptico. Los posibles efectos citopticos son numerosos. Entre ellos
se cuentan la aparicin de sincitios, la lisis celular, el desarrollo de cordones, la vacuolizacin,
la aparicin de clulas gigantes, etc.
NOTA: Nuestro laboratorio no cuenta con lo mencionado lneas arriba, asi que los casos
clnicos y el material que puedan adicionar los estudiantes a la prctica es de mucha ayuda
para la comprensin de este tema.

Micologa
EXAMEN DIRECTO
La microscopa sigue siendo una de las herramientas ms antiguas y tiles del miclogo clnico.
Con frecuencia los hongos tardan en desarrollar las estructuras conidigenas caractersticas
para su identificacin definitiva. Por lo tanto, es de gran utilidad que a la vez que se inoculan

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IDENTIFICACIN DE HONGOS-CLAVES DICOTOMICAS. Universidad Complutense de Madrid. Guin de
prcticas 2008

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los medios de cultivo, se realicen las tcnicas microscpicas que, en tiempo real (menos de 10
min), puedan orientar de forma preliminar la etiologa del proceso.

El examen microscpico directo proporciona un diagnstico definitivo si se observan


elementos fngicos patognomnicos: cpsula de Cryptococcus neoformans, clulas fumagoides
en cromo blastomicosis, levaduras pequeas intracelulares de Histoplasma capsulatum,
quistes/ascas tpicos de P. jiroveci, levaduras con brotes de base ancha de Blastomyces
dermatitidis, levaduras con gemacin multipolar en rueda de timn de Paracoccidioides
brasiliensis o las esfrulas de Coccidiodes immitis. En algunos casos, el diagnstico
microscpico puede ser la nica evidencia de infeccin fngica y, en otros, su negatividad
puede sustentar la interpretacin de aislamientos como contaminantes. La escasez de la
muestra es, en la prctica, la nica razn para no efectuar la observacin microscpica en
beneficio del cultivo. El examen microscpico puede tambin orientar la tcnica de cultivo
(medios, temperatura, tiempo de incubacin, precauciones especiales de bioseguridad) e,
incluso, su inutilidad por tratarse de patgenos enigmticos no cultivables como
Rhinosporidium seeberi o Pneumocystis jiroveci.
La observacin microscpica se realiza con bajo aumento, seguida de alto aumento en seco y,
si es necesario, con aceite de inmersin. Las dos formas observadas habitualmente son
levaduras y/o elementos miceliares. La mayora de los hongos se pueden detectar sin tincin,
en la mayor parte de las muestras clnicas como esputos, orinas, exudados y LCR, usando
siempre que sea posible microscopia de contraste de fases. No obstante, se han desarrollado
una serie de tinciones (tinta china, Giemsa, argnticas, agentes quimio fluorescentes, etc.)
para mejorar la sensibilidad de la tcnica. Las tcnicas microscpicas directas son de gran
utilidad en el estudio de muestras clnicas de pacientes con micosis que afectan a la piel y
mucosas, pero tambin son muy tiles en el diagnstico de micosis subcutneas y profundas.

Son mltiples las tcnicas de observacin microscpica para el diagnstico de las micosis. Se
utilizan montajes hmedos, tinciones fijas y diversas tcnicas histolgicas para las muestras de
tejidos. En los montajes hmedos, la adicin de KOH y dimetil-sulfxido (DMSO) permiten la
clarificacin de la muestra, mientras que la adicin de glicerol, mejora la conservacin de las
estructuras fngicas.

Tabla tomada del manual Micro diagnstica. II parte. Diagnstico de hongos y levaduras.

