TECNOLOGAS EMERGENTES

Para optar al grado de Doctor por la Universidad de Vigo

RECUPERACIN DE ANTIOXIDANTES POR TECNOLOGAS
EMERGENTES A PARTIR DE EFLUENTES INDUSTRIALES Y
RESIDUOS FORESTALES

TESIS DOCTORAL
presentada por:
Beatriz Daz Reinoso
Para optar al grado de Doctor por la
Universidad de Vigo

Ourense, Julio de 2015

AGRADECIMIENTOS

A mis directores de tesis, D. Juan Carlos Paraj Liares, D. Herminia Domnguez

Gonzlez y D. Andrs Moure Varela.

A todas las personas con las que trabaj durante mi etapa en el laboratorio.

A mi familia y a mis amigas y amigos.

NDICE
ndice de tablas ....................................................................................................................i

ndice de figuras ................................................................................................................. iii

Abreviaturas....................................................................................................................... iv

1. INTRODUCCIN ...............................................................................................................3

1.1. ANTIOXIDANTES NATURALES ............................................................................................................ 4

1.1.1. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE ........................................................................................................ 5

1.1.1.1. MEDIDA DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE....................................................................... 7

1.1.2. COMPUESTOS FENLICOS ......................................................................................................... 8

1.1.2.1. ESTRUCTURA Y CLASIFICACIN .......................................................................................... 8

1.1.2.1. RELACIN ESTRUCTURA - ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE ..................................................... 13

1.1.2.2. ACTIVIDAD BIOLGICA ..................................................................................................... 15

1.2. EXTRACCIN Y PURIFICACIN DE COMPUESTOS FENLICOS ANTIOXIDANTES ............................. 17

1.2.1. FLUIDOS SUPERCRTICOS ......................................................................................................... 17

1.2.1.1. PROCESO DE EXTRACCIN SUPERCRTICA ....................................................................... 21

1.2.1.1. ESQUEMAS PROPUESTOS EN EXTRACCIN CON FLUIDOS SUPERCRTICOS DE

COMPUESTOS DE NATURALEZA ANTIOXIDANTE........................................................................... 22

1.2.1.2. PARMETROS OPERACIONALES QUE AFECTAN AL PROCESO DE EXTRACCIN ............... 25

1.2.1.3. PROPIEDADES DE LOS EXTRACTOS ANTIOXIDANTES OBTENIDOS MEDIANTE FSC .......... 30

1.2.1.4. EXTRACCIN DE ANTIOXIDANTES MEDIANTE FLUIDOS SUPERCRTICOS A PARTIR

DE MATERIAS PRIMAS RESIDUALES ............................................................................................ 32

1.2.2. TECNOLOGA DE MEMBRANAS ................................................................................................ 37

1.2.2.1. CARACTERSTICAS DE LAS MEMBRANAS .......................................................................... 38

1.2.2.2. ENSUCIAMIENTO DE LAS MEMBRANAS ........................................................................... 42

1.2.2.3. CONFIGURACIN DEL MDULO DE MEMBRANA ............................................................ 45

1.2.2.4. RECUPERACIN DE COMPUESTOS ANTIOXIDANTES MEDIANTE TECNOLOGA DE

MEMBRANAS ................................................................................................................................. 48

1.3. FUENTES NATURALES ...................................................................................................................... 53

1.3.1. RESIDUOS VITIVINCOLAS ........................................................................................................ 54

1.3.2. RESIDUOS FORESTALES: HOJA DE CASTAO ........................................................................... 63

 1.2.3. FRUTOS DEL BOSQUE ............................................................................................................... 68

2. OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO ..................................................................................... 75

3. MATERIALES Y MTODOS ............................................................................................... 79

3.1. MATERIAS PRIMAS .......................................................................................................................... 79

3.2. PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES ............................................................................................. 79

3.2.1. EXTRACCIN CON FLUIDOS SUPERCRTICOS ........................................................................... 80

3.2.2. EXTRACCIN SLIDO-LQUIDO CON DISOLVENTES ................................................................. 83

3.2.3. CONCENTRACIN/PURIFICACIN MEDIANTE MEMBRANAS .................................................. 85

3.2.4. ADSORCION-DESORCIN MEDIANTE RESINAS ........................................................................ 87

3.2.5. EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO .............................................................................................. 89

3.3. METODOLOGA ANALTICA ............................................................................................................. 89

3.3.1. DETERMINACIN DE LA HUMEDAD ......................................................................................... 89

3.3.2. CONTENIDO EN SLIDOS O PESO SECO ................................................................................... 89

3.3.3. DETERMINACIN DEL RENDIMIENTO DE EXTRACCIN ........................................................... 90

3.3.4. TCNICAS CROMATOGRFICAS ............................................................................................... 90

3.3.4.1. CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA EFICACIA (HPLC)..................................................... 90

3.3.4.2. CROMATOGRAFA DE GASES (GC) .................................................................................... 91

3.3.5. DETERMINACIN DEL CONTENIDO TOTAL EN COMPUESTOS FENLICOS: MTODO DE

FOLIN-CIOCALTEAU ............................................................................................................................ 92

3.3.6. DETERMINACIN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE.............................................................. 92

3.3.6.1. CAPTACIN DEL RADICAL DFPH ....................................................................................... 93

3.3.6.2. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EQUIVALENTE A TROLOX O TEAC ......................................... 93

3.3.6.3. PODER ANTIOXIDANTE DE REDUCCIN DEL HIERRO O FRAP .......................................... 94

3.3.6.4. PODER REDUCTOR ............................................................................................................ 95

3.3.6.5. OXIDACIN DEL -CAROTENO EN EMULSIONES DE CIDO LINOLEICO ........................... 96

3.3.6.6. CAPTACIN DE ESPECIES REACTIVAS DE OXGENO Y NITRGENO (ERO y ERN) .............. 97

3.3.6.7. HEMOLISIS INDUCIDA POR AAPH ................................................................................... 101

3.3.6.8. PEROXIDACIN LIPDICA EN ERITROCITOS ..................................................................... 101

3.3.7. ENSAYO IN VITRO DE IRRITACIN DE LA PIEL (EPISKIN) ........................................................ 102

 3.3.8. DETERMINACIN DE AZCARES ............................................................................................ 103

3.3.8.1. DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES MEDIANTE EL MTODO DNS ............... 103

3.3.8.2. DETERMINACIN DE AZCARES TOTALES. MTODO DE LA ANTRONA ......................... 104

3.3.9. DETERMINACIN DE PROTENA. MTODO DE BRADFORD ................................................... 104

4. RESULTADOS ............................................................................................................... 109

5. DISCUSIN GENERAL.................................................................................................... 219

6. CONCLUSIONES............................................................................................................ 233

7. REFERENCIAS ............................................................................................................... 237

NDICE DE TABLAS

Tabla 1.1: Valores promedio de las propiedades fsicas y de transporte ms importantes

de lquidos, gases y fluidos supercrticos (Pereda y col., 2008).................................................................. 19

Tabla 1.2: Fluidos supercrticos ms utilizados y propiedades crticas de los mismos

(Poling y col., 2001) .................................................................................................................................... 20

Tabla 1.3: Extraccin de compuestos antioxidantes mediante FSC a partir de fuentes residuales ........... 35

Tabla 1.4: Recuperacin de compuestos fenlicos mediante tecnologa de membranas a

partir de corrientes residuales ................................................................................................................... 51

Tabla 1.5: Recuperacin de compuestos antioxidantes a partir de residuos de la uva ............................. 59

Tabla 1.6: Obtencin de compuestos antioxidantes a partir de erizos de castaa ................................... 64

Tabla 1.7: Obtencin de compuestos antioxidantes a partir de hoja de castao ...................................... 66

Tabla 1.8: Extraccin de compuestos fenlicos a partir de bagazos de distintas bayas ............................ 70

Tabla 3.1: Estructura del diseo central compuestos: Variables codificadas y condiciones

operacionales ............................................................................................................................................. 84

Tabla 3.2: Caractersticas de las membranas de filtracin utilizadas ......................................................... 85

Tabla 3.3: Propiedades fsico-qumicas de la resina Sepabads SP700 ....................................................... 88

Tabla 3.4: Gradiente no lineal utilizado en el anlisis mediante HPLC ...................................................... 90

i
NDICE DE FIGURAS

Figura 1.1: Mecanismo bsico de la oxidacin lipdica ................................................................................ 6

Figura 1.2: Estructura qumica de los principales cidos fenlicos .............................................................. 9

Figura 1.3: Estructura bsica de un flavonoide .......................................................................................... 10

Figura 1.4: Estructura qumica de los flavonoles........................................................................................ 10

Figura 1.5: Estructura qumica de las flavonas ........................................................................................... 10

Figura 1.6: Estructura qumica de las flavanonas ....................................................................................... 11

Figura 1.7: Estructura qumica de las isoflavonas ...................................................................................... 11

Figura 1.8: Estructura qumica de los flavanoles ........................................................................................ 12

Figura 1.9: Estructura qumica de las antocianidinas ................................................................................. 12

Figura 1.10: Estructura qumica de una procianidina ................................................................................ 13

Figura 1.11: Estructura qumica de un lignano........................................................................................... 13

Figura 1.12: Estructura qumica del resveratrol ......................................................................................... 13

Figura 1.13: Diagrama de fases de un compuesto puro............................................................................. 18

Figura 1.14: Diagrama de flujo general de un proceso de extraccin con FSC .......................................... 22

Figura 1.15: Etapa de extraccin seguida de separacin fraccionada (E 1: Extracto; R1,

R2: Residuos slidos) ................................................................................................................................... 23

Figura 1.16: Etapas consecutivas de extraccin de severidad creciente (E1: Extracto;

R1, R2: Residuos slidos) ............................................................................................................................. 23

Figura 1.17: Extraccin convencional con disolventes seguida de extraccin con FSC

(E1: Extracto; R1, R2: Residuos slidos) ........................................................................................................ 24

Figura 1.18: Extraccin con FSC seguida de extraccin convencional o tratamientos

hidrotrmicos (E1: Extracto; R1, R2, R3: Residuos slidos) ........................................................................... 25

Figura 1.19: Efecto de la presin y la temperatura en el rendimiento de extraccin de compuestos

fenlicos con CO2 supercrtico a partir de madera de pino (30 C; 40 C; 60 C)

(Conde y col., 2013) .................................................................................................................................... 28

Figura 1.20: Esquema general de un mdulo de membranas ................................................................... 37

Figura 1.21: Esquema general de un proceso de filtracin con membranas ............................................. 37

Figura 1.22: Capacidad de separacin por tamao de partculas de los distintos tipos de membranas38

iii
Figura 1.23: Estructuras porosas tpicas (Scott, 1996) ............................................................................... 40

Figura 1.24: Disminucin del flujo asociada a los fennemos de ensuciamiento (Li y col., 2008) ............. 43

Figura 1.25: Relacin entre el flujo de permeado y los parmetros operacionales durante el

proceso de filtracin (Cheryan, 1998) ........................................................................................................ 45

Figura 1.26: Proceso de elaboracin de vino blanco y aguardiente .......................................................... 54

Figura 3.1: Esquema experimental para el aprovechamiento de residuos procedentes de alcoholera .... 80

Figura 3.2: Planta de extraccin supercrtica de muestras slidas modelo SFF de Iberfluid ..................... 81

Figura 3.3: Planta de extraccin supercrtica modelo SFE1000 de Thar .................................................... 82

Figura 3.4: Diagrama de flujo del proceso de extraccin supercrtica utilizado ........................................ 83

Figura 3.5: Esquema general del proceso de filtracin con membranas ................................................... 86

Figura 3.6: Recta de calibrado para la determinacin del contenido total en compuestos fenlicos ....... 92

Figura 3.7: Recta de calibrado para el mtodo TEAC ................................................................................. 94

Figura 3.8: Recta de calibrado para el mtodo FRAP ................................................................................. 95

Figura 3.9: Recta de calibrado para el mtodo del poder reductor ........................................................... 96

Figura 3.10: Recta de calibrado para el mtodo DNS .............................................................................. 103

Figura 3.11: Recta de calibrado para el mtodo de la antrona ................................................................ 104

Figura 3.12: Recta de calibrado para el mtodo de Bradford .................................................................. 105

iv
ABREVIATURAS

AAPH: 2,2'azobis(2-amidinopropano) clorhidrato

ABTS: 2,2'azinobis (3-etilbenzotiazolin 6-cido sulfnico)
AC: Acetato de celulosa
AEDT: cido etildiaminotetraactico
ADN: cido desoxirribonucleico
ATC: cido tricloroactico
BHA: Butilhidroxianisol
BHT: Butilhidroxitolueno
CAA: Coeficiente de actividad antioxidante
CE50: Concentracin eficiente para alcanzar el 50 % de inhibicin
DAD: Detector de diodos en lnea
DAF-2: 4,5-diaminofluorescena
DAF-2T: Triazolofluorescena
DCC: Diseo central compuesto
DCM: Diclorometano
DFPH: 2, 2- difenilo, 1-picrilhidrazilo
DHR: Dihidrorodamina
DMSO: Dimetil sulfxido
DNS: 3,5 dinitrosaliclico
DQO: Demanda qumica de oxgeno
DTPA: cido dietilen triamino pentaactico
EAG: Equivalentes de cido glico
EI: Impacto de electrones
ERO: Especies reactivas de oxgeno
ERN: Especies reactivas de nitrgeno
FC: Reactivo Folin-Ciocalteu
FRAP: Capacidad de reduccin frrica del plasma
FSC: Fluido supercrtico
GC: Cromatografa de gases
HAT: Reaccin de transferencia de un tomo de hidrgeno
HPLC: Cromatografa lquida de alta eficacia
IL-1: Interleuquina-1
LDL: Lipoprotena de baja densidad
LMH: Litros por metro cuadrado y hora
MDA: Malondialdehido
MF: Microfiltracin

v
MTT: Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolio
NADH: Nicotinamida adenin dinucletido fosfato de sodio
NBT: Azul de nitro-tetrazolio
NDPO2: 3,3-(1,4-naftaleno) dipropionato de sodio
NF: Nanofiltracin
NIST: National Institute of Standards and Technology
OI: smosis inversa
ORAC: Capacidad de absorcin de radicales de oxgeno
PA: Poliamida
PAN: Poliacrilonitrilo
PBS: Tampn fosfato salino
PES: Politersulfona
PI: Porcentaje de inhibicin
PMS: Metasulfato de fenandina
PS: Polisulfona
PTM: Presin transmembrana
PVFD: Fluoruro de polivilideno
R: Rechazo o retencin
RCV: Relacin de concentracin de volumen
SDS: Dodecilsulfato sdico
SET: Reaccin de transferencia de un electrn
TBA: cido tiobarbitrico
TBAR: Especies reactivas del cido tiobarbitrico
TBARS: ndice del cido tiobarbitrico
TBHQ: Terbutilhidroxiquinona
TEAC: Capacidad antioxidante equivalente al Trolox
TFC: Thin-Film Composite
TRAP: Parmetro antioxidante total de captura de radicales
Trolox: cido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- carboxlico
TPTZ: 2,4,6-tri(2-piridilo)-1,3,5-triazina
UF: Ultrafiltracin
UV: Ultravioleta
VIH: Virus de la inmunodeficiencia humana

vi
1. INTRODUCCIN
 Introduccin

1. INTRODUCCIN

El incremento de la demanda de los consumidores por aditivos e ingredientes de origen

natural ha incentivado la bsqueda de diferentes fuentes de compuestos bioactivos. Los
antioxidantes han sido uno de los aditivos que mayor atencin han suscitado en las ltimas
dcadas. La demanda de antioxidantes de origen natural ha aumentado a causa de una mayor
preocupacin por los riesgos para la salud a largo plazo y una valoracin negativa de los
consumidores de los antioxidantes de origen sinttico.

Numerosos estudios han confirmado la importancia de los antioxidantes naturales tanto en

sistemas alimentarios como biolgicos. En los primeros protegen contra el deterioro oxidativo
de grasas y aceites gracias a su capacidad para captar radicales libres, complejar metales o
actuar como agentes reductores, mientras que en los segundos, aunque no son necesarios
desde un punto de vista nutricional, los antioxidantes elevan los niveles de las defensas
endgenas y protegen contra el cncer y enfermedades degenerativas.

Los antioxidantes naturales se encuentran presentes en la biomasa vegetal como parte del
mecanismo de defensa contra la radiacin solar e infecciones. Actualmente se estn centrando
los esfuerzos en la bsqueda de tecnologas respetuosas con el medio ambiente que permitan
la extraccin y purificacin de compuestos antioxidantes a partir de materias primas vegetales.
Estos procesos son importantes desde el punto de vista tcnico, econmico y medioambiental.
Un proceso ideal debera ser no destructivo, eficaz y adecuado para la obtencin de grandes
cantidades de extracto con elevada capacidad antioxidante optimizando los recursos
utilizados. El uso de fluidos supercrticos presenta un gran potencial para la extraccin
selectiva de compuestos antioxidantes. La recuperacin y fraccionamiento de compuestos
activos presentes en una fase lquida puede llevarse a cabo eficazmente mediante tecnologa
de membranas.

El inters por los antioxidantes naturales alternativos a los sintticos ha originado una intensa
bsqueda de fuentes abundantes y biorrenovables de estos compuestos, mereciendo especial
atencin aqullas de origen residual. Los residuos agroindustriales y forestales, cuya
eliminacin supone un coste adicional, son fuentes econmicas de compuestos antioxidantes.
Estas materias primas tienen la ventaja adicional de estar ampliamente distribuidas y
disponibles y ocasionalmente aparecen geogrficamente concentradas, por lo que la
explotacin integral de las materias primas y la minimizacin de los residuos generados son
aspectos claves que merecen ser investigados.

3
Introduccin

Entre los residuos agroalimentarios abundantes en Galicia destaca el bagazo de uva. En el ao

2012 la produccin en Galicia de uva para vinificacin fue de ms de 200.000 TM (Ministerio
de Agricultura, Alimentacin y Medio Ambiente, 2013). Se estima que del procesado de las
uvas para la obtencin de vino se obtiene hasta un 13 % en peso de bagazo compuesto
fundamentalmente por el raspn, el hollejo las pepitas y residuos orgnicos y minerales
procedentes de las uvas (Torres y col., 2002). Esta cantidad se reduce tras ser procesada en
alcoholeras, siendo el bagazo agotado y la corriente residual obtenida, denominada vinazas,
los principales subproductos a revalorizar.

En Galicia el 69 % del suelo tiene un uso forestal (aproximadamente 2.040 miles de hectreas),
frente al 28,5 % dedicado a uso agrcola. Ms concretamente, en la provincia de Ourense la
superficie forestal representa un 80 % del total de la provincia con unas 21.000 ha dedicadas al
castao (Castanea sativa) (Bermdez Alvite y Touza Vzquez, 2000). Por otro lado, en Galicia
se producen aproximadamente 22 toneladas al ao de castaas, de las cuales 7.000 toneladas
son procesadas por la industria alimentaria para producir derivados como el marron glac o
crema de castaa (Vzquez y col., 2009). Como consecuencia de la actividad forestal se
generan residuos como hojas y erizos cuyo tratamiento principal es la quema o el
amontonamiento, que pueden suponer un peligro potencial en forma de plagas o incendios
forestales, por lo que el desarrollo de aplicaciones alternativas para estos residuos podra
contribuir a su revalorizacin y a una utilizacin integral de los recursos disponibles.

1.1. ANTIOXIDANTES NATURALES

En las ltimas dcadas el consumo de productos percibidos como naturales por la sociedad ha
aumentado. Adems, el uso de determinados antioxidantes sintticos como BHA
(butilhidroxianisol), BHT (butilhidroxitolueno) o TBHQ (terbutilhidroxiquinona) ha sido
cuestionado por sus posibles efectos adversos sobre la salud. Se ha generado as una
tendencia a la sustitucin de los aditivos sintticos por otros de origen natural, considerados
por los consumidores como una alternativa ms segura y saludable. Actualmente se estn
realizando diversas investigaciones dirigidas a la bsqueda de productos naturales con
actividad antioxidante que permitan sustituir los compuestos sintticos (Balasundram y col.,
2006). Adems, existen evidencias epidemiolgicas y clnicas que relacionan una dieta rica en
antioxidantes con un menor riesgo de enfermedades degenerativas, por lo que la
incorporacin de estos antioxidantes naturales puede suponer un beneficio sobre la salud de
los consumidores al mismo tiempo que ayuda en la estabilizacin del alimento.

4
 Introduccin

Sin embargo no debe darse por supuesta la inocuidad de los compuestos naturales, siendo
necesario el estudio de los posibles efectos txicos de dichas sustancias aisladas y aadidas
como sustancias puras a los alimentos (Pokorny, 2007).

1.1.1. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

Las especies reactivas de oxgeno (ERO), que incluyen radicales libres tales como superxido,
hidroxilo o peroxilo y otras especies no radicalarias como el perxido de hidrgeno, pueden
provocar daos permanentes en los componentes de la clula mediante procesos oxidativos
(Perjs y col., 2012). Estas especies reactivas pueden causar dao oxidativo en biomolculas
como el ADN o las protenas, jugando un papel importante en la aparicin de diabetes, cncer
u otras enfermedades (Halliwell y Gutteridge, 1989; Stadtman, 2006). Adems, pueden inducir
la peroxidacin de lpidos provocando la aparicin de enranciamiento y disminuyendo la vida
til de los alimentos.

De acuerdo con una definicin clsica, un antioxidante es cualquier sustancia que, presente en
pequeas concentraciones en comparacin con el sustrato oxidable (como lpidos, protenas,
ADN o carbohidratos), retrasa o previene significativamente la oxidacin de dicho sustrato
(Halliwell y Gutteridge, 1989). En los sistemas alimentarios, los antioxidantes se utilizan para
inhibir la peroxidacin lipdica manteniendo as sus cualidades nutricionales y organolpticas,
mientras que en los sistemas biolgicos, por lo general junto con los antioxidantes endgenos
(como las enzimas, vitaminas, protenas y otros), ayudan a prevenir o retrasar el estrs
oxidativo inducido por los radicales libres.

El mecanismo bsico de la peroxidacin lipdica (Frankel, 2005; Pokorny, 1991; Laguerre y col.,
2007) se presenta en la Figura 1.1. Durante la etapa de iniciacin, se induce la formacin del
radical lipdico por las ERO en presencia de iniciadores tales como calor, luz o iones metlicos.
Una vez formado el radical lipdico, la peroxidacin progresa a un ritmo elevado mediante una
reaccin en cadena entre radicales hasta que la oxidacin finaliza tras la formacin de un
compuesto no radicalario estable.

5
Introduccin

Iniciacin
Formacin deradicales:
Formacin de radicales: peroxil(RO
peroxilo (RO ),), alcoxi ) o) alquilo
(RO or alquil ) )
(R(R
2 2 alcoxi (RO
Radical lipdico

Iniciacin Propagacin
R + O2 RO 2
Lpido insaturado RO 2 + RH ROOH + R
Propagacin RO + RH ROH + R
ROOH RO + OH
2 ROOH RO 2 + RO + H2O

Terminacin
2 R
R + RO 2 Productos estables
Perxido lipdico Radical perxido lipdico 2 RO 2

Figura 1.1: Mecanismo bsico de la oxidacin lipdica.

Los compuestos antioxidantes pueden actuar a distintos niveles dentro de esta secuencia
oxidativa: captando las especies responsables de la iniciacin de la oxidacin, interrumpiendo
la propagacin de la cadena de reacciones, mediante la inhibicin del oxgeno singlete,
actuando como agentes reductores, como agente complejante de metales, inhibiendo enzimas
oxidativas (especialmente lipoxigenasas) o induciendo la actividad de sistemas biolgicos
antioxidantes.

En funcin de la forma en que inhiben o retardan la oxidacin, los antioxidantes se pueden

clasificar en dos grupos: antioxidantes primarios y antioxidantes secundarios. Los antioxidantes
primarios reaccionan directamente con los radicales libres convirtindolos en productos
estables. La mayora de estos antioxidantes actan mediante la donacin de un tomo de
hidrgeno, y se consumen durante el perodo de iniciacin (Gordon, 2001). Los antioxidantes
secundarios actan impidiendo o disminuyendo la formacin de los radicales libres mediante
diversos mecanismos, entre ellos: complejando iones metlicos que catalizan las reacciones de
oxidacin, captando oxgeno, absorbiendo radiacin ultravioleta, inhibiendo enzimas o
descomponiendo hidroperxidos en especies no radicalarias.

A menudo los antioxidantes actan simultneamente mediante varios mecanismos mixtos o

cooperativos. Adems, un antioxidante puede comportarse como un prooxidante,
dependiendo de la estructura, entorno qumico y condiciones ambientales; por ejemplo,
ciertas molculas tpicamente consideradas por su accin antioxidante como los flavonoides,
-tocoferol o cido ascrbico pueden actuar como prooxidantes en presencia de iones de
metales de transicin; mientras que otra familia de antioxidantes tpicamente empleados,
como los carotenoides muestran propiedades prooxidantes a elevada presin de oxgeno
(Galati y OBrien, 2004).

6
 Introduccin

1.1.1.1. MEDIDA DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

En la actualidad no existe un nico mtodo estandarizado, sencillo y fiable que permita

determinar la capacidad antioxidante de un compuesto. Adems del mecanismo de reaccin,
la capacidad antioxidante de un compuesto se ve influenciada por numerosos factores tales
como el tipo de sustrato, medio e iniciadores, las condiciones de oxidacin, las propiedades de
reparto del antioxidante entre las fases lipdica y acuosa, as como por el mtodo experimental
empleado (Frankel y Meyer, 2000; Gordon, 2001; Yanishlieva, 2001; Antolovich y col., 2002;
Decker y col., 2005; Fraga y col., 2014; Glin, 2012).

Los resultados obtenidos mediante diferentes ensayos pueden llegar a ser contradictorios por
lo que se hace necesaria la combinacin de distintos mtodos de medida en la determinacin
de la capacidad antioxidante. Algunas recomendaciones en la determinacin in vitro de la
capacidad antioxidante de un compuesto incluyen:

- Identificar y cuantificar los compuestos activos.

- Evaluar la proteccin contra la oxidacin en alimentos o sistemas fisiolgicos modelo
en las mismas condiciones fsico-qumicas que el sistema real que debe ser protegido.
- Entender detalladamente el mecanismo de oxidacin.
- Medir tanto los productos iniciales como secundarios.
- Utilizar concentraciones de reactivo a niveles que resulten fisiolgicamente relevantes.

Adems, deben considerarse los niveles de oxidacin bajos y la posibilidad de modificaciones

del mecanismo en condiciones de oxidacin acelerada (Frankel y Meyer, 2000; Frankel, 1993;
Gordon, 2001; Antolovich y col., 2002; Schlesier y col., 2002; Collins, 2005; Decker y col., 2005;
Huang y col., 2005; Prior y col., 2005; Choe y Ming, 2006, Frankel y Finley, 2008).

En funcin de las reacciones que tienen lugar, los mtodos antioxidantes pueden clasificarse
en dos grupos: reacciones de transferencia de un tomo de hidrgeno (HAT) y reacciones de
transferencia de un electrn (SET) (Huang y col., 2005).

Los mtodos basados en HAT miden la capacidad del antioxidante para captar radicales libres
mediante la donacin de un tomo de hidrgeno. En general, estos mtodos incluyen una
molcula oxidable indicadora, un generador de radicales libres y un antioxidante. Este tipo de
reacciones son independientes del pH y del disolvente y son, en general, bastante rpidas
(Prior y col., 2005; Huang y col., 2005). Dentro de este tipo de mtodos se encuentran ensayos

7
Introduccin

como ORAC (Oxygen Radical Absorption Capacity) o TRAP (Total Radical-Trapping Antioxidant
Parameter).

En los mtodos SET, la capacidad del antioxidante se basa en su capacidad para reducir un
compuesto oxidante, que cambiar de color al reducirse. El grado de variacin de color ser
proporcional a la concentracin del antioxidante en el medio de reaccin. Este tipo de
reacciones son dependientes del pH y en general bastante lentas (Prior y col., 2005; Huang y
col., 2005). Dentro de los ensayos basados en SET se incluyen el mtodo de Folin-Ciocalteau,
DFPH (2, 2- difenilo, 1-picrilhidrazilo) o FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power).

1.1.2. COMPUESTOS FENLICOS

1.1.2.1. ESTRUCTURA Y CLASIFICACIN

Los compuestos fenlicos constituyen uno de los grupos de antioxidantes naturales ms

abundantes y ampliamente distribuidos del reino vegetal, con ms de 8000 estructuras
conocidas. Son productos del metabolismo secundario de las plantas y se encuentran en
races, tallos, troncos, hojas y frutos, donde desarrollan funciones diversas que abarcan desde
la proteccin frente a influencias externas (radiacin UV, mordeduras de animales y ataques
fngicos y vricos) a los mecanismos de polinizacin, el olor, el color y la tolerancia al fro
(Stevenson y Hurst, 2007).

Estos compuestos poseen un anillo aromtico unido a uno o ms grupos hidroxilo y otros
derivados funcionales como steres, metilsteres o glucsidos. La naturaleza de estos
compuestos vara desde molculas simples, como los cidos fenlicos, hasta compuestos
altamente polimerizados, como los taninos. Su actividad antioxidante se atribuye a su facilidad
para ceder tomos de hidrgeno desde un grupo hidroxilo aromtico a un radical libre y a la
posibilidad de deslocalizacin de cargas en el sistema de dobles enlaces del anillo aromtico
(Duthie y col., 2003). Los compuestos fenlicos poseen adems una estructura qumica ideal
para captar iones metlicos, principalmente hierro y cobre) y, por tanto, para inhibir la
formacin de radicales libres a travs de reacciones de Fenton (Rice-Evans y col., 1997). Los
polifenoles se encuentran en las plantas en forma conjugada con uno o ms residuos de azcar
unidos a los grupos hidroxilo, aunque en algunos casos se pueden producir uniones directas
entre una molcula de azcar y un carbono aromtico. Los azcares asociados a los polifenoles
pueden ser monosacridos, disacridos o incluso oligosacridos. Los compuestos a los que se
encuentran unidos con ms frecuencia son glucosa, galactosa, arabinosa, ramnosa, xilosa y

8
 Introduccin

cidos glucournico y galactournico. Tambin pueden encontrarse unidos a cidos

carboxlicos, cidos orgnicos, aminas, lpidos y a otros compuestos fenlicos (Bravo, 1998).

En funcin de su estructura, los compuestos fenlicos se clasifican en cidos fenlicos,

flavonoides, estilbenos, taninos y lignanos (Ignat y col., 2011).

cidos fenlicos: En su estructura bsica contienen un grupo carboxilo. Se distinguen dos

familias distintas de cidos fenlicos (Figura 1.2): la serie benzoica (si el grupo carboxilo est
directamente enlazado al anillo aromtico) y la serie cinmica (si el grupo carboxlico est
enlazado a l a partir de un sustituyente 2-propanilo).

SERIE BENZOICA R1 R2 Compuesto

H H cido pp-hidroxibenzoico
-hidroxibenzoico
OH H cido vanllico
OH OH cido sirngico
OCH 3 H cido glico
OCH 3 OCH 3 cido sirngico

SERIE CINMICA R1 R2 Compuesto

H H cido p-cumrico
OH H cido cafeico
OCH 3 H cido ferlico

Figura 1.2: Estructura qumica de los principales cidos fenlicos.

Dentro de la serie benzoica, se encuentran abundantemente en el mundo vegetal cidos tales

como vanllico y p-hidroxibenzoico. De entre la serie cinmica los cidos ms comunes son el
cafeico, ferlico, sinpico y p-cumrico.

Flavonoides: Los flavonoides constituyen el grupo de compuestos fenlicos ms diverso y

ampliamente distribuido en las plantas. Su estructura bsica consta de dos grupos fenilo (A y
B) unidos por un puente de tres carbono formado un anillo heterocclico oxigenado (anillo C)
(Figura 1.3)

9
Introduccin

Figura 1.3: Estructura bsica de un flavonoide.

En funcin de los grados de oxidacin e insaturacin del anillo heterocclico se pueden

diferenciar varias clases de flavonoides y dentro de cada clase se pueden establecer
clasificaciones en base a la naturaleza y nmero de los sustituyentes unidos a los anillos
(Robards y col., 1999). Los flavonoides se subdividen habitualmente en flavonoles, flavonas,
flavanonas, isoflavonas, flavanoles y antocianidinas.

Flavonoles: Son los flavonoides ms abundantes en los alimentos, especialmente en el

vino tinto, las cebollas, la escarola y el brcoli. Los principales representantes son
quercetina y kaempferol (Figura 1.4).

R1 R2 Compuesto
H H Quercetina
OH OH Miricetina
H H Kaempferol
Kaemferol

Figura 1.4: Estructura qumica de los flavonoles.

Flavonas: Se encuentran principalmente en el perejil y el apio. Las ms representativas

son luteolina y apigenina (Figura 1.5).

R1 Compuesto

H Apigenina

OH Luteolina

Figura 1.5: Estructura qumica de las flavonas.

10
 Introduccin

Flavanonas: Estn presentes en frutas ctricas, tomates y plantas aromticas. Las ms

abundantes son naringenina y hesperidina (Figura 1.6).

R1 R2 Compuesto
R1 R2 Compuesto
H OH Naringenina
H OH Naringenina
OH H Hesperitina
OH H Hesperidina

Figura 1.6: Estructura qumica de las flavanonas.

Isoflavonas: Se encuentran casi exclusivamente en plantas leguminosas especialmente

en la soja. Los ms importantes son genistena y genistina (Figura 1.7).

R1 R2 Compuesto

OH H Genistena

H OCH 3 Genistina

Figura 1.7: Estructura qumica de las isoflavonas.

Flavanoles: Pueden presentarse en forma monomrica (catequinas) o en forma

polimrica (proantocianidinas). Las catequinas son muy abundantes en la fruta pero
las principales fuentes son el t verde, el chocolate y el vino. Las proantocianidinas,
tambin conocidas como taninos condensados, son dmeros, oligmeros y polmeros
de catequinas con uniones C4 y C8 y pueden hallarse en bebidas como el t, el vino y la
cerveza, en el chocolate y en frutas como la uva, el melocotn y la manzana (Figura
1.8).

11
Introduccin

R1 R2 Compuesto

H H Catequina

H OH Catequina-3-galato

R1 R2 Compuesto

H H Epicatequina

H OH Epicatequina-3-galato

Figura 1.8: Estructura qumica de los flavanoles.

Antocianidinas: Son pigmentos responsables de la coloracin de las flores y frutos de

ciertos vegetales. Se encuentran en el vino tinto, ciertas variedades de cereales y
vegetales como la cebolla, guisantes, calabaza, pero sobre todo en frutas como
cerezas, frambuesas, moras o ciruelas (Figura 1.9).

R1 R2 Compuesto

OH H Cianidina

OCH 3 OCH 3 Malvidina

OCH 3 OH Petunidina

Figura 1.9: Estructura qumica de las antocianidinas.

Taninos: Son compuestos de alto peso molecular y constituyen el tercer grupo ms importante
de compuestos fenlicos. Los taninos presentes en las plantas se subdividen en taninos
hidrolizables y taninos condensados o proantocianidinas. Dentro de los taninos hidrolizables se
encuentran los galotaninos que hidrolizan en glucosa y cido glico, y los elagitaninos que
contienen cido elgico. Por su parte, los taninos condensados ms estudiados son polmeros
de unidades flavan-3-ol (-)epicatequina y (+)-catequina (Figura 1.10). Las algas contienen
florotaninos, formados por la polimerizacin del floroglucinol (Ignat y col., 2011).

12
 Introduccin

Figura 1.10: Estructura qumica de una procianidina.

Lignanos: Se forman mediante la dimerizacin oxidativa de dos unidades de fenilpropano y se

encuentran ampliamente distribuidos en plantas, aunque se presentan en pequea cantidad
en alimentos (Figura 1.11).

Figura 1.11: Estructura qumica de un lignano.

Estilbenos: Estas estructuras se encuentran en un gran nmero de especies vegetales

localizndose principalmente en la mdula del tronco de especies arbreas como el pino o el
eucalipto. La forma molecular ms extendida de este grupo es el resveratrol, muy
caracterstico de las familias Pinaceae y Vitaceae (Figura 1.12).

Figura 1.12: Estructura qumica del resveratrol.

1.1.2.1. RELACIN ESTRUCTURA - ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

De todas las propiedades que presentan los compuestos fenlicos, su capacidad antioxidante
es probablemente la ms estudiada. Dicha actividad est fuertemente relacionada con su
estructura qumica y es un factor determinante en su capacidad para actuar como inhibidores

13
Introduccin

de la peroxidacin lipdica, atrapando directamente a los radicales libres, o bien complejando

iones de metales de transicin que catalizan la formacin de especies radicalarias (Huang y
col., 2005; Balasundran y col., 2006; Munin y Edwards-Lvy, 2011).

La capacidad antioxidante de los cidos fenlicos depende del nmero y posicin de los grupos
hidroxilo en relacin al grupo carboxilo funcional. A medida que aumenta el nmero de
sustituyentes hidroxilo aumentar la capacidad antioxidante. As, el cido glico, con tres
sustituyentes -OH presenta una alta capacidad antioxidante, mientras que la sustitucin de los
grupos hidroxilo en las posiciones 3 y 5 por grupos metoxilo, como ocurre en el cido sirngico,
disminuye su actividad (Balasundram y col., 2006). Los cidos hidroxicinmicos presentan
actividades mayores que los cidos hidroxibenzoicos. Esto puede deberse a que los grupos
CH=CH-COOH proporcionan una mayor capacidad para donar tomos de H y estabilizar el
radical que el grupo COOH (Rice-Evans y col., 1997).