Limitaciones del examen microscpico

Un examen directo negativo nunca descarta una infeccin fngica. La sensibilidad de la


tcnica puede estar entre 103-105 elementos fngicos por ml y puede depender del
lugar anatmico, tipo de paciente, tincin y experiencia del observador.
El examen microscpico puede originar falsos positivos al confundirse ciertas
estructuras con elementos fngicos (linfocitos lisados que se confunden con C.
neoformans en la tincin con tinta china, fibras de colgeno o del hisopo que se
confunden con elementos fngicos, gotas de grasa con levaduras en gemacin, etc.)
El examen microscpico debe realizarse, al menos, en todas las muestras con alta
sospecha de micosis; aunque lo ideal sera realizarlo siempre que fuese posible.
Posee una relativamente baja sensibilidad diagnstica.
En la mayora de los casos, no es posible identificar la especie fngica.

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No permite la realizacin de estudios de sensibilidad a los Antifngicos.

Medios de cultivo.- Agar Sabouraud + Glucosa modificado por Emmons: es el medio estndar
para el aislamiento, esporulacin y conservacin de muchos hongos. Su pH y la concentracin
de glucosa favorecen la esporulacin.

Incubacin.- La temperatura ptima de crecimiento de la mayora de los hongos patgenos es


30C. La temperatura de 37C debe reservarse para hongos dimrficos o algn hongo que se
desarrolle mejor a esta temperatura. Los cultivos de hongos deben incubarse durante 3-4
semanas antes de ser desechados, y no deben desecharse cuando se asla un hongo, sino que
debe completarse el periodo de incubacin. Sin embargo, hay muestras que se pueden
eliminar antes (por ejemplo, exudado vaginal), a los 7 das, cuando se realizan cultivos
habituales.

IDENTIFICACIN

HONGOS FILAMENTOSOS

Cuando el crecimiento detectado corresponda a un hongo filamentoso, la identificacin se de-


be hacer por el examen macroscpico de la colonia: forma, color, textura, velocidad de
crecimiento y reverso. Si el hongo tiene abundantes formas de reproduccin se emplea la
tcnica del scotch o papel de celofn, que consiste en tocar la superficie de la colonia con la
cinta adhesiva y colocarla sobre un porta, en el que se ha depositado una gota de azul de
lactofenol y observar al microscopio.

Cuando no se puede conseguir una buena observacin de las formas de reproduccin por las
tcnicas anteriores, es necesario hacer un microcultivo. Esta tcnica consiste en depositar
sobre un porta un trozo de agar de Sabouraud, o del medio recomendado segn el gnero de
hongo filamentoso que se presume, de 1 cm de superficie aproximadamente, en cuyos
extremos se inocula el hongo problema (en profundidad). Posteriormente se le coloca un
cubre encima y se incuba en cmara hmeda a 25C hasta observar crecimiento; entonces se
toma el cubre, que es donde se han depositado las formas de reproduccin, y se coloca sobre
un porta que lleva una gota de azul de lactofenol y se observa al microscopio.

Grficos:

Imgenes tomadas de http://www.biblioteca.upibi.ipn.mx/

Los criterios de identificacin son fundamentalmente morfolgicos basados en la presencia de


estructuras de reproduccin sexual, estructuras de reproduccin asexual y caractersticas
especiales de las hifas, cuya descripcin pueden ser consultados en atlas micolgicos. En
ocasiones, la identificacin se complementa con pruebas bioqumicas, como la investigacin
de la ureasa, que diferencia T. mentagrophytes (positivo) de T. rubrum (negativo).

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LEVADURAS

La mayora de los organismos levaduriformes crecen fcilmente en un gran nmero de medios


de cultivo usados rutinariamente en el laboratorio de microbiologa (agar sangre, agar
chocolate, agar Cled, etc.). Sin embargo, el AGS (agar glucosado de Sabouraud), con o sin
antibiticos aadidos, es el medio de aislamiento por excelencia para la identificacin de
levaduras. En el medio AGS las colonias de levaduras suelen ser completas, ligeramente
abombadas o planas, de consistencia mantecosa, lisa o rugosa, con olor dulzn agradable,
volvindose ms pastosas a medida que la colonia envejece. Por lo general, las colonias de
levaduras no desarrollan micelio areo, aunque en ocasiones pueden aparecer prolongaciones
aracneiformes en la periferia de las colonias.

Identificacin convencional.- Si se visualiza crecimiento en cualquier medio que sugiera


posibilidad de levaduras, se realiza una extensin en fresco. Si en la misma se observan
levaduras, se procede a la identificacin mediante subcultivo.
Si se observa un micelio areo definido, debe considerarse la posibilidad de que se trate de un
hongo dimrfico. Una colonia de aspecto y consistencia mucoide sugiere la formacin de
cpsulas y puede ser el paso inicial para la identificacin de C. neoformans.

Otros medios diagnsticos complementarios33


- Prueba del tubo germinal o filamentacin precoz: el tubo germinal es una extensin
filamentosa de la levadura, sin estrechamiento en su origen, cuyo ancho suele ser la mitad de
la clula progenitora y su longitud tres o cuatro veces mayor que la clula madre.
Falsos negativos: aproximadamente un 5% de cepas de C. albicans dan negativa la prueba de
los tubos germinales. Si se utiliza un inculo demasiado abundante de levaduras, tambin
pueden obtenerse falsos resultados negativos.
Metodologa: 1) emulsionar una porcin de la colonia aislada en 0,5 ml de suero humano, de
caballo o de conejo. 2) Incubar a 35C durante 2 horas. 3) Depositar una gota de la emulsin
sobre un portaobjetos limpio y desengrasado, colocar un cubreobjetos y visualizar a 100 X, 400
X o 1000 X.
Interpretacin: La prueba es positiva si se visualizan tubos germinales.

Grficos:

Fotografa de pseudohifas en Candida spp. (Izquierda). Fotografa de tubo germinativo positivo, es decir, presencia
de C. albicans. Imagen tomada de la Universidad de concepcin. Carrera de Tecnologa mdica.

- Deteccin de ureasa: una levadura con reaccin positiva a la prueba de la ureasa es sugestiva
de pertenecer al gnero Cryptococcus
- Prueba de la enzima nitrato-reductasa: la capacidad de C. neoformans de reducir nitratos a
nitritos es una prueba de utilidad cuando se pretende identificar esta levadura.
Interpretacin: el desarrollo inmediato de un color rojo indica una reaccin positiva.

33
Micro diagnstica. II parte. Diagnstico de hongos y levaduras.

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- Prueba de la fenol-oxidasa: C. neoformans produce fenol-oxidasa, una enzima necesaria para
el metabolismo de la 3,4-dihidroxifenilanina (DOPA) y otros compuestos fenlicos en la sntesis
de la melanina.
Interpretacin: el desarrollo de una pigmentacin marrn oscura alrededor del crecimiento es
caracterstico de C. neoformans.
-Deteccin de antgenos y Anticuerpos: Se han descrito numerosas tcnicas para la deteccin
de antgenos fngicos, algunas de ellas incluso disponibles comercialmente.
- Ltex para Cryptococcus.
- Inmunofluorescencia para Pneumocystis jiroveci (ex carinii).
- Antigenemia para bsqueda de Aspergillus spp.
- Deteccin de antgenos de Candida spp.

-Biologa molecular:
Entre las tcnicas ms difundidas est la amplificacin por PCR, especialmente por su alta
sensibilidad y rapidez. Esta tcnica se ha implementado en diferentes aproximaciones: PCR con
partidores especie o gnero-especficos, PCR y Southern blot, PCR y anlisis con enzimas de
restriccin, PCR anidada, PCR en tiempo real, PCR con anlisis de fragmentos y secuenciacin.
Esta tcnica se pretende observar con los subgrupos de estudiantes coordinando con el rea
de biologa molecular e inmunologa.

Actividades por realizar:

Complete:
Como se denominan a las colonias mucosas de color blanco, crema o rosas, que crecen en agar
glucosado de Sabouraud sin formacin de filamentos:
Crecimiento en medio Agar Glucosado de Sabouraud formando colonias de apariencia
miceliar...........................................................................................