En el caso de los flavonoides, cuyas estructuras moleculares son ms complejas, la relacin

estructura-actividad antioxidante es ms complicada. En general, la capacidad antioxidante de
los flavonoides depender tanto de su estructura fundamental como de la presencia y posicin
de los distintos sustituyentes en los anillos B y C.

El nmero y posicin de grupos OH influye de manera notable en la capacidad antioxidante

de los flavonoides. Los grupos hidroxilo en el anillo B pueden donar con facilidad tomos de
hidrgeno y electrones a distintos ROS y NOS (especies reactivas de oxgeno y nitrgeno)
dando lugar a un radical flavonoide muy estable. Adems, la capacidad estabilizadora de
radicales libres se incrementa al aumentar el nmero de grupos OH en su estructura (Cao y
col., 1997) y especialmente la formacin de un grupo catecol (dos grupos OH en las
posiciones 3, 4) aumenta considerablemente la capacidad antioxidante mediante
deslocalizacin electrnica (Amid y col., 2003). Los flavonoides que poseen grupos hidroxilo en
las posiciones 3, 4 y 5 (grupo pirogalol) presentan una actividad antioxidante ms elevada
que aqullos con un nico grupo hidroxilo (Van Acker y col., 1996). Adems, la capacidad
antioxidante de los flavonoides se ve incrementada por la presencia de un grupo OH en la
posicin 3 del anillo C (Pietta, 2000).

La presencia de un doble enlace en las posiciones 2 y 3 combinado con un grupo 4-oxo en el

anillo C, favorece la actividad antioxidante del flavonoide mediante deslocalizacin electrnica
(Pietta, 2000). Del mismo modo, su capacidad antioxidante aumenta con la presencia del
doble enlace en las posiciones 2 y 3 junto con un grupo 3-OH (Van Acker y col., 1996), mientras

14
 Introduccin

que la sustitucin del grupo 3-OH produce un aumento de la torsin que conlleva una prdida
de la capacidad antioxidante (Seeram y Nair, 2000).

En muchos casos los flavonoides aparecen unidos a azcares, generalmente en la posicin C3 y

en menor medida en la C7 del anillo A. La formacin de estos glicsidos disminuye de manera
importante la actividad antioxidante (Heim y col., 2002).

1.1.2.2. ACTIVIDAD BIOLGICA

A pesar de que cierto nivel fisiolgico es necesario para la regulacin de las funciones celulares
(Wang y Yi, 2008), una excesiva produccin de ROS y otros radicales libres est asociada con el
envejecimiento y la aparicin de numerosas afecciones como cncer, diabetes, enfermedades
hepticas, envejecimiento, artritis, SIDA, degeneracin muscular, enfermedades autoinmunes,
inflamatorias, cardiovasculares o neurodegenerativas. Los compuestos antioxidantes, capaces
de mantener el nivel de radicales libres por debajo de concentraciones perjudiciales, han sido
propuestos como una terapia prometedora en la prevencin y tratamiento de dichas
enfermedades (Seifried y col., 2007). Distintos estudios epidemiolgicos han confirmado que
los compuestos fenlicos pueden ejercer una actividad preventiva frente a distintas
enfermedades infecciosas y degenerativas.

El efecto protector de los antioxidantes contenidos en la dieta frente a enfermedades

cardiovasculares ha sido recogido en diversas publicaciones. Los compuestos polifenlicos
naturales poseen propiedades antioxidantes, vasodilatadoras y antihipertensivas (Deng y col.,
2013; Roy y col., 2010; Ullah y Khan, 2008; Ghosh, 2005; Depeint y col., 2002; Erlund, 2004),
aunque en algunos casos se han encontrado resultados contradictorios (Seifried y col., 2007).
Diversos estudios epidemiolgicos sugieren que una elevada ingestin de compuestos
flavonoides puede reducir el riesgo de mortalidad por enfermedad coronaria hasta en un 65 %
(Petti y Scully, 2009), adems podra tener efectos favorables sobre la mejora de la
aterosclerosis (Li y col., 2006; Loke y col., 2010). Se ha confirmado que algunos compuestos
como -tocoferol y -caroteno, inhiben la oxidacin de LDL (lipoprotena de baja densidad) y el
proceso aterosclertico (Odeh y Cornish, 1995), mientras que algunos tocoferoles muestran un
aumento de la respuesta inmune y la regulacin de la agregacin plaquetaria (Weber y
Rimbach, 2002). Los polifenoles procedentes de extractos de uva y el vino relajan la funcin
endotelial (Shen y col., 2006), y el resveratrol (Szewczuk y Penning, 2004; Thuc y col., 2012), las
antocianidinas o la vitamina E (Violi y col., 2006) pueden ejercer proteccin contra
enfermedades coronarias.

15
Introduccin

Estudios epidemiolgicos sugieren una asociacin positiva entre una dieta rica en frutas y
verduras y una menor incidencia de cncer (Ames y col., 1993; Ren y col., 2003; Pan y col.,
2008; Tanaka y Sugie, 2008). Varios antioxidantes presentes en la dieta estn siendo objeto de
investigacin por sus propiedades contra el cncer, incluyendo la curcumina (Tsvetkov y col.,
2005; Maheshwari y col., 2006), la oleuropena (Bonfili y col., 2008), antocianinas (Diaconeasa
y col., 2015) o la tangerina, la nobiletina, y el resveratrol (Narayanan, 2006). El t verde inhibe
la incidencia y multiplicacin de tumores en distintos rganos, y se han llevado a cabo ensayos
clnicos para comprobar su actividad (Ping, 2008; Davalli y col., 2012). Los flavonoides pueden
reducir el riesgo de diversos tipos de cncer (Kanadaswami y col., 2005), incluyendo de mama
y prstata (Hodek y col., 2002), de intestino (Hoensch y Kirch, 2005) y de piel (Singh y Agarwal,
2002), mientras que el cido glico puede prevenir el cncer de colon (Giftson y col., 2010). El
licopeno ha mostrado actividad anticarcinognica tanto in vitro como in vivo (Bhuvaneswari y
Nagini, 2005) y diversos taninos han inducido apoptosis de clulas tumorales de cncer oral
(Ding y col., 2013).

El sistema nervioso, rico en cidos grasos y en hierro, es vulnerable a la oxidacin inducida por
la generacin de radicales libres (Ullah y Khan, 2008). Los niveles elevados de dao oxidativo
pueden dar lugar a la progresin de enfermedades neurodegenerativas (Philips y col., 1993).
Los polifenoles son agentes activos en neuroproteccin debido a su capacidad para influir y
modular varios procesos celulares y se han realizado estudios epidemiolgicos, que indican
que los antioxidantes dietticos pueden limitar la incidencia de trastornos neurodegenerativos
(Morris, 2002). Algunos compuestos fenlicos, tales como el galato de epigalocatequina, la
curcumina, la naringenina, extractos de arndanos y Scutellaria (Ullah y Khan, 2008) o
extractos de t verde (Bastianetto y col., 2006), han mostrado resultados prometedores en
este sentido.

Se ha encontrado que los flavonoides y sus derivados inhiben el crecimiento y desarrollo del
VIH (Critchfield y col., 1996; Zhang y col., 2005). Los compuestos fenlicos, incluyendo
resveratrol o flavonoides (Lomnitski y col., 2000; Ghosh, 2005; Das y Rosazza, 2006; Hodek,
2002), presentan actividad antiinflamatoria, y actividad antialrgica (Ghosh, 2005; Das y
Rosazza, 2006; McKay y Blumberg, 2006; Hodek y col., 2002; Essafi-Benkhadir y col., 2012; Li y
col., 2014; Teixeira y col., 2014).

16
 Introduccin

1.2. EXTRACCIN Y PURIFICACIN DE COMPUESTOS FENLICOS

ANTIOXIDANTES

La extraccin de compuestos fenlicos a partir de materias primas de origen vegetal se ha

llevado a cabo habitualmente mediante el empleo de disolventes orgnicos. Estos procesos
presentan numerosas limitaciones tales como: elevado coste energtico, necesidad de grandes
volmenes de disolvente, altas temperaturas de extraccin perjudiciales para la obtencin de
compuestos termolbiles, baja selectividad y presencia de disolvente en soluto (Oliveira y col.,
2013). Sin embargo, en comparacin con este mtodo de extraccin convencional, el uso de
fluidos supercrticos puede suponer una alternativa eficaz para la extraccin y fraccionamiento
de compuestos naturales con propiedades antioxidantes. Con esta tecnologa se puede limitar
el tiempo de extraccin y conseguir una mejor selectividad de la separacin, sin la necesidad
de emplear disolventes orgnicos. El dixido de carbono, uno de los fluidos supercrticos ms
utilizado, es un disolvente no txico y barato, adecuado para la extraccin de compuestos
apolares. Combinado con pequeas cantidades de un modificador polar permite la separacin
de compuestos polares, como los de naturaleza fenlica. La alta selectividad del proceso, las
bajas temperaturas de extraccin, la ausencia de luz y oxgeno y la ausencia de disolvente en el
extracto, son caractersticas del proceso que conllevan una mejora del producto final.

La utilizacin de membranas para la recuperacin de compuestos bioactivos presentes en

corrientes acuosas es un rea de trabajo de inters creciente. La concentracin de
componentes bioactivos extrados a partir de materias primas de origen natural se lleva a cabo
tradicionalmente mediante procesos que implican altas temperaturas y alto consumo de
energa. La tecnologa de membranas se presenta como una alternativa a procesos
convencionales de separacin y concentracin de compuestos biolgicamente activos a partir
de medios lquidos, debido a ventajas tales como el empleo de bajas temperaturas, ausencia
de transicin de fase o bajo consumo energtico (Xu y Wang, 2005; Li y Chase, 2010;
Murakami y col., 2011).

1.2.1. FLUIDOS SUPERCRTICOS

Los fluidos supercrticos (FSC) empiezan a cobrar importancia en las industrias alimentarias,
farmacutica y nutracutica, ofreciendo productos de alta pureza y calidad a la vez que
mantienen sus propiedades activas y el carcter de producto natural. Este hecho es de
particular importancia en el contexto actual caracterizado por normas cada vez ms

17
Introduccin

restrictivas en la produccin de aditivos y por la demanda de los consumidores de productos

de origen natural.

La extraccin con FSC puede resultar ms efectiva que la extraccin convencional con
disolventes en la obtencin selectiva de compuestos de naturaleza antioxidante a partir de
fuentes de origen natural. La posibilidad de trabajar a temperaturas moderadas previene la
degradacin trmica de compuestos termolbiles y la ausencia de luz previene las reacciones
de oxidacin.

Las principales desventajas de esta tecnologa incluyen la baja solubilidad de algunas

molculas en el FSC, la falta de datos de solubilidad de algunos compuestos, lo que dificulta la
prediccin de las condiciones de equilibrio, y el empleo de tecnologas de alta presin que
eleva los costes de capital y mantenimiento.

El estado fsico de un compuesto puro viene definido por tres variables: presin (P),
temperatura (T) y volumen (V). La relacin que existe entre estas variables est definida por
ecuaciones de estado que permiten determinar en qu estado se encuentra la sustancia:
slido, lquido, o vapor y su representacin se denomina diagrama de fases.

En un diagrama de fases, como el que se muestra en la Figura 1.13 se observan regiones que
corresponden a un solo estado de la materia y lneas a lo largo de las cuales la sustancia se
encuentra en equilibrio entre dos fases. En particular, la lnea de vapor-lquido representa la
curva de presin de vapor que comienza en el punto triple, donde coexisten las tres fases
slido-lquido-vapor y termina en el punto crtico.

LQUIDO
PRESIN
FLUIDO
Punto crtico
SUPERCRTICO

Punto triple
SLIDO

GAS
VAPOR

TEMPERATURA

Figura 1.13: Diagrama de fases de un compuesto puro.

18
 Introduccin

La naturaleza del punto crtico se puede entender siguiendo los cambios de las propiedades de
los fluidos a lo largo de la curva de presin de vapor. A medida que la temperatura aumenta, la
densidad de la fase lquida disminuye y la de la fase vapor aumenta debido a la mayor presin
de vapor. Finalmente, ambos valores de densidad convergen en el punto crtico. Por encima de
la temperatura crtica ya no es posible diferenciar los estados lquido y vapor. Un fluido FSC es
todo compuesto a una temperatura y presin por encima del punto crtico.

En la regin supercrtica los compuestos poseen propiedades intermedias entre las de los
gases y los lquidos. En la Tabla 1.1 se muestran los valores tpicos de diferentes propiedades
fsicas y de transporte para los estados lquido, gaseoso y supercrtico.

Tabla 1.1: Valores promedio de las propiedades fsicas y de transporte ms importantes de lquidos, gases y
fluidos supercrticos (Pereda y col., 2008) .

PROPIEDAD LQUIDO (Tamb) FSC (Tc, Pc) GAS (Tamb)

3
Densidad (kg/m ) 600-1600 200-500 0,6-2

Viscosidad (mPas) 0,2-3 0,01-0,03 0,01-0,3

Conductividad trmica (W/mK) 0,1-0,2 0,05-1 0,01-0,025

6 2
Difusividad (10 m /s) 0,0002-0,002 0,07 10-40

El gran atractivo que presentan los fluidos supercrticos para ser utilizados como agentes
extractores radica en que poseen densidades similares a las de los lquidos, y por tanto
propiedades disolventes similares, pero a la vez su viscosidad es mucho menor, lo que hace
que los coeficientes de difusin de los solutos en un fluido supercrtico sean mucho mayores
que en un disolvente lquido. As pues, cabe esperar que la extraccin con fluidos supercrticos
sea, en primer lugar, tan completa como la llevada a cabo con disolventes lquidos debido a
que ambos presentan propiedades disolventes similares y, en segundo lugar, ms rpida y
eficaz ya que su baja viscosidad favorece los fenmenos de transferencia de materia y la
penetrabilidad en los poros de la matriz de la muestra.

Adems, la densidad de los fluidos supercrticos es extremadamente sensible a los cambios de

presin y temperatura, en especial en las inmediaciones del punto crtico, donde cambios
pequeos en la presin y/o temperatura se traducen en cambios significativos en la densidad,
constante dielctrica y capacidad solvatante del fluido, permitiendo la posibilidad de llevar a
cabo la extraccin selectiva de distintos compuestos.

19
Introduccin

Existe una gran variedad de compuestos que se pueden utilizar como fluidos supercrticos. En
la prctica los criterios de eleccin del fluido supercrtico son los habituales en un proceso de
extraccin convencional: selectividad, solubilidad del soluto, baja viscosidad y no reactividad.
Adems es deseable un producto no inflamable, no txico y barato.

En la Tabla 1.2 se muestran los compuestos ms utilizados como fluidos supercrticos con sus
valores de presin crtica (Pc), temperatura crtica (Tc) y densidad crtica (c).

Tabla 1.2: Fluidos supercrticos ms utilizados y propiedades crticas de los mismos (Poling y col., 2001).

3
Compuesto Tc (C) Pc (MPa) c (g/cm )

Dixido de carbono 31 7,38 0,469

Amonaco 133 11,35 0,236

Agua 374 22,12 0,323

xido nitroso 36 7,24 0,452

Metano -82 45,60 0,169

Etano 32 4,88 0,203

Propano 97 4,25 0,217

Pentano 197 3,37 0,237

Etileno 9 5,04 0,218

Benceno 289 4,89 0,302

Tolueno 319 4,10 0,292

Metanol 240 8,09 0,272

Etanol 241 6,14 0,276

Acetona 235 4,70 0,279

n-Hexano 234 3,02 0,234

Isopropanol 234 4,76 0,271

El dixido de carbono supercrtico es el disolvente ms comn para la extraccin de

compuestos naturales. Adems de las propiedades favorables que presenta el dixido de
carbono (no txico, no inflamable, barato, inerte, no contaminante) su comportamiento de

20
 Introduccin

fases y otras propiedades termofsicas son bien conocidas. Posee una presin crtica moderada
(73,8 bar) y una baja temperatura crtica (31 C). Estas condiciones relativamente suaves
previenen la degradacin trmica de los productos naturales, preservando la integridad de
compuestos termolbiles. Permite obtener altas concentraciones de extracto y, dado que el
CO2 pasa a estado vapor tras la despresurizacin, no deja residuos en el producto obtenido.

Su mayor inconveniente est asociado a su baja polaridad, que lo hace inadecuado para la
extraccin de sustancias polares. Sin embargo, la adicin de un modificador de naturaleza
polar (como agua, etanol o metanol) puede mejorar la extraccin de este tipo de compuestos.

1.2.1.1. PROCESO DE EXTRACCIN SUPERCRTICA

La extraccin slido-lquido es una operacin heterognea multicomponente que implica la

transferencia no estacionaria de solutos desde la matriz slida hasta el fluido disolvente. Las
materias primas de origen vegetal contienen multitud de solutos que pueden ser extrados
simultneamente dependiendo de su localizacin en la matriz (superficie externa, poros,
vacuolas, etc.) y de sus coeficientes de particin. La extraccin supercrtica engloba una serie
de etapas consecutivas: a) el transporte de las molculas de CO2 desde la disolucin hasta la
superficie externa del slido, b) la penetracin y difusin hacia el interior de slido, c) la
solubilizacin de los solutos, d) el trasporte de stos a travs del slido y finalmente e) su
transporte desde la superficie externa del slido hacia la disolucin (Pereira y Meireles, 2010).

El grado de extraccin de los solutos depender de la resistencia a la transferencia de masa

externa, la difusividad del soluto en el slido, la solubilidad del soluto en el disolvente y de las
uniones entre los solutos y la matriz slida.

Un proceso de extraccin con FSC implica dos pasos bsicos: una primera etapa de extraccin
de los solutos de la matriz slida solubles en el FSC y una segunda etapa de separacin de
dichos solutos mediante expansin y eliminacin del disolvente.

El diseo bsico de un proceso de extraccin supercrtica consistira en un compresor (o una

bomba si el fluido es introducido en el sistema en estado lquido), un extractor donde se
introduce la matriz slida, uno o ms separadores e intercambiadores de calor y sistemas de
medida y control de parmetros (Figura 1.14). El FSC se alimenta al extractor y se distribuye
uniformemente a travs del lecho fijo formado por el sustrato slido. El FSC fluye de manera
continua a travs del extractor disolviendo los compuestos solubles. A la salida del extractor
los solutos se separan del disolvente mediante un descenso de presin. La utilizacin de

21
Introduccin

distintos separadores en serie, operando a distintas condiciones de presin y temperatura,

permitira la separacin fraccionada de los solutos extrados.

EXTRACTOR

SEPARADORES

Fraccin 1 Fraccin 2 Fraccin 3

Figura 1.14: Diagrama de flujo general de un proceso de extraccin con FSC.

1.2.1.2. ESQUEMAS PROPUESTOS EN EXTRACCIN CON FLUIDOS SUPERCRTICOS DE

COMPUESTOS DE NATURALEZA ANTIOXIDANTE

El proceso de extraccin supercrtica puede optimizarse para extraer distintos compuestos a

partir de una matriz slida de manera selectiva. De este modo, se han propuesto diferentes
configuraciones operacionales en la extraccin mediante FSC de compuestos bioactivos a
partir de materias primas de origen vegetal:

a) Etapa de extraccin seguida de separacin fraccionada

La extraccin de compuestos fenlicos con actividad antioxidante mediante FSC requiere la

utilizacin de elevadas presiones, y en estas condiciones se puede provocar la coextraccin de
otras fracciones como aceites esenciales o ceras. Las ceras y otros compuestos parafnicos
estn localizados en la superficie de determinados vegetales y pueden ser extrados fcilmente
en procesos gobernados por la solubilidad. Por su parte, los aceites esenciales se encuentran
dentro de la estructura celular y su extraccin est controlada por la transferencia de materia
interna. La coextraccin de ceras no es deseable, sin embargo algunos aceites esenciales
muestran actividad antioxidante como en el caso del romero (Ibez y col., 1999), algunas
especies de Lamiaceae (Mimica-Dukic y Bozin, 2008), como la lavanda (Danh y col., 2012).

El fraccionamiento de los extractos en distintos separadores con control independiente de la

presin y la temperatura, puede ser til para resolver los problemas asociados a la
coextraccin de solutos no deseados (Figura 1.15). Se ha propuesto el uso de varios
separadores en la recuperacin, fraccionamiento y purificacin de extractos antioxidantes. Se
han empleado hasta tres separadores en serie para fraccionar extractos crudos de hojas de

22
 Introduccin

olivo (Tabera y col., 2004), salvia (Daukas y col., 2001) o prpolis (Wang y col., 2004), aunque
lo ms frecuente es el empleo de dos separadores (Marongiu y col., 2003), como en el proceso
de fraccionamiento de extractos de bagazo de uva blanca (Pinelo y col., 2007) o de romero
(Vicente y col., 2012)

FSC E1 Fraccionamiento Compuestos

Materia prima
(100-450 bar) (1-3 separadores) antioxidantes

R1 R2

Figura 1.15: Etapa de extraccin seguida de separacin fraccionada (E 1: Extracto; R1, R2: Residuos slidos).

b) Etapas consecutivas de extraccin con aumento progresivo de la extraccin

Tras una primera etapa de extraccin a baja presin (< 150 bar) para extraer compuestos
apolares (como compuestos voltiles, ceras o aceites esenciales), el residuo slido resultante
se somete a una nueva extraccin en condiciones ms severas con el fin de extraer
compuestos polares antioxidantes (Figura 1.16). Este esquema de extraccin secuencial ha sido
propuesto para la obtencin de aceites esenciales en una primera etapa de extraccin a
presiones entre 80 y 100 bar y una posterior recuperacin de compuestos ms polares en una
segunda etapa a 180-400 bar para romero (Ibez y col., 1999), organo (Simndi y col., 1998),
citronela (Marongiu y col., 2004) o semillas de cilantro (Yepez y col., 2002)

FSC E1
Materia prima Aceite
(90-150 bar)

R1

FSC Fraccionamiento Compuestos

(200-500 bar) (1-3 separadores) antioxidantes

R2

Figura 1.16: Etapas consecutivas de extraccin de serveridad creciente (E1: Extracto; R1, R2: Residuos slidos).

c) Extraccin convencional con disolventes seguida de extraccin con FSC

La tecnologa de FSC no es recomendable para la extraccin de materias primas de origen

vegetal cuyo contenido en solutos es bajo, sin embargo, puede utilizarse para purificar el

23
Introduccin

extracto crudo obtenido mediante extraccin convencional con disolventes. En este contexto,
la extraccin con FSC de los extractos secos presenta ventajas operacionales y econmicas
como son condiciones suaves de extraccin y menor consumo de disolventes. Este esquema es
recomendable cuando la aplicacin directa de FSC limita el rendimiento de extraccin o la
actividad antioxidante del extracto, o bien cuando los extractos obtenidos presentan un color y
olor indeseables (Figura 1.17). Este esquema ha sido aplicado para obtencin de extractos
antioxidantes de prpolis (Wang y col., 2004), bagazo de uva (Louli y col., 2004) o plantas
aromticas (Lemonis y col., 2013).

Compuestos
E1 FSC antioxidantes
Materia prima Extraccin convencional Secado
con disolventes (90-150 bar) Aromas

R1
R2

Figura 1.17: Extraccin convencional con disolventes seguida de extraccin con FSC (E1: Extracto; R1, R2: Residuos
slidos).

La extraccin con FSC de concentrados comerciales y extractos crudos da como resultado un

menor consumo de CO2 comparado con el tratamiento directo con FSC, tal como ha sido
sealado para los extractos etanlicos de Ginkgo biloba (Yang y col., 2002). Este efecto es ms
evidente cuando se trata de compuestos de alto peso molecular presentes en baja
concentracin que interactan con la matriz slida (Murga y col., 2000).

La extraccin supercrtica puede emplearse para la eliminacin de compuestos apolares no

activos presentes en los extractos obtenidos mediante disolventes convencionales. Un ejemplo
de esta disposicin es la preparacin de extractos de romero obtenidos con disolventes
convencionales, y tratados posteriormente con FSC en condiciones suaves para eliminar
compuestos indeseables (aceites esenciales y ceras) y concentrar los componentes de inters,
mejorando sus propiedades organolpticas y actividad antioxidante (Hadolin y col., 2004).

Yang y col. (2002) llevaron a cabo la extraccin con etanol de hojas de Gingko biloba seguido
de una etapa de extraccin supercrtica del refinado para la obtencin de un extracto rico en
flavonoides y terpenoides con buenas propiedades de color y solubilidad.

d) Extraccin con FSC seguida de extraccin convencional o tratamientos hidrotrmicos

Una primera etapa con FSC en condiciones suaves permite la eliminacin de compuestos
voltiles y ceras de la materia prima antes de su extraccin con disolventes convencionales

24
 Introduccin

(Figura 1.18). Este esquema operacional ha sido propuesto para Melissa officinalis (Ribeiro y
col., 2001), romero (Zibetti y col., 2013), salvia (Nakatsu y Namasaki, 2000) o citronela (Peev y
col., 2011). Vatai y col. (2009) desarrollaron un proceso de extraccin en dos etapas para la
obtencin de compuestos fenlicos a partir de bagazo de uva que inclua una fase de
pretratamiento con dixido de carbono supercrtico (para la eliminacin de compuestos
apolares) seguida de la extraccin con disolventes del residuo (para la obtencin de
compuestos antioxidantes). En la extraccin de hoja de pitanga, una primer tratamiento con
CO2 supercrtico favoreci la obtencin de un extracto ms concentrado en compuestos
fenlicos en una segunda etapa de extraccin convencional con agua o etanol comparado con
el proceso en una sola fase (Martnez-Correa y col., 2011)

FSC E1
Materia prima Compuestos polares
(90-150 bar)

R1
E2
Extraccin convencional
Compuestos antioxidantes
con disolventes

R2

Figura 1.18: Extraccin con FSC seguida de extraccin convencional o tratamientos hidrotrmicos (E1, E2:
Extractos; R1, R2: Residuos slidos).

Si los compuestos antioxidantes presentes en el residuo slido de la extraccin supercrtica son

demasiado polares o poseen un elevado peso molecular, pueden emplearse otras tecnologas
de extraccin como los tratamientos hidrotrmicos, que presentan ventajas operacionales y
medioambientales asociadas al carcter no txico del disolvente empleado, tal y como se ha
encontrado en la extraccin de quinonas y derivados a partir del bamb (Quitain y col., 2004).

1.2.1.3. PARMETROS OPERACIONALES QUE AFECTAN AL PROCESO DE EXTRACCIN

Cuando la materia prima que se pretende extraer es un slido, el equilibrio y la cintica de

extraccin dependern tanto de las condiciones de extraccin como del acondicionamiento
inicial de la muestra. La capacidad de un FSC para extraer un determinado tipo de compuestos
depender de factores tales como la solubilidad del soluto en el FSC, las interacciones soluto-
matriz, la localizacin del soluto en la materia prima o la porosidad del lecho en el extractor. El
diseo y optimizacin del proceso extractivo dependern de una seleccin adecuada de los
parmetros operacionales ajustando correctamente el poder disolvente del FSC, reduciendo

25
Introduccin

las interacciones matriz-soluto y minimizando la coextraccin de impurezas (Pereira y

Meireles, 2010).

a) Acondicionamiento de la materia prima

Cuando se procesan muestras slidas, el acondicionamiento inicial de la materia prima es

decisivo para facilitar la extraccin de compuestos intracelulares. Este acondicionamiento est
orientado a reducir las limitaciones a la transferencia interna de materia. Generalmente la
etapa limitante del proceso suele ser la difusin interna, por lo que un tamao de partcula
pequeo favorecer el proceso de extraccin. Un ejemplo puede ser la extraccin de hojas de
albahaca: tras 5 h de operacin no se alcanz un rendimiento satisfactorio cuando el tamao
de partcula era de 0,55 mm, pero al reducir la muestra a un tamao de partcula de 0,17 mm,
2 h de extraccin fueron suficientes para lograr una extraccin completa (Reverchn y col.,
1993).

Sin embargo, tamaos de partcula demasiado pequeos pueden producir fenmenos de

compactacin y apelmazamiento del lecho slido, aumentando la resistencia a la transferencia
de materia interna y favoreciendo la aparicin de canales preferentes, provocando una
disminucin en el rendimiento de la extraccin. Este problema puede minimizarse empacando
la muestra con cuentas de vidrio u otro material inerte (Lang y Wai, 2001). Un tamao de
muestra demasiado pequeo puede producir tambin volatilizacin (Rozzi y col., 2002) o
degradacin de compuestos activos, disminuyendo el rendimiento de extraccin (Kaiser y col.,
2004).

En general, en la extraccin de productos de origen natural suelen utilizarse tamaos de

partcula en torno a 0,2-1,80 mm (Pereira y Meireles, 2010).

El efecto de la humedad de la muestra tiene tambin especial importancia en los procesos de

extraccin supercrtica. En la mayora de los casos, el agua compite con el soluto por
interactuar con el disolvente, disminuyendo el rendimiento de extraccin, por lo que suele ser
recomendable secar la muestra (Pereira y Meireles, 2010). La presencia de agua puede causar
otros efectos negativos como la formacin de tapones de hielo debido al efecto Joule-
Thompson, la ionizacin e hidrlisis de compuestos o la reduccin de la vida til del producto
(Pereira y Meireles, 2010).

Sin embargo en algunos casos la presencia de agua es necesaria para permitir la interaccin
entre el FSC y los solutos, como en la extraccin de la cafena a partir de granos de caf, dado

26
 Introduccin

que el agua mejora la permeabilidad de las membranas celulares y expande la estructura

celular favoreciendo el flujo de los solutos a travs de la matriz. En general el contenido de
agua aceptable en la materia prima suele encontrarse entre 4-14 % (Pereira y Meireles, 2010;
Brunner, 1994).

b) Presin y temperatura

La presin y temperatura afectan tanto al equilibrio como a la cintica de extraccin y

controlan la densidad y poder disolvente del FSC.

A temperatura constante, un aumento en la presin implica un aumento en la densidad y

poder disolvente del FSC as como una mayor interaccin entre el disolvente y la muestra.
Presiones en torno a 80-150 bar suelen ser adecuadas para la extraccin de aceites esenciales
(del Valle y col., 2005; Reverchon, 1997), mientras que presiones entre 140-400 bar suelen ser
las ms utilizadas en la extraccin de compuestos fenlicos (Baumann y col., 2004). En la
extraccin de compuestos antioxidantes, un aumento de la presin puede traducirse en una
prdida de selectividad debido a la coextraccin de compuestos, que reducen la pureza del
extracto y pueden conferir color (Yang y col., 2002) o a una accin prooxidante de los extractos
obtenidos (Gouveia y col., 2006).

A presin constante, el efecto de la temperatura sobre la solubilidad es complejo debido a la

combinacin de dos efectos: al aumentar la temperatura se reduce la densidad del fluido
supercrtico, lo que reduce su poder disolvente; pero se aumenta la presin de vapor de la
sustancia a extraer, por lo que su tendencia a pasar a la fase fluida es mayor. El efecto de la
densidad predomina a presin baja, mientras que el efecto de la volatilidad es mayor a altas
presiones. Este doble efecto que provoca el aumento de temperatura sobre los parmetros
que influyen en la solubilidad da lugar a la aparicin de un punto de cruce o crossover point
(Figura 1.19). La presin a la cual tiene lugar depender del tipo de compuesto que se
pretende extraer (Albuquerque y Meireles, 2012). Para la mayora de los compuestos este
punto de cruce aparece en el intervalo de presiones entre 20 y 35 MPa (Martnez y Vance,
2008).

27
Introduccin

Rendimiento (g EAG/100 g muestra)

0,04

0,03

0,02

0,01

0,00
5 10 15 20 25 30
P (MPa)

Figura 1.19: Efecto de la presin y la temperatura en el rendimiento de extraccin de compuestos fenlicos con
CO2 supercrtico a partir de madera de pino (30 C; 40 C; 60 C) (Conde y col., 2013).

En la extraccin de compuestos antioxidantes a partir de materias primas de origen vegetal

suelen utilizarse temperaturas moderadas entre 40 y 60 C (Reverchon y de Marco, 2006;
Wijngaard y col., 2012).

c) Flujo de disolvente

El flujo de disolvente es un parmetro relevante si el proceso est controlado por la resistencia

a la transferencia de materia externa. Esta resistencia puede disminuirse aumentando el flujo
de disolvente, lo que reduce el tiempo de residencia e incrementa las interacciones soluto-
disolvente favoreciendo su disolucin. Este efecto es notable en las etapas iniciales del proceso
cuando se extraen los solutos unidos a la superficie de la matriz. Sin embargo, en algunos
casos, altos flujos de disolvente pueden producir un descenso en el rendimiento de extraccin
debido a un contacto insuficiente entre el soluto y el disolvente. Adems, flujos elevados
implican mayores costes de operacin (Pereira y Meireles, 2010).

d) Tiempo de extraccin

Dependiendo de la distribucin de los compuestos que se desea extraer dentro de la matriz

slida, el rendimiento de extraccin puede disminuir drsticamente una vez que la mayora de
los compuestos son eliminados de la superficie de la muestra. Esto es debido a que los solutos
restantes estn dentro de la estructura de la matriz y slo pueden ser extrados tras un
periodo prolongado. Por ejemplo, una eliminacin del 99 % de un determinado compuesto
puede requerir un tiempo de extraccin de hasta diez veces mayor que el necesario para
eliminar el primer 50 %. Por lo tanto, tiempos prolongados de extraccin pueden llegar a no

28
 Introduccin

resultar rentables (Lang y Wai, 2001). En general, dada la forma asinttica de las curvas de
extraccin, el proceso se considera completo una vez recuperado el 90 % del extracto.
Tiempos de extraccin ms largos provocan un aumento de los costes que no seran
compensados por el aumento del rendimiento de extraccin (del Valle y col., 2005).

Los datos encontrados para este parmetro en la bibliografa son muy variables en funcin de
los solutos que se desea extraer as como del resto de variables operacionales. Se han utilizado
perodos de extraccin esttica desde 1 min hasta 2 h, seguidos de extraccin dinmica de 15
minutos hasta 5 h (Dean y Liu, 2000; Quitain y col., 2004; Ramrez y col., 2004). En otros casos
se ha utilizado una nica etapa de extraccin de 30 min a 4 h (Mau y col., 2002; Poli y col.,
2003; Damjanovid y col., 2005).

e) Modificador

El dixido de carbono en estado supercrtico es adecuado para la extraccin de aceites y

compuestos de naturaleza lipdica, pero muchos compuestos de origen natural con actividad
biolgica, como los compuestos fenlicos, son poco solubles en este disolvente. Las
modificaciones en la presin y temperatura del proceso pueden afectar ligeramente a la
solubilidad de compuestos de alto peso molecular, como flavonoides, pero la utilizacin de
dixido de carbono puro como disolvente puede conllevar bajos rendimientos de extraccin y
pureza.

La eficacia de la extraccin puede mejorarse mediante la adicin de un modificador polar. La

presencia de estas sustancias aumenta la interaccin de los solutos con el disolvente
modificando la densidad, polaridad y viscosidad del FSC, permitiendo la aparicin de
interacciones qumicas especficas (como puentes de hidrgeno), provocando alteraciones en
la estructura de la matriz (como el hinchamiento de las estructuras celulares) o rompiendo las
interacciones polares entre los solutos y la matriz (Hamburger y col., 2004).

La concentracin ptima de modificador debe establecerse experimentalmente con el fin de

optimizar el rendimiento de extraccin del compuesto de inters. Una concentracin
demasiado alta de modificador puede disminuir la selectividad del proceso dependiendo del
tamao de los compuestos fenlicos presentes en la muestra (Scalia y col., 1999). Adems,
dependiendo de la naturaleza del mismo, podra limitar y comprometer el carcter verde del
proceso. El modificador puede introducirse en el proceso bien mezclado con el FSC o bien
mezclado de manera uniforme con la muestra antes de su introduccin en el extractor
(Gouveia y col., 2007). En la extraccin de compuestos fenlicos suelen utilizarse

29
Introduccin

concentraciones entre 10-20% (Wijngaard y col., 2012), aunque han llegado a utilizarse
concentraciones de hasta el 60 % respecto al flujo de CO2 (Li y col., 2010).

El empleo de un modificador adecuado puede mejorar la eficacia del proceso desde un punto
de vista operacional y econmico ya que permite mejorar los rendimientos de extraccin
utilizando condiciones de extraccin ms moderadas. Metanol y etanol son los modificadores
ms utilizados en la extraccin de compuestos antioxidantes a partir de materias primas de
origen vegetal, siendo el etanol, dada su baja toxicidad, el ms recomendable. Los procesos
que usan agua como modificador son medioambientalmente limpios pero presentan
problemas como la formacin de tapones de hielo durante la expansin, la hidrlisis de
determinados compuestos y la reduccin de la vida til del producto final (Leeke y col., 2002).
El agua se utiliza como modificador a nivel industrial en procesos como la eliminacin de la
cafena y la nicotina, y ha sido propuesta para la extraccin de compuestos antioxidantes
(Leeke y col., 2002; Da Porto, 2014) y para la eliminacin de aromas de extractos de romero
obtenidos mediante extraccin convencional (Lpez-Sebastin y col., 1998).

En algunos casos, como en la extraccin de compuestos antioxidantes a partir de aloe vera, el

modificador apenas tiene efecto en los rendimientos de extraccin (Hu y col., 2005) pero
puede mejorar la composicin del extracto obtenido, tal como se ha dado en la extraccin de
jengibre (Zancan y col., 2002). El empleo de cantidades crecientes de modificador permite
separar primero los compuestos menos polares y a continuacin los compuestos con mayor
polaridad. Un aumento progresivo en la presin de extraccin y concentracin de modificador
permite la extraccin de compuestos fenlicos con mayores pesos moleculares, tal como se ha
sealado en la obtencin de concentrados de semilla de uva (Murga y col., 2000).

1.2.1.3. PROPIEDADES DE LOS EXTRACTOS ANTIOXIDANTES OBTENIDOS MEDIANTE FLUIDOS

SUPERCRTICOS

En base a los resultados de diferentes estudios se obtienen mejores rendimientos de

extraccin y/o mayor selectividad hacia compuestos activos mediante el empleo de FSC en
comparacin con otras tcnicas de extraccin como Soxhlet, a partir de distintas plantas
(Vaher y Koel, 2003), hojas de Lippia alba (Stashenko y col., 2004), piel de pomelo (He y col.,
2012), residuo de pulpa de algarrobo (Roseiro y col., 2013) o ssamo negro (Hu y col., 2004).

En la extraccin a escala piloto de flores de camomila mediante FSC en ausencia de

modificador se obtuvo un contenido total en flavonoides ligeramente menor, pero con un
perfil cromatogrfico similar al obtenido mediante extraccin convencional (Scalia y col.,

30
 Introduccin

1999). En el caso de la extraccin supercrtica a partir de piel de ctricos el contenido en

naringina fue mayor que el obtenido mediante maceracin y similar al conseguido mediante
extraccin en Soxhlet (Giannuzzo y col., 2003). Los extractos obtenidos a partir de hoja de
eucalipto mediante FSC presentaron mayor actividad antioxidante que los obtenidos mediante
hidrodestilacin debido a una mejor extraccin de sesquiterpenos y compuestos oxigenados
(Fadel y col., 1999). A pesar de que la extraccin convencional con etanol de piel de tamarillo
condujo a mejores rendimientos de extraccin, la actividad antioxidante de los extractos
obtenidos fue menor que la presentada en la extraccin con dixido de carbono supercrtico
utilizando etanol como modificador debido a una menor selectividad del disolvente y a la
degradacin trmica de sustancias activas durante el proceso (Castro-Vargas y col., 2013).

La tecnologa de extraccin supercrtica proporcion extractos con alta actividad cuando se

procesaron sustratos con elevado contenido en sustancias activas trmicamente inestables;
adems las fracciones separadas presentaron mejores caractersticas de olor y color (Quispe-
Condori y col., 2005; Carvalho y col., 2005; Damjanovid y col., 2005). Sin embargo, la menor
selectividad de los disolventes convencionales puede favorecer la actividad antioxidante de los
extractos al aparecer sinergismos entre los distintos compuestos, tal como se ha observado en
la extraccin a partir de crcuma (Braga y col., 2003), semillas de tamarindo (Luengthanaphol y
col., 2004) o ssamo negro (Xu y col., 2005a).

Adems de las propiedades antioxidantes, se ha confirmado la actividad antimicrobiana de los

extractos supercrticos en numerosas ocasiones, particularmente en los extractos de hierbas
aromticas y especias (Leal y col., 2003), fruto de Phyllanthus emblica L. (Liu y col., 2009),
oleorresina de jengibre (Zancan y col., 2002), pulpa de naranja (Benelli y col., 2010), bagazo de
uva tinta (Oliveira, 2013) y fracciones de semillas de uva blanca (Palma y col., 1999). Los
extractos supercrticos de mayorana fueron significativamente ms potentes que los obtenidos
con etanol para la inhibicin de crecimiento de hongos y bacterias (Vgi y col., 2005).

Se han observado propiedades antimutagnicas y antineoplsicas en los extractos

supercrticos de plantas y especias (Leal y col., 2003) y antimutagnicas para extractos de hoja
de Terminalia catappa (Ko y col., 2003). Los extractos supercrticos obtenidos a partir de
residuos de pulpa de algarrobo mostraron un mayor efecto antiproliferativo frente a clulas
cancergenas que los obtenidos mediante extraccin convencional (Roseiro y col., 2013). Del
mismo modo, los extractos de romero obtenidos con dixido de carbono supercrtico
resultaron tener un efecto beneficioso en la inhibicin del progreso de cncer heptico
(Vicente y col., 2013). Se ha comprobado la capacidad de extractos de jengibre para causar

31
Introduccin

inhibicin y proliferacin de cncer de pecho y pulmn (Zancan y col., 2002), mientras que los
extractos de cscara de cacao pueden prevenir el dao oxidativo isqumico (Arlorio y col.,
2005).

1.2.1.4. EXTRACCIN DE ANTIOXIDANTES MEDIANTE FLUIDOS SYPERCRTICOS A PARTIR DE

MATERIAS PRIMAS RESIDUALES

En los ltimos aos se estn realizando grandes esfuerzos en la bsqueda de fuentes baratas y
alternativas de antioxidantes naturales, as como en el desarrollo de tcnicas de extraccin
eficientes y selectivas. En este sentido los residuos de naturaleza forestal y agroindustrial se
convierten en una opcin rentable para la obtencin de dichos compuestos, y la tecnologa de
FSC ha resultado una herramienta til en muchos de estos estudios. En la Tabla 1.3 se recogen
algunos de los trabajos realizados acerca de la extraccin de compuestos antioxidantes a partir
de residuos de diferente naturaleza.

La tecnologa de FSC se ha utilizado en la extraccin de compuestos fenlicos con actividad

antioxidante a partir de diversas partes de rboles y plantas tales como hojas de eucalipto (El-
Ghorab y col., 2003; Herzi y col., 2013), pitanga (Martnez-Correa y col., 2011; Garmus y col.,
2014), jatrofa (Manpong y col., 2011), bamb (Zulkafli y col., 2014), cortezas de pino (Braga y
col., 2008), eucalipto (Santos y col., 2012; Srivastava y Vankar, 2012) o abeto rojo (Co y col.,
2012).

Durante el proceso de extraccin con FSC a partir de residuos se ha utilizado un amplio

intervalo de condiciones de presin y temperatura, pero en general en la mayora de los
trabajos encontrados en la bibliografa se seleccionan temperaturas entre 40 y 60 C y
presiones entre 200 y 300 bar. A continuacin se citan algunos ejemplos de extraccin con FSC
de compuestos fenlicos con accin antioxidante a partir de residuos agrcolas e industriales.

La extraccin supercrtica de residuos del caf (posos y cscara) se ha llevado a cabo utilizando
etanol como modificador. Se utilizaron presiones entre 100 y 300 bar y temperaturas entre 40
y 60 C. Los rendimientos de extraccin y la actividad antioxidante de los extractos fueron
menores que los obtenidos mediante extraccin en Soxhlet y ultrasonidos. Los compuestos
mayoritarios presentes en el extracto fueron cafena y cido clorognico (Andrade y col.,
2012).

La tecnologa de extraccin con FSC tambin result til en la obtencin de diversas fracciones
fenlicas con actividad antioxidante a partir de cscara de cacao. Las fracciones ms activas se

32
 Introduccin

obtuvieron utilizando 50 C de temperatura y presiones de 150 o 200 bar. Al contrario de lo

esperado, el anlisis de dichas fracciones mostr la ausencia de compuestos tales como cidos
fenlicos o flavonoides, por lo que los autores atribuyeron su actividad antioxidante a la
posible extraccin de compuestos fenlicos de naturaleza oligomrica como procianidinas o
bien a la presencia de clovamida, un potente antioxidante presente en el cacao (Arlorio y col.,
2005).

La extraccin con fluidos supercrticos se ha empleado para la obtencin de distintas

fracciones de compuestos fenlicos con actividad antioxidante tales como glicsidos de
kaempferol, a partir de residuos de semilla de t (Li y col., 2010), quercetina de hoja de cebolla
(Martino y Guyer, 2004) o (-)-epicatequina de cscaras de semilla de tamarindo
(Luengthanaphol y col., 2004).

Castro-Vargas y col. (2010) llevaron a cabo la extraccin de semillas de guayaba utilizando

etanol como modificador. Los extractos obtenidos presentaron mejores resultados en cuanto a
rendimiento de extraccin y actividad antioxidante que los obtenidos mediante extraccin en
Soxhlet. Por el contrario, Goli y col. (2005) obtuvieron rendimientos en compuestos fenlicos
muy bajos utilizando dixido de carbono supercrtico a partir de cscara de pistacho, en
comparacin con otros mtodos de extraccin como Soxhlet o extraccin asistida con
ultrasonidos.

Otros residuos utilizados en la extraccin de antioxidantes incluyen desechos de patata (Okuno

y col., 2002), hojas de melocotn (Kazan y col., 2014) o de mango (Fernndez-Ponce y col.,
2012), bagazos de melocotn, manzana (Adil y col., 2007) o albaricoque (anal y col., 2004),
residuos de pulpa de naranja (Benelli y col., 2010), pieles de pomelo (Giannuzzo y col., 2003;
He y col., 2012), manzana (Massias y col., 2015) y mango (Prado y col., 2013; Garca-Mendoza y
col., 2015) u hoja de anacardo (Leito y col., 2013).

La extraccin de compuestos fenlicos de naturaleza antioxidante a partir del residuo

procedente de la explotacin del algarrobo como fuente de compuestos antioxidantes se llev
a cabo mediante un proceso en dos etapas: una primera etapa de extraccin convencional con
agua para la eliminacin de azcares seguida de una segunda etapa de extraccin supercrtica
del residuo slido resultante (Bernardo-Gil y col., 2011). Los extractos obtenidos mediante
dixido de carbono supercrtico presentaron una concentracin ms elevada de compuestos
fenlicos y una mayor capacidad antioxidante que los obtenidos mediante ultrasonidos o
extraccin convencional con agua o acetona al 70 % (Roseiro y col., 2013).

33
Introduccin

Los subproductos generados durante la elaboracin del vino constituyen otra fuente
importante compuestos fenlicos. Su inters est relacionado con el tipo y la cantidad de
compuestos fenlicos que se encuentran en las semillas de uva y pieles. La obtencin de
compuestos antioxidantes a partir de bagazo o semillas de uva ha sido abordada mediante
extraccin supercrtica en distintos trabajos (Palma y Taylor, 1999; Murga y col., 2000; Da
Porto, 2014). El proceso de extraccin supercrtica resulta ms rpido que la extraccin
convencional con disolventes y permite el fraccionamiento de los compuestos fenlicos
mediante variaciones en la presin y adicin de modificadores en distintas proporciones
(Murga y col., 2000).

34
 Tabla 1.3: Extraccin de compuestos antioxidantes mediante FSC a partir de fuentes residuales.
Residuo CANTIDAD PRESIN TEMPERATURA MODIFICADOR FLUJO TIEMPO EXTRACCIN RENDIMIENTO Referencia
(g) (bar) (C) (%) (h) (%)
Pulpa de naranja 15 100-300 40-50 - 17 g CO2/min 5 0,61-1,42 Benelli y col., 2010
prensada 250 50 Etanol: 2-8 17 g (CO2+etanol)/min 5 1,7-3
Cscara de pistacho 2,5 355 35-55 Metanol: 0-15 - 5 min esttico + 0,2-7,8 mg EAG/g Goli y col., 2005
15-40 min dinmico
Posos y cascarilla de - 100-300 40-60 Etanol - - 15 (posos) Andrade y col., 2012
caf 31 (cscara)
Corteza de abeto rojo 66,5 260 70 Etanol 35 g CO2/min 30 min (0 % Etanol)+ 30 3,3 Co y col., 2012
min (20 % Etanol)
Semillas de guayaba 30 100-300 40-60 Etanol: 0-10 - 2 (30 min esttico) 12,3-16,4 Castro-Vargas y col., 2010
-5
Hojas de pitanga 7 (0,817 mm) 400 60 - 410 kg CO2/s - 3,5 Martnez-Correa y col.,
2011
Residuos de semilla de 25 150-450 40-80 Etanol:Agua (50-90%, v/v) 2 L CO2/min 30-150 min 0-9 mg/g Li y col., 2010
t 0,5 L Modificador/min
Corteza de pino - 100-300 30; 40; 50 1 Etapa: 0 5-10 kg CO2/s 10 min esttico + 90 7-14 Braga y col., 2008
35

min dinmico
100-300 30; 40; 50 2 Etapa: Etanol: 10 4-8 kg CO2/s 90 min dinmico 1-3
Bagazos de manzana y 1 200-600 40-60 Etanol: 14-20 2 g (CO2+etanol)/min 10-40 min 0,1-0,5 (manzana), 0,08-0,25 Adil y col., 2007
melocotn (0,638 mm) (melocotn) mg EAG/g
Hoja de melocotn 10 150-300 40-80 Etanol: 6-20 15 g/min 60 min 26,74-79,92 mg EAG/g Kazan y col., 2014
Hoja de mango 15 100, 400 35; 55 Etanol, Metanol: 20 20 g/min 3 6,53 (100 bar, 55 C, Fernndez-Ponce y col.,
Metanol) 2012
Hoja eucalipto 1 400 70 Etanol: 10-15 2 mL (CO2+etanol)/min 2 12-16 El-Ghorab y col., 2003
Hoja de eucalipto 50 90 40 - 20 g/min 30 min E. camaldulensis: 8,8 g/kg, Herzi y col., 2013
Separadores: 3,9 mg EAG/g
50, 50, 2 E. cineria: 27,5 g/kg; 2,16
mg EAG/g
 Tabla 1.3: Extraccin de compuestos antioxidantes mediante FSC a partir de fuentes residuales (continuacin).
Residuo CANTIDAD PRESIN TEMPERATURA MODIFICADOR FLUJO TIEMPO EXTRACCIN RENDIMIENTO Referencia
(g) (bar) (C) (%) (h) (%)
Semilla uva 3 200, 300 40 Etanol o Metanol: 2-15 0,5 mL CO2/min 3 Polifenoles bajo peso Murga y col., 2000
molecular > 90%
Bagazo de uva 100 100, 200 40, 50, 60 Etanol: 15 6 kg/h 5 6,9-10,2 Da Porto y col., 2014
Agua: 15 268,1-733,6 mg EAG/100g
Piel de pomelo 2 95 40-65 Etanol: 5; 10, 15 - 45 min Etanol: 2,5-6,8 (seca); 4,9- Giannuzzo y col., 2003
1
Metanol: 10 14,4 (hmeda)
Metanol: 4,4 (seca), 9,2
(hmeda)1
Piel de cebolla - 393 40 Etanol: 5 - 2,5 0,02 g/kg piel Martino y Guyer, 2004
(12,7 mm)
Corteza de eucalipto - 300-500 35-65 Metanol - - 28 mg EAG/g Srivastava y Vankar, 2012
Corteza de eucalipto - 300 70 Etanol: 20 10 g CO2/min - 0,48 Santos y col., 2012
57,22 mg EAG/g
Hoja de bamb 0,3 100, 200, 250 50, 80, 95, 110 Etanol/Agua: 10 mL/min - ptimo: Zulkafli y col., 2014
36

5, 8, 10 (mol) 7,31 mg EC/g hojas

Cscara de cacao 50 100-200 50 - - - Arlorio y col., 2005
Bagazo de albaricoque 75-600 m 304-507 40-60 - 1 mL CO2/min 90 min 88 g -caroteno/g bagazo amal y col., 2004
Pulpa de algarrobo - 150-220 40-70 Etanol (80 %): 0-12,4 0,28-0,85 kg/h - - Bernardo-Gil y col., 2011
0,27-1,07
mm
Pulpa de algarrobo 50 220 40 Etanol (80 %): 10 0,29 kg/h - 0,33 Roseiro y col., 2013
0,27 mm 27,1 mg EAG/g
Piel de pomelo - 280-420 0-80 - - 20-60 min 2,37 He y col., 2012
Piel de mango 5 (liofilizado) 300 40 - 1,1 L/min 7,5 3,15 Garca-Mendoza y col.,
15,80 mg EAG/g extracto 2015
Piel de manzana 15 250 50 E (96 %): 25 10g(CO2+E)/min 3 30,1 Massias y col., 2015
27,4 g fenlicos/kg extracto

(1) g naringina/kg piel

Abreviaturas: EAG: Equivalentes de cidoglico; EC: equivalente de catequina
 Introduccin

1.2.2. TECNOLOGA DE MEMBRANAS

En trminos generales, una membrana puede definirse como una barrera semipermeable que
separa dos fases y restringe o favorece el transporte de uno o ms componentes a travs de
ella de una manera selectiva (Mulder, 1997; Baker, 2004). Los componentes que la atraviesan
constituyen la corriente de permeado y los que no atraviesan la membrana constituyen la
corriente de retenido (Figura 1.20).

ALIMENTACIN PERMEADO

RETENIDO

Figura 1.20: Esquema general de un mdulo de membranas.

La funcin primordial de una membrana es actuar como una capa de separacin, permitiendo
el paso de ciertos componentes y la retencin de otros presentes en una mezcla determinada,
conllevando la concentracin de uno o ms componentes tanto en el permeado como en el
retenido (Coutinho y col., 2009).

El transporte de los componentes a travs de la membrana se consigue mediante la aplicacin

de una fuerza impulsora, que puede ser un gradiente de concentracin, presin, temperatura
o potencial elctrico (Figura 1.21).

Alimentacin Retenido

Fuerza impulsora

Permeado

Figura 1.21: Esquema general de un proceso de filtracin con membranas.

Los procesos basados en aplicacin de un gradiente de presin como fuerza impulsora del
trasporte de materia, microfiltracin (MF), ultrafiltracin (UF), nanofiltracin (NF) y smosis

37
Introduccin

inversa (OI), han sido utilizados de manera satisfactoria en la concentracin y purificacin de

compuestos antioxidantes procedentes de materias primas de origen natural.

Las membranas de MF suelen operar a presiones inferiores a 2 bar y permiten la separacin de

partculas en suspensin con tamaos entre 0,025 y 10 m. Las membranas de UF retienen
macromolculas y coloides con pesos moleculares entre 1 y 300 kDa, mientras que dejan pasar
a su travs agua y pequeas molculas. La presin de trabajo necesaria se encuentra entre 2 y
10 bar, aunque en algunos casos se han llegado a usar presiones de hasta 30 bar (Nawaz y col.,
2006). Las membranas de NF se caracterizan por trabajar a presiones entre 10 y 40 bar y
separar partculas cuya masa molecular se encuentra entre 350 y 1000 Da. Las membranas de
OI retienen esencialmente todos los solutos disueltos en agua, incluyendo pequeos iones
como el sodio (Murakami y col., 2011; Coutinho y col., 2009) (Figura 1.22).

0,1 kDa 1 kDa 10 kDa 100 kDa 500 kDa

MICROFILTRACIN
ULTRAFILTRACIN
NANOFILTRACIN

SMOSIS INVERSA

0,0001 m 0,001 m 0,01 m 0,1 m 1 m

Iones Molculas Macromolculas Coloides Micropartculas

pequeas

Figura 1.22: Capacidad de separacin por tamao de partculas de los distintos tipos de membranas.

1.2.2.1. CARACTERSTICAS DE LAS MEMBRANAS

La eficiencia de una membrana viene determinada por dos parmetros conocidos como flujo y
selectividad (Mulder, 1997).

La densidad de flujo (J) se define como el caudal que fluye a travs de la membrana por
unidad de rea. Las unidades de flujo utilizadas comnmente son L/m2h (LMH). Los flujos
tpicos varan entre 10-1000 LMH para las membranas de MF y UF, 30-150 LMH para las
membranas de NF, y 25-50 LMH para las membranas de OI (Baker, 2004; Pereira y Peinemann,
2006; Porter, 1990; Scott y Hughes, 1996).

Para los procesos cuya fuerza impulsora es la diferencia de presin, la densidad de flujo es un
indicador de la resistencia hidrulica que la membrana presenta al paso de un determinado
componente. Sin embargo, la medida del flujo depende de la presin y de la corriente de

38
 Introduccin

alimentacin utilizada. En el caso de la filtracin con lquidos, el flujo es directamente

proporcional a la diferencia de presin P entre la alimentacin y el efluente:

Ji = k P (1.1)

En la ecuacin (1.1), la constante de proporcionalidad k representa la permeabilidad de la

membrana. La permeabilidad de agua pura es un parmetro importante que puede emplearse
para comparar distintas membranas para una aplicacin determinada. Una alta permeabilidad
de agua pura indica que ser necesario aplicar una presin menor para obtener el caudal
deseado y por tanto la membrana ser ms eficiente energticamente.

La diferencia de presin P es la fuerza impulsora del flujo. En la mayora de los procesos de

MF y UF, P es esencialmente igual a la presin transmembrana (PTM), que se define como:

P1 +P2
PTM = - P3 (1.2)
2

Donde P1 es la presin de entrada a la membrana, P2 la presin a la salida de la membrana y P3

es la presin del permeado, generalmente despreciable.

Sin embargo, si existe una diferencia de presin osmtica significativa () entre la

alimentacin y el permeado, la diferencia de concentracin provoca una disminucin de la
fuerza impulsora:

P = PTM- (1.3)

Donde es el coeficiente de Staverman, una medida de la permeoselectividad de la membrana

(Mulder, 1997). Para procesos de UF y MF, que permiten el paso de sales, es generalmente
cero y el efecto de la presin osmtica despreciable. Para las membranas de OI, que retienen
casi completamente las sales, es prximo a 1, y la superacin de la presin osmtica se
convierte en un problema importante. As las presiones necesarias en los procesos de UF y MF
son menores que en el caso de las membranas de NF y OI, y los flujos alcanzados son mayores
(Girard y Fukumoto, 2000).

La selectividad de una membrana generalmente se expresa en trminos de coeficiente de

retencin o rechazo. La retencin de un componente i (Ri) describe qu cantidad de dicho
componente es impedido por la membrana a pasar a la corriente de permeado, y viene dado
por la ecuacin:

39
Introduccin

Ci,permeado
Ri = 1- (1.4)
Ci, alimentacin

Donde Ci,permeado es la concentracin del componente i en la corriente de permeado y

Ci,alimentacin es la concentracin del componente i en la corriente de alimentacin.

Estos parmetros (flujo y selectividad) estn estrechamente relacionados con el mecanismo de

transporte, la morfologa y la naturaleza qumica de las membranas:

Mecanismo de transporte

Atendiendo al mecanismo de transporte, las membranas se dividen en porosas y densas.

Habitualmente se considera que una membrana es porosa si sus poros tienen un dimetro
superior a 20 . Por el contrario, si no existe evidencia de poros de ese tamao se considera
que la membrana es densa, aunque se admite que puede contener huecos con dimetros
comprendidos entre los 10 y 20 (Hernndez y col., 1990).

En las membranas porosas el transporte a travs de la membrana viene determinado

principalmente por el tamao, la distribucin y la estructura de los poros, donde las partculas
con dimensiones mayores que el tamao de los poros de la membrana son retenidas por sta.
En la Figura 1.23 se muestran algunas de las estructuras porosas tpicas (Scott y Hughes, 1996).
Las membranas de MF, UF y NF son membranas porosas.

Figura 1.23: Estructuras porosas tpicas (Scott, 1996).

Cuando el tamao de los poros de la membrana es grande, el mecanismo de exclusin est

predominantemente regido por la morfologa de los poros de la membrana. Sin embargo, a
medida que el tamao de los poros disminuye, las interacciones qumicas entre las especies

40
 Introduccin

presentes en la mezcla y la membrana adquieren un papel ms importante el mecanismo de

transporte.

En las membranas densas, el mecanismo de transporte depender de la solubilidad y

difusividad de las molculas transportadas a travs de la membrana, que dependen
fundamentalmente del material de la membrana, de la naturaleza de los fluidos en contacto y
de las posibles interacciones que puedan tener lugar entre las especies permeadas y la
membrana (Mulder, 1997; Baker, 2004).

Morfologa

Desde un punto de vista morfolgico, las membranas pueden clasificarse en simtricas y

asimtricas.

Las membranas simtricas poseen una estructura y composicin uniforme a lo largo de todo el
espesor de la membrana. Este tipo de membranas muestran una integridad estructural
excelente, sin embargo no poseen un buen rendimiento debido a su baja permeabilidad ya que
todo el espesor de la membrana, comprendido entre 10 y 200 m, ofrece resistencia a la
transferencia de materia, por lo que se ha limitado su aplicacin en procesos de separacin
(Mulder, 1997; Baker, 2004).

Con el avance de las tcnicas de fabricacin de membranas se desarrollaron las membranas

asimtricas. stas estn formadas por dos capas de distinta porosidad denominadas capa
porosa y capa densa fina. La capa porosa, de un grosor entre 50 y 150 m, tiene por finalidad
dar consistencia mecnica a la membrana afectando lo menos posible a las propiedades de
permeabilidad y retencin. Para ello, su permeabilidad debe ser muy alta y el tamao de los
poros muy superior al de la capa fina. La capa fina, con espesores entre 0,1 y 0,5 m, es la que
determina la selectividad y permeabilidad de la membrana al ser estas caractersticas
inversamente proporcionales al espesor de la membrana. De este modo, se combina la
elevada selectividad de una membrana porosa con el elevado flujo de permeado que dan las
membranas ms delgadas (Mulder, 1997).

Naturaleza qumica

En general, las membranas se fabrican a partir de materiales polimricos o cermicos.

Los polmeros ms comnmente utilizados incluyen acetato de celulosa (AC), poliamida (PA),
politersulfona (PES), polisulfona (PS), poliacrilonitrilo (PAN) o fluoruro de polivilideno (PVDF).

41
Introduccin

Las membranas de AC fueron las primeras que se usaron y han sido denominadas de primera
generacin. Poseen menor tendencia al ensuciamiento que otros polmeros. Trabajan en unos
intervalos limitados de pH (3-8) y temperatura (menores de 50 C) y son susceptibles a la
degradacin por microorganismos. Las membranas de PA, presentan mayor resistencia a la
temperatura, al ataque qumico, al pH y al dao mecnico, pero muestran sensibilidad al cloro,
baja permeabilidad y problemas de adsorcin, en particular a las protenas (Daufin y col.,
1991). Las membranas de PS y PES son resistentes a niveles de pH extremos y poseen buena
estabilidad trmica, sin embargo presentan baja afinidad por el agua dada su naturaleza
hidrfoba, lo que favorece el ensuciamiento. Las membranas de PVDF poseen una resistencia
qumica excepcional y buena estabilidad trmica (hasta 140 C). Son ms resistentes que las
membranas de PS y PES a una amplia gama de disolventes, pero tambin sufren tendencia al
ensuciamiento por su carcter hidrfobo. Las membranas de PAN son relativamente ms
hidrfilas que las anteriores, sin embargo siguen presentando problemas de ensuciamiento y
menor estabilidad trmica (Mulder, 1997; Baker, 2004).

Las membranas cermicas se fabrican por combinacin de un metal (normalmente aluminio,

titanio o zirconio) con un no-metal, formando xidos, nitruros o carburos. De todas ellas las
ms utilizadas son las de xidos metlicos, principalmente xidos de aluminio y zirconio.

Las principales caractersticas de las membranas inorgnicas son su alta estabilidad trmica,
mecnica y qumica. Las membranas cermicas son capaces de soportar temperaturas de hasta
800 C, un lmite muy superior al de operacin de las membranas orgnicas, que operan en
intervalos de temperatura de entre 100 y 300 C. Esta resistencia trmica aumenta las
posibilidades de trabajo con membranas y facilita su limpieza. Adems, estas membranas
presentan una baja afinidad qumica con un amplio nmero de molculas orgnicas como
protenas, grasas, azcares, etc., lo que hace que la adsorcin qumica sea baja, reduciendo el
riesgo de ensuciamiento. Este hecho, unido a su facilidad de limpieza, hace que el tiempo de
vida til de estas membranas sea mayor que el de las polimricas (Mulder, 1997).

1.2.2.2. ENSUCIAMIENTO DE LAS MEMBRANAS

Uno de los problemas ms importantes asociados al uso de la tecnologa de membranas es la

reduccin de flujo de permeado causado por los fenmenos de polarizacin por concentracin
y ensuciamiento de las membranas, lo que provoca un aumento del coste operativo del
proceso dada la necesidad de incluir rutinas de limpieza (Choi y col., 2005), as como la
reduccin de la vida til de la membrana (Li y Chase, 2010).

42
 Introduccin

La disminucin inicial rpida del flujo en los primeros minutos del proceso se atribuye a la
llegada de molculas rechazadas a la superficie de la membrana por transporte convectivo.
Estas partculas forman una capa concentrada en la superficie de la membrana, dando lugar a
un gradiente de concentracin denominado polarizacin por concentracin (Cheryan, 1998).
El efecto de la polarizacin por concentracin puede determinarse mediante la comparacin
del flujo de agua pura (JA) y el flujo de permeado inicial (J0) a la misma presin transmembrana.

Despus de la cada inicial en el flujo debido a la polarizacin por concentracin, el flujo

contina disminuyendo debido al ensuciamiento de la membrana provocado principalmente
por deposicin de macromolculas dentro de los poros de la membrana que estn bloqueados
por los solutos rechazados, as como por la adsorcin de los solutos sobre las paredes de la
membrana. Finalmente, puede alcanzarse un flujo estable o bien puede disminuir lentamente
debido a deposiciones adicionales sobre la superficie de la membrana o a la consolidacin de
la capa de ensuciamiento (Figura 1.24).

JA
Flujo (Ji)

J0

I II III
Tiempo (t)
Figura 1.24: Disminucin del flujo asociada a los fenmenos de ensuciamiento (Li y col., 2008).

El ensuciamiento de las membranas depender de varios factores, tales como las

caractersticas propias de la membrana, las propiedades de la corriente de alimentacin,
tamao molecular de los solutos y su interaccin con la superficie de la membrana, as como
de las condiciones de operacin (Turano y col., 2002).

La disminucin del flujo de permeado causada por la polarizacin por concentracin puede
revertirse mediante la modificacin de los parmetros operacionales como la velocidad de
flujo, concentracin de la alimentacin o presin transmembrana. Sin embargo, la disminucin
del flujo asociada al ensuciamiento es irreversible y se hace necesaria la limpieza de la

43
Introduccin

membrana mediante un contralavado con agua o permeado, o en casos ms severos mediante

agentes qumicos (disoluciones de sosa o cidos diluidos) (Li y Chase, 2010).

Adems de las caractersticas de la membrana, la eficacia de la separacin depende de los

parmetros operacionales del proceso (como la velocidad de flujo o la presin
transmembrana) y de las caractersticas de la corriente de alimentacin (como concentracin o
temperatura).

Velocidad de flujo

Un aumento en la velocidad de flujo provoca un aumento en el flujo de permeado, ya que el

espesor de la capa de polarizacin disminuye al aumentar la turbulencia que provoca la
dispersin de las molculas de soluto concentradas sobre la superficie de la membrana
(Coutinho y col., 2009; Afonso y col., 2004) (Figura 1.25). En general, se considera que
velocidades superiores a 2 m/s son suficientes para evitar el ensuciamiento de las membranas
(Choi y col., 2005).

Presin transmembrana

El flujo de permeado aumenta al elevar la presin hasta que el flujo se ve limitado por la
formacin de una capa gel sobre la superficie de la membrana (Figura 1.25). Una vez que se
produce la polarizacin de la capa gel, el flujo de permeado no puede incrementarse e incluso
puede disminuir al aumentar la presin debido a la compactacin de la capa gel (Afonso y col.,
2004).

Temperatura

Un aumento de la temperatura provoca un aumento en el flujo de permeado debido a la

disminucin de la viscosidad y aumento de la difusividad (Figura 1.25). En general, el flujo de
permeado aumenta en un 3-4 % por cada grado de elevacin de temperatura (Afonso y col.,
2004). Sin embargo, ha de considerarse el efecto negativo que puede tener una temperatura
demasiado elevada sobre la membrana (especialmente si sta es orgnica) y sobre la
estabilidad de los solutos. Las temperaturas elevadas ocasionan desnaturalizacin de las
protenas lo que provoca una disminucin en el flujo de permeado por adsorcin de las
macromolculas sobre la superficie de la membrana (Dilman y Miller, 1973).

44
 Introduccin

Concentracin de la alimentacin

Al aumentar la cantidad de molculas de soluto acumuladas en la capa de polarizacin se

produce un aumento del espesor y la resistencia al flujo de la misma, resultando en un
descenso del flujo de permeado (Figura 1.25).

J
Agua

Regin
controlada
por la presin

Mayor velocidad
Mayor temperatura
Menor concentracin

Regin controlada
por la transferencia de materia

PTM

Figura 1.25: Relacin entre el flujo de permeado y los parmetros operacionales durante el proceso de filtracin
(Cheryan, 1998).

1.2.2.3. CONFIGURACIN DEL MDULO DE MEMBRANA

La eficacia de un proceso de separacin con membranas se ver afectada por la configuracin

del mdulo empleado. El diseo de los mdulos de membrana se centra en el desarrollo de
configuraciones que permitan alcanzar el ptimo de productividad. Para ello, es necesario
controlar el flujo de fluido en la alimentacin y en el permeado generando un flujo turbulento
cerca de la superficie de la membrana, de modo que se reduzca la resistencia al transporte y
los efectos de la polarizacin de la concentracin.

La adicin de separadores que creen turbulencias (Choi y col., 2005), el empleo de mdulos de
membrana que permitan trabajar con altas velocidades transversales (Choi y col., 2005) y la
agitacin continua de la corriente de alimentacin, son algunas de las medidas adoptadas ms
comnmente (Baker, 2004; Goosen y col., 2004; Porter, 1990; Choi y col., 2005). El uso de
mdulos ms cortos divididos por espaciadores en lugar de un nico mdulo largo tambin
resulta til ya que impide el pleno desarrollo de la capa lmite.

Otros mtodos que tienen por objeto la prevencin de deposiciones sobre la superficie de la
membrana tales como ultrasonidos, inyeccin de burbujas de aire (Choi y col., 2005) o el

45
Introduccin

empleo de fragmentos slidos en suspensin (Noordman y col., 2003) tambin han resultado
tiles para reducir al mnimo la polarizacin por concentracin.

Los mdulos ms utilizados son de placas y bastidor, en espiral, tubulares y de fibras huecas.

Placas y bastidor

Estos sistemas constan de un gran nmero de membranas planas superpuestas con una serie
de espaciadores situados entre ellas que proporcionan los canales necesarios para el flujo. Las
membranas, generalmente de 50 hasta 500 m de espesor, se unen mediante una matriz
porosa e inerte que ofrece poca resistencia al flujo de fluido. El flujo de la alimentacin y el
retenido ocupan canales alternos (Singh y Heldman, 2001).

La relacin superficie/volumen es normalmente baja y depende de la forma y eficacia del

material utilizado como separador, pero oscila generalmente entre 100-300 m2/m3 (Singh y
Heldman, 2001).

Las unidades pueden desmontarse fcilmente para ganar accesibilidad para la limpieza o
cambio manual de las membranas.

Espirales

En estas membranas, dos lminas planas, separadas por una lmina de plstico, se colocan
entre dos lminas ms de soporte poroso. Esta combinacin de hojas se envuelve alrededor de
un tubo central que a travs de perforaciones en su superficie, conecta con el material poroso.
La corriente de alimentacin entra por un extremo del tubo exterior y circula a travs del
espacio entre las superficies de las membranas. Los separadores de plstico disminuyen la
resistencia al flujo y tambin actan como un promotor de turbulencia para ayudar a reducir la
polarizacin de la concentracin. A medida que la alimentacin circula sobre la superficie de la
membrana, la corriente de permeado fluye radialmente a travs de la membrana y atraviesa
las perforaciones en la superficie del tubo central para ser descargada en uno de los extremos
del tubo interior (Brennan y col., 1990). Las membranas espirales son mucho ms compactas
(700 a 1000 m2/m3) y producen una prdida de carga menor que los mdulos de platos y
bastidor sin embargo son ms sensibles a la obstruccin (Mallevialle y col., 1996). Los mdulos
en espiral no se pueden desmontar para su limpieza. Si la corriente de alimentacin contiene
una cantidad importante de partculas en suspensin, puede ser necesario algn
pretratamiento inicial de la corriente como centrifugacin (Brennan y col., 1990).

46
 Introduccin

Tubulares

En la configuracin tubular la membrana se moldea sobre la pared interior de un tubo poroso

cuyo dimetro interno puede llegar a los 25 mm. El mdulo tubular est formado por uno o
varios de estos tubos acoplados en el interior de una carcasa. La corriente de alimentacin
fluye a travs del interior del tubo y el permeado atraviesa radialmente la membrana hacia el
exterior del tubo.

En este tipo de configuracin puede trabajarse con velocidades del orden de 6 m/s si se
necesita un flujo de alta turbulencia. Estos mdulos no necesitan una prefiltracin fina de la
alimentacin y son de limpieza fcil. Estn particularmente bien adaptados para el tratamiento
de fluidos muy viscosos. Su principal desventaja es que resultan poco compactadas, entre 25-
100 m2/m3, lo que se traduce en ms superficie de instalacin y mayor coste de instalacin y
mantenimiento (Brennan y col., 1990).

Fibras huecas

La fibra hueca, fabricada con aramida e introducida por Du Pont en 1970, posee un dimetro
interno de 40 y un dimetro externo de 85 . En los sistemas de membrana de fibras huecas
se dispone de un gran nmero de estas fibras (varios millones) en un haz alrededor de un tubo
distribuidor perforado. La corriente de alimentacin se introduce a travs de un distribuidor y
el permeado fluye a travs del espacio anular interior de las fibras hacia la placa final del tubo,
descargndose a travs del orificio de salida (Singh y Heldman, 2001).

Estas fibras proporcionan reas superficiales extremadamente elevadas, por lo que los
sistemas de membrana de fibra hueca pueden fabricarse de forma muy compacta (desde 1000
m2/m3 en mdulos de ultrafiltracin hasta 10000 m2/m3 en mdulos de smosis inversa)
(Mallevialle y col., 1996).

Una desventaja inherente a este tipo de membranas es que los canales de alimentacin son
muy pequeos. El empleo de corrientes de alimentacin con un nivel significativo de slidos en
suspensin causara el colmatado del canal de flujo. Esto limita su uso a separaciones lquido-
lquido o ciertos procesos de nanofiltracin (Brennan y col., 1990).

47
Introduccin

1.2.2.3. RECUPERACIN DE COMPUESTOS ANTIOXIDANTES MEDIANTE TECNOLOGA DE

MEMBRANAS

La tecnologa de membranas puede utilizarse en la concentracin y/o fraccionamiento

selectivo de compuestos de inters a partir de distintas corrientes acuosas y/o alcohlicas
procedentes del procesamiento de distintos productos, subproductos y residuos de la industria
agroalimentaria

La utilizacin de tecnologas de membranas para la concentracin y purificacin de

compuestos fenlicos bioactivos con naturaleza antioxidante es un tema de inters creciente.
En la Tabla 1.4 se recogen algunos ejemplos de la recuperacin de compuestos fenlicos a
partir de distintas fracciones residuales, empleando tecnologa de membranas.

En la bibliografa se encuentran trabajos enfocados a la concentracin mediante tecnologa de

membranas de extractos crudos obtenidos mediante extraccin convencional de corteza y
hojas de mate (Murakami y col., 2011; Prudncio y col., 2012), corteza de Eucalyptus globulus
(Baptista y col., 2015), Geranium robertianum y Salvia officinalis (Paun y col., 2011), raz de
regaliz (Sohrabi y col., 2010), hojas de Ginkgo biloba (Xu y Wang, 2005), bagazo de frambuesa
(Molnr y col., 2011), propleo (Tylkowski y col., 2010; Mello y col., 2010), Sideritis sp. L.
(Tylkowski y col., 2011), romero (Pesheva y col., 2011) y semillas de uva (Nawaz y col., 2006).

La tecnologa de membranas ha sido utilizada para la purificacin de los extractos obtenidos

mediante el empleo de tecnologas emergentes de fraccionamiento de biomasa. Gonzlez-
Lpez y col. (2012) procesaron mediante membranas los extractos obtenidos mediante
hidrlisis no isotrmica de la cscara de castaa. La concentracin fenlica obtenida en el
producto final fue aproximadamente un 15 % mayor que la concentracin inicial en los
hidrolizados y su actividad antioxidante comparable a la de los antioxidantes sintticos.
Sarmeto y col. (2008) utilizaron membranas de OI y NF para concentrar compuestos fenlicos
obtenidos por extraccin con CO2 supercrtico y por extraccin convencional de semillas de
cacao.

La tecnologa de membranas supone un procedimiento rpido y sencillo para la separacin de

compuestos fenlicos en funcin de su peso molecular. El fraccionamiento en compuestos
fenlicos de alto y bajo peso molecular se ha llevado a cabo a partir de extractos crudos de
setas comestibles (Cheung y Cheung, 2005) y de corteza de la raz de la morera (Yu y col.,
2007). Los compuestos fenlicos obtenidos mediante extraccin convencional de la pulpa de
caqui se procesaron con una membrana de ultrafiltracin de polisulfona para obtener diversas

48
 Introduccin

fracciones de taninos de distintos pesos moleculares (Gu y col., 2008). Kalbasi y Cisnero-
Zevallos (2007) utilizaron la tecnologa de membranas para separar fracciones monomricas y
polimricas de antocianinas procedentes del jugo de uva. La membrana empleada (< 100 kDa)
consegua separar las formas polimricas en la corriente de retenido, mientras que el
permeado contena los compuestos de bajo peso molecular. Santamara y col. (2002)
desarrollaron una secuencia de filtracin utilizando cuatro membranas diferentes para la
obtencin de fracciones de proantocianidinas con diferentes grados de polimerizacin. A
escala analtica, los compuestos fenlicos procedentes de la piel de la almendra fueron
separados en compuestos de bajo peso molecular en la corriente de permeado y oligmeros
de proantocianidina en el retenido (Prodanov y col., 2008).

Se ha aplicado con xito la tecnologa de membranas a la recuperacin de distintos

compuestos a partir de una misma materia prima. As, Todisco y col. (2002) obtuvieron
concentrados de catequinas procedentes de t negro despus de una etapa preliminar de UF
para retener protenas. En la misma lnea, la ultrafiltracin de extractos acuosos de t verde
result ser adecuada para la retencin de pequeas partculas, protenas, polisacridos y cido
tnico mientras que en la corriente de permeado se recuperaron ms del 40 % de los
compuestos polifenlicos del t (Li y col., 2005). Conidi y col. (2012) estudiaron diferentes
membranas de nanofiltracin para separar azcares y concentrar los flavonoides presentes en
el licor obtenido por prensado de piel de naranja.

La selectividad de la separacin puede mejorarse mediante el uso de materiales de membrana

capaces de interactuar con algunos de los compuestos en la corriente de alimentacin. Por
ejemplo, el uso de una membrana de PVDF modificado favorece la formacin de enlaces de
hidrgeno con flavonoides, mejorando su separacin de un extracto de Ginkgo biloba (Xu y
col., 2005b).

Las membranas pueden emplearse como tecnologas respetuosas con el medio ambiente para
la concentracin y/o fraccionamiento de fluentes residuales. Se han utilizado membranas en el
procesamiento de aguas residuales con alto contenido en compuestos orgnicos ligeramente
biodegradables y cantidades significativas de compuestos fenlicos. En este campo, se ha
conseguido una reduccin en la demanda qumica de oxgeno (DQO), as como la separacin
de compuestos revalorizables (grasas, azcares, polifenoles, etc.) a partir de alpechn mediante
el empleo de membranas planas de ultrafiltracin (Turano y col., 2002). Se han utilizado
diversas tcnicas para separar compuestos fenlicos de bajo peso molecular del alpechn a

49
Introduccin

escala piloto (Russo, 2007), incluyendo combinaciones de etapas de MF, UF, NF y OI (Galanakis
y col, 2012; Garca-Castell y col., 2010; Cassanoy col., 2011; Cassano y col., 2013; Zagklis y
Paraskeva, 2014; Conidi y col., 2015) y se han empleado resinas polimricas de
adsorcin/desorcin para recuperar compuestos fenlicos de bajo peso molecular presentes
en la corriente de retenido final tras la etapa de OI (Zagkils y col., 2015). Bernardo y col. (2011)
estudiaron la biodegradabilidad de diferentes fracciones de aguas residuales procedentes de la
industria del tratamiento de corcho procesadas a travs de membranas de ultrafiltracin y
nanofiltracin (NF) con diferentes tamaos de corte molecular, con el objetivo de establecer el
tamao de corte ms adecuado tanto para reducir la carga orgnica de las corrientes de
permeado como para la revalorizacin de las corrientes retenidas a travs de la recuperacin
de taninos. Finalmente, se ha estudiado tambin la concentracin de isoflavonas mediante
smosis inversa a partir de los permeados procedentes de las etapas de
ultrafiltracin/diafiltracin de una planta de obtencin de leche de soja (Xu y col., 2004).

50
 Tabla 1.4: Recuperacin de compuestos fenlicos mediante tecnologa de membrana a partir de corrientes residuales.
Residuo Tipo de Configuracin Material rea Tamao de corte Flujo o velocidad PTM T RCV Referencia
separacin (m2) (kDa) alimentacin (bar) (C)

Extractos corteza de rbol mate NF Espiral - 0,9 0,15-0,30 - 60 22 1,5-6 Prudencio y

col., 2012
Extractos pulpa de caqui UF Fibras huecas PS - 10 10 L/h 0,5 - - Gu y col. , 2008
Extractos semilla de uva UF - PS, PVDF 8; 20; 200 - 0,2; 2; 5 - - Santamara y
NF - PA 60 % rechazo CaCl2 6 col., 2002
Extractos semilla de uva UF - - - 0,22; 0,45 m 5 23 - Nawaz y col.
2006
Extractos de raiz de morera MF - 0,45 m 5 25 4 Yu y col., 2007
UF PS, PA 200; 50; 20; 10
Extractos piel de almendra UF - - - 10; 30; 50 - - - - Prodanov y col.,
centrfuga 2008
Extractos cscara de castaa NF - - - - - 4 20 3 Gonzlez-Lpez
UF 1 - 20 3 y col., 2012
Extracto oliva prensada NF - - - 0,25 - 10 - - Nunes y col.,
51

RO - 25 2007
Licores de piel de naranja NF Espiral PA/PS 2,1 0,18 - 20 20 3 Conidi y col.,
prensada APP 2,6 0,3 20 20 3 2012
PES 1,6 0,4 6 20 3
PES 1,6 1 6 20 3
Alpechn UF Placas filtrantes PS, PES - 100; 25; 10; 2 - 2; 3; 5; 8 - - Galanakis y col.,
1
NF Placas filtrantes PA - 120 - 12 2010
Alpechn MF Tubular, espiral Cermica, PES 0,35; 3,8 0,8 m; 0,35 m; 500 4; 3,4 m3/h 1,5; 2 20-25 3; 3,4 Russo y col.,
3
UF Espiral, tubular PS, PES, xido circonio 5; 8,36; 0,35 80; 20; 6; 1 3-5; 4 m /h 2,5-4,5; 20-25 3; 2,5 2007
3
RO Espiral PA 7 99,5 % rechazo sal 1,2 m /h 1,5 20-25 2,5
10-15
Alpechn MF Tubular Al2O3 0,0048 200 nm 760 L/h 0,72 22 - Garca-Castell y
NF Espiral PES 1,6 0,578 - 8 20 - col., 2010
 Tabla 1.4: Recuperacin de compuestos fenlicos mediante tecnologa de membrana a partir de corrientes residuales (continuacin).
Residuo Tipo de Configuracin Material rea Tamao de corte Flujo o velocidad PTM T RCV Referencia
separacin (m2) (kDa) alimentacin (bar) (C)
Alpechn MF Tubular PP 0,036 0,2 m - 0,5 25 - Cassano y col.,
UF Lminas planas PES 0,00038465 4; 5; 10 5; 2 25 3 2011
Celulosa regenerada
Alpechn UF Fibras huecas PVDF 0,4 0,02 m 433 L/h 4,3 18 3 Cassano y col.,
UF Placas Fluoropolmero 0,0022 1 600 L/h 9 30 - 2013
2
NF Espiral TFC 2,6 > 97 % rechazo sal - 5y9 22 -
Alpechn MF Cermica 0,35 0,1-1,4 m - - - - Pizzichini y
UF Espiral Polimrica 1-20 Russo, 2005
NF Espiral Polimrica 0,15-0,250
RO Espiral PA
Alpechn MF - - 0,24 120 - - - - Villanova y col.,
UF 1,6 120-20; 20-1 2008
NF 2,5 1-0,35
RO 2,5 0,35
52

Alpechn UF Tubular Cermica 0,24 100 nm - 1 - - Zagklis y

NF Espiral Polimrica 2,4 95 % rechazo MgSO4 - 20 - - Paraskeva, 2014
RO Espiral Polimrica 2,5 99 % rechazo NaCl - 3,3 - -
Aguas residuales de tratamiento UF Lminas planas AC 0,147 0,125-91 - - - - Bernardo y col.,
de corcho NF Espiral PS/PA 2,09 0,125 2011
Corriente residual de produccin RO Placa y marco - - 98% rechazo de sal 3,2 L/min 14 20 - Xu y col., 2004
de leche de soja
Extractos de corteza de eucalipto UF Lminas planas PA 0,0014 1 4,5 L/min 3, 5, 8 35 - Baptista y col.,
PES 5 2015
PVDF 30
PS 60
Aguas residuales del procesado UF Tubular TiO2 0,1 15 4 m3/h 4,3 - Conidi y col.,
de alcachofa NF Espiral PA 2,6 0,2-0,3 300 L/h 8 5 2015

(1) El fabricante especifica que la retencin de una disolucin de 2000 mg MgSO4/L es 99% a 9 bar y 25C
(2) Condiciones de ensayo: 2000 ppm MgSO4, 25 C y 15 % recuperacin a 4,8 bar
Abreviaturas: APP: Amida polipiperacina; PP: polipropileno, RCV: Relacin de concentracin de volmenes, TFC: Thin-Film Composite
 Introduccin

1.3. RESIDUOS AGROINDUSTRIALES Y FORESTALES COMO FUENTES

NATURALES DE COMPUESTOS ANTIOXIDANTES

Adems de las fuentes tpicas de compuestos fenlicos como las frutas, verduras o distintos
tipos de hierbas medicinales y especias, los residuos de naturaleza agrcola, forestal e
industrial son un grupo de materias primas cada vez ms atractivos para la obtencin de
antioxidantes naturales (Moure y col., 2001; Balasundram y col., 2006; Vigan y col., 2015).
Estos residuos presentan la ventaja de ser una fuente renovable, barata y fcilmente
disponible, especialmente aqullos cuya eliminacin directa al medio podra dar lugar a serios
problemas medioambientales.

Se han identificado compuestos fenlicos con actividad antioxidante en distintos subproductos

de origen agroindustrial como cscaras de almendra (Moure y col., 2007, Conde y col., 2011a),
cscaras de cebada (Conde y col., 2008), cscaras de coco (Dey y col., 2003), piel de patata
(Kanatt y col., 2005; Mohdaly y col., 2010; Makris y col., 2007), cscaras de girasol
(Szydowska-Czerniak y col., 2011), piel de cebolla (Makris 2007; Kiassos y col., 2009),
subproductos de la industria del caf (Murthy y Naidu, 2012) o desechos de cosechas de
pepino, escarola y achicoria (Peschel y col., 2006). Los subproductos de la industria de la uva y
produccin de vino han generado un gran inters como fuente de compuestos fenlicos (Cruz
y col., 2004; Corrales y col., 2008; Lafka y col., 2007; Makris y col., 2007; Pinelo y col., 2006;
Arvanitoyannis y col., 2006; Louli y col., 2004; Soto y col., 2012). Los alpechines, las hojas de
olivo y otros subproductos de la produccin de aceite de oliva, tambin han sido estudiados
como fuentes de compuestos fenlicos (Lafka y col., 2011; Benavente-Garca y col., 2000;
Herrero y col., 2012). Tambin pueden encontrarse altos contenidos en compuestos fenlicos
en los residuos de diversas futas como pulpas de ciruela (Sjka y col., 2015) cereza
(Kolodziejczyk y col., 2013), bagazo de manzana (Reis y col., 2012; Surez y col., 2010; Peschel
y col., 2006), pulpa y piel de pltano (Someya y col., 2002), semillas y pieles de ctricos
(Londoo-Londoo y col., 2010; Li y col., 2006; Babbar y col., 2011), residuos de frutas
tropicales (Kiassos y col., 2009; Marina y Noriham, 2014), pieles de melocotn, de pera
(Gorinstein y col., 2002) o de mango (Berardini y col., 2005; Ajila y col., 2007).

53
Introduccin

1.3.1. RESIDUOS VITIVINCOLAS

La elaboracin del vino es una actividad estacional, desarrollada bsicamente en otoo, donde
el 60-70 % de las corrientes generadas se obtienen durante los 3 meses siguientes al inicio del
proceso (Devesa-Rey y col., 2011). Durante el proceso de vinificacin se generan grandes
cantidades de residuos que constituyen uno de los problemas ms importantes asociados a la
industria vitivincola. Estos residuos se caracterizan por poseer pH bajos y una elevada carga
orgnica (azcares, taninos, polifenoles, polialcoholes, pectinas y lpidos) y contener
importantes cantidades de macronutrientes, especialmente potasio, por lo que su descarga
directa puede suponer un importante riesgo medioambiental. La eliminacin efectiva de estos
residuos es costosa y supone un importante reto para las bodegas que deben encontrar otras
aplicaciones adems de su utilizacin como fertilizante o para la formulacin de piensos (Lafka
y col., 2007).

En la Figura 1.26 se muestra el proceso llevado a cabo en la Cooperativa Vitivincola del Ribeiro
para la elaboracin de vino y de aguardiente a partir de uva blanca. En el esquema se destacan
los residuos generados en las distintas etapas.

UVA

Bagazo prensado
PRENSADO

Mosto

FERMENTACIN ALMACENAMIENTO

Vino

TRASIEGOS DESTILACIN AGUARDIENTE

Las

VINO Las Bagazo Vinazas

destiladas destilado

Figura 1.26: Proceso de elaboracin de vino blanco y aguardiente.

El principal residuo obtenido durante el proceso de elaboracin de vino es el bagazo, un

residuo compuesto por las uvas prensadas, el raspn y las semillas obtenidas en las distintas
etapas del proceso. Adems, en las empresas que utilizan este bagazo para la obtencin de
bebidas espirituosas se obtiene un nuevo residuo constituido por el bagazo agotado tras el

54
 Introduccin

proceso de destilacin. Este residuo suele utilizarse como combustible para plantas de
generacin de energa, como abono o para compostaje (Nogales y col., 2005).

Durante el proceso de destilado se genera adems una corriente lquida residual denominada
vinaza. Este efluente, de carcter cido y con un alto contenido en compuestos orgnicos
ligeramente biodegradables, contiene cenizas, azcares residuales, aminocidos, tartratos,
cidos orgnicos (como actico, lctico y en ocasiones mlico) y cantidades significativas de
compuestos fenlicos (Borja y col., 1993; Beltrn y col., 1999; Bentez y col., 2003; Martn
Santos y col., 2003).

Los compuestos fenlicos presentes en las uvas y el vino incluyen cidos fenlicos,
especialmente los derivados del cido benzoico y del cido hidroxicinmico, flavonoides como
catequinas, flavonoles y antocianinas y taninos y proantocianidinas (Pinelo y col., 2007).
Adems, numerosos estudios realizados muestran que estos compuestos presentan
importantes efectos beneficiosos incluyendo actividades antioxidante, antiinflamatoria,
anticancergena y antimutagnica (Cheng y col., 2012). Puesto que slo una parte de estos
compuestos presentes en la uva son transferidos al vino durante su elaboracin, quedan
importantes cantidades presentes en el bagazo. Este motivo ha aumentado el inters en la
extraccin de dichos compuestos a partir de residuos de vinificacin para la obtencin de
compuestos fenlicos de naturaleza antioxidante.

En la bibliografa se encuentran referencias acerca del aprovechamiento de los distintos

residuos producidos durante la elaboracin de vino y aguardiente para la obtencin de
compuestos fenlicos de naturaleza antioxidante. Uno de los subproductos ms estudiados es
el bagazo resultante de la etapa de prensado de la uva. Los compuestos fenlicos identificados
incluyen catequinas (catequina y epicatequina), flavonoles (quercetina, kaempferol,
miricetina), cidos benzoicos (cidos glico, protocatquico, 4-hidroxibenzoico o sirngico) y
cidos cinmicos (p-cumrico). Sin embargo, en la bibliografa se encuentran escasas
referencias relativas a la extraccin de compuestos antioxidantes a partir de bagazo destilado,
especialmente en comparacin con las referencias relativas a bagazo prensado.

En la Tabla 1.5 se recogen ejemplos de extraccin de compuestos fenlicos a partir de distintos

tipos de bagazo tanto mediante extraccin convencional como supercrtica. Se ha abordado la
extraccin de compuestos fenlicos mediante el uso de distintos disolventes tales como
metanol, etanol o acetato de etilo. Rubilar y col. (2007) llevaron a cabo la extraccin con
etanol de bagazo prensado procedente tanto de uvas tintas como uvas blancas. Los extractos

55
Introduccin

obtenidos a partir de bagazo de uva tinta mostraron mayor capacidad antioxidante que los
procedentes de bagazo de uva blanca. Gonzlez-Params y col. (2004) extrajeron con metanol
bagazo de uva tinta y semillas antes y despus de su lavado con agua caliente y sulfito. En
todos los casos se obtuvo una capacidad antioxidante elevada, incluso en los residuos
procedentes de los lavados con sulfito, en los que dicho proceso de lavado favoreci la
recuperacin de flavonoles. Adems, las semillas secas obtenidas al final del proceso
mantenan una actividad antioxidante significativa. Los compuestos fenlicos mayoritarios
encontrados en los extractos metanlicos de diversas variedades de bagazo de uva blanca
incluan principalmente flavanoles, seguidos de flavonoles y en menor medida cidos fenlicos
(Jara-Palacios y col., 2014)

El efecto del tipo disolvente ha sido abordado en diferentes estudios. Los extractos obtenidos
a partir de los bagazos de distintas variedades de uva utilizando disoluciones acuosas de
acetona resultaron ser ms activos frente a los radicales superxido y DFPH que los obtenidos
utilizando disoluciones acuosas de etanol o metanol (Cheng y col., 2012). Lapornik y col. (2005)
encontraron que los extractos obtenidos con metanol o etanol resultaron siete veces ms
activos que los obtenidos con agua, mientras que en el estudio realizado por Chydambara
Murthy y col. (2002) los extractos metanlicos resultaron ser los ms activos que los obtenidos
usando acetato de etilo o agua.

Tambin se ha llevado a cabo la extraccin alcohlica utilizando en el disolvente pequeas

cantidades de cido (Negro y col., 2003; Rockenbach y col., 2011a,b; Ruberto y col., 2007;
Brazinha y col., 2014). Sin embargo, Makris y col. (2007) encontraron que la acidificacin de
etanol acuoso con pequeas cantidades de cido clorhdrico, cido actico o cido tartrico,
caus un descenso del rendimiento en compuestos fenlicos comparado con el rendimiento
obtenido mediante el disolvente sin acidificar. En ese mismo estudio se observ que pequeas
cantidades de SO2, a pesar de disminuir el rendimiento de extraccin de compuestos fenlicos,
condujo a la obtencin de extractos ms activos.

Tambin se puede encontrar informacin de la optimizacin de otras variables del proceso

extractivo, como tiempo, temperatura o relacin lquido:slido. Spigno y col. (2007) estudiaron
el efecto de distintas variables en la cintica de extraccin de compuestos fenlicos a partir de
bagazo de uva tinta. La temperatura tuvo un efecto positivo en la extraccin obtenindose
mayores rendimientos a 60 C, mientras que no se encontraron diferencias significativas entre
los tiempos de extraccin entre 5 y 24 h. Los mayores rendimientos se obtuvieron utilizando
etanol como disolvente, sin embargo los extractos de mayor pureza fueron los obtenidos con

56
 Introduccin

acetato de etilo (Spigno y Faveri, 2007). Lafka y col. (2007) encontraron que el mnimo tiempo
requerido para extraer el mximo de compuestos fenlicos fueron 180 minutos utilizando
etanol al 50 % con una relacin lquido:slido de 9 (v:p) y un pH de 1,5. Los extractos
etanlicos presentaron una actividad antioxidante elevada comparada con otros antioxidantes
sintticos comerciales como el BHT.

La tecnologa de fluidos supercrticos tambin ha sido abordada como alternativa a la

extraccin convencional con disolvente. De Campos y col. (2008) estudiaron la extraccin de
bagazo prensado mediantes distintas tcnicas. Mediante el empleo de dixido de carbono
supercrtico se obtuvo un rendimiento de la extraccin del 3 %, valor que se incremet hasta
un 9 % mediante la adicin de un 15 % de etanol como cosolvente. Este rendimiento fue
mayor que el obtenido mediante extraccin convencional con etanol, pero menor que
resultante de la extraccin Soxhlet. El proceso de extraccin supercrtica permite extraer
compuestos como cido oleico o fitol, que no fueron detectados mediante extraccin
convencional. Los extractos obtenidos mediante CO2 supercrtico no presentaron actividad
frente al radical DFPH.

Da Porto y col. (2014) encontraron que la extraccin supercrtica de bagazo de uva blanca en
dos etapas, utilizando agua como modificador en la primera y etanol en la segunda, favoreca
la extraccin de proantocianidinas.

Casas y col. (2010) encontraron que las condiciones ptimas para la extraccin de resveratrol a
partir de bagazo prensado con dixido de carbono fueron 400 bar, 35 C y 5 % de etanol como
cosolvente. Operando en estas condiciones la recuperacin de resveratrol fue mayor que la
obtenida mediante extraccin convencional con metanol acidificado. Louli y col. (2004)
llevaron a cabo la extraccin con dixido de carbono supercrtico a partir de los extractos de
bagazo prensado obtenidos con acetato de etilo. A partir de presiones superiores a 100 bar se
obtuvieron mejoras en los rendimientos de extraccin y actividad antioxidante de los extractos
que presentaron capacidad antioxidante similar al BHT o a extractos de romero. En otro
trabajo, se encontr que los extractos obtenidos a partir de bagazo de uva mediante dixido
de carbono supercrtico presentaban una elevada actividad antimicrobiana. Los compuestos
presentes en mayor proporcin fueron los cidos glico, benzoico y vanllico, as como
epicatequina (Oliveira y col., 2012).

Dado el carcter apolar del dixido de carbono supercrtico, algunos autores han utilizado esta
tcnica como alternativa al pretratamiento de la materia prima con disolventes orgnicos tales

57
Introduccin

como el hexano. Vatai y col. (2009) desarrollaron un proceso de extraccin en dos etapas que
inclua el pretratamiento con dixido de carbono supercrtico con el fin de eliminar
compuestos no polares. Los resultados mostraron que, en general, la etapa de extraccin con
fluidos supercrticos mejor la extraccin final de compuestos fenlicos, aunque la cantidad de
antocianinas extradas no se vio afectada por el tratamiento.

Pinelo y col. (2005a) compararon los resultados obtenidos mediante extraccin convencional a
partir de bagazo prensado de uvas blanca y tinta, as como del bagazo destilado residual
resultante del proceso de elaboracin de bebidas espirituosas. En todos los experimentos
realizados la concentracin de compuestos fenlicos y su actividad antioxidante fue mayor en
el caso de los bagazos sometidos al proceso de destilacin. Durante dicho proceso se alcanzan
temperaturas entre 120 y 130 C, que favorecen la combinacin de compuestos fenlicos en
reacciones de polimerizacin. Los oligmeros obtenidos, debido a su mayor rea de
deslocalizacin de carga, presentan mayor actividad antioxidante que los monmeros
originales. Adems, los extractos obtenidos a partir de bagazo destilado presentaron mayor
estabilidad trmica que otros antioxidantes sintticos como BHA o BHT (Cruz y col., 2007).

Se han propuesto distintas alternativas para la extraccin de compuestos antioxidantes a partir

de bagazo destilado (Cruz y col., 2004). La alternativa ms simple de aprovechamiento consiste
en una etapa de prensado para recuperar el lquido retenido en el bagazo y su posterior
liofilizacin. Se obtiene as un extracto con un rendimiento del 0,47 % y una capacidad
antioxidante moderada frente al radical DFPH (CE50 = 0,72 g/L). Podra obtenerse un
aprovechamiento ms completo del bagazo destilado si una vez prensado se somete a una
etapa de extraccin con agua caliente para la recuperacin de compuestos fenlicos de la
matriz slida. Adems este tratamiento incrementara la aplicabilidad para su uso en
compostaje.

Tambin se ha llevado a cabo la extraccin mediante fluidos supercrticos del bagazo destilado.
Los extractos obtenidos fueron en general ms activos frente al radical DFPH que aqullos
obtenidos mediante extraccin convencional con agua o etanol. Los perfiles cromatogrficos
confirmaron la extraccin de distintas clases de compuestos fenlicos con cada una de las
tcnicas. Los extractos obtenidos mediante extraccin convencional contenan ms
proantocianidinas, mientras que los extractos supercrticos contenan bsicamente cido
glico, catequina y epicatequina (Pinelo y col., 2007).

58

Faras-Campomanes y col. (2013) estudiaron la viabilidad econmica de una planta de
extraccin supercrtica de 0,5 m3 de capacidad a partir de bagazo de uva. El coste estimado
para una concentracin fenlica en el extracto de aproximadamente 23 g/kg result de 133,16
$/kg.
Tabla 1.5: Recuperacin de compuestos antioxidantes a partir de residuos de la uva.
Material Condiciones extraccin
Extraccin con disolventes
Bagazo prensado de Agua/Etanol acidificado
uva tinta 25 mL, (5,5 mL/g)
700 rpm, 15 min
Bagazo destilado de Extraccin continua:
uva blanca 27 g bagazo
Agua, Etanol
40 y 50 C
2 y 4 mL/min
Bagazo prensado Extraccin asistida por
ultrasonidos
5 g, Metanol 75 %
15 min
Piel y semillas Hexano + Metanol, Etanol,
Etanol 50%, Isopropanol o
Acetato de etilo
pH: 1,5-3,6
30 min-24 h
3:1-12:1 (mL/g)
Bagazo prensado Soxhlet Hexano + Acetato de
etilo, Metanol o Agua
Bagazo prensado y 10 g bagazo
bagazo destilado Metanol, Etanol 96%, Agua,
140 rpm
25 y 50 C, 30 y 90 min
1:1 y 5:1 (mL/g)
Bagazo prensado Etanol, Acetato de etilo:
de uva tinta Agua (9:1)
28 y 64 C, 5 y 24 h
Bagazos prensados Etanol, 25 C, 90 min, 1:1
de uva blanca y (mL/g), 140 rpm
tinta
Introduccin
Rendimientosde extraccin Actividad antioxidante Referencia
FT (mg EAG/100 g): 2320-7259 AADFPH (mM EqT/g): 2.91 Makris y col.,
Flavonoides (mg EC/100 g): 2008
1443-7222
AT (mg EC/100 g): 114,2-156,6
ET (%): 1,5 A; 0,065 E - Guerrero y col.,
2008
FlavT (mg/100 g bagazo): 29- TBARS (g): 248-751 Gonzlez-Params
199 Valor TEAC: 10-42 y col., 2004
FT (%): 2.89 2 PIDFPH (%): 93,32 Lafka y col., 2007
ET (%): 3,9 (AE); 5,6 (M); 1,1 PIDFPH (%): 42,1 (AE); 67,3 (M); Chidambara
(A) 9,1 (A) Murthy y col.,
3
AAPL (%): 71,74 2002
4 4
AALDL (%): 91,2 ; 84,6
ET (%): 4,25-15,07 (E); 3,84- PIDFPH (%): 9,63-93,52 (M); 5,23- Pinelo y col.,
14,96 (M); 5,12-13,21 (A) 65,96 (E); 2,8-34,41 (A) 2005a
FT (mg/L):56,9-493,4 (M); 28,4-
361,9( E); 15,2-179,4 (A)
FT (%)4: ~ 0.5 (E), ~0.3 (AE), CAAC, 200 ppm: 40-80 Spigno y Faveri,
Pureza (%): ~ 9 (E); ~ 9 (AE) 2007
Spigno y col.,
2007
FT (ppm): 250 (uva blanca); EC50,DFPH(g/L): 0,2 (uva tinta); Rubilar y col.,
350 (uva tinta) 1,0 (uva blanca) 2007
TBARS(%): 65 (uva tinta), 62
(uva blanca)
59
 Introduccin
Tabla 1.5: Recuperacin de compuestos antioxidantes a partir de residuos de la uva (continuacin).
Material Condiciones extraccin
Bagazo prensado de Bagazo desgrasado con
uvas Pinot noir (PN) hexano
y Pinot meunier Acetona 50 %, Etanol 50 %,
(PM) Metanol 50 %
25 C, 40 min, 5:1 (mL/g)
Bagazo prensado 50 g, 100 mL, 1-24 h
Etanol (70 %), Metanol
(70%), Agua
Bagazo prensado Etanol 80 % con
de uva tinta 0,5 % 0,1 N HCl
10:1 (mL/g)
Bagazo destilado Agua acidificada
Etanol 60% acidificado
250 rpm, 6 h, 70 C, 9:1
(L/kg)
Piel y semillas de 1 g bagazo liofilizado
uva tinta Metanol/agua/cido acetico
(80:20:5)
50 mL, 1 h, 4 C
Bagazo de uva tinta 1 g bagazo liofilizado
Metanol/Agua/cido acetico
(80:20:5)
50 mL, 1h, 4C
Bagazo de distintas Metanol + 1 % HCl 1N
variedades de uva 50 g bagazo
tinta 300 mL x 3
4 h, 25 C
Bagazo de distintas Metanol (75%)
variedades de uva 5 g bagazo
blanca 25 mL
1h
Extraccin con CO2 supercrtico
Bagazo de uva 4,6 g bagazo; 100 y 400 bar,
blanca 35 y 55 C; Etanol (5 %)
Rendimientosde extraccin
PN: ET (%): 8 (AE), 6.8 (E), 8.9
(M); FT (mg EAG/g): 148.3 (AE),
112,5 (E), 124,2 (M)
PM: ET (%): 50,7 (AE), 37,7 (E),
53,0 (M); FT (mg EAG/g):
77,5 (AE), 64,2 (E), 55,2 (M)
FT (mg/L): 193,6-951 (A);
801,3-5790,1 (E (70 %)), 974,4-
6782,8 (M (70 %)).
AT (mg/L): 56,5-155,3 (A);
282,0-338,6 (E (70 %)); 236,7-
325,2 (M (70 %))
FT (g EAG/100 g): 4,19
FT (mg EAG/L): 1890-3962
FT (mg EC/100 g)6: 1055 (piel),
8463 (semillas)
FlavT (mg EC/100 g)6: 161
(piel), 5762 (semillas)
ET (%): 15-25
FT (mgEAG/g)6: 32,62-74,75
ET (%): 3,54-5,76
FT (mg/g): 6,91-49,33
AT(mg/g): 3,75-45,27
FlavT (mg/g): 1,04-4,64
FT (mg EAG/100 g)6: 455-3113
FlavT (mg/100 g)6: 315-874
FlavoT (mg/100 g)6: 33/16
AcFT (mg/100 g)6: 11-35
ET (mg/100 g): 90-2176
6
EResv (mg/100g) : 0,4-19,2
(ED: 0,9 7); CRes(mg/100g):
0.93-10.73 (EC: 8.827)
60
Actividad antioxidante Referencia
PN:EC50,DFPH (g): 190,9 (AE), Cheng y col.,
304,0 (E), 321,1 (M) 2012
PISO, 150g (%): 42,3 (AE), 40,6 (E),
32,6 (M)
PM: EC50,DFPH (g): 1072,5 (AE),
1575,5 (E), 1753,1 (M)
PISO, 150 g (%): 39,7 (AE), 31,5
(E), 38,8 (M)
PIDFPH (%): 1,5-6,2 (A); 4,7-38,6 Lapornik y col.,
(E); 3,7-47,3 (M) 2005
CAAC: 43,4-74,9 (A); 62,3-
443,9 (E); 63,4-4236 (M)
AAc (%): 20,215 Negro y col., 2003
- Brazinha y col.,
2014
AADFPH (mol Trolox/100 g): Rockenbach y col.,
2076 (piel), 8517 (semillas) 2011a
FRAP (mol Fe+2/100 g): 2524
(piel), 10,72 (semillas)
ABTS (mol Trolox/g): 93,36- Rockenbach y col.,
475,42 2011b
DPPH (mol Trlox/g): 188-
505,52
FRAP (mol Trolox/g): 117,79-
247,6
CE50, DFPH (g/mL): 14,45-38,93 Ruberto y col.,
TEAC: 1,58-2,24 2007
ABTS (mmol Trolox/100 g Jara-Palacios y
bagazo): 22,5-59,42 col., 2014
- Casas y col., 2010
 Introduccin

Material Condiciones extraccin Rendimientosde extraccin Actividad antioxidante Referencia

Bagazo 150 bar; 40 C ET (%): 2,7 (0 % E); 9.2 (15 % E) CE50, DFPH (g/mL)> 250 de Campos y col.,
Etanol (0-20%) ( ~13 % SX-EtOH) (49,5 SX-EtOH) 2008
FT (g EAG/ mg): nd
(3,4 SX-EtOH)
Bagazo destilado de 350 y 80 bar; S1: 60 % ET (%): 2,5-28,9 PIDFPH (%): 10-70 (S1); 36-73 Pinelo y col., 2007
uva blanca Pextractor; S2: 10 bar; 35 C, 60 (ED: 1,79-8,54 (E); 1,86-7,14 (S2)
min (A)) (ED: 7,65-68 (E); 1,20-20,70
FT (ppm): 67,8-388,6 (S1), (A))
52,6-473,5 (S2)
(ED: 19,7-170,9 (E); 4,8-82,8
(A))
Bagazo de uva tinta 150 y 300 bar; 40 C; FT (mg EAG/g)6: ~5-19 - Vatai y col., 2009
0-0,2 mL/min Etanol (ED (Etanol 50 %, 60 C): 49,7)
0,1-0,5 L/min C02
Bagazo de uva tinta ED: Acetato etilo (75 C, 400 FT (%)6: 4,3-18,1 CE50, DFPH(mg/mg): 0,24-1,97 Louli y col., 2004
mL, 120 g, 8 h) + EFSC: (100, (residuo), 13,4-20,3 (extracto)
250 bar, 45 C, Metanol (0-5
%))
Bagazo 200-350 bar; 40 C, Etanol ET (%): 2,2-5,5 - Faras-
(10%) FT (g/kg): 20-23 Campomanes y
col., 2013
Bagazo 150-300 bar; 50-60 C; 4 h, ET (%): 4-14 - Oliveira y col.,
25 g; 13 g CO2/min; Etanol 2013
(0-17,5 %)
Bagazo de uva 100, 200 bar; 40-60 C; 300 ET (%): 6,9-10,8 AADPPH (mg -tocoferol/100 g): Da Porto y col.
blanca min; 6 kg CO2/h; Etanol (15 (ED (Metanol): 15,6) 698,6-2649,6 2014
%) Metanol (15 %) FT (g EAG/kg): 38,8-68 (ED (Metanol): 677,9)
(ED (Metanol): 180)

Referencias en base seca.

(1) Valor para 57% etanol + 0,01 % SO2
(2) Valor para etanol 50 % tras 3 h de extraccin
(3) Concentracin de extracto: 200 ppm
(4) Concentracin de extracto: 100 ppm
(5) Concentracin de compuestos fenlicos: 10 ppm
(6) Respecto al bagazo inicial
(7) Extraccin convencional: metanol/HCl (0,1 %), 25 g de muestra, 50 mL disolvente, 30 minutos
nd: No detectado.
Abreviaturas: A: Agua; AAc: actividad antioxidante frente a la oxidacin del -caroteno; AADFPH: Actividad antioxidante frente al radical
DFPH; AALDL: actividad antioxidante frente a la oxidacin LDL; AAPL: Actividad antioxidante frente a la peroxidacin lipdica; AE: Acetato de
etilo; AT: Antocianinas totales; CAAC: Coeficiente de actividad antioxidante al -caroteno; CE50,DFPH: Concentracin de extracto necesaria
para captar el 50 % del radical DFPH; CE50,TBARS: Concentracin de extracto necesaria para captar el 50 % del radical TBARS; CRes:
Concentracin resveratrol; E: Etanol; EAG: Equivalentes de cido glico; EC: Equivalentes de catequina; ED: Extraccin con disolventes;
EFSC: Extraccin con fluidos supercrticos; EResv: Extraccin resveratrol; ET: Extraccin total; FlavT: Flavanoles totales; FT: Fenoles
totales; M: Metanol; PIDFPH: Porcentaje de inhibicin del radical DFPH; PISO: Porcentaje de inhibicin del radical superxido; S1:
Separador 1; S2: Separador 2; SX-EtOH: Extraccin en Soxhlet con etanol.

61
Introduccin

Giacobbo y col. (2013a, 2013b, 2015) estudiaron el empleo de distintas membranas de MF, UF
y NF con el fin de fraccionar los polisacridos y compuestos fenlicos en las corrientes de las
generadas durante el proceso de elaboracin del vino.

La purificacin mediante tecnologa de membranas de los extractos crudos obtenidos a partir

de residuos vitivincolas apenas ha sido estudiada. Shi y col. (2005) emplearon membranas de
UF para la concentracin de los extractos obtenidos mediante disolventes orgnicos a partir de
bagazo prensado. La tecnologa de membranas se ha utilizado tambin para la concentracin
de compuestos fenlicos (Nawaz y col., 2006) y la obtencin de distintas fracciones de
proantocianidinas (Santamara y col., 2002) a partir de los extractos crudos obtenidos de
semillas de uva. Galanakis y col. (2013) utilizaron distintas membranas de UF para recuperar
compuestos fenlicos a partir de los extractos alcohlicos de los lodos generados durante la
decantacin del vino. La membrana de polisulfona de 100 kDa permiti separar los
compuestos fenlicos de la pectina, mientras que con la membrana de fluoropolmero de 1
kDa permiti separar cido hidroxicinmicos de antocianidinas y flavonoides en el permeado y
retenido, respectivamente.

1.3.2. RESIDUOS FORESTALES: HOJA Y ERIZO DE CASTAO

El castao europeo (C. sativa) es un rbol de hoja caduca que crece en el sur de Europa,
especialmente en la regin del Mediterrneo y los Balcanes. En Galicia, se dedican a su cultivo
aproximadamente 45000 hectreas (Molina Rodrguez y col., 2014). Las semillas de C. sativa se
utilizan en pediatra para el tratamiento de la gastroenteritis y como dieta libre de gluten en
casos de enfermedad celaca (Hiermann y col., 2002).

La castaa, su fruto de temporada, se recolecta en otoo y ha sido tradicionalmente un

alimento bsico que puede ser transformado en diferentes productos elaborados. Gracias a su
composicin nutricional, completamente libre de colesterol, con bajo contenido de grasa, bajo
contenido en sodio y alto en potasio y un contenido moderado pero de alta calidad en
protena, la castaa constituye un alimento equilibrado (ivkovi y col, 2009b). En Galicia, se
producen aproximadamente 22 toneladas al ao de este fruto, de los cuales 7000 toneladas
son procesados por la industria alimentaria para producir derivados como el marron glac o
crema de castaa (Vzquez y col., 2009a). Como resultado de su recoleccin y procesado, se
producen como residuos los erizos y las cscaras de la castaa. En la actualidad, las cscaras no
tienen aplicaciones comerciales y se emplean como combustible. El desarrollo de aplicaciones
alternativas para estos desechos podra contribuir a la valorizacin de los principales

62
 Introduccin

constituyentes y para una utilizacin integral de los recursos renovables de bajo coste y de
origen residual (Gonzlez-Lpez y col., 2012). El uso de la cscara de la castaa como fuente de
compuestos antioxidantes ha sido estudiado por varios autores (Vzquez y col, 2008, 2009b;
Barreira y col., 2010; Gonzlez-Lpez y col., 2012; Fernndez-Agull y col., 2014).

En la bibliografa se encuentran escasas referencias relativas a la extraccin de compuestos

fenlicos y actividad de los extractos obtenidos a partir de erizos de castaa (Tabla 1.6). Los
compuestos fenlicos identificados incluyen cidos fenlicos como el cido glico y el cido
protocattico, flavonoides como la quercetina, la rutina y la apigenina (Conde y col., 2011a) y
cido elgico (Vzquez y col., 2012).

Se ha llevado a cabo la extraccin convencional de erizos de castaa con distintos disolventes.

El rendimiento de extraccin, el contenido en compuestos fenlicos y la actividad de los
extractos obtenidos aumentaron con la polaridad del disolvente utilizado, alcanzndose los
mejores resultados con agua seguida de metanol, etanol y acetona (Vzquez y col., 2009).
Vzquez y col. (2012) estudiaron el efecto de la temperatura, el tiempo de extraccin y la
concentracin de etanol y metanol en agua. En las condiciones ptimas obtenidas (75 C, 75
min, metanol al 50 %) se obtuvo un rendimiento en compuestos fenlicos de 36,32 %. Los
extractos obtenidos mostraron capacidad de inhibir el crecimiento de bacterias gram positivo y
gram negativo, adems mediante la utilizacin de microondas bajo las mismas condiciones de
operacin se consigui reducir ligeramente el tiempo de extraccin (Fernndez-Agull y col.,
2014). Los extractos obtenidos mediante extraccin asistida con ultrasonidos presentaron
buena capacidad de captacin del radical superxido y actividad antimicrobiana,
especialmente frente a Micrococcus pyrogenes var. Albus y Salmonella typhimurium (ivkovi y
col., 2010). Adems, los extractos antioxidantes obtenidos a partir de erizos de castaa
podran resultar beneficiosos en pacientes hipertensos (ivkovi y col., 2008).

Conde y col. (2011a) propusieron el proceso de autohidrlisis como alternativa para la

obtencin de compuestos fenlicos de naturaleza antioxidante a partir de erizos de castaa
Los licores procedentes del proceso de autohidrlisis se extrajeron con acetato de etilo y los
solutos presentes en la fase orgnica se redisolvieron en etanol:agua con el fin de recuperar
compuestos ms polares. Los extractos crudos obtenidos se purificaron mediante adsorcin-
desorcin con resinas polimricas, obteniendo un producto con propiedades antioxidantes
similares a los antioxidantes sintticos y alta accin protectora para la oxidacin lipdica en
aceites y emulsiones (Conde y col., 2011b).

63
Introduccin

Tabla 1.6: Obtencin de compuestos antioxidantes a partir de erizos de castaa.

Condiciones de Rendimiento de
Disolvente Actividad antioxidante Referencia
extraccin extraccin

Etanol 50 % Ultrasonidos ET (%): 1,82 PI (%)0,2 mg/mL: 792 ivkovi y col., 2010
50 g: 250 mL FT (%): 0,49
30 min Flavonoides (%): 0,131
Acetona, Soxhlet 15 h ET (%): 2,43 (Ac)-21,24 FRAP (nmol EAA/mg): 379 Vzquez y col., 2009a
Metanol, Etanol 1:10 (g/g), 90 (A) (Ac)-2120 (A)
Agua C, 1 h FT (g EAG/100 g): 12,27 ABTS (mmol ETR/g): 0,70
(Ac)-37,64 (A) (Ac)-3,59 (A)
DPPH (mmol ETR/g): 1,54
(Ac)-3,68 (A)
Metanol (50-90 25-75 C M(50 %, 75 C, 75 min): FRAP (nmol EAA/mg): Vzquez y col., 2012
%) 30-120 min ET (%):18,95 2361(M), 1547(E)
Etanol (50-90 %) 1:10 (g/g) FT (g EAG/100g): 36,32 ABTS (mmol ETR/g): 3,42
E(50 %, 75 C, 30 min): (M), 2,43(E)
ET (%):17,95 DPPH (mmol ETR/g): 3,58
FT (g EAG/100 g): 26,11 (M), 2,95 (E)
Agua Autohidrlisis ET(%): 16,42 CE50, DFPH (mg/L): 346 Conde y col., 2011a,b
220C FT (g EAG/100 g): 4,35 CE50, TEAC (mg/L): 419
8:1 (g/g) ORAC100ppm (M Trolox):
22,5
FRAP (mM Eq. cido
ascrobico): 0,23
CAAC, 100 ppm: 534
Agua, Metanol 25-20-75 C ET (%): 8,54-19,58 Fernndez-Agull y col.,
(50%), Etanol 2014
(50%)

Referencias en base seca.

(1) Expresado como equivalentes de catequina.
(2) Respecto al radical superxido.
Abreviaturas: A: Agua; Ac: acetona; EAA: Equivalentes de cido ascrbico; EAG: Equivalentes de cido glico; ET: Extraccin
total; ETR: Equivalentes de Trolox; : FT: Fenoles totales; M: Metanol; PI: Porcentaje de inhibicin.

Las hojas de C. sativa se han utilizado tradicionalmente como remedio popular para tratar la
tos, la diarrea y las enfermedades reumticas as como dolores de espalda y de articulaciones
o msculos. Al igual que en otras plantas medicinales, sus efectos beneficiosos sobre la salud
han sido atribuidos a la presencia de compuestos fenlicos (ivkovi y col., 2009a,b). Los
compuestos fenlicos identificados incluyen cidos fenlicos como cido glico (Henry y col.,
2005), clorognico y elgico (Almeida y col., 2008a), taninos (Calliste y col., 2005) y flavonoides
como rutina, hesperidina, quercetina, apigenina, morina, galangn, kaempferol, isoquercitrina,
astragaln, naringin y narcisin (Basile y col., 2000; Almeida y col, 2008b; Calliste y col., 2005;
Henry y col., 2005).

64
 Introduccin

En la Tabla 1.7 se recogen ejemplos de la extraccin de compuestos fenlicos antioxidantes a

partir de hojas de castaa. Segn Calliste y col. (2001) los extractos con agua, metanol y
acetato de etilo presentaron buena capacidad antioxidante frente al radical DFPH, anin
superxido e hidroxilo, comparada con extractos obtenidos a partir de Vitis vinfera, mientras
que las fracciones de acetato de etilo obtenidas de los extractos crudos de etanol:agua
mostraron actividades intermedias a las presentadas por la quercetina y la vitamina E, y
comparables a las de otros extractos puros como el Pycnogenol (Calliste y col., 2005). La
actividad de los extractos etanol:agua frente a especies reactivas de oxgeno fueron similares a
la del cido ascrbico y mayores que la del Trolox (un derivado sinttico hidrosoluble de la
vitamina E). Dichos extractos resultaron ser incluso ms activos frente a especies reactivas del
nitrgeno (Almeida y col., 2008a). Barreira y col. (2008, 2010) confirmaron la capacidad
antioxidante de los extractos de hoja de castaa obtenidos con agua caliente en los ensayos de
inhibicin del -caroteno, poder reductor y hemodilisis oxidativa.

Adems de los estudios in vitro para la capacidad antioxidante de los extractos de hoja de
castaa, Mujid y col. (2011) comprobaron in vivo el potencial de dichos extractos para prevenir
el estrs oxidativo en clulas.

Tambin se ha comprobado la capacidad antimicrobiana de los extractos de hoja de castaa

(Hao y col., 2012). Las fracciones solubles en acetato de etilo de extractos acuosos de hoja de
castaa mostraron una potente accin frente a bacterias gram positivas y gram negativas
(Basile y col., 2000), mientras que extractos etanlicos presentaron buena actividad
microbiana frente a Lactococcus lactis ssp. Lactis, Micrococcus pyrogenes var. albus y
Staphylococcus aureus (ivkovi y col., 2010).

Los extractos de hoja de castaa obtenidos mediante diferentes disolventes han sido
propuestos para su utilizacin como componentes en cosmticos (Henry y col., 2005). Se han
llevado a cabo pruebas de irritabilidad en piel in vivo para extractos en etanol:agua
presentando una tolerancia aceptable (Almeida y col., 2008b) lo que favorece su uso potencial
como antioxidante tpico (Almeida y col., 2014, 2015).

65
Introduccin

Tabla 1.7: Obtencin de compuestos antioxidantes a partir de hoja de castao.

Condiciones Rendimiento de
Disolvente Actividad antioxidante Referencia
de extraccin extraccin
Agua 25 g: 500 mL - PIDFPH (%): 68,91 (A); 78,91 Calliste y col., 2001
2
Metanol (M) 35 (AE)
Acetato de etilo PISO, 0,5 mg/mL(%): 90 (A); 65
(M); 60 (AE)
PIOH, 0,5 mg/mL(%): 62 (A); 81
(M); 5 (AE)
Agua:Acetona 25 g: 250 mL ET (%): 3.4 CE50, DFPH (g/mL): ~17 Calliste y col., 2005
(1:2) 60 C FT (%): 27,13 CE50, SO (g/mL): 3,0
30 min CE50, OH (g/mL): 91
Etanol 70% 2 g:50 mL x 5 - CE50 (g/mL): 13,6 (O2-); Almeida y col., 2008a
10 min, 40 C, 216 (HO); 410 (H2O2); 12,3
500 rpm (1O2); 3,10 (NO)
Agua 2 g: 50 mL x 3 FT (mg EAG/g): 269,2 CE50, DFPH(g/mL): 17,7(A); Almeida y col., 2008b
Etanol 40 % 20 min, 500 (A); 273,9 (E (40 %)); 14,6 (E (40 %));
Etanol 70 % rpm 295,3 (E (70 %)); 13,9(E (70 %)); 23 (E)
Etanol 195,9 (E)
CF4 (E (70 %)): 2,8 (ACl);
3,5 (Ho); 3,0(Iq); 5,9
(Ru); 4,2 (AEl)
Agua 5 g: 50 mL ET (%): 20,9 CE50 (g/mL): 170 (DFPH); Barreira y col., 2008
100 C, 30 min FT (mg EAG/g): 20,3 313 (PR), 145 (c), 169
Flavonoides (mg/g): (IH), 31,4 (POL)
5
54,5 TBARS 0,25 mg/mL (%): 47,7
Agua 1 h, 150 rpm ET (%): 13,73-17,67 CE50 (g/mL): <400 (DFPH); Barreira y col., 2010
FT (mg EAG/g): 228,37- 129,8-361,06 (PR); 64,14-
522,98 160,04 (c); 69,04-133,52
Flavonoides (mg/g): (POL)
5
73,31-90,39
Etanol 50 % Ultrasonidos ET (%): 4,94 PI DFPH (%)0,2 mg/mL: 21,4 ivkovi y col., 2009a,b
50 g: 250 mL FT (%): 1, 40
30 min, 50 Hz, Flavonoides (%): 0,325
125 W

Referencias en base seca.

(1) Concentracin de extracto: 0,1 mg/mL
(2) Concentracin de extracto: 0,5 mg/mL
(3) Expresado como equivalente de pirogalol
(4) Expresado como mg/g extracto liofilizado
(5) Expresado como equivalentes de catequina
Abreviaturas: c: -caroteno; A:Agua; ACl: cido clorognico; AE: Acetato de etilo; AEl: cido elgico; CE50, DFPH: Concentracin de
extracto necesaria para captar el 50 % del radical DFPH; CE50,OH: Concentracin de extracto necesaria para captar el 50 % del
radical hidroxilo presente; CE50,SO: Concentracin de extracto necesaria para captar el 50 % del radical superxido presente; E:
Etanol; EAG: Equivalentes de cido glico; ET: Extraccin total; FT: Fenoles totales; Ho: Hipersido; IH: Inhibicin de la hemlisis;
Iq: Isoquercitrina; M: Metanol; PIDFPH: Porcentaje de inhibicin del radical DFPH; PIOH: Porcentaje de inhibicin al radical hidroxilo;
PISO: Porcentaje de inhibicin al radical superxido; POL: Peroxidacin lipdica; PR: Poder reductor; Ru: Rutina.

66
 Introduccin

1.2.3. FRUTOS DEL BOSQUE

Los frutos del bosque, como las frambuesas y arndanos, constituyen un grupo de pequeos
frutos jugosos globulares. Representan aproximadamente el 2 % de la produccin mundial de
frutas, con volmenes superiores a los 4,4 millones de toneladas (segn datos de la FAO, 2003)
y un mercado que registra tasas de aumento crecientes durante ms de diez aos
ininterrumpidos, siendo los principales pases productores Estados Unidos, Rusia y Canad.

Los frutos del bosque son una fuente importante de compuestos fenlicos y sus efectos
beneficiosos sobre la salud debidos a su actividad antioxidante han sido ampliamente
estudiados (Scalzo y Mezzetti, 2010).

Las antocianinas constituyen el principal grupo de compuestos fenlicos en los frutos del
bosque y son responsables de su color. Se encuentran generalmente en forma de mono-, di- y
tri- glicsidos (Szajdek y Borowska, 2008). La quercetina y la miricetina son dos de los
flavonoides ms comnmente encontrados en los frutos del bosque (White y col., 2010), los
cidos fenlicos estn representados por el cido cinmico y derivados del cido benzoico. Se
presentan principalmente enlazados a glucsidos (Zadernowski y col., 2005). De entre los
derivados del cido benzoico se han encontrado el cido p-hidroxibenzoico, cido saliclico,
cido glico y cido elgico, y en el grupo de los derivados del cido cinmico se ha
determinado la presencia del cido p-cumrico, cido cafeico y el cido ferlico (Szajdek y
Borowska, 2008; Vattem y col., 2005). Los taninos son un componente importante de frutos
del bosque, siendo los responsables de su sabor amargo y de cambios en el color del fruto. Los
taninos ms importantes presentes en las frutos del bosque incluyen proantocianidinas y
steres de cido glico (Szadjek y Borowska, 2008).

El residuo slido resultante del prensado de las frutas para la obtencin de zumos est
compuesto principalmente de la piel, la pulpa y las semillas. Tradicionalmente este
subproducto se ha usado como un ingrediente en la alimentacin animal pero, debido a su
bajo contenido en protenas e hidratos de carbono, carece de valor nutritivo. Su eliminacin
directa representa una prdida considerable de potencial econmico as como problemas
ambientales asociados su bajo pH. Sin embargo, dichos residuos an contienen cantidades
importantes de compuestos fenlicos por lo que pueden ser utilizados como materia prima
para la obtencin de compuestos antioxidantes naturales (Vattem y col., 2005; Zhou y col.,
2009).

67
Introduccin

White y col. (2010) estudiaron la composicin fenlica del residuo slido resultante del
prensado de arndanos mediante extraccin convencional con una mezcla de acetona, agua y
cido actico. Encontraron hasta seis tipos distintos de antocianidinas, miricetina y quercetina
como flavonoles ms abundantes y procianidinas con distintos grados de polimerizacin.

La recuperacin de compuestos fenlicos a partir del residuo slido resultante del prensado de
frutas del bosque se ha llevado a cabo tanto mediante la extraccin convencional con
disolventes como con tecnologas alternativas incluyendo la extraccin con dixido de carbono
supercrtico (Tabla 1.8).

Los disolventes ms utilizados en la bibliografa para la extraccin convencional de compuestos

fenlicos a partir del residuo prensado de frutas del bosque son etanol, metanol, acetona y
agua. La extraccin con metanol posterior a un lavado con agua del residuo de grosella negra
condujo a una fraccin antioxidante rica en antocianinas (Juedtz y col., 2013). Los extractos
etanlicos y metanlicos de grosella roja y negra resultaron ser hasta dos veces ms ricos en
compuestos fenlicos que los extractos acuosos. El metanol y el etanol son disolventes menos
polares que el agua lo que facilita la degradacin de las paredes celulares, de carcter apolar,
favoreciendo la liberacin de los polifenoles. Adems, el contenido fenlico de los extractos
alcohlicos se vio favorecido por tiempos de extraccin largos (Lapornik y col., 2005). Vulid y
col. (2011) utilizaron metanol al 80 % con pequeas cantidades de cido actico para la
extraccin de prensados de arndano, mora, fresa y frambuesa. El mayor rendimiento en
compuestos fenlicos se obtuvo para el arndano. El extracto de fresa present la mayor
actividad antioxidante frente al radical DFPH, mientras que el de mora present el menor
poder reductor.

Raghvan y Richards (2007) utilizaron agua, etanol y acetona en distintas proporciones para la
extraccin del prensado de arndano, tanto en extraccin convencional como asistida por
microondas. En ambos casos los extractos acuosos fueron los menos efectivos en la inhibicin
de la oxidacin lipdica debido a la menor capacidad del agua para extraer polifenoles del
slido prensado. El disolvente ms eficaz en la extraccin convencional result ser la acetona
mientras que para la extraccin asistida por microondas fue el etanol, y estos extractos
presentaron mayor actividad antioxidante. Zhou y col. (2009) evaluaron la capacidad
antioxidante frente al radical ABTS+ de los extractos de distintos tipos de prensado de Myrica
rubra sieb. et Zucc., mediante extraccin asistida por ultrasonidos utilizando metanol al 80 %
como disolvente.

68
 Introduccin

La tecnologa de fluidos supercrticos se ha utilizado en la extraccin de antocianinas a partir

del prensado de baya de saco (Sambucus nigra L.). La extraccin se llev a cabo a 40 C y 200
bar en dos etapas: una primera etapa solo con CO2 para eliminar compuestos apolares y una
segunda etapa con distintas mezclas de etanol, agua y CO2. La presencia de agua tanto en la
materia prima como en la mezcla disolvente favoreci altos rendimientos de extraccin y
contenido de antocianinas (Seabra y col., 2010a). Adems, el empleo de mezclas de agua y
etanol como cosolvente da lugar a mayores contenidos en antocianinas y mejor capacidad
antioxidante de los extractos de baya de saco y arndano (Seabra y col., 2010a,b; Paes y col.,
2014). Peschel y col. (2006) utilizaron la extraccin con dixido de carbono supercrtico con
residuos de fresa. El mximo contenido en compuestos fenlicos se obtuvo a 350 bar y 60 C
empleando etanol al 50 % como modificador. Pasquel-Retegui y col. (2014) llevaron a cabo la
extraccin supercrtica asistida por ultrasonidos de residuos de mora. La influencia de los
ultrasonidos fue significativa especialmente a la presin ms baja utilizada (15 MPa),
incrementndose significativamente el rendimiento de extraccin y la capacidad de los
extractos obtenidos.

69
 Introduccin

Tabla 1.8: Extraccin de compuestos fenlicos a partir de bagazos de distintas bayas

Material Condiciones extraccin Rendimiento de extraccin Actividad antioxidante Referencia

Extraccin con disolventes

Arndano 21 g, 105 mL, 2 h ET (%): 2,2-9,9 TBARS: Acetona > Etanol > Raghavan y
(Vaccinium Etanol, Acetona, Agua, FT (mmol/g)1: 0,02-0,28 Agua Richards, 2007
macrocarpon) Etanol (50 %), Acetona (50
%)
Baya del saco 1:10 (w/v), 40 C, 15 min ET(%):15,9 (E(80 %); 33,3 (A) CE50, DFPH (g): 48 (E80), 86 Seabra y col.,
(Sambucus Etanol (80 %) CF (mg/g) E: 61 (Cis); 78 (Cig);153 (A) 2010 a,b
nigra L.) Agua (AT); 13 (Ru)
CF (mg/g) A: 30 (Cis); 31 (Cig); 67
(AT); 6 (Ru)
Grosellas rojas 50 g, 100 mL, 1-24 h FT (mg EAG/L): 401,8-696,4 (A); PIDFPH (%): 1,0-4,3 (A), 5,5- Lapornik y col.,
(Ribes rubrum Etanol (70 %), 884,1-1166,4 (E), 826,4-1165,5 7,1 (E); 5,8-6,8 (M) 2005
var. Rondom) Metanol (70 %), Agua (M). CAAC: 63,3-69,2 (A); 71,6-
AT (mg/L): 56,5-155,3 (A); 282,0- 72,6 (E); 71,8-74,5 (M)
338,6 (E); 236,7-325,2 (M)
Grosellas 50 g, 100 mL, 1-24 h FT (mg EAG/L): 2426,1-3769,6 PIDFPH (%): 15,1-38,0 (A),
negras Etanol (70 %), (A); 6135,7-7557,9 (E), 6972,2- 33,9-43,0 (E); 43,3-49,2
(Ribes nigrum Metanol (70 %), Agua 9721,2 (M) (M)
var. Rosenthal AT (mg/L): 1693,3-2029,0 (A); CAAC: 409,0-480,1 (A);
Falch) 4213,6-6236,2 (E); 5174,3-6148,9 405,6-493,4 (E); 528,9-
(M) 538,5 (M)
2
Arndano 20 g FT (mg EAG/100 g) : 116,24 CE50, DFPH (mg/mL): 0,04 Vulid y col., 2011
Metanol (80 %) + 0,05 % FlavT (mg/100 g)2: 1047,39
cido actico AT (mg/100 g)2: 1279,49
Mora 60 min (160 mL)+ 30 min FT (mg EAG /100 g)2: 804,5 CE50, DFPH (mg/mL): 0,017
(80 mL) + 30 min (80 mL) FlavT (mg/100 g)2: 245,48
AT (mg/100 g)2: 149,12
Fresa FT (mg EAG /100 g)2: 488,12 CE50, DFPH (mg/mL): 0,038
FlavT (mg/100 g)2: 296,11
AT (mg/100 g)2: 19,48
Frambuesa FT (mg/100 g)2: 637,77 CE50, DFPH (mg/mL): 0,04
2
FlavT (mg/100 g) : 591,65
AT (mg/100 g)2: 65,21
Extraccin asistida por ultrasonidos
Bayberry 2 g bagazo liofilizado FT (mg EAG/g)2: 27,7-47,4 FRAP (mg TEAC/g): 40,4- Zhou y col.,
(Myrican 40 mL Metanol (80 %) AT (mg/kg)2: 3073,3-6219,2 71,4 2009
2
rubra Sieb. et 40 Hz, 100 W, 25 C FlavT (mg/kg) : 616,5-1647,1 DFPH (mg TEAC/g): 65,7-
2
Zucc.) 4 x 20 min AcFT (mg/kg) : 180,2-323,7 91,0
ABTS (mg TEAC/g): 82,9-
100,6

70
 Introduccin

Material Condiciones extraccin Rendimiento de extraccin Actividad antioxidante Referencia

Extraccin asistida por microondas

Arndano 3,5 g, 20 mL ET (%): 2,2-17,6 TBARS: Etanol > Acetona Raghavan y
1
(Vaccinium 125 C, 20 min FT (mmol/g) : 0,02-0,53 >Agua Richards, 2007
macrocarpon) Etanol, Acetona,
Agua, Etanol (50 %),
Acetona (50 %),
Etanol (50 %)
Extraccin con CO2 supercrtico
Baya del sauco 40 C, 20 MPa ET (%): 1,7-24,2 CE50, DFPH (g): 31-262 Seabra y col.,
(Sambucus CO2 (15 min esttico + 40 FT (%): 2,7-15,8 2010a,b
nigra L.) min dinmico) + AT (mg/g): 39-149
CO2/etanol/agua (45 min
dinmico)
Fresa 65-450 bar ptimo: 350 bar/60 C + Peschel y col.,
(Fragaria sp.) 60 C, 2 h modificador 2006
Etanol (30 %) FT (mg EAG/g): 41,2
(ED: ET (%): 17,1; FT: 59,77 (M))
Arndano 15-25 MPa, 40 C 100%CO2: AADFPH (mol EqT/g): 514- Paes y col., 2014
-4 -4
(Vaccinium 1,0510 , 1,410 kg/s ET(%):1,84-2,19, FT (mg EAG/g): 688
myrtillus L.) Etanol, Agua, Agua pH2 (10 28-36 AAABTS (mol EqT/g): 10-14
%, 50 %) ptimo:
Etanol (10 %)+Agua (40 %) ptimo (5 % Etanol+5 % Agua): AADFPH (mol EqT/g): 1658
Etanol (5 %)+Agua (5 %) ET (%):2,7; FT(mg EAG/g): 134 AAABTS (mol EqT/g): 199
Etanol (8 %)+Agua pH2 (2
%)
Etanol (4 %)+Agua pH2 (1
%)
Mora (Rubus 15, 20 MPa; 40,50 C; ET (%): 7,13-9,48 AADFPH (molEqT/g): 21,27- Pasquel-
-4
sp.) 2,7710 kg/s FT (mg EAG/g): 3,77-4,77 24,85 Retegui y col.,
300 min AAABTS (molEqT/g): 59,67- 2014
63,66

Referencias en base seca.

(1) Expresado como equivalentes en quercetina
(2) Valores respecto al bagazo fresco
Abreviaturas: A: Agua; AAABTS: Actividad antioxidante frente al radical ABT; AADFPH: Actividad antioxidante frente al radical DFPH;
AcFT: cidos fenlicos totales; AT: Antocianininas totales; CAAC: Coeficiente de actividad antioxidante como proteccin de la
decoloracin del -caroteno; CE50, DFPH: Concentracin de extracto necesaria para captar el 50 % del radical DFPH; CF: Contenido en
fenoles; Cig: Cianidin-3-glucoside; Cis: Cianidin-3-sambubioside; E: Etanol; EAG: Equivalentes en cido glico; ED: Extraccin con
disolventes; ET: Extraccin total; EqT: Equivalentes de Trolox; FlavT:Flavonoles totales; FT: Fenoles totales; PIDFPH: Porcentaje de
inhibicin del radical DFPH; Ru: Rutina.

71
2. OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO
 Objetivos y plan de trabajo

2. OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO

2.1. OBJETIVOS

El principal objetivo de la presente Tesis ha sido la evaluacin de tecnologas de limitado

impacto ambiental, bajo coste y fcil implementacin, para la revalorizacin de compuestos
fenlicos con actividad antioxidante presentes en residuos agroindustriales y forestales.

Para alcanzar dicho objetivo, se han planteado los siguientes objetivos especficos:

1. Obtencin de extractos con actividad antioxidante mediante procesos de extraccin

con fluidos supercrticos o disolventes de bajo impacto ambiental a partir de residuos
agroindustriales y forestales.

2. Desarrollo de procesos basados en tecnologa de membranas para la concentracin

y/o purificacin de compuestos fenlicos con actividad antioxidante.

3. Evaluacin de las propiedades antioxidantes e irritabilidad cutnea de los productos

obtenidos.

2.2. PLAN DE TRABAJO

En funcin de los objetivos propuestos se plante el siguiente plan de trabajo:

Tareas propuestas para alcanzar el Objetivo 1:

1. Evaluacin del efecto de la temperatura, presin y presencia de modificador en la

extraccin supercrtica de las materias primas seleccionadas en el rendimiento global
de extraccin, rendimiento de extraccin en compuestos fenlicos y actividad
antioxidante de los extractos obtenidos.

2. Evaluacin del efecto de la temperatura, tiempo de extraccin y relacin slido-lquido

en la extraccin convencional con disolventes de las materias primas seleccionadas en
el rendimiento global de extraccin, rendimiento de extraccin en compuestos
fenlicos y actividad antioxidante de los extractos obtenidos.

75
Objetivos y plan de trabajo

Tareas propuestas para alcanzar el Objetivo 2:

1. Evaluacin del efecto del material de la membrana, tamao de corte y presin

transmembrana en la concentracin y/o fraccionamiento de compuestos fenlicos a
partir de distintos efluentes de carcter residual.

2. Desarrollo de procesos secuenciales basados en filtracin con membranas para la

obtencin de un producto final enriquecido en compuestos fenlicos.

3. Evaluacin del contenido fenlico y la actividad antioxidante de los productos

obtenidos.

Tareas propuestas para alcanzar el Objetivo 3:

3. Evaluacin de la actividad antioxidante de los productos finales seleccionados frente a

distintos ERO (O2-, H2O2, HOCl, 1O2, ROO) y ERN (ONOO, NO).

4. Estudiar la proteccin de la membrana de eritrocitos frente a la peroxidacin lipdica

inducida por AAPH.

5. Evaluacin de la irritabilidad cutnea de los productos seleccionados en piel humana

reconstruida mediante el mtodo EpiSkin.

76
3. MATERIALES Y MTODOS
 Materiales y Mtodos

3. MATERIALES Y MTODOS

3.1. MATERIALES PRIMAS

Se han utilizado diferentes tipos de residuos de origen agroindustrial y forestal como fuentes
baratas para la obtencin de compuestos de naturaleza antioxidantes:

a) Residuos vitivincolas

El bagazo de uva blanca destilado y las vinazas procedentes del proceso de elaboracin de
aguardiente fueron suministrados por la Cooperativa Vitivincola do Ribeiro (Ourense). Las
muestras fueron prensadas (Enerpac, 1,4 MPa, 5 minutos) para recuperar el lquido retenido
en ellas. El lquido prensado fue centrifugado para eliminar los slidos suspendidos y se
almacen a 4 C hasta su uso. El bagazo residual se lav con agua durante 1 h a 60 C y con
una relacin lquido-slido de 15 g/g. La fase lquida se decant, centrifug y se almacen a 4
C hasta su uso.

Las vinazas de uva blanca se centrifugaron y almacenaron a 4 C hasta su uso. Posteriormente

fueron centrifugadas a 4500 rpm para eliminar los slidos en suspensin.

a) Residuos forestales

Las hojas de castao y los erizos de castaa, recogidos en una finca local prxima, se secaron al
ambiente, se molieron en fro para evitar reacciones de degradacin, se tamizaron y envasaron
a vaco. Posteriormente fueron almacenadas en oscuridad a temperatura ambiente.

b) Residuos industria alimentaria

Los residuos de las distintas clases de frutos del bosque (frambuesa, arndano y arndano
rojo) procedentes de la elaboracin de zumos fueron suministrados por Bayas del Sur (Chile).
Las muestras se secaron al ambiente, se molieron en fro, se tamizaron y se envasaron a vaco.
Posteriormente fueron almacenadas a 4 C hasta su uso.

3.2. PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES

En esta seccin se describen los procedimientos experimentales utilizados para la obtencin

de extractos antioxidantes a partir de las distintas materias primas empleadas.

79
Materiales y Mtodos

Los residuos procedentes de la elaboracin de agua ardiente se procesaron siguiendo el

esquema que se muestra en la Figura 3.1. Las etapas incluyeron extraccin con disolventes
convencionales, concentracin y/o fraccionamiento con membranas y adsorcin/desorcin en
resinas polimricas. En cuanto a los residuos forestales, las hojas de castao se extrajeron con
disolventes convencionales y la corriente lquida resultante se concentr y fraccion mediante
membranas, mientras que los erizos de castaa se sometieron a extraccin con fluidos
supercrticos. Finalmente los bagazos de frutos del bosque se extrajeron tanto con disolventes
convencionales como con fluidos supercrticos.

RESIDUOS PROCEDENTES DE ALCOHOLERA

Bagazo
destilado Vinazas

Slidos
LAVADO PRENSADO
Extracto Licores CENTRIFUGADO Slidos
acuoso
Permeado
MEMBRANAS Licores
MEMBRANAS RESINAS

Concentrado Permeado
Concentrado MEMBRANAS RESINAS

EXTRACCIN EXTRACCIN
LQUIDO - LQUIDO LQUIDO - LQUIDO Concentrado

PRODUCTO I PRODUCTO II PRODUCTO III PRODUCTO IV PRODUCTO V

Figura 3.1: Esquema experimental para el aprovechamiento de residuos procedentes de alcoholera.

3.2.1. EXTRACCIN CON FLUIDOS SUPERCRTICOS

Para llevar a cabo los experimentos de extraccin supercrtica se utilizaron dos equipos
diferentes: una planta de extraccin supercrtica modelo SFF de Iberfluid (Madrid, Espaa) y un
equipo de extraccin modelo SFE-1000F-2-C10 de Thar Technology Inc. (Pittsburgh, EEUU).

La planta de extraccin supercrtica modelo SFF de Iberfluid (Figura 3.2) consta de una celda de
extraccin para slidos de 285 mL de capacidad construida en acero inoxidable, dos
separadores para fraccionamiento en cascada del extracto de 40 cm3 tambin en acero
inoxidable y un ltimo separador a presin atmosfrica para la recoleccin de los compuestos
ms voltiles. Adems de la bomba de impulsin del CO2 (Dosapro Milton Roy) con capacidad
de bombeo hasta 4,7 L/h, la planta dispone de una bomba de pistn (Dosapro Milton Roy) con
capacidad de bombeo hasta 0,3 L/h, para la adicin de modificador en las extracciones que as

80
 Materiales y Mtodos

lo requieran. Tanto el extractor como los separadores poseen control independiente de

presin y temperatura, desde el panel de la planta y desde ordenador. La presin mxima que
se alcanza en la celda es 40 MPa y la temperatura mxima en todo el sistema es 60 C. El
software, con capacidad para controlar y almacenar todas las variables de la extraccin, fue
suministrado por el fabricante.

Figura 3.2: Planta de extraccin supercrtica de muestras slidas modelo SFF de Iberfluid.

El equipo de Thar (Figura 3.3) consta de una cmara de extraccin de 1 L, y dos separadores
ciclnicos en cascada con una capacidad de 500 mL cada uno. El sistema est equipado con
una bomba de doble pistn modelo P-200 A (Thar Instruments, Inc., Pittsburgh, EE.UU) para la
impulsin del CO2 (intervalo de flujo: 3-200 g/min) y una bomba para el cosolvente modelo
Series III (Thar Instruments, Inc., Pittsburgh, EE.UU) con capacidad de bombeo de hasta 10
mL/min. La presin en el extractor se regula mediante una vlvula de alta precisin controlada
por el sistema, mientras que los separadores disponen de control manual de la presin
mediante vlvulas de resorte. La presin mxima de trabajo es de 60 MPa en la celda de
extraccin y 38 MPa en los separadores, la temperatura mxima en todo el sistema es de 120
C. Todo el sistema est controlado en tiempo real por el software suministrado por el
fabricante. El equipo consta adems de una columna para la extraccin de muestras lquidas.

81
Materiales y Mtodos

Figura 3.3: Planta de extraccin supercrtica modelo SFE1000 de Thar.

En la Figura 3.4 se muestra el diagrama de flujo general del proceso de extraccin supercrtica.
El dixido de carbono se suministra desde botellas con sifn. Antes de ser bombeado el
dixido de carbono se hace circular a travs de un intercambiador de calor donde es enfriado
para mantenerlo en fase lquida. Una vez bombeado al sistema el CO2 atraviesa un
precalentador a la temperatura de la celda de extraccin. Tras entrar en contacto con la
muestra, el CO2 y los compuestos extrados atraviesan un plato poroso para evitar el arrastre
de la muestra slida hacia los separadores, dirigindose a continuacin hacia la primera vlvula
de regulacin fina, situada justo encima del primer separador, donde tiene lugar la primera
descompresin al encontrarse con una presin y/o temperatura distintas de la presin y
temperatura de extraccin. Los compuestos no solubles en las nuevas condiciones precipitan
en este separador mientras que el resto sigue hacia la segunda vlvula y el segundo separador,
donde se vuelve a repetir el mismo proceso de precipitacin en las condiciones del segundo
separador. El tiempo de la extraccin se cuenta desde que se alcanzan las condiciones en la
celda y los separadores, momento en el cual se lleva a cabo la extraccin dinmica de la
muestra.

82
 Materiales y Mtodos

IP
IP
IP
6

2 5 8

4
1. Bombona CO2
2. Bomba CO2
3. Bomba modificador
4. Criostato
1 3 5. Intercambiador de calor
6. Extractor
7. Vlvula automtica
8. Separadores

Figura 3.4: Diagrama de flujo del proceso de extraccin supercrtica utilizado.

En todos los casos la celda se extraccin se carg con 10 g de muestra seca y molida junto con
perlas de vidrio como material de relleno para evitar la formacin de caminos preferentes.

En los experimentos llevados a cabo en el equipo de Iberfluid se trabaj con presiones de

extraccin en el intervalo 8-30 MPa, manteniendo en todos los casos una temperatura de
60 C. El flujo de CO2 se fij en 2,5 L/h. Para el fraccionamiento de los extractos se utilizaron
dos separadores fijando la presin del primero de ellos al 60% de la presin de extraccin y a
una temperatura de 30 C, el segundo de los separadores se mantuvo en condiciones
ambientales. El tiempo de extraccin fue de 2 h.

Para los experimentos realizados en el equipo de Thar se utilizaron flujos de CO2 ente 0,3 - 1,8
kg CO2/h y se emplearon distintas presiones (10-35 MPa) y temperaturas (35-70 C) de
extraccin. En este caso no se llev a cabo fraccionamiento de los extractos por lo que solo se
utiliz un separador que se mantuvo a 20 C donde se recogieron los extractos a presin
ambiental. Para los experimentos con modificador se utiliz etanol (Panreac) que fue
introducido al sistema en proporcin 1-20 % (p/p).

3.2.2. EXTRACCIN SLIDO-LQUIDO CON DISOLVENTES

Con el fin de determinar el efecto de cada una de las variables sobre la extraccin se formul
un diseo central compuesto (DCC) de 20 experimentos con seis repeticiones del punto
central. Las variables independientes estudiadas fueron: Tiempo de extraccin (30-90 min),
temperatura (25-50 C) y relacin slido lquido (15-25 v/p). Los niveles superior, inferior e

83
Materiales y Mtodos

intermedio de cada factor se codificaron como +1, -1 y 0 respectivamente. En la Tabla 3.1 se

muestran las condiciones operacionales de cada experimento. Las variables dependientes
estudiadas fueron el rendimiento de extraccin (seccin 3.3.3), el contenido en compuestos
fenlicos (seccin 3.3.5) y a capacidad antioxidante frente al radical DFPH (3.3.6.1).

Tabla 3.1: Estructura del diseo central compuestos: Variables codificadas y condiciones operacionales.

Experimento X1 X2 X3 t (min) T (C) L/S (v/p)

1 -1 -1 1 30 25 25

2 -1 1 1 30 50 25

3 -1 -1 -1 30 25 15

4 -1 1 -1 30 50 15

5 1 -1 1 90 25 25

6 1 1 1 90 50 25

7 1 -1 -1 90 25 15

8 1 1 -1 90 50 15

9 -1,68 0 0 9,6 37,5 20

10 1,68 0 0 110,4 37,5 20

11 0 -1,68 0 60 16,5 20

12 0 1,68 0 60 58,5 20

13 0 0 -1,68 60 37,5 11,6

14 0 0 1,68 60 37,5 28,4

15 0 0 0 60 37,5 20

16 0 0 0 60 37,5 20

17 0 0 0 60 37,5 20

18 0 0 0 60 37,5 20

19 0 0 0 60 37,5 20

20 0 0 0 60 37,5 20

Las muestras molidas y tamizadas se dispusieron en matraces erlenmeyer en contacto con el

disolvente seleccionado (etanol 96 %, metanol o agua) bajo las condiciones de temperatura,
relacin slido lquido y tiempo seleccionadas, en un agitador orbital a 140 rpm. Una vez
finalizada la extraccin, se filtraron las muestras y se elimin el disolvente en un evaporador a

84
 Materiales y Mtodos

vaco. Los extractos as obtenidos se analizaron para determinar el rendimiento de extraccin,

el contenido total en compuestos fenlicos y su capacidad antioxidante.

Los resultados obtenidos para cada uno de los tres disolventes se ajustaron por el mtodo de
los mnimos cuadrados a una ecuacin de segundo orden de la forma:

2 1
= 0 + =1 + =1 + =1 =2 (3.1)
<

Donde k es el nmero de variables independientes, Xi son las variables independientes

codificadas, Y es la variable dependiente estudiada y i, j , ij y ii los coeficientes de regresin.

El efecto de las variables independientes en las variables de respuesta objetivo se analiz

aplicando ANOVA de una va con un nivel de significacin del 0,05 y se visualizaron a partir de
las superficies de respuesta generadas por el anlisis de regresin. Se utiliz el paquete
estadstico Statistica 6.0.

3.2.3. CONCENTRACIN/PURIFICACIN MEDIANTE MEMBRANAS

Las caractersticas de las distintas membranas comerciales utilizadas se muestran en la Tabla

3.2.

Tabla 3.2: Caractersticas de las membranas de filtracin utilizadas.

MEMBRANA MATERIAL ESTRUCTURA REA TAMAO PMAX TMAX FABRICANTE

2
(m ) DE CORTE (MPa) (C)
Nanomax 50 PA/PS Espiral 0,37 350 Da 4,1 50 Millipore

Nanomax 95 PA/PS Espiral 0,37 100 Da 4,1 50 Millipore

DL2540 TFC Espiral 1,77 150-300 Da 4 50 Osmonics

GE2540 TFC Espiral 1,77 1 kDa 4 50 Osmonics

ATF2540 PES Espiral 1,77 200 Da 4 55 Iberlact

FH2540 PES Espiral 1,77 0,5 m 4 55 Iberlact

InsideCram ZrO2-TiO2 Tubular 0,022 1 kDa 1 150 TAMI

InsideCram ZrO2-TiO2 Tubular 0,022 3 kDa 1 150 TAMI

Omega Minisette PES Plana 0,07 5 kDa 0,4 55 PallFiltron

Omega Minisette PES Plana 0,07 10 kDa 0,4 55 PallFiltron

Abreviaturas: PA: Poliamida; PES: Polietersulfona; PS: Polisulfona; TFC: Thin-Film composite.

85
Materiales y Mtodos

El esquema general del proceso de filtracin con membranas se muestra en la Figura 3.5. El
sistema fue equipado con una bomba de velocidad variable empleada para impulsar la
corriente de alimentacin y un rotmetro para la medida del flujo. Las presiones fueron
medidas con dos manmetros situados a la entrada y salida del mdulo de membrana y
reguladas mediante una vlvula situada en la lnea de retenido. La temperatura fue medida
con un termmetro y controlada mediante el flujo de agua a travs de un serpentn situado en
el interior del tanque de alimentacin.

IF IP

1 RETENIDO

2 IT IP
4
3
ALIMENTACIN

PERMEADO
1. Tanque de alimentacin
2. Serpentn
3. Bomba
4. Membrana
5. Vlvula manual

Figura 3.5: Esquema general del proceso de filtracin con membranas.

En los diferentes experimentos de realizados se utilizaron distintas variaciones con el fin de

alcanzar la velocidad de flujo y/o presin transmembrana necesarias para cada una de las
membranas empleadas. Para los experimentos realizados con las membranas tubulares y
espirales, se utilizaron tres mdulos monotubulares de acero inoxidable de distintas longitud y
dimetro: 1,2 m y 6,07 cm para las membranas de Osmonics e Iberlact, 0,305 m y 4,6 cm para
el caso de las membranas de Millipore, y 0,604 m y 1 cm para las membranas cermicas de
TAMI. Para la impulsin de la corriente de alimentacin se utiliz una bomba Hydra-Cell, capaz
de trabajar hasta 60 bar con un flujo mximo de 600 L/h, en el caso de las membranas
tubulares y espirales, mientras que para las membranas planas Omega se utiliz una bomba
peristltica con capacidad de flujo de entre 0,48 L/h. El volumen del tanque de alimentacin
utilizado fue de 4 L en el caso de las membranas planas, 8 L para las membranas cermicas y
20 L en los dems casos.

86
 Materiales y Mtodos

Todos los experimentos se llevaron a cabo entre 2 y 10 bar con una velocidad de flujo de 2-3
m/s. La temperatura de filtracin se mantuvo en el intervalo de 15-25 C.

Para la evaluacin de las condiciones ptimas de operacin para cada membrana, se llevaron a
cabo experimentos con recirculacin de las corrientes de retenido y permeado manteniendo
fijo el caudal de alimentacin y variando la PTM. Los flujos de permeado se midieron a las
presiones transmembrana de 2 a 8 bar. El cambio de presin se realiz al alcanzar un flujo
estable en cada una de ellas. Antes de cada cambio a una presin superior se tomaron
muestras de retenido y permeado para su posterior anlisis y se opero de nuevo a la presin
anterior con el fin de estudiar el ensuciamiento.

Una vez determinada la PTM ptima de operacin se llevaron a cabo los experimentos de
concentracin recirculando la corriente de retenido y retirando la corriente de permeado. La
relacin de concentracin de volumen (RCV) se calcul como el cociente entre el volumen
inicial de alimentacin y el volumen de retenido remanente al tiempo de operacin
considerado. Se tomaron muestras de permeado y de retenido a distintos RCV para su
posterior anlisis.

Durante los procesos de filtracin con membranas el flujo de permeado decae debido a los
problemas de concentracin por polarizacin y fenmenos de ensuciamiento. Con el fin de
evaluar el ensuciamiento de la membrana se determin la permeabilidad de la misma
midiendo el flujo de permeado con agua destilada antes y despus de cada experimento.

El lavado de las membranas se realiz con una disolucin detergente al 0,5 % (Ultrasil 11,
Henkel Ecolab) a 50 C durante 60 minutos. Se oper en modo recirculacin total con la
disolucin de limpieza para a continuacin aclarar la membrana con abundante agua destilada.

3.2.5. ADSORCION-DESORCIN MEDIANTE RESINAS

Como adsorbente se emple la resina Sepabeads SP700 suministrada por Resindion S.R.L.
(Mitsubishi Chemical Corporation). Las caractersticas de la resina empleada se muestran en la
Tabla 3.3.

87
Materiales y Mtodos

Tabla 3.3: Propiedades fsico-qumicas de la resina Sepabads SP700.

Material PS-DVB

Humedad (%) 60-70

Tamao de partcula (m) 250-700

Volumen de poro (mL/g) 2,2

Radio de poro () 85

2
Superficie especfica (m /g) ~ 1200

Densidad (g/mL) ~1,01

Activacin de la resina

En un erlenmeyer se mezclaron la resina y metanol hasta cubrir la resina con 2,5-5 cm de

disolvente en exceso. Se agit suavemente durante un minuto para asegurar que la resina y el
metanol se mezclaron por completo. A continuacin, en un agitador orbital se mantuvo la
mezcla en agitacin a 175 rpm y 25 C durante 15 min. Transcurrido dicho tiempo, se filtr a
vaco la mezcla y se lav la resina con agua destilada en una relacin slido lquido de 5 g/g.

Adsorcin

Para llevar a cabo la adsorcin se pusieron en contacto las muestras lquidas correspondientes
con la resina (5 g muestra/5 g resina hmeda) en un agitador orbital durante 20 min a 25 C y
175 rpm. Una vez alcanzado el equilibrio de adsorcin, se filtr la mezcla a vaco. La fase
lquida obtenida se analiz para determinar su contenido total en compuestos fenlicos
(seccin 3.3.5). La resina se lav con agua destilada para eliminar los compuestos no
adsorbidos. El lavado se llev a cabo en un agitador orbital a 25 C y 175 rpm durante 20 min.
La relacin resina:agua fue de 1:3 (p/p). Transcurrido el tiempo de contacto se filtr la resina a
vaco y se determin el contenido total en compuestos fenlicos eliminados en el agua de
lavado.

Desorcin

La desorcin se llev a cabo en una columna de vidrio de 10 mm de dimetro y 300 mm de

altura empaquetada con 20 g de resina saturada. Por medio de una bomba modelo F10 (Bio-
Rad, EEUU) se hizo pasar etanol (82 %) a travs de la columna a un flujo de 1 mL/min. La
temperatura de operacin se mantuvo a 45 C. Las fracciones recolectadas se analizaron para

88
 Materiales y Mtodos

determinar su contenido total en compuestos fenlicos (seccin 3.3.5) y su capacidad

antioxidante (seccin 3.3.6).

3.2.6. EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO

Las extracciones se llevaron a cabo utilizando acetato de etilo como disolvente en una relacin
1:3 (v/v) con una agitacin de 250 rpm durante 1 hora a temperatura ambiente. La fase
orgnica se separ por decantacin y se elimin el disolvente mediante evaporacin a vaco. El
extracto obtenido se sec a 50 C en estufa a vaco durante 24 horas y se analiz para
determinar el rendimiento de extraccin (seccin 3.3.3), contenido total en compuestos
fenlicos (seccin 3.3.5) y capacidad antioxidante (seccin 3.3.6).

3.3. METODOLOGA ANALTICA

3.3.1. DETERMINACIN DE LA HUMEDAD

Para determinar la humedad una cantidad conocida de muestra se mantuvo en una estufa a
105 C hasta peso constante durante 24 h. Posteriormente se enfri en desecador y se pes.

El contenido en humedad vendr dado por:

(P1 -P2 )
Humedad (%) = 100 (3.2)
P1

Donde P1 es el peso inicial de la muestra y P2 es el peso de la muestra seca.

3.3.2. CONTENIDO EN SLIDOS O PESO SECO

Para la determinacin de contenido total en slidos, un volumen conocido de muestra lquida

se mantuvo en una estufa a 105 C durante 24 h. Posteriormente se enfri en desecador y se
pes.

El contenido total en slidos vendr dado por:

Ps
Slidos totales = (3.3)
Vi

Donde PS es el peso de la muestra seca y Vi es el volumen de la muestra inicial.

89
Materiales y Mtodos

3.3.3. DETERMINACIN DEL RENDIMIENTO DE EXTRACCIN

El rendimiento de extraccin es una medida de la eficiencia de un disolvente para extraer los

compuestos de inters a partir de la materia prima original. El extracto se obtuvo mediante
evaporacin a vaco del disolvente utilizado. A continuacin la muestra se introdujo en un
desecador a vaco y se sec en estufa a 50 C. El rendimiento de extraccin se determina
gravimtricamente y se calcula como el porcentaje de peso de extracto respecto al peso de
materia prima original:

Pe
Rendimiento de extraccin (%) = 100 (3.4)
Pm

Donde Pe es el peso del extracto y Pm es el peso de la materia prima inicial.

3.3.4. TCNICAS CROMATOGRFICAS

La identificacin de los compuestos fenlicos se llev a cabo mediante la utilizacin de tcnicas

cromatogrficas.

3.3.4.1. CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA EFICACIA (HPLC)

La identificacin por HPLC se llev a cabo en un equipo Hewlett-Packard 1100 con un detector
de diodos en linea (DAD). La separacin se realiz en una columna Supelcosil LC18 de 25 cm de
longitud, 4,6 mm de dimetro interno, rellena de octadecilsilano (C18) con un tamao de
partcula de 5 m. El volumen de inyeccin fue de 5 L, se us un flujo de 1 mL/min y el tiempo
de anlisis fue de 65 min. Se us un gradiente no lineal de una mezcla de Fase mvil A
(acetonitrilo: cido frmico en agua 5 % (v/v), 10:90 (v/v)) y Fase mvil B (acetonitrilo: cido
frmico en agua 5 % (v/v), 90:10 (v/v)). Los disolventes utilizados fueron de grado HPLC y
suministrados por Scharlau. El gradiente empleado se muestra en la Tabla 3.4.

Tabla 3.4: Gradiente no lineal utilizado en el anlisis mediante HPLC.

Tiempo (min) Fase mvil A (%) Fase mvil B (%)

0 100 0
40 85 15
45-55 0 100
60-65 100 0

90
 Materiales y Mtodos

Todas las muestras fueron filtradas a travs de un filtro de membrana de 0,45 m antes de su
anlisis por HPLC. Los compuestos fenlicos se identificaron por comparacin de sus tiempos
de retencin y de sus espectros UV-vis con patrones comerciales suministrados por Sigma-
Aldrich Quimica S.A. y Extrasynthse.

3.3.4.2. CROMATOGRAFA DE GASES (GC)

La preparacin de las muestras para su posterior anlisis mediante GC se llev a cabo como
sigue:

- A 25 mL de disolucin diluida de la muestra se le aadieron como patrn interno 0,25

mL de 3-octanol (10 ppm) y 3,4-dimetilfenol (100 ppm).

- La mezcla se extrajo con 2,5 mL diclorometano (DCM) durante 5 min a 600 rpm.
Transcurrido dicho tiempo se dej reposar durante 5 min ms.

- La fase orgnica se extrajo dos veces ms con 1,25 mL de DCM en las mismas
condiciones.

- La fase orgnica total se transfiri a un tubo de vidrio graduado y se concentr

utilizando una corriente de nitrgeno hasta un volumen final de 0,5 mL.

El anlisis por GC se llev a cabo en modo splitless en un cromatgrafo de gases Hewlett-

Packard (HP) 5890-II unido a un espectrmetro de masas HP-5970 usando He como gas
portador. La separacin se llev a cabo usando una columna capilar HP-Innowax (60 m x 0,25
mm de dimetro interno y 0,25 m de espesor). La temperatura del horno se mantuvo a 45 C
durante un minuto, y se increment hasta 230 C a razn de 3 C cada minuto, donde se
mantuvo durante 30 minutos ms. La ionizacin de las muestras se llev a cabo por impacto de
electrones (EI) y la adquisicin de las muestras se realiz mediante barrido desde 30 a 300
amu/s y 1,9 espectros/s.

Los compuestos fueron identificados comparando el tiempo de retencin y los espectros de

masas con los datos proporcionados por la librera del NIST (National Institute of Standards
and Technology). La cuantificacin de las concentraciones de los compuestos presentes se
llev a cabo mediante el mtodo del patrn interno mediante comparacin de las reas de los
picos con las de 3-octanol y 3,4-dimetilfenol (Aldrich):

Ac
Concentracin relativa = (3.5)
Api

91
Materiales y Mtodos

Donde Ac es el rea del compuesto detectado y Api es el rea del patrn interno.

3.3.5. DETERMINACIN DEL CONTENIDO TOTAL EN COMPUESTOS FENLICOS:

MTODO DE FOLIN-CIOCALTEAU

La cantidad de fenoles totales se determin con el reactivo Folin-Ciocalteau mediante el

mtodo descrito por Singleton y Rossi (1965).

A 0,5 mL de muestra se le aadieron 3,75 mL de agua destilada y 0,25 mL del reactivo Folin-
Ciocalteu (FC) diluido en agua en proporcin 1:1 (v/v). Se agit bien y se le aadi 0,5 mL de
Na2CO3 al 10 % (p/v).

La muestra se homogeniz y se dej 1 hora a temperatura ambiente. A continuacin se ley la

absorbancia a 765 nm frente a un blanco preparado de igual modo pero sustituyendo la
muestra por el disolvente en el que estaba diluida.

Usando el mismo procedimiento, se realiz una recta de calibrado (Figura 3.6) con distintas
concentraciones (0-1 g/L) de una disolucin de cido glico (Sigma-Aldrich Qumica S.A.). El
contenido total en compuestos fenlicos se expresa como equivalentes de cido glico (EAG).

0,12
Concentracin (g EAG/L)

C(g/L) = 0,1120Abs - 0,0006

0,10
R = 0,9996
0,08

0,06

0,04

0,02

0,00
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00
Absorbancia 765 nm

Figura 3.6: Recta de calibrado para la determinacin del contenido total en compuestos fenlicos.

3.3.6. DETERMINACIN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

Debido a que no existe un nico mtodo para medir la capacidad antioxidante de una
sustancia y a que la actividad vara dependiendo del tipo de ensayo, es necesario realizar ms
de un tipo de test.

92
 Materiales y Mtodos

3.3.6.1. CAPTACIN DEL RADICAL DFPH

La actividad antioxidante de captacin del radical DFPH se determin por el mtodo descrito
por von Gadow y col. (1997).

Se prepar una disolucin en metanol de DFPH 1,5 mM y se almacen en oscuridad a -18 C.

En el momento de su uso, se tom una alcuota de dicha disolucin y se diluy con metanol
hasta alcanzar una concentracin final de 0,06 mM.

A 2 mL de la disolucin metanlica de DFPH (0,6 mM), se le aadi 50 L de la muestra, y se

registr la cada de absorbancia a 515 nm durante 16 min usando como blanco metanol.

La actividad antioxidante se calcula como:

- Porcentaje de Inhibicin (PI): Porcentaje de radical DFPH que reacciona con el

antioxidante:
A0 min A16 min
PI (%) = (3.6)
A0min
Donde A0 min es la absorbancia de la muestra al inicio y A16 min es la absorbancia de la
muestra transcurridos 16 min.
- Concentracin equivalente (CE50): Concentracin de antioxidante necesaria para
disminuir la concentracin inicial del radical en un 50 %.

3.3.6.2. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EQUIVALENTE A TROLOX O TEAC

La actividad antioxidante equivalente a Trolox se determin por el mtodo descrito por Miller
y col. (1993) y mejorado posteriormente por Re y col. (1999).

Se prepar una disolucin del radical ABTS (2,2'azinobis (3-etilbenzotiazolin 6-cidosulfnico)

haciendo reaccionar 7 mM de ABTS con 2,45 mM de persulfato de potasio en tampn salino
fosfato o PBS (8,0 g de NaCl, 0,2 g de KH2PO4, 1,15 g de Na2HPO4, 0,2 g de KCl y 0,2 g de azida
sdica en un volumen de agua de 1 L) (pH 7,4). A continuacin se mantuvo la mezcla en
agitacin constante durante 16 h, impidiendo que le diese la luz. La disolucin resultante se
almacen en oscuridad a -18 C hasta su uso.

Para la realizacin de anlisis se diluy la disolucin del radical ABTS con PBS hasta alcanzar
una absorbancia de 0,4 a 734 nm frente a un blanco de PBS. A continuacin se aadi 1 mL de
la disolucin diluida a 10 L de muestra. La mezcla se incub durante 6 min a

93
Materiales y Mtodos

30 C. Transcurrido dicho tiempo se midi el descenso de la absorbancia a 734 nm usando PBS

como blanco.

Usando el mismo procedimiento descrito, se construy una recta de calibrado (Figura 3.7)
usando distintas concentraciones (0-2 mM) de Trolox (Aldrich). Los resultados se expresaron
como equivalentes de Trolox.

2,50
Concentracin (mM Trolox)

C (mM) = 5,689Abs + 0,051

2,00 R = 0,997

1,50

1,00

0,50

0,00
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40
Absorbancia 734 nm

Figura 3.7: Recta de calibrado para el mtodo TEAC.

3.3.6.3. PODER ANTIOXIDANTE DE REDUCCIN DEL HIERRO O FRAP

La actividad antioxidante fue determinada por el mtodo descrito por Benzie y Strain (1996).

Se prepar el reactivo mezclando con 25 mL de tampn acetato (pH 3,6) (0,31 g de acetato de
sodio trihidratado y 1,6 mL de cido actico glacial en 100 mL de agua destilada), 2,5 mL de
una disolucin de TPTZ (2,4,6-tri(2-piridilo)-1,3,5-triazina) (10 mM TPTZ en HCl 40 mM) y 2,5
mL de FeCl36 H2O (20 mM) en agua destilada. El reactivo se prepar en el momento del
anlisis y se mantuvo en oscuridad a 4 C.

A 3 mL del reactivo se aadieron 0,1 mL de la muestra. Transcurridos 6 minutos se midi la

absorbancia a 593 nm frente a un blanco con agua destilada.

Como patrones se utilizaron disoluciones de cido ascrbico (Merck) y sulfato de hierro

heptahidratado (Sigma). Para la construccin de las rectas de calibrado (Figura 3.8) se
represent grficamente la absorbancia frente a las concentraciones de cido ascrbico (0-1
mM) y de sulfato de hierro heptahidratado (0-2 mM), respectivamente.

94
 Materiales y Mtodos

cido ascrbico Sulfato de hierro heptahidratado

2,50

Concentracin (mM)
2,00 C (mM) = 1,848Abs + 0,014
R = 0,9992
1,50

1,00

0,50
C (mM) = 0,7033Abs + 0,0004
R = 0,9995
0,00
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60
Absorbancia 593 nm

Figura 3.8: Recta de calibrado para el mtodo FRAP.

3.3.6.4. PODER REDUCTOR

El poder reductor de las muestras se determin por el mtodo descrito por Oyaizu (1986)
basado en la reduccin del Fe (III) a Fe (II).

A 1 mL de muestra se le aadieron 2,5 mL de tampn fosfato (pH 6,6) (0,35 g de Na2HPO4 y 2,1
g NaH2PO4 en 100 mL de agua destilada) y 2,5 mL de ferrocianuro potsico al 1 % (p/v). La
mezcla se incub a 50 C durante 30 min y a continuacin se adicionaron 2,5 mL de cido
tricloroactico al 10 % (p/v). La mezcla se centrifug y 2,5 mL del sobrenadante se mezclaron
con 2,5 mL de agua destilada y 0,5 mL de cloruro frrico 1 % (p/v). Finalmente, se ley la
absorbancia a 700 nm frente a un blanco de agua destilada.

Siguiendo el mismo procedimiento se construy la recta de calibrado (Figura 3.9)

representando grficamente la absorbancia frente a concentraciones conocidas (0 - 1 mM) de
cido ascrbico (Merck).

95
Materiales y Mtodos

1,20

Concentracin (mM cido ascrbico)

1,00 C (mM) = 0,836Abs - 0,030
R = 0,993
0,80

0,60

0,40

0,20

0,00
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40

Absorbancia 700 nm

Figura 3.9: Recta de calibrado para el mtodo del poder reductor.

3.3.6.5. OXIDACIN DEL -CAROTENO EN EMULSIONES DE CIDO LINOLEICO

Se utiliz el mtodo espectrofotomtrico descrito por Miller (1971) basado en la capacidad de

diferentes extractos de inhibir la oxidacin del -caroteno en emulsiones de cido linoleico/ -
caroteno.

Se prepar una disolucin de -caroteno cristalino en cloroformo (3,7 mM) y se almacen en

oscuridad a -18 C hasta su uso. Para llevar a cabo el anlisis, una alcuota de dicha disolucin
se diluy con cloroformo hasta alcanzar una concentracin de 0,37 mM. A un baln de
destilacin se aadieron 20 mg de cido linoleico y 200 mg del emulgente Tween 40 y se
pipete 1 mL de la disolucin de -caroteno (0,37 mM). Se homogeniz la mezcla y se elimin
el cloroformo mediante evaporacin a vaco. A continuacin se aadieron 50 mL de agua
destilada oxigenada y se agit vigorosamente hasta formar una emulsin. Se tomaron
alcuotas de 5 mL de la emulsin resultante, se adicionaron a 0,2 mL de muestra y se incub a
50 C durante 2 h.

Se prepar una muestra de control siguiendo el mismo procedimiento sustituyendo la muestra

por 0,2 mL de disolvente.

Transcurridas las 2 h se midi la absorbancia a 470 nm frente a un blanco obtenido siguiendo

el procedimiento descrito anteriormente sin la adicin del -caroteno.

La actividad antioxidante se mide como el Coeficiente de Actividad Antioxidante (CAA) que da

una estimacin del grado relativo de oxidacin del -caroteno en presencia y ausencia de la
muestra.

96
 Materiales y Mtodos

Am(120min) Ac(120min)
CAA = 1000 (3.7)
Ac(0min) Ac(120min)

Donde Am(120min) es la absorbancia de la muestra a los 120 min, Ac(120min) es la absorbancia del
control a los 120 min y Ac(0min) es la absorbancia del control al inicio.

3.3.6.6. CAPTACIN DE ESPECIES REACTIVAS DE OXGENO Y NITRGENO (ERO y ERN)

En los ensayos de captacin de ERO y ERN se emple un lector de microplato (Synergy HT, BIO-
TEK) termostatizado para las medidas de fluorescencia, absorbancia en ultravioleta-visible y
luminiscencia segn la metodologa descrita por Gomes y col. (2007).

Captacin del radical superxido (O2-)

El radical superxido fue generado mediante el sistema NADH (nicotinamida adenin

dinucletido fosfato de sodio)/PMS (metasulfato de fenandina). La capacidad de captacin del
radical superxido se determin espectrofotomtricamente a 560 nm siguiendo durante 2
minutos el efecto de la muestra en la reduccin inducida del NBT (azul de nitro-tetrazolio)
mediante la transferencia de electrones provenientes del anin superxido. NADH, PMS y NBT
se disolvieron en 19 mM de tampn fosfato, pH 7,4. En cada pocillo del lector de microplacas
se adicionaron 300 L de mezcla reactiva compuesta por: NADH 166 M, NBT 43 M, PMS 2,7
M y las muestras a analizar disueltas en DMSO (dimetilsulfxido) a varias concentraciones.
Los ensayos se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Como control se utiliz quercetina.
Los resultados se expresaron como porcentaje de inhibicin de la reduccin del NBT.

Captacin del perxido de hidrgeno (H2O2)

La medida de la captacin del radical perxido se evalu mediante quimioluminiscencia

siguiendo el efecto de las muestras en la oxidacin de la lucigenina en H2O2. Cada ensayo se
llev a cabo en un volumen de reaccin de 250 L formado por: tampn Tris-HCl 50 mM (pH
7,4), lucigenina 0,8 mM disuelta en el tampn, 1 % H2O2 y las muestras a analizar disueltas en
DMSO a varias concentraciones. La seal de quimioluminiscencia se detect en el lector
inmediatamente despus de la introduccin de la placa. Los ensayos se llevaron a cabo a 37 C
y se utiliz quercetina como control. Los resultados se expresaron como porcentaje de
inhibicin de la oxidacin de lucigenina.

97
Materiales y Mtodos

Captacin del cido hipocloroso (HOCl)

La capacidad de captacin de cido hipoclorosose midi evaluando el efecto de las muestras

en la inhibicin de la oxidacin de la dihidrorodamina (DHR) a 1,2,3-rodamina inducida por el
HOCl.

El HOCl se prepar ajustando el pH de una disolucin de NaOCl al 1 % (p/v) a 6,6 mediante la

adicin gota a gota de H2SO4 al 10 %. La concentracin de HOCl fue determinada
posteriormente espectrofotomtricamente a 235 nm usando un coeficiente de absorcin
molar de 100 M-1cm-1 y la dilucin adecuada se prepar en tampn fosfato 100 mM (pH 7,4).
Se prepar una disolucin de DHR 2,89 mM en dimetilformamida que fue purgada con
nitrgeno y almacenada a -20 C hasta su uso. Para llevar a cabo el ensayo se tomaron
alcuotas de dicha disolucin, se diluyeron en tampn fosfato y se mantuvieron en hielo en
oscuridad.

Las mezclas reactivas en un volumen final de 300 L estaban compuestas por: Tampn fosfato
100 mM (pH 7,4), DHR 5 M, HOCl M y las muestras disueltas en etanol a distintas
concentraciones. Los ensayos fluorimtricos se llevaron a cabo a 37 C a una longitud de onda
de 528 20 nm con una excitacin de 485 20 nm. La seal de fluorescencia fue medida
inmediatamente despus de la introduccin de la placa en el detector. Se utiliz quercetina
como control y los resultados se expresaron como el porcentaje de inhibicin de la oxidacin
de DHR inducida por HOCl.

Captacin del oxgeno singlete (1O2)

La capacidad de captacin del 1O2 se midi siguiendo el efecto de las muestras en la oxidacin
del DHR no fluorescente a 1,2,3-rodamina fluorescente inducida por el radical.

El 1O2 se gener mediante descomposicin trmica del endoperxido NDPO2 (3,3-(1,4-

naftaleno) dipropionato de sodio) soluble en agua sintetizado anteriormente. Antes de cada
ensayo se prepar la disolucin de NDPO2 disolvindolo en tampn fosfato 100 mM (pH 7,4).
Por otro lado, una disolucin de DHR 2,89 mM en dimetilformamida se purg con nitrgeno y
se almacen a -20 C hasta su uso. Para llevar a cabo el ensayo se tomaron alcuotas de dicha
disolucin, se diluyeron en tampn fosfato y se mantuvieron en hielo en oscuridad. Las
disoluciones de histidina en tampn fosfato se prepararon cada da.

Las mezclas reactivas en un volumen final de 250 L estaba compuestas por: Histidina 10 mM,
DHR 50 M, NDPO2 1 mM, y las muestras disueltas en DMSO a distintas concentraciones. Los

98
 Materiales y Mtodos

ensayos fluorimtricos se llevaron a cabo a 37 C a una longitud de onda de 528 20 nm con

una excitacin de 485 20 nm. La seal de fluorescencia fue medida despus de un perodo de
incubacin de 30 min. Se utiliz quercetina como control y los resultados se expresaron con el
porcentaje de inhibicin de la oxidacin de DHR inducida por 1O2.

Captacin del radical peroxilo (ROO)

La capacidad de captacin del radical peroxilo se midi evaluando el efecto de las muestras en
el descenso de la fluorescencia como consecuencia de la oxidacin inducida por el radical de la
fluorescena. El radical peroxilo fue generado por la termodescomposicin de AAPH (2,2'
azobis(2-amidinopropano) clorhidrato).

Se prepar una disolucin de fluorescena 1,53 mg/mL que se almacen a 4 C hasta el

momento de su uso. Para la realizacin de los ensayos se diluy en tampn fosfato 75 mM (pH
7,4) hasta 1:5000 (v/v).

En cada pocillo del lector de microplacas se adicionaron 200 L de mezcla reactiva compuesta
por: fluorescena 61 nM, AAPH19 mM diluido en tampn fosfato y la muestra a analizar
disuelta en acetona y diluida en tampn fosfato 75 mM (pH 7,4) a distintas concentraciones. La
mezcla se preincub en el lector durante 15 minutos a 37 C. La cada de la seal de
fluorescencia fue monitorizada cada minuto a una longitud de onda de 528 20 nm con una
excitacin de 485 20 nm. Como control se utiliz Trolox y los resultados se calcularon como
la diferencia de las reas bajo la curva de cada de fluorescencia para la muestra y el control.
Los resultados se expresaron como valores ORAC (Capacidad de absorcin de radicales de
oxgeno).

Captacin de radical peroxinitrito (ONOO)

La capacidad de captacin del radical ONOO se midi evaluando el efecto de las muestras
sobre la oxidacin inducida por el radical de DHR.

El radical ONOO- se gener siguiendo el mtodo descrito por Fernandes y col. (2005). Una
disolucin 0,6 M de H2O2 acidificada (HCl 0,7 M) se mezcl con 0,66 M de NaNO2 durante 1 s. A
continuacin la reaccin se inactiv utilizando NaOH 3 M enfriado en hielo. El H2O2 residual se
elimin por mezcla con MnO2 granular prelavado con NaOH 3 M. La disolucin de ONOO-
obtenida se filtr y congel a -80 C. Antes de cada experimento se recogi la capa superior de
dicha disolucin, se determin espectrofotomtricamente a 302 nm la concentracin del
radical ( = 1670 M-1cm -1) y se disolvi hasta la concentracin necesaria con NaOH 0,05 M.

99
Materiales y Mtodos

Por otro lado, una disolucin de DHR 2,89 mM en dimetilformamida se purg con nitrgeno y
se almacen a -20 C hasta su uso. Para llevar a cabo el ensayo se tomaron alcuotas de dicha
disolucin, se diluyeron en disolucin tampn (NaCl 90 mM, Na3PO4 50 mM y KCl 5 mM, pH
7,4) y se mantuvieron en hielo en oscuridad. Al principio de los experimentos se aadi al
tampn DTPA (cido dietilentriaminopentaactico) 100 M.

Las mezclas reactivas en un volumen de 300 L se prepararon aadiendo: DHR 5 M, ONOO-

600 nM y las muestras disueltas en DMSO a distintas concentraciones. Los ensayos se llevaron
a cabo a 37 C. La seal de fluorescencia se registr al cabo de 2 minutos de incubacin a una
longitud de onda de 528 20 nm con una excitacin de 485 20 nm. Paralelamente, los
ensayos se realizaron en presencia de NaHCO3 25 mM con la finalidad de simular
concentraciones fisiolgicas de CO2. Esta medida es importante ya que en condiciones
fisiolgicas la reaccin entre ONOO y bicarbonato es predominante con una constante de
reaccin elevada (k2 = 35.8 x 104 M-1 s-1) (Whiteman y col., 2002). Los resultados se
expresaron como el porcentaje de inhibicin de la oxidacin inducida por ONOO de DHR. Se
utiliz quercetina como control.

Captacin del xido nitrico (NO)

La capacidad de captacin de NO se midi siguiendo el efecto de las muestras en la oxidacin

inducida por el radical de DAF-2 (4,5-diaminofluorescena) no fluorescente en DAF-2T

(triazolofluorescena) fluorescente. El NO fue generado por la nicotinamida adenina
dinuclotido (NOC-5).

Se prepar una disolucin de DAF-2 2,76 mM en DMSO, se purg con nitrgeno y se almacen
a -20 C. Para la realizacin de los ensayos se diluyeron alcuotas de dicha disolucin con
tampn fosfato 50 mM (pH 7,4) hasta 1:368 (v/v) y se mantuvieron en hielo y oscuridad hasta
su uso.

En cada pocillo del lector de microplacas se adicionaron 300 L de mezcla reactiva compuesta
por: DAF-2 5 M, NOC-5 10 M y las muestras disueltas en DMSO a distintas concentraciones.
Los ensayos se llevaron a cabo a 37 C. La seal de fluorescencia se midi tras 30 minutos de
incubacin a una longitud de onda de 528 20 nm con una excitacin de 485 20 nm. Se
utiliz como control quercetina. Los resultados se expresaron como el porcentaje de inhibicin
de la oxidacin inducida por NO de DAF-2.

100
 Materiales y Mtodos

3.3.6.7. HEMOLISIS INDUCIDA POR AAPH

Las muestras de sangre se obtuvieron de ratas siguiendo las directrices ticas de la

Universidad de Barcelona y se recolectaron en tubos utilizando AEDT (cido
etildiaminotetraactico) como anticoagulante. Los glbulos rojos fueron separados del plasma
y de la capa leucocitaria mediante centrifugacin (1000 x g, 10 min).

La medida de la hemolisis de los glbulos rojos inducida por AAPH (2,2'azobis(2-

amidinopropano) clorhidrato) se llev a cabo mediante una modificacin del mtodo de
Ugartondo y col. (2008).

La actividad antihemoltica de las muestras se determin mediante la adicin de las mismas a

una suspensin de glbulos rojos en presencia de AAPH 100 mM a 37 C durante 2,5 h. Los
datos se expresaron como EC50 de la hemolisis inducida por APPH.

3.3.6.8. PEROXIDACIN LIPDICA EN ERITROCITOS

La concentracin de malondialdehido (MDA), un producto secundario de la peroxidacin

lipdica, fue determinada indirectamente midiendo espectrofotomtricamente la formacin de
especies reactivas del cido tiobarbitrico (TBAR) de acuerdo con el mtodo descrito por
Ugartondo y col. (2009).

El mtodo se basa en la extraccin de MDA de una suspensin de eritrocitos mediante una

disolucin de cido tricloroactico (ATC) y la posterior reaccin del MDA extrado con cido
tiobarbitrico (TBA), dando lugar a un complejo coloreado con un mximo de absorcin a 532
nm.

La peroxidacin lipdica es inducida mediante la incubacin de los eritrocitos con H2O2 (20 mM)
en presencia o no de las muestras a analizar durante 90 min a 37 C. A continuacin, la
suspensin de eritrocitos se mezcl con 1 mL de ATC al 20 % (p/v) para eliminar sustancias que
podran interferir en la determinacin (Srour y col., 2000). Seguidamente la mezcla fue
centrifugada y se tom 1 mL del sobrenadante que se agreg a 1 mL de TBA al 1 %.
Finalmente, las muestras se calentaron a 90 C durante 50 min, se enfriaron y centrifugaron.
Se midi la absorbancia del sobrenadante a 532 nm y a 600 nm para eliminar posibles
impurezas.

El grado de peroxidacin lipdica se expres en unidades de absorbancia y como EC50 de la

inhibicin de formacin de TBAR.

101
Materiales y Mtodos

3.3.7. ENSAYO IN VITRO DE IRRITACIN DE LA PIEL (EPISKIN)

Se ha utilizado el mtodo de modelo de piel humana reconstituida EpiSkin descrito como

mtodo validado y aceptado para valorar la irritacin drmica y como alternativa al ensayo con
animales (Portes y col., 2002, Tornier y col. 2010).

El mtodo consiste en un modelo tridimensional de epidermis humana obtenida a partir de

queratinocitos humanos cultivados sobre una matriz de colgeno, obtenindose una epidermis
estratificada despus de 13 das de cultivo y constituida por una capa basal, espinosa y
granulosa y un estrato crneo. El modelo ha sido desarrollado y comercializado por EpiSkin
SNC (Lyon, Francia) y se basa en la aplicacin de los productos y la posterior determinacin de
la viabilidad celular, as como la produccin de IL-1 (Interleuquina-1) inducida por los
procesos irritativos.

Una vez recibido el producto de EpiSkin SNC, las epidermis reconstruidas de 0,38 cm2cada una,
se colocaron en 12 pocillos de las placas con 2 mL de medio de mantenimiento y se incubaron
a 37 C en atmsfera humidificada (> 95 %) con 5 % de CO2 durante 24h.

Las muestras a analizar (10 L) se disolvieron en agua destilada (1 %) y se pusieron en contacto

con las muestras de epidermis durante 15 min. Se utiliz como control negativo PBS (tampn
fosfato salino) y como control positivo una disolucin al 5 % de SDS (dodecilsulfato sdico) en
agua destilada. Transcurridos los 15 minutos de contacto las muestras de epidermis se lavaron
con PBS estril y se incubaron en el medio de mantenimiento. Despus de 42 h, el medio se
recogi en tubos eppendorf y se congel a -20 C hasta la posterior determinacin de IL1-
con el kit comercial Diaclone ELISA (Reino Unido) con una sensibilidad mxima de 31,2 pg/mL
siguiendo las indicaciones del fabricante.

La viabilidad celular se determin mediante el ensayo MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-

il)-2,5-dfenil-tetrazolio). Para ello, se colocaron las epidermis en los pocillos junto con 2 mL de
una disolucin de MTT en medio de ensayo (0,3 mg MTT/mL) y se incubaron durante 3 h a
37 C en atmsfera humidificada (5 % CO2, 95 % humedad). Transcurrido el tiempo de
incubacin, las epidermis se colocaron en tubos eppendorf y se extrajeron con 0,5 mL de
isopropanol acidificado para retirar del interior de las clulas el formazn producido. Los tubos
se mantuvieron a temperatura ambiente durante 4 h protegidos de la luz. Finalizado el periodo
de incubacin se centrifugaron los tubos se colocaron 200 L por duplicado de cada uno de los
tubos en placas de 96 pocillos y se ley la absorbancia a 550 nm con un blanco de isopropanol

102
 Materiales y Mtodos

acidificado. La determinacin de la viabilidad celular se determin a partir de los datos de

densidad ptica considerando la viabilidad del 100 % para las muestras de epidermis tratadas
con el control negativo.

3.3.8. DETERMINACIN DE AZCARES

3.3.8.1. DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES MEDIANTE EL MTODO DNS

El contenido en azcares reductores se determin mediante el mtodo descrito por Chaplin y

Kennedy (1987).

El reactivo se prepar prepara disolviendo 10 g de 3,5 dinitrosaliclico (DNS) en 200 mL de

NaOH 2M. A continuacin se aadieron 300 g de tartrato de sodio y potasio 4-hidrato 2,12 M.
Todo ello se enras a 1 L. El reactivo se guard en oscuridad a 4 C hasta su uso.

A 0,5 mL de muestra se aadieron 0,5 mL de reactivo DNS. Se agit y se llev a ebullicin

durante 5 min. Se dej enfriar y se aadieron 5 mL de agua destilada. Se agit y se ley la
absorbancia a 540 nm frente a un blanco de agua destilada.

Usando el mismo procedimiento descrito, se construy una recta de calibrado (Figura 3.10)
representando grficamente la absorbancia frente a distintas concentraciones (0-1 g/L) de
glucosa (Panreac).

1,20
Concentracin (g Glucosa/L)

1,00
C (g/L) = 1,836Abs + 0,034
0,80 R = 0,997

0,60

0,40

0,20

0,00
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60
Absorbancia 540 nm

Figura 3.10: Recta de calibrado para el mtodo DNS.

3.3.8.2. DETERMINACIN DE AZCARES TOTALES. MTODO DE LA ANTRONA

Para la determinacin del contenido total en azcares se utiliz el mtodo descrito por
Trevelyan y col. (1952).

103
Materiales y Mtodos

El reactivo de la antrona se prepar disolviendo 0,75 g de antrona en 500 mL de cido sulfrico

al 70 % (v/v). A continuacin se dej reposar durante 30-40 min agitando ocasionalmente
hasta obtener una mezcla perfectamente clara.

A 0,2 mL de muestra se aadieron 5 mL del reactivo y se hirvi en un bao a 90 C durante 17

min. Se dej enfriar y se ley la absorbancia a 625 nm frente a un blanco preparado siguiendo
el mismo procedimiento pero reemplazando la muestra por 0,2 mL de disolvente.

Usando el mismo procedimiento descrito, se construy una recta de calibrado (Figura 3.11)
representando grficamente la absorbancia frente a distintas concentraciones (0-0,5 g/L) de
glucosa (Panreac).

0,60
Concentracin (g Glucosa/L)

0,50 C (g/L) = 0,628Abs + 0,010

R = 0,997
0,40

0,30

0,20

0,10

0,00
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00
Absorbancia 625 nm

Figura 3.11: Recta de calibrado para el mtodo de la antrona.

3.3.9. DETERMINACIN DE PROTENA. MTODO DE BRADFORD

El contenido en protenas se determin siguiendo el mtodo descrito por Bradford (1976).

A 0,5 mL de muestra se le aadieron 3 mL de reactivo Bradford (Sigma), se agit y se dej

reposar de 5 min temperatura ambiente. Transcurrido dicho tiempo se ley la absorbancia a
595 nm frente a un blanco preparado siguiendo el mismo procedimiento pero reemplazando la
muestra por 0,5 mL de disolvente.

Usando el mismo procedimiento descrito, se construy una recta de calibrado (Figura 3.12)
utilizando distintas concentraciones (0-0,8 g/L) de suero de albmina de oveja (BSA) (Sigma).

104
 Materiales y Mtodos

1,20

Concentracin (g BSA/L)
1,00
C(g/L) = 1,255Abs - 0,016
0,80 R = 0,998

0,60

0,40

0,20

0,00
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00
Absorbancia 595 nm
Figura 3.12: Recta de calibrado para el mtodo de Bradford.

105
4. RESULTADOS
Resultados

4. RESULTADOS

Los resultados ms relevantes de esta tesis se recogen en seis trabajos, dos manuscritos y una
patente. Las referencias y resmenes de los mismos se incluyen a continuacin.

Publicacin I: Beatriz Daz-Reinoso, Andrs Moure, Herminia Domnguez, Juan Carlos Paraj.
Ultra- and nanofiltration of aqueous extracts from distilled fermented grape pomace. Journal
of Food Engineering, 91 (2009) 587-593.

Publicacin II: Beatriz Daz-Reinoso, Noelia Gonzlez-Lpez, Andrs Moure, Herminia

Domnguez, Juan Carlos Paraj. Recovery of antioxidants from industrial waste liquors using
membranes and polymeric resins. Journal of Food Engineering, 96 (2010) 127-133.

Publicacin III: Beatriz Daz-Reinoso, Diana Couto, Andrs Moure, Eduarda Fernandes,
Herminia Domnguez, Juan Carlos Paraj. Optimization of antioxidants Extraction from
Castanea sativa leaves. Chemical Engineering Journal, 203 (2012) 101-109.

Publicacin IV: Beatriz Daz-Reinoso, Andrs Moure, Herminia Domnguez, Juan Carlos Paraj.
Membrane concentration of antioxidants from Castanea sativa leaves aqueous extracts.
Chemical Engineering Journal, 175 (2011) 95-102.

Publicacin V: Liza E. Laroze, Beatriz Daz-Reinoso, Andrs Moure, Mara Elvira Ziga,
Herminia Domnguez. Extraction of antioxidants from several berries pressing wastes using
conventional and supercritical solvents. European Food and Research Technology, 231 (2010)
669-677.

Publicacin VI: Andrs Moure Varela, Herminia Domnguez Gonzlez, Juan Carlos Paraj
Liares, Mara Jess, Gonzlez Muoz, Beatriz Daz Reinoso, Enma Conde Pieiro, Mara Jess
Conde Pieiro, Noelia Gonzlez Lpez, Argimiro Levoso Touceda, Manuel Castro Gonzlez,
Emilio Vidal Canto, Jos Gonzlez Mndez. Procedimientos de recuperacin de compuestos
antioxidantes presentes en efluentes de destilera de vino. (2010) Patente ES 2 345 748 A2.

Publicacin VII: Beatriz Daz, Ana Gomes, Marisa Freitas, Eduarda Fernandes, Daniele R.
Nogueira, Jos Gonzlez, Andrs Moure, Argimiro Levoso, Mara Pilar Vinadell, Montserrat
Mitjans, Herminia Domnguez, Juan Carlos Paraj. Valuable polyphenolic antioxidants from
wine vinasses. Food and Bioprocess Technology, 5 (2012) 2708-2716.

109
 Resultados

Publicacin VIII: Beatriz Daz-Reinoso, Andrs Moure, Herminia Domnguez. Ethanol-modified

supercritical CO2 extraction of chestnut burs antioxidants. Journal of Supercritical Fluids
(enviado).

110
 PUBLICACIN I

Ultra- and nanofiltration of aqueous extracts from distilled fermented grape pomace.
Beatriz Daz-Reinoso, Andrs Moure, Herminia Domnguez, Juan Carlos Paraj.
Journal of Food Engineering 91 (2009) 587-593.
NDICE DE IMPACTO: 2,313
 Resultados

Resumen

Durante el proceso de vinificacin se genera gran cantidad de residuos que deben ser tratados
para disminuir su impacto ambiental. Estas corrientes de desecho contienen compuestos
antioxidantes, por lo que su recuperacin y aprovechamiento permitira aportar una mayor
rentabilidad al proceso de partida.

El principal residuo de la industria vitivincola es el bagazo resultante del prensado de la uva y

constituido principalmente por hollejos, raspones y semillas. En las empresas vitivincolas
donde se obtiene aguardiente, este residuo se somete a un proceso de fermentacin donde se
producen varios compuestos orgnicos voltiles que son recuperados mediante destilacin
para la obtencin de bebidas espirituosas. El bagazo destilado permanece como residuo siendo
habitualmente empleado como fertilizante en los propios viedos de las empresas
productoras. Sin embargo las elevadas producciones anuales de este tipo de bebidas elevan la
generacin de este residuo y hacen que esta reutilizacin no sea suficiente para su completa
eliminacin, necesitando los servicios de empresas gestoras que se encarguen de la misma.

La informacin en la bibliografa acerca del aprovechamiento de este residuo de destilera para

la obtencin de antioxidantes es ms escasa que la utilizacin del bagazo de prensado. Sin
embargo algunos estudios (Cruz y col., 2004; Pinelo y col., 2005b) demostraron que los
compuestos fenlicos presentes en este residuo son ms activos que los presentes en el
bagazo inicial.

En trabajos anteriores del grupo (Cruz y col., 2004, Pinelo y col., 2004) se propusieron distintas
alternativas para la obtencin de compuestos antioxidantes a partir del bagazo destilado. La
opcin ms simple consistira en una etapa de prensado para recuperar los compuestos
antioxidantes presentes en el lquido embebido en el sustrato.

En el presente trabajo se plante un aprovechamiento ms completo del bagazo destilado. Los

slidos resultantes del prensado se sometieron a una etapa de extraccin con agua caliente y
se evalu la viabilidad del empleo de membranas comerciales para la concentracin de
compuestos antioxidantes presentes en los extractos acuosos.

Se trabaj con membranas de distintos materiales, configuraciones y tamao de corte con el

fin de optimizar las condiciones de operacin que conducen a la concentracin de compuestos
fenlicos con capacidad antioxidante, as como la evaluacin del efecto del ensuciamiento y
de las etapas de limpieza en el proceso de filtracin.

113
Resultados

En comparacin con la corriente de alimentacin inicial el contenido en compuestos fenlicos

de los concentrados obtenidos aument entre 3 y 6 veces su valor. Adems, las fracciones
solubles en acetato de etilo procedentes de los concentrados obtenidos con las distintas
membranas presentaron una capacidad antioxidante comparable a la de antioxidantes
sintticos. Los resultados experimentales confirmaron la aplicabilidad de la tecnologa de
membranas para procesar corrientes de desecho generadas en la industria vitivincola.

114
 Journal of Food Engineering 91 (2009) 587593

Contents lists available at ScienceDirect

Journal of Food Engineering

journal homepage: www.elsevier.com/locate/jfoodeng

Ultra- and nanoltration of aqueous extracts from distilled fermented grape pomace
Beatriz Daz-Reinoso, Andrs Moure, Herminia Domnguez *, Juan Carlos Paraj
Department of Chemical Engineering, University of Vigo (Campus Ourense), Edicio Politcnico, As Lagoas, 32004 Ourense, Spain

a r t i c l e i n f o a b s t r a c t

Article history: Aqueous extracts from pressed distilled grape pomace were processed using ultraltration (UF) and
Received 19 May 2008 nanoltration (NF) membranes to obtain fractions enriched in compounds with antioxidant activity.
Received in revised form 25 July 2008 The properties of concentrates (composition, phenolic content and antioxidant activity) were determined
Accepted 6 October 2008
for different commercial UF and NF membranes as a function of the volume reduction factor. Membrane
Available online 18 October 2008
concentrates obtained under selected conditions were extracted with ethyl acetate to yield fractions with
enhanced antioxidant activity. The radical scavenging capacities of ethyl acetate extracts were in the
Keywords:
range reported for synthetic antioxidants. Cleaning resulted in the recovery of 92100% of the initial
Nanoltration
Ultraltration
permeability.
Distilled grape pomace 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved.
Phenolic compounds
Antioxidant activity

1. Introduction
In the wine industries that produce spirits, the pressing grape
pomace subjected to distillation, leads to a solid phase called
distilled grape pomace (DGP). This spent fraction is used just for
disposal in cultivation lands.
Scarce information exists on the extraction of antioxidants from
this material (particularly, in comparison with the data available
for pressing grape pomace). However, the phenolic compounds
contained in DGP are more active than those in the pressing pom-
ace (Pinelo et al., 2005) and highly thermostable compared to syn-
thetic antioxidants (Cruz et al., 2007).
Several alternatives have been proposed for extracting antioxi-
dants from DGP (Cruz et al., 2004). The most simple one is based on
a pressing stage (Pinelo et al., 2004) to recover the liquid retained
in the pomace, which has been reported to yield 0.47 g of extract/
100 g of dry pomace with a moderate DPPH radical scavenging
capacity (EC50 = 0.72 g/L). A more complete utilization of the dis-
tilled grape pomace could be achieved if the pressed solids were
extracted with hot water, and this treatment increases the suitabil-
ity of the solids for composting. However, this approach leads to an
additional aqueous stream.
The utilization of membrane technologies for concentrating and
purifying bioactive phenolic compounds from aqueous streams is a
topic of growing interest. For example, fractionation of phenolics
into low- and high- molecular weight compounds was applied to
aqueous extracts from edible mushrooms (Cheung and Cheung,
2005), to partially puried methanolic extracts from persimmon
* Corresponding author. Tel.: +34 988 387082; fax: +34 988 387001.
E-mail address: herminia@uvigo.es (H. Domnguez).
pulp (Gu et al., 2008), and to almond skin extracts (Prodanov
et al., 2008) (in this latter case, for analytical purposes).
The separation selectivity can be improved by using mem-
branes able to interact with some compounds in solution. For
example, a modied PVP membrane favouring the formation of
hydrogen bonds with avonoids improved their separation from
a Ginkgo biloba extract (Xu et al., 2005).
Some efuent processing technologies can reduce pollution and
recover useful products in a single step. In this eld, chemical oxy-
gen demand (COD) reduction and separation of valuable com-
pounds (fats, sugars, polyphenols, etc.) from centrifuged olive
mill wastewaters have been reached by ultraltration (UF) in a
at-sheet module (Turano et al., 2002). Several techniques have
been used to separate low molecular weight phenolics from olive
mill wastewaters at the pilot scale (Russo, 2007), including combi-
nations of UF, nanoltration (NF) and reverse osmosis (RO) stages.
The low content of organic compounds and salts in permeates al-
lowed their direct disposal in aquatic receptors, or their use for
irrigation (Paraskeva et al., 2007a,b). UF of cork processing waste-
waters to reduce COD, color, and the contents of aromatics and
tannins has been proposed (Acero et al., 2005). Phenolics from
grape have been processed by UF for concentration (Nawaz
et al., 2006) or for anthocyanin fractionation (Kalbasi and Cisneros-
Zevallos, 2007); as well as by NFUFmicroltration (MF)UF for
producing proanthocyanic fractions (Santamara et al., 2002).
Membranes have been used to recover phenolic compounds pres-
ent in processed extracts of mulberry root cortices (Yu et al., 2007),
and to concentrate catechins from black tea after a preliminary UF
stage carried out to retain proteins (Todisco et al., 2002). In a
related study, ethanol extracts from corn were processed with
membranes to retain zein, and the permeates were further

0260-8774/$ - see front matter 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved.
doi:10.1016/j.jfoodeng.2008.10.007
588 B. Daz-Reinoso et al. / Journal of Food Engineering 91 (2009) 587593
subjected to NF to concentrate xanthophylls (Tsui and Cheryan,
2007). Ultraltration of green tea water extracts was suitable for
retaining particles, proteins, polysaccharides and tannic acid,
yielding a permeate with more than 40% polyphenols and caffeine
(Li et al., 2005), which were further separated by adsorption
desorption in resins. RO concentration of isoavones from the
UFDF permeate of a soymilk making plant has been also reported
(Xu et al., 2004).
The aim of this work was to assess the performance of commer-
cial membranes for concentrating antioxidant compounds present
in the aqueous extracts from DGP, leading to concentrates contain-
ing phenols with high antioxidant activity that could be recovered
by extraction. Membrane fouling and cleaning effects were also
measured.
2. Materials and methods
2.1. Material
Distilled white grape pomace (vintage 2006) from a local win-
ery (Cooperativa Vitivincola do Ribeiro, Ourense, Spain) was used
in experiments. Distilled grape pomace was pressed (1.4 MPa,
5 min) to remove the liquors retained in the grape pomace (Cruz
et al., 2004). The remaining solid was washed with tap water at a
liquid-to-solid ratio of 15 g/g during 1 h at 60 C. The liquid phase
was decanted from the washed solids, centrifuged, ltered, stored
in sealed plastic bottles and kept at 4 C until use. The average
composition of the resulting solution was 0.22 g total solids/L,
0.23 g phenolics (measured as gallic acid equivalents, GAE)/L, and
0.27 g total sugars/L. The average antioxidant activity was
3.42 mmol Trolox equivalents, with EC50,DPPH = 0.11 g GAE/L.
2.2. Experimental set-up
The commercial UF and NF membranes used in this work were
made of composite polyamide materials, polymeric materials, and
ceramic materials (see Table 1).
In order to achieve the necessary feed ow velocity and/or
transmembrane pressure (TMP) using the different membranes,
different equipments have been used, as described elsewhere
(Vegas et al., 2008). To test the spiral or tubular elements, two
stainless steel monotubular modules with lengths of either 1.2 m
(Osmonics membranes), 0.305 m (Millipore membranes) or
0.604 m (Inside Cram membrane) were used. A variable speed
Hydracell pump (able to work up to 60 bar with a maximum ow
rate of 600 L/h) was employed, and the system was tted with a
ow meter. Pressure was monitored at the entrance and exit of
the membrane module, and a needle valve located after the mem-
brane module was used for TMP regulation. Temperature was
monitored using a PT100 probe, and controlled by ushing tap
water through a refrigeration coil placed in the feed tank (which
had a volume of 8 L when operating with Inside Cram or 20 L in
the rest of cases). The system allowed simultaneous operation
with two different membranes, with separate handling of the
permeates.
Table 1
Membranes tested in this study.
Membrane Material Manufacturer P maximum (bar)
Nanomax 95 PA/PS Millipore 41
Nanomax 50 PA/PS Millipore 41
DL2540 TF Osmonics 40
GE2540 TF Osmonics 40
Inside Cram Titania Tami 90
a
Determined in our laboratory at 8 bar and 20 C.
2.3. Operational modes
2.3.1. Full recycle mode
Full recycle experiments were carried out at different TMP in
order to determine the optimal operational conditions for each
membrane. The permeate ux J was measured at TMP in the range
28 bar. Successive experiments were carried out from lower to
higher pressures. Once the stable ux value was reached at a given
TMP, the pressure was increased to the next (higher) considered
value. When the new stationary permeate ux was achieved,
TMP was decreased to the previously tested value to assess irre-
versible fouling, and the TMP was then increased to the next value
(Fig. 1).
2.3.2. Batch operation in concentration mode
Concentration experiments were carried out in batch mode,
with simultaneous retentate recycling and permeate removal.
The volume reduction factor (VRF) was calculated as the ratio be-
tween the initial feed volume and the volume of retentate remain-
ing at the considered operation time. Samples of permeate and
concentrate were collected at various operation time, as well as
in concentration experiments at various VRF. The samples were as-
sayed for total solids, total phenolics, total sugars, and radical scav-
enging capacity (ABTS, DPPH).
2.3.3. Cleaning
The inuence of fouling was assessed in selected experiments.
To assess irreversible fouling, membranes were rinsed with water
after each experiment, and their water permeability was measured
again. In addition, the system was operated with increasing/
decreasing TMP proles in order to assess their effects on fouling.
After, the fouled membranes were cleaned with a caustic detergent
solution (0.5% Ultrasil 11, from Henkel Ecolab) at 50 C for 60 min
operating in full recirculation mode, and the system was then
operated with fresh water in order to check the ux recovery.
The detergent, employed at the same concentration for all the
cleaning cycles, has been widely used and was selected based on
its suitability for a variety of feed solutions.
2.4. Analytical methods
Total solids were determined by oven drying at 105 C. Total
phenolic content was determined by the FolinCiocalteu colori-
metric method and expressed as gallic acid equivalents (GAE).
The total sugar content was determined by the anthrone method
(Trevelyan et al., 1952), and expressed as glucose equivalents (GE).
2.5. Antioxidant activity determination
The retentates obtained from batch operation in the concentra-
tion mode were extracted with ethyl acetate at 3 (v/v) reten-
tate:solvent ratio at room temperature during 15 min in a double
extraction stage. The organic phase was vacuum evaporated to re-
move and recover the solvent and the extract was oven dried and
analyzed for total phenolics and antioxidant activity.
T maximum (C) MWCO/rejection Water permeabilitya (L/m2 h)
50 250 85
50 350 50
50 150300 95
50 1000
150 1000 380
 B. Daz-Reinoso et al. / Journal of Food Engineering 91 (2009) 587593 589

absorbance of 0.70 at 734 nm and equilibrated at 30 C. After addi-

a 60
2 bar tion of 1.0 mL of diluted ABTS+ solution to 10 lL of antioxidant
50 4 bar compounds or Trolox standards in ethanol or PBS, the absorbance
6 bar reading was taken 1 min after initial mixing and up to 6 min. Sol-
40 8 bar vent blanks were run in each assay, and the percentage inhibition
J (L/hm2)

of absorbance was calculated as a function of the concentration of

30 extracts and Trolox.

20
3. Results and discussion
10
3.1. Time dependence of the permeate ux with transmembrane
0 pressure
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
Time (h) The aqueous extracts from pressed distilled grape pomace were
centrifuged to remove suspended solids before UF. This strategy to
b 70
2 bar decrease membrane fouling has been applied to other efuents,
60 4 bar including olive wastewaters (Turano et al., 2002), mosambi juice
6 bar
(Rai et al., 2007), dairy cleaning-in-place (CIP) solutions (Dresch
50 et al., 2001), and black liquors (Bhattacharjee and Bhattacharya,
8 bar
J (L/hm2)

40 2006). Alternatively, microltration could be used to reduce the

fouling layer and the specic resistance of ultraltration mem-
30 branes (Yu et al., 2007).
20 The construction material, pore size, temperature, and TMP are
inuential variables on the performance of membrane processes.
10 Since in our case the feed stream is not viscous, operation was
carried out at room temperature (20 C). In the set of experiments
0
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 performed to assess the inuence of TMP, the feed velocity was
Time (h) kept in the range 23 m/s.
Preliminary assays were carried out in full recycle mode at TMP
c 30
2 bar
in the range 28 bar. Fig. 1 shows the time dependence of J deter-
mined for aqueous extracts from pressed distilled grape pomace
25 4 bar operating at selected TMP. The most marked declining of J, caused
6 bar by concentration polarization and fouling, was observed for the
20
J (L/h m2)

8 bar ceramic membrane (Inside Cram) and Nanomax 95. J showed less
15 variations in experiments with DL2540 and GE2540, except at the
lowest pressures tested. The effects observed were not in direct
10 relation to the pore size. In studies dealing with the processing of
extracts of root cortices from mulberry with a given type of mem-
5
brane (Yu et al., 2007), J increased with the pore size.
0
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 3.2. Effect of TMP on J
Time (h)
Fig. 2 shows the effects of TMP on the values of J achieved in sta-
Fig. 1. Time course of permeation for aqueous extracts from pressed distilled grape ble operation. A linear interrelationship between both variables
pomace processed with: (a) Inside Cram; (b) Nanomax 50 (white), Nanomax 95
was observed for experiments performed with Nanomax 95 and
(black); (c) DL2540 (white) and GE2540 (black), operating at (}: 2 bar; h: 4 bar; D:
6 bar; s: 8 bar). Feed ow velocity, 2 m/s for the UF membranes, and 3 m/s for the GE2540. Operating with the DL2540 and the Inside Cram
NF membrane. Temperature, 20 4 C. membranes, J increased linearly with TMP only at low pressures.
In experiments with Nanomax 50, higher TMP led to J independent

The antioxidant activities of feed, retentates and crude ethyl

acetate extracts from the retentates were evaluated using the
70
in vitro tests for radical scavenging listed below. Inside Cram
a,a-Diphenyl-b-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging 60 DL2540
capacity was determined as described elsewhere (Cruz et al.,
50 GE2540
2004). The inhibition percentage (IP) of the DPPH radical was cal-
J (L/hm2)

Nanomax 95
culated as the percent of absorbance reduction after 16 min respect 40
to the initial value. EC50 was calculated as the concentration of Nanomax 50
30
phenolic compounds necessary to quench 50% of the initial DPPH
radical. 20
TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) assay was based on 10
the scavenging of ABTS radical [2,20 -azinobis (3-ethyl-benzothiaz-
oline-6-sulfonate)]. ABTS radical cation (ABTS+) was produced by 0
0 2 4 6 8 10
reacting 7 mM ABTS stock solution with 2.45 mM potassium per-
P (bar)
sulfate (nal concentration) and allowing the mixture to stand in
the dark at room temperature for 1216 h before use. ABTS+ solu- Fig. 2. Effect of TMP on the permeate ux using a feed ow velocity, 23 m/s at
tion was diluted with phosphate buffer saline (PBS) (pH 7.4) to an 20 4 C, operating in full recycle mode.
590 B. Daz-Reinoso et al. / Journal of Food Engineering 91 (2009) 587593

of further increases in pressure. A related behaviour was observed

a 100
in the concentration of avones by nanoltration of Ginkgo biloba
extracts (Xu and Wang, 2005; Xu et al., 2005), where the permeate
ux exhibited a linear relation with TMP when the system was 80

Rejection (%)
operated at low pressures, and showed non-linear increases with
the operating pressure, especially in the range 1.01.5 MPa. 60
As observed in Fig. 1, the permeate ux did not vary proportion-
ally to the MWCO of the membrane, suggesting that the chemical 40
nature of the membrane material plays a key role in membrane
performance. The highest ux was achieved with Nanomax 95
20
(which had the lowest pore size), whereas the uxes attained with
Inside Cram DL2540 Nanomax 95 Nanomax 50
the GE2540 membrane (MWCO 1000 Da) were lower than those
found for DL2540, Nanomax 95 and Nanomax 50 (MWCO 150 0
350 Da). This apparent contradiction has been previously found 1 3 5 7 9
in studies dealing with membrane-processing of biomass-derived P (bar)
solutions, probably due to the formation during operation of very
b 100
small particles (of the same size range of the UF membrane
channels), which were deposited in the channels, increasing the
resistance to the ow. In the NF membranes, the particles would 80
remain out of the channels, instead of clogging them, resulting in

Rejection (%)
a comparative lower ow resistance. 60
The separation ability of a membrane can be established in
terms of solute rejection coefcient (Rj), dened as: 40
Rj 1  C p =C f 1
20
where Cp is the permeate concentration, and Cf is the feed concen- Inside Cram DL2540 GE2540
tration. Rj measures the fraction of solute retained by the Nanomax 95 Nanomax 50
membrane. 0
1 3 5 7 9
Fig. 3 shows the effects caused by TMP on the solute rejections
P (bar)
for the tested membranes. For each membrane considered, the
rejection coefcient followed a different TMP dependence within c 100
the studied range: increased retentions of solids and phenols were Inside Cram
observed for the ceramic membrane, almost constant values were DL2540
determined for Nanomax-95, and decreasing retentions were no- 80
GE2540
ticed for DL2540 and GE2540. The ceramic membrane provided
Rejection (%)

the highest rejections of total solids and phenolics, except when 60 Nanomax 95

the system was operated at the lowest TMP. As expected, TEAC Nanomax 50
of retentates followed trends similar to the ones observed for 40
phenolics, conrming the proportionality between both parame-
ters. This proportionality would not occur if the fractions or com- 20
pounds tested became prooxidant at the concentration ranges
considered. Lower TMP resulted in higher retention of antioxidant
0
except for the ceramic membrane, which did not show TMP effects
2 4 6 8
on retention. (bar)
P
Related studies dealing with tea ltration through ceramic
membranes have reported increases in retention coefcients with Fig. 3. Rejection of (a) total solids, (b) total phenols and (c) TEAC operating in full
recycle mode.
increasing TMP (Todisco et al., 2002). In pilot scale NF and UF of
Kraft black liquors through ceramic membranes to remove low
molecular weight lignin, the apparent rejection coefcient in-
creased linearly with TMP, but was independent of pressure under
the highest ow condition (Keyoumu et al., 2004).
Inside Cram DL2540
50
3.3. Concentration of aqueous extracts from pressed distilled grape 45 GE2540 Nanomax 95

pomace 40
Nanomax 50

35
Fig. 4 shows the evolution of J along the concentration experi-
J (L/mh2)

30
ments, operating at the TMP selected for each of the tested mem-
25
branes. The permeate ux decreased gradually with VRF due to the
20
increased concentration of solutes in retentate. Such a decrease
15
was progressive for Millipore membranes (Nanomax 50 and Nano-
10
max 95), asymptotic for Inside Cram and DL2540, and almost not
marked in the assay with the GE2540 membrane (which provided 5
the lowest J). Ceramic and GE2540 membranes showed the best 0
1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0
concentration performance, allowing VRF about 6.5. With the Mil-
VRF
lipore membranes, VRF between 5.5 and 6.5 were reached, but no
steady J were achieved. In these experiments, the comparatively Fig. 4. Effect of VRF on the permeate ow.
 B. Daz-Reinoso et al. / Journal of Food Engineering 91 (2009) 587593 591

high values of J obtained at the end of the runs suggested that both
membranes could be further operated to achieve steady uxes.
3.4. Retention of total phenolics and total sugars
The solute rejection apparent coefcients (Rj) of total phenolics
and total sugars were calculated for experiments performed at the
TMP previously selected to achieve VRF in the range 5.56.5 (see
Fig. 5). Operating in concentration mode during a differential per-
iod of time, in which the volume of retentate decreases from Vr to
Vr  dVr and a volume of permeate dVP (numerically equal to dVr)
passes through the membrane, and considering that the solute
concentrations in permeate and retentate are Cp and Cr, respec-
tively, a material balance to the solute can be established as fol-
lows (Krishna Kumar et al., 2003):
C p dV r dV r C r
On the other hand, Cp can be expressed as a function of Cr using
Eq. (1). After solving for Cp and substituting in the above expres-
sion, further integration (assuming that Rj is independent from
the retentate concentration) leads to:
lnC r =C r0 Rj  lnV r0 =Vr
where Cr0 and Vr0 are the concentration and the volume of the feed,
and the term Vr0/Vr is VRF. Under the hypotheses mentioned above,
ln(Cr/Cr0) is expected to vary linearly with ln(VRF), Rj being the
slope of the plot.
As a general trend, the tested membranes did not show a pref-
erential rejection of phenolic compounds over sugars, the most
selective being Osmonics membranes and Nanomax 50. The
molecular weight of various simple phenols and avonoids present
in grape and wine byproducts was quite similar: catechin and
epi-catechin (290.3), epi-catechin gallate (442.4), gallic acid
(170.1), and quercetin (448.4). Procyanidins oligomers have higher
molecular weights, whereas the molecular weight of sugars and or-
ganic acids is slightly lower. The similar molecular weights of var-
ious compounds present in feed stream hinder a suitable
membrane fractionation. Because of this, membrane processing
was oriented towards concentration. In related studies, UF was
used to concentrate a grape seed ethanol:water extract (Nawaz
et al., 2006). Membrane fractionation of phenolic compounds on
the basis of their molecular weight has been reported for grape
proanthocyanidins (Santamara et al., 2002), for monomeric and
polymeric grape anthocyanins (Kalbasi and Cisneros-Zevallos,
2007), and for separation of low molecular weight phenolics from
high molecular weight tannins of persimmon pulp (Gu et al., 2008).
3.5. Characterization of retentate
2
The chemical composition of retentates produced with the var-
ious membranes at volume concentration ratios (VRF) in the range
5.56.5 is summarized in Table 2. The initial feed showed a content
of phenolics similar to that reported for the water extracts of red
grape distilled pomace (Pinelo et al., 2005), and was increased by
3
factors in the range 36 after membrane processing.
The DPPH radical scavenging capacity of the streams concen-
trated with the Inside Cram and DL2540 membranes was compa-
rable to that of the initial feed. All retentates showed slightly
higher activity than synthetic antioxidants (EC50,BHA = 0.24 mg/mL,
EC50,BHT = 2.79 mg/mL).
The ABTS radical scavenging capacity of retentates was in-
creased by 3.56.6 times, achieving a nal value comparable
to that reported for grape pomace from different varieties
(Gonzalez-Paramas et al., 2004). These activities were seven

a 2.0
Inside Cram
2
1.6 GE2540 Membrane Rj R
Nanomax 95 Inside Cram 0.614 0.980
LN (C/C0)

1.2
Nanomax 50 Osmonics DL2540 0.984 0.947
0.8
Osmonics GE2540 0.983 0.986
0.4 Nanomax 95 0.828 0.982
Nanomax 50 1.010 0.976
0.0
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2
LN (VRF)

b 2.0 Inside Cram 2

Membrane Rj R
GE2540
1.6 Inside Cram 0.873 0.974
Nanomax 95
Osmonics DL2540 0.969 0.981
LN (C/C0)

1.2
Nanomax 50 Osmonics GE2540 0.978 0.977
0.8 Nanomax 95 1.009 0.988
Nanomax 50 0.943 0.949
0.4

0.0
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2
LN (VRF)

Fig. 5. Rejection coefcients for total phenolics (a) and for total sugars (b).
592 B. Daz-Reinoso et al. / Journal of Food Engineering 91 (2009) 587593

Table 2
Characterization of the retentates obtained in the tested membranes operating in concentration mode.

Membrane Total soluble solids Total phenolics Total sugars TEAC DPPH EC50 DPPH EC50
(g/100 g) (mg GAE/mL) (mg/mL) (mmol Trolox) (g extract/mL) (g GAE/mL)
Initial value 0.222 0.173 0.27 3.42 0.112
Nanomax 95 1.410 0.019 1.090 0.0002 2.09 0.02 19.6 0.173 1.14 0.155
Nanomax 50 0.990 0.011 0.842 0.003 1.19 0.019 22.5 0.074 1.37 0.198
DL2540 0.698 0.009 0.940 0.002 0.89 0.009 18.0 0.450 1.52 0.103
GE2540 0.659 0.019 0.615 0.002 0.45 0.004 12.1 0.750 1.96 0.127
Inside Cram 0.786 0.020 0.867 0.006 1.35 0.040 19.6 0.173 0.88 0.100

Table 3
Characterization of the extract processed by solvent extraction from the retentates in the tested membranes operating in concentration mode.

Membrane Solid yield (g /100 g) Total phenolics (g GAE/100 g extract) TEAC (mmol Trolox/g extract) DPPH EC50 (g extract/L) DPPH EC50 (g GAE/L)
Nanomax 95 0.937 0.06 22.2 0.8 6.22 0.25 0.394 0.002 0.072 0.001
Nanomax 50 1.60 0.03 37.3 3.9 8.83 0.35 0.184 0.001 0.063 0.001
DL2540 1.12 0.08 34.1 1.7 7.73 0.11 0.215 0.001 0.094 0.001
GE2540 0.834 0.13 21.6 1.8 4.93 0.15 0.457 0.002 0.121 0.002
Inside Cram 1.60 0.11 51.7 1.1 9.65 0.09 0.223 0.001 0.118 0.001

times higher than that reported for grape marc phenolic extract the results determined for the corresponding retentates. The re-
(Spigno et al., 2007), and 6.59 times higher than that reported sults show that the most favourable membrane was Inside Cram,
for blood orange juice before concentration (Arena et al., 2001). as it provided the highest yield and antioxidant activity.
In order to obtain an extract with high antioxidant activity from
retentates, an ethyl acetate extraction stage was carried out. Table 4. Cleaning
3 lists data concerning these extracts. The highest yields (1.60 g
solid/ 100 g retentate) corresponded to concentrates obtained with Fig. 6 shows the steady uxes of water reached after each clean-
Nanomax 50 and Inside Cram membranes. This latter resulted in ing cycle performed at the selected TMP. For comparative pur-
extracts with the highest phenolic content (nearly 52%), whereas poses, the gure includes data of permeability (P) for (i) distilled
the extracts produced with Nanomax 50 showed low phenolic con- water, (ii) fouled membranes, and (iii) cleaned membranes in suc-
tent. The higher ethyl acetate extraction yields do not correspond cessive cleaning cycles. The Inside Cram membrane did not show
with the higher retention of total solids, nor with the expected irreversible fouling, but four cleaning cycles were required to re-
smaller molecular weight of the retained compounds, suggesting store the initial permeability (Fig. 6a). Nanomax membranes did
that both the membrane cut-off and the chemical interaction of not recover the initial permeability, and Nanomax 95 needed more
the membrane and the target compounds are inuencing factors, cleaning cycles to restore the initial permeability (Fig. 6d and e).
as previously observed with the permeate ux. Beyond the effects Different behaviour was observed for the Osmonic membranes:
related to differences in MWCO, this behaviour must be related to DL2540 showed irreversible fouling (accounting for 6.9% of the ini-
the interactions established among solutes and the membrane con- tial permeability), whereas GE2540 lost just 2.3%. With these latter
struction material at a molecular level. membranes, an increase on the number of cleaning cycles did not
The ABTS and DPPH radical scavenging capacity of the ethyl result in improved permeability (Fig. 6b and c). Fig. 6e summarizes
acetate extracts were 2 and 46 times better, respectively, than the permeability recovery along the cleaning cycles. The number of

a 500
Inside Cram membrane b 120 DL2540 membrane
c 25
GE2540 membrane
400 100 20
J (L/hm2)

J (L/h m2)

J (L/h m2)

80
300 15
60
200 10
40
100 20 5

0 0 0
0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10
P (bar) P (bar) P (bar)

d 90
Nanomax 95 membrane
e 60
Nanomax 50 membrane
f 100
Flux recovery (%)

80 50
70 80
J (L/h m2)

J (L/hm2)

60 40
60
50 30
40 40 Inside Cram
30 20 DL2540
GE2540
20 10 20 Nanomax 95
Nanomax 50
10
0 0 0
0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8
P (bar) P (bar) Cleaning stages
Fig. 6. Effect of the washing cycles on the permeation ux for each of the membranes tested at different TMP (: clean membrane; j: fouled; N: 1st cycle; : 2nd cycle; : 3rd
cycle; d: 4th cycle; +: 5th cycle).
 B. Daz-Reinoso et al. / Journal of Food Engineering 91 (2009) 587593
cleaning cycles to restore permeability ranged from one for the
GE2540 membrane (which recovered 97.7% of the initial value)
to four cycles for the Inside Cram. Nanomax 95 needed three
cleaning cycles but did not recover the initial permeability. Nano-
max 50 and DL2540 needed more cleaning cycles and did not re-
cover the initial permeability.
5. Conclusions
Aqueous extracts from pressed distilled grape pomace were
processed with commercial membranes, and the concentrates
were extracted with ethyl ether to obtain highly active antioxidant
extracts. Preliminary experiments were carried out to assess the
inuence of TMP on the process and to evaluate both permeate ux
and rejection coefcients. Excepting the polymeric membrane with
MWCO of 350, the permeate ow varied linearly with TMP. All the
tested membranes presented similar rejections of total phenolics
and sugars, and were suitable for concentration purposes. The phe-
nolic content in retentates was increased by factors of 36 respect
to the feed. The ethyl acetate soluble fraction of retentates pre-
sented high radical scavenging capacities, in the range reported
for commercial antioxidants. Upon cleaning, membranes recovered
92100% of their initial permeability. The experimental results
conrm the applicability of membrane technology for processing
wine distillery wastes.
Acknowledgements
The authors are grateful to the Spanish Ministry of Education
and Science (MEC) for the nancial support of this work (in the
framework of the Research Project reference ALG2006-05387,
which had partial nancial support from the FEDER funds of the
European Union). Beatriz Daz-Reinoso thanks the Spanish MEC
for her grant (reference BES-2005-7525). Andrs Moure Varela
thanks the Xunta de Galicia for his research contract (Isidro Parga
Pondal Program). The authors wish to thank Elena Gonzlez Prez
for her excellent technical support.
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 PUBLICACIN II

Recovery of antioxidants from industrial waste liquors

using membranes and polymeric resins.
Beatriz Daz-Reinoso, Noelia Gonzlez-Lpez, Andrs Moure,
Herminia Domnguez, Juan Carlos Paraj.
Journal of Food Engineering 96 (2010) 127-133.
IINDICE DE IMPACTO: 2,168
 Resultados

Resumen

Diversos estudios han confirmado que los compuestos fenlicos contenidos en el bagazo de
uva destilado obtenido en las alcoholeras como residuo son ms activos que los presentes en
el bagazo no destilado (Pinelo y col., 2005a,b). Este aumento de la actividad se atribuye a que
el tratamiento trmico al que han sido sometidos favorece la polimerizacin de los
compuestos fenlicos (Pinelo y col., 2005a,b).

En trabajos anteriores del grupo (Cruz y col, 2004) se planteaba el aprovechamiento de los
compuestos fenlicos presentes en el lquido embebido en el sustrato tras la destilacin. Estos
licores presentan una amplia variedad de compuestos fenlicos que incluyen procianidinas,
flavan-3-oles monomricos como catequina, epicatequina, epigalocatequina, quercetina o
quercetina-3-glicsido, cidos glicos esterificados con unidades de catequina y cidos
benzoicos. Sin embargo, el contenido fenlico de estos licores es bajo (15%, base seca) por lo
que se hace necesario su procesamiento fsico-qumico para aumentar su pureza y la
capacidad antioxidante.

La tecnologa de membranas puede utilizarse para la concentracin y/o fraccionamiento de

compuestos bioactivos con actividad antioxidante a partir de corrientes de procesado de
productos, subproductos y residuos procedentes de la transformacin de biomasa vegetal y ha
sidoempleada con xito para la recuperacin de compuestos fenlicos a partir de
subproductos de la uva (Shi y col., 2005; Nawaz y col., 2006; Kalbasi y Cisneros-Zevallos, 2007).

Una alternativa al uso de membranas es el empleo de resinas polimricas. En trabajos

anteriores del grupo se utiliz esta tecnologa para la recuperacin de compuestos
antioxidantes a partir de bagazo de uva (Soto y col., 2012) y para la purificacin y recuperacin
selectiva de compuestos fenlicos a partir de los licores de autohidrlisis de bagazo destilado
(Conde y col., 2008, 2011a,b). El uso combinado de ambas tecnologas puede suponer una
opcin interesante con el fin de aumentar la selectividad del proceso global.

En este trabajo se emplearon tanto tecnologa de membranas como procesos de adsorcin-

desorcin con resinas con el objetivo de concentrar y fraccionar compuestos fenlicos
antioxidantes presentes en la corriente lquida resultante del prensado de bagazo destilado.

125
Resultados

Se trabaj con distintas membranas de UF y NF en las condiciones experimentales optimizadas

en la Publicacin I, y se emple la resina polimrica Sepabeads SP700 para la recuperacin de
compuestos fenlicos en las corrientes de permeado.

Se utilizaron varios mtodos in vitro para ensayar la capacidad antioxidante de los distintos
productos obtenidos. Los resultados experimentales mostraron que el empleo combinando de
ambas tecnologas permite la obtencin de un concentrado rico en compuestos fenlicos con
alta actividad antirradicalaria y alta capacidad de reduccin de iones de hierro.

126
 Journal of Food Engineering 96 (2010) 127133

Contents lists available at ScienceDirect

Journal of Food Engineering

journal homepage: www.elsevier.com/locate/jfoodeng

Recovery of antioxidants from industrial waste liquors using membranes

and polymeric resins
Beatriz Daz-Reinoso a,b, Noelia Gonzlez-Lpez a,b, Andrs Moure a,b, Herminia Domnguez a,*,
Juan Carlos Paraj a
a
Departamento de Enxeera Quimica, Universidade de Vigo (Campus Ourense), Edicio Politcnico, As Lagoas, 32004 Ourense, Spain
b
CITI-Universidade de Vigo, Parque Tecnolxico de Galicia, Ra Galicia n 2, 32900 Ourense, Spain

a r t i c l e i n f o a b s t r a c t

Article history: Liquors obtained by pressing distilled grape pomace were assayed for composition and antioxidant activ-
Received 4 May 2009 ity, and rened by different methods (adsorptiondesorption or processing by ultraltration (UF) and
Received in revised form 6 July 2009 nanoltration (NF) membranes, followed by solvent extraction of concentrates and adsorptiondesorp-
Accepted 7 July 2009
tion of permeates). Commercial polymeric resins (Sepabeads SP700) were employed in the adsorption
Available online 14 July 2009
step, and desorption was carried out with aqueous ethanol solutions. The nal products presented ABTS
radical scavenging capacities equivalent to 1.59.9 g of Trolox per gram of desorbed product, and DPPH
Keywords:
radical scavenging capacities comparable to that of BHA, with reducing powers corresponding to 1.94
Nanoltration
Ultraltration
2.97 mM ascorbic acid.
Resins 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved.
Distilled white grape pomace
Phenolic compounds
Antioxidants

1. Introduction
Grape pomace is one of the most studied residual sources of
antioxidants. Several methods have been proposed for antioxidant
applications of grape pomace, including its direct utilization
(Saura-Calixto, 1998), extraction with conventional solvents (Lafka
et al., 2007; Makris et al., 2008), extraction with supercritical CO2
(Louli et al., 2004; de Campos et al., 2008), or with both types of
solvents (Pinelo et al., 2007).
In some wine industries, the grape pomace is distilled to pro-
duce spirits, yielding a waste solid known as distilled grape pom-
ace (DGP). The phenolic compounds contained in DGP are more
active than those in the pressing liquors from pomace (Pinelo
et al., 2005a,b). The increased activity is ascribed to the thermal
treatment, which favours the polymerization of phenols (Pinelo
et al., 2005a,b).
Several alternatives have been proposed for extracting antioxi-
dants from DGP (Cruz et al., 2004; Diaz-Reinoso et al., 2009). Dis-
tilled grape pomace pressing liquors (DGPPL) contain a variety of
phenolic compounds, including procyanidinis, monomeric avan-
3-ols (catechin, epicatechin, epigallocatechin, quercetin and quer-
cetin-3-glucoside), gallic acids esters of the catechins (epigalloca-
techin gallate, EGCG), and benzoic acids (gallic and ellagic acid).
* Corresponding author. Tel.: +34 988 387082; fax: +34 988 387001.
E-mail address: herminia@uvigo.es (H. Domnguez).
These compounds make DGPPL more active antioxidant than syn-
thetic, commercial compounds (Cruz et al., 2004).
Membranes have been successfully employed for concentrating
or fractionating phenolic compounds extracted from natural prod-
ucts. Applications in this eld include the processing of ethanolic
extracts from grape seeds (Nawaz et al., 2006), as well as the frac-
tionation of proanthocyanidins (Santamara et al., 2002) and
anthocyanins (Kalbasi and Cisneros-Zevallos, 2007).
The results obtained in membrane processing cover a wide
scope: for example, clarication of grape must with ultraltration
membranes provided average rejections of 8% and 26% for total sol-
uble solids and total phenolics, respectively (Cassano et al., 2008);
whereas nanoltration and reverse osmosis of grape juice provided
high rejections of sugars (7797%) and polyphenols (7094%), but
low rejections of malic acid (214%) (Ferrarini et al., 2001; Versari
et al., 2003).
In a previous work, ultra- and nanoltration membranes were
successfully used to concentrate the aqueous waste stream ob-
tained by extracting the pressed distilled white grape pomace
(Daz-Reinoso et al., 2009). After membrane processing, the pheno-
lic content and the ABTS radical scavenging capacity of retentates
were 36.6 times higher than the ones of the feed. Enhanced anti-
oxidant activity was observed for the ethyl acetate soluble fraction
of retentates obtained with Nanomax 50 and Inside Cram
membranes.
Alternatively, polymeric resins have been used for the sep-
aration and purication of phenolic compounds (anthocyanins,

0260-8774/$ - see front matter 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved.
doi:10.1016/j.jfoodeng.2009.07.007
128 B. Daz-Reinoso et al. / Journal of Food Engineering 96 (2010) 127133

avonoids and hydroxycinnamates) from natural products (Llorach
et al., 2004; Saleh et al., 2008; Scordino et al., 2005). Anthocyanins
from grape pomace were obtained at lab and pilot plant scales by
adsorption in a styrenedivinylbenzene resin, and eluted with
alcoholic solutions (Kammerer et al., 2005); whereas polyphenols
from apple juice were eluted with water, ethanol or methanol
(Saleh et al., 2008) Coupled membrane processing and adsorption
has been proposed to recover or to remove phenolic compounds
from tea solutions (Li et al., 2005) or alfalfa protein concentrates
(DAlvise et al., 2000).
In this work, adsorptiondesorption and membrane processing
were employed (alone or in combination) for obtaining isolates of
high antioxidant activity from DGPPL. Fig. 1 summarizes the pro-
cessing methods considered.
2. Materials and methods
2.1. Materials
phenolic compounds present in pressing liquors of distilled white
grape pomace (DGPPL). Nanomax 95 and Nanomax 50 (from Milli-
pore) are PA/PS membranes with MWCO of 250 kDa and 350 kDa,
respectively; whereas Inside Cram (Tami) is a ceramic membrane
of 1000 kDa MWCO. Different equipment has been used order to
achieve the desired feed ow velocity and/or transmembrane pres-
sure (TMP) for each membrane. Two stainless steel monotubular
modules with lengths of 0.305 m (Millipore membranes) or
0.604 m (Inside Cram membrane) were used. The system was t-
ted with a ow meter, and operated with a variable speed Hydra-
cell pump. Pressure was monitored at the entrance and exit of the
membrane module, and controlled by a needle valve located after
the membrane module. Temperature was monitored with a PT100
probe, and controlled by owing tap water through a refrigeration
coil placed in the feed tank. Operation was carried out at room
temperature (20 C) and at the TMP selected for each of mem-
branes (Millipore membranes, 8 bar; Inside Cram membrane,
6 bar) (Daz-Reinoso et al., 2009).

Grape pomace resulting from spirit distillation was supplied by

Cooperativa Vitivincola do Ribeiro (Ourense, Spain). Distilled
pomaces were pressed (1.4 MPa, 5 min) to remove the liquid frac-
tion imbibing the pomace, denoted as distilled grape pomace
pressing liquors, DGPPL (Cruz et al., 2004). An average of 0.3 L
DGPPL/kg wet pomace containing 4.4 g GAE/L DGPPL was obtained.
Pressing was carried out just when the pomace was received from
the distillery, and DGPPL was stored at 4 C. Before membrane pro-
cessing, DGPPL were centrifuged to remove suspended solids.
2.2. Experimental set-up
The commercial membranes used in this work (Nanomax 95,
Nanomax 50 and Inside Cram) were selected on the basis of pre-
vious results (data not shown) dealing with the concentration of
2.3. Operational modes
Operational conditions for each membrane were chosen accord-
ing to results reported previously (Diaz-Reinoso et al., 2009). Full
recycle experiments were performed at the TMP indicated above.
Concentration experiments were carried out in batch mode, with
simultaneous retentate recycling and permeate removal. The vol-
ume reduction factor (VRF) was calculated as the ratio between
the initial feed volume and the volume of retentate remaining at
the end of the experiment. Along full recycle and concentration
experiments, samples of permeate and concentrate were with-
drawn and assayed for total solids, total phenolics, and antioxidant
activity (see below).

Distilled grape pomace pressing liquors (DGPPL)

Centrifugation
Centrifugation Solid phase

Nano/ultrafiltration
Nano/ultrafiltration Adsorption
Adsorption

Concentrate
Concentrate Permeate
Permeate
Desorption
Desorption

Adsorption
Adsorption Ethanol

Desorption
Desorption Vacuum
Vacuum evaporation
evaporation
Ethanol
Solvent
Solvent Extraction
Extraction
Vacuum
Vacuum evaporation
evaporation
Ethyl acetate

Vacuum
Vacuum evaporation
evaporation Freeze-drying
Freeze-drying Freeze-drying
Freeze-drying

Product 1 Product 2 Product 3

Fig. 1. Flow diagram of the alternatives proposed to recover and concentrate phenolic antioxidant compounds from the liquid phase embebing the distilled white grape
pomace.
 B. Daz-Reinoso et al. / Journal of Food Engineering 96 (2010) 127133
2.4. Membrane cleaning
Fouled membranes were cleaned with a caustic detergent solu-
tion (0.5% Ultrasil 11, from Henkel Ecolab) at 50 C for 60 min oper-
ating in full recirculation mode (Daz-Reinoso et al., 2009).
2.5. Resin adsorption
Centrifuged DGPPL or permeates from membrane processing
were contacted with Sepabeads SP700, a commercial food grade
resin kindly supplied by Resindion S.R.L. (Mitsubishi Chemical Cor-
poration). For activation purposes, the resin was mixed with meth-
anol, shaked for 1 min, and stirred (175 rpm, 25 C) for 15 min.
Resins were rinsed before use with deionized water at a liquid to
solid mass ratio of 5 g/g. In adsorption experiments, phases were
contacted in an orbital shaker (25 C, 175 rpm; 5 g DGPPL/g wet re-
sin) for 20 min. Previous experiments (data not shown) conrmed
that equilibrium was achieved under these operational conditions.
2.6. Washing
Washing with distilled water in an orbital shaker (25 C,
175 rpm, 3 g water/g resin, 20 min) was performed to remove un-
bound compounds.
2.7. Desorption
Desorption was carried out in a jacketed glass column (10 mm
diameter, 300 mm height) packed with saturated resins. Ethanol
(82%) was pumped through the bed at a ow rate of 1 mL/min
using a F10 pump (Bio-Rad, CA, USA). Eluent and column were kept
at 45 C. Fractions were collected from the efuent, and assayed for
composition and antioxidant activity.
2.8. Analytical methods
The content of total solids was determined by oven drying at
105 C. The total phenolic content was determined by the Folin
Ciocalteu colorimetric method, and expressed as gallic acid equiv-
alents (GAE). Selected samples were subjected to thiolysis followed
by Reverse Phase (RP)-HPLC to assess the procyanidin composition.
For this purpose, a thiolysis mixture containing cysteamine hydro-
chloride (50 mg) and 37% HCl (200 lL) dissolved in methanol
(930 lL) was prepared. Freeze-dried DGPPL samples were diluted
in methanol at a concentration of 1 mg/mL, and an aliquot
(200 lL) of the sample was added to 200 lL of the thiolysis mix-
ture, allowing the reaction to proceed at 65 C for 15 min. The
molecular weight and composition of procyanidins were estimated
by RP-HPLC analysis of the depolymerized fractions present in the
reaction media, using the method described by Torres and Selga
(2003). Terminal avan-3-ol units were released by acid cleavage
in the presence of cysteamine, whereas the extension moieties
were released as C4 cysteamine derivatives. RP-HPLC assays were
carried out using a Smart system (AmershamPharmacia Biotech,
Uppsala, Sweden) equipped with a l peak monitor (Amersham
Pharmacia Biotech) and tted with a C18 Hypersil ODS column
(Supelco). Elution was carried out at a ow rate of 1 mL/min
according to the following pattern: solvent [A], 0.1% (v/v) aqueous
TFA; solvent [B], 0.082% (v/v) TFA in water/CH3CN (1:4); gradient
030 min from 12% to 30% of [B], 3040 min from 30% to 100% of
[B], 4045 min from 100% to 12% of [B], wavelength employed
for detection, 280 nm. The parameters calculated (Torres and Selga,
2003) were:
129
mean degree of polymerizationmDP
total nmol=nmol terminal units;
% galloylation %G
100  nmol of EcG nmol of cysteamine-EcG=total nmol
2.9. Antioxidant activities
The antioxidant activities of the various samples were evalu-
ated using the following in vitro tests:
a,a,-Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging capacity
was determined as described elsewhere (Daz-Reinoso et al., 2009).
EC50 was calculated as the concentration of phenolic compounds
necessary to quench 50% of the initial DPPH radical.
Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC) assay, based on the
scavenging of ABTS radical [2,20 -azinobis (3-ethyl-benzothiazoline-
6-sulfonate was carried out from a modied method as described
by Re et al. (1999).
Ferric reducing antioxidant power (FRAP). The ferric reducing
ability was measured by colorimetry according to the method by
Benzie and Strain (1996), using ascorbic acid as a standard.
Reducing power. The reducing power capacity was measured as
per Oyaizu (1986) using ascorbic acid as standard.
Assays were carried out by triplicate, and the average values are
reported.
3. Results and discussion
3.1. Full recycle experiments
DGPPL were processed by ultra- and nanoltration using mem-
branes selected on the basis of reported data (Diaz-Reinoso et al.,
2009) dealing with the utilization of washing liquors from distilled
fermented grape pomace (which present similarities with DGPPL
in the type of components, but at lower concentrations). Fig. 2
shows the dependence of the ux J on time observed for the vari-
ous membranes operating with DGPPL at the selected transmem-
brane pressure (TMP).
The time dependence of J was assessed using the equation pro-
posed by Moure et al. (2006):
J b J 0  b expa  t
where t is time and a and b are coefcients determined by regres-
sion. J0 was determined experimentally for each membrane. This
equation provided a good interpretation of the experimental trends,
except for the data obtained with Nanomax 95. In this case, a
marked declining of J (caused by concentration polarization and
fouling) was observed, with 50% drop of the initial ux. A similar
behaviour was reported for the processing of distilled grape pomace
washing liquors (Diaz-Reinoso et al., 2009), but in DGPPL process-
ing, J decreased sharply in the nal stages of prolonged treatments.
Oppositely, the time proles determined for Nanomax 50 and Inside
Cram membranes were similar and characterized by a gradual
declining of J.
3.2. Experiments in concentration mode
Fig. 3 shows the declining of J along the concentration runs car-
ried out at the TMP selected for each membrane. Inside Cram
showed the best performance in terms of the values of J corre-
sponding to a given Volume Reduction Factor (VRF). At VRF near
3 operation with Nanomax 50 and Inside Cram, showed an almost
steady state J value, whereas in Nanomax 95 a slight decrease was
still observed (see Fig. 3a).
130 B. Daz-Reinoso et al. / Journal of Food Engineering 96 (2010) 127133

18 Along concentration experiments, the phenolic contents of per-

Nanomax95 meates showed a similar variation pattern for all the membranes
16
Nanomax50 considered (see Fig. 3b), with an initial decrease up to achieve
14
VRF around 1.25 and a fairly linear increase up to reach VRF about
12
3. The initial decrease in concentration of permeates could be due
J (L/hm 2)

10 to the adsorption of phenolics in the membrane (Daz-Reinoso

8 et al., 2009).
6 The apparent rejection coefcient (R) was calculated for exper-
iments performed to achieve VRF in the range 35. Operating in
4
concentration mode during a differential period of time, in which
2 a the volume of retentate decreases from Vr to VrdVr and a volume
0 of permeate dVP (numerically equal to dVr) passes through the
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
membrane, and considering that the solute concentrations in per-
Time (h) meate and retentate are Cp and Cr, respectively, a material balance
to the solute can be established as follows (Moure et al., 2006).
20
18 C p dV r dV r  C r 1
InsideCeram
16 Assuming that R is independent from the retentate concentra-
14 tion, Cp and be obtained as a function of Cr, and the equation can
J (L/hm 2)

12 be solved to yield:
10    
Cr V r0
8 ln R ln 2
C r0 Vr
6
4 where C r0 and V r0 are the concentration and the volume of the feed,
2 b and the term V r0 /Vr is VRF. Under the hypotheses mentioned above,
0 ln(Cr/C r0 ) varies linearly with ln(VRF), and R can be calculated as the
0 2 4 6 8 10 slope of the plot. The highest apparent rejection coefcient was ob-
Time (h) tained, as can see in Fig. 4, for Nanomax 50 (96.6%), whereas those
found for Inside Cram and Nanomax 95 were 71.7% and 51.5%,
Fig. 2. Time course of permeation for aqueous extracts from pressed distilled grape respectively.
pomace processed operating at TMP: 8 (Nanomax membranes) and 4 (Inside Cram
membrane) bar; feed ow velocity: 2 m/s for the UF membranes and 3 m/s for the
NF membrane. Temperature: 20 4 C. 3.3. Characterization of retentates and permeates

Data concerning the phenolic content and in vitro antioxidant

activity of retentates obtained with the three membranes are sum-
20 marized in Table 1a and b. The proportion of phenolics respect the
18 total solids were similar in both freeze-dried retentates and feed.
16
In agreement with the apparent rejection coefcients showed
above, the volumetric concentration of retentates obtained with
14
Nanomax 50, Nanomax 95 and Inside Cram membranes were
J (L/hm2 )

12
about 1.5, 2 and 1.25 times higher than the one of the feed,
10
respectively.
8
The capacities of freeze-dried retentates for scavenging the
6
ABTS radical were lower than that of Trolox, whereas their capac-
4 ities for scavenging DPPH were intermediate between those of BHA
2 a (EC50 = 0.24 mg/mL) and BHT (EC50 = 2.79 mg/mL). The protection
0 provided by retentates against the joint linoleic acid and b-caro-
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
tene oxidation was limited, with AAC values about 3 times lower
VRF

2.5 1.4

1.2
2.0
1.0
Cp (mg/mL)

LN (Cr/Cro)

1.5
0.8

1.0 0.6

0.4
0.5
b 0.2

0.0 0.0
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
VRF LN (VRF)

Fig. 3. Effect of VRF on the permeate ow (a) and on the concentration of phenolic Fig. 4. Apparent rejection coefcients for total phenolics calculated from lineari-
compounds (expressed as gallic acid equivalents) (b). zation of ln(Cr/C r0 ) vs. ln(VRF).
 B. Daz-Reinoso et al. / Journal of Food Engineering 96 (2010) 127133 131

Table 1
Characterization of retentates processed by: (a) freeze-drying, (b) ethyl acetate extraction, (c) adsorptiondesorption.

Phenolic content TEAC DPPH (EC50) FRAP (mM ascorbic acid/g product) Reducing power b-Caroteno (AAC)
(g GAEa/100 g product) (g Trolox/g product) (g product /L) (mM ascorbic acid/g product) (2 g product /L)
(a) Freeze-dried
Nanomax 95 9.5 0.385 1.51 0.413 0.207 189
Nanomax 50 10.3 0.395 1.64 0.464 0.232 213
Inside Cram 10.2 0.410 1.58 0.444 0.222 209
(b) Ethyl acetate extractb (Product 1c)
Nanomax 95 37.1 1.83 0.613 1.76 2.81 124
Nanomax 50 42.5 2.09 0.293 1.84 2.97 176
Inside Cram 38.6 2.00 0.533 1.79 2.70 126
(c) Adsorptiondesorption (mmol Fe/g extract) 1 g/L
DGPPL (Product 3c) 49.9 9.9 0.255 5.48 2.12 230
Nanomax 50 53.6 10.3 0.218 5.37 1.94 177
Inside Cram 39.4 10.5 0.229 4.99 2.07 163
a
Gallic acid equivalents (GAE).
b
Extraction yields: Nanomax 95: 3.79 g soluble solids/100 g initial solids; Nanomax 50: 2.91 g soluble solids/100 g initial solids; Inside Cram: 3.51 g soluble solids/100 g
initial solids.
c
According to nomenclature from Fig. 1.

than those of the above mentioned synthetic antioxidants. How- processing 3 L of feed with Inside Cram required 9 h. This latter
ever, the results are 2.53 times higher than the data reported by membrane presented the highest permeability loss (11.8%),
Jayaprakasha et al. (2001) for methanolic or ethyl acetate extracts whereas almost total permeability recovery was observed for
of grape seeds. The reducing power of membrane concentrates Nanomax 95 (99.6%).
were similar to the one reported for the methanolic extracts of Pru- As a summary of the most representative results, Table 3 lists
nus mume owers (Shi et al., 2009), and the FRAP values were low- the data (on a volumetric basis) concerning the concentration of
er than the data reported by Lim et al. (2009) for methanolic solids, concentration of total phenolics and ABTS radical scaveng-
extracts of Macaranga species. ing capacity of the feed stream and the permeates obtained with
As a method for improving the above results, retentates were the various membranes. Permeates from Inside Cram and Nano-
extracted with ethyl acetate as shown in Fig. 1, to yield soluble sol- max 50 membranes contained 3961% of the solids initially pres-
ids with enhanced antioxidant activity (see Table 1). The chemical ent in DGPPL, whereas the phenolics and radical scavenging
composition of ethyl acetate soluble compounds obtained with the capacity of the said permeates accounted just for 2629% and
three membranes was similar, with slightly higher phenolic con- 1732% of the values determined for the feed, respectively. Nano-
tent for the fraction obtained with the Nanomax 50 membrane. max 95 showed a limited ability for retaining the active com-
In comparison with reported data, the yields of phenolics obtained pounds, resulting in permeates with increased antioxidant activity.
in this work almost doubled the ones obtained from distilled grape
pomace washing liquors (Daz-Reinoso et al., 2009). Concerning
the ABTS radical scavenging capacity of isolates, no signicant dif- 3.4. Processing of permeates by adsorption/desorption
ferences were observed among the products obtained with the
three membranes, and were about 5 times higher than the results In order to improve the above results, adsorption/desorption
determined for the corresponding retentates. The ethyl acetate ex- was explored as an alternative method to recover active com-
tracts of retentates obtained with Nanomax 50 were the most pounds. Adsorption/desorption was assessed for both DGPPL and
powerful DPPH radical scavengers, with an activity similar to that permeates, as shown in Fig. 1. According to the data in Table 4,
of BHA (EC50 of isolates 0.293 mg/mL). The reducing power deter- the adsorption capacity of the resin (denoted q) was signicantly
mined for ethyl acetate extracts were in the range reported by
Makris et al. (2006) for white grape pomace (2.71 mM ascorbic Table 3
acid/g), whereas the b-carotene test gave lower results than the Composition in solids, total phenolics and Trolox equivalents in the distilled grape
ones reported by Kulisic-Bilusic et al. (2009) for grape juice. pomace pressing liquid (DGPPL) and in permeates from selected membranes.
In order to assess both fouling and ux recovery after cleaning, Solids Total phenolics TEAC (mmol Trolox)
the water permeabilities of membranes before use, after use and (g/L) (g GAEa/L)
after cleaning were measured, as well as the permeabilities of DGPPL 41.0 4.40 51.9
membranes with the working solutions under the same conditions. Inside Cram permeate 22.1 1.14 11.9
Cleaning stages were repeated to ensure total ux recovery. The Nanomax 50 permeate 25.0 1.18 15.4
experimental data are summarized in Table 2. Processing 6 L of Nanomax 95 permeate 27.6 1.90 32.9

feed required 12 h with Nanomax 95 or Nanomax 50, whereas a

Gallic acid equivalents (GAE).

Table 2
Permeability of the selected membranes, initially, after fouling and after four cleaning cycles.

Permeability
TMP (bar) Water (cleaned Water (fouled Water (cleaned Initial feed Fouled membrane
membrane) (L/hm2) membrane) (L/hm2) membrane) (L/hm2) (L/hm2) (after use) (L/hm2)
Nanomax 95 8 92.66 44.10 92.31 15.83 8.33
Nanomax 50 8 62.80 41.56 60.32 10.50 4.58
Inside Cram 4 145.75 23.42 128.53 17.79 8.85
132 B. Daz-Reinoso et al. / Journal of Food Engineering 96 (2010) 127133
Table 4
Adsorption capacity, percentages of adsorption and desorption (referred to the adsorbed fraction) and ABTS radical scavenging of permeates.
q (mg GAE/g Adsorption (g GAE adsorbed/
resin, w.b.) 100 g GAE initial)
DGPPL 13.3 83.3
Nanomax 50 (Product 2b) 8.23 91.7
Inside Cram (Product 2b) 5.41 91.3
a
Desorption percentage of the major peak, further recovered as puried extract.
b
According to nomenclature from Fig. 1.
different for the various streams. The maximal capacity was deter-
mined for DGPPL, and 4060% of this value was observed for the
ceramic and the polymeric membranes, respectively. The different
behaviour observed for feed and permeates is related to the com-
positional changes caused by membrane separation.
Desorption of adsorbed compounds from both DGPPL and per-
meates proceeded with an elution pattern characterized by a major
peak, which accounted for 56.6% of the recovered solutes. Table 4
presents data of the adsorption capacity determined for phenolic
compounds, whose concentrations were measured by the Folin
Ciocalteu method.
The adsorption percentage of phenolic compounds was higher
for permeates than for DGPPL, which presented an intermediate
behaviour in the overall desorption step. The lowest phenolic
recovery percent corresponded to the Inside Cram permeate.
The Nanomax 50 membrane performed slightly better than the
ceramic one in terms of ABTS radical scavenging capacity, and both
products showed lower TEAC activity than DGPPL product. The
higher radical