Segn lo anterior observe los grficos y mencione de qu se trata

Imgenes tomadas de: IDENTIFICACIN DE HONGOS-CLAVES DICOTOMICAS. Universidad Complutense de Madrid.


Guin de prcticas 2008.
Responda:

1. Qu es un conidio?
2. Qu es un esporangio?
3. A qu familia pertenece el virus de la rubeola?
4. Qu es el dengue, cuales son las estadsticas en el pas actualmente?

Investigue
5. Esquema de vacunacin
6. Tratamiento Antiretroviral

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Referencias bibliogrficas
1. Bailey y Scott. (2009). Diagnstico Microbiolgico. (12 Ed.). Argentina: Editorial
Panamericana.
2. Harrison, T. et. al. (2012). Principios de Medicina Interna. (18 Ed.). Mxico: Editorial
Mc Graw Hill. Volumen 1.
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Panamericana.
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para el control de la tuberculosis en Ecuador. (2 Ed.). (s.l.i.): (s.e.).
7. Organizacin Panamericana de la Salud. (2008). Manual para el diagnstico
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9. Pesantes, Carmen. (2010). Mdulo de Microbiologa. (1 Ed.). Guayaquil: Universidad
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10. Ramrez, Ana et. al. (2010). Manual Prctico de Bacteriologa general. (Texto
universitario). (1 Ed. Digital). Mrida: Universidad de los Andes.
11. Santambrosio, Eduardo et. al. (2009). Tincin y Observacin de Microorganismos. (1
Ed.). Argentina: Universidad Tecnolgica Nacional.
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Clnica. (1 Ed.). Espaa: Editorial Elsevier.
13. Velasco Judith, Araque Mara del Carmen. (2011). Manual Prctico de Bacteriologa
Clnica. (Texto universitario). (1 Ed. digital), Mrida: Universidad de los Andes.
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Clnica. (1 Ed.). Quito: OPS.

Paginas consultadas de internet:


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- http://www.practicalscience.com/microscopy.html
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- http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/bacteriologia/tuberculosis.html
- http://aprendeenlinea.udea.edu.co/lms/moodle/file.php/743/Bacteriologia/Pruebas_
de_laboratorio/Prueba_urea.html
- http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Microbiology/Dehydrated-Culture-
Media-Biochemical-Identification-Media-Animal-based-Media/MIO-Medium-Motility-
Indole-Ornithine-Medium-M378
- http://www.biblioteca.upibi.ipn.mx/Archivos/Material%20Didactico/T%C3%A9cnicas%
20microbiol%C3%B3gicas/T%C3%A9cnicas%20Microbiol%C3%B3gicas%20Parte%202.p
df
- http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioAntibioticos.htm
- http://procedimientosmicrobiologicos.wikispaces.com/

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ndice

Introduccin..pg. 1

Tema 1: Normas de Bioseguridad en el laboratorio de Microbiologa pg. 2

Tema 2: Materiales y Equipos en el laboratorio de Microbiologa pg. 5

Tema 3: Desinfeccin y Esterilizacin pg. 13

Tema 4: Toma de muestras. Normas bsicas generales.. pg. 17

Tema 5: Tinciones pg. 26

Tema 6: Medios de cultivo pg. 32

Tema 7: Cultivos.. pg. 37

Tema 8: Pruebas de identificacin de cocos gram (+) y gram (-) pg. 42

Tema 9: Pruebas bioqumicas para bacilos gram negativos (enterobacterias) pg. 46

Tema 10: Protocolos (tcnicas, aplicacin e interpretacin) para Urocultivos


Hemocultivos, Coprocultivos pg. 55

Tema 11: Antibiograma.. pg. 63

Tema 12: Mtodos diagnsticos de infecciones virales y micticas.. pg. 67

Bibliografa. pg. 72

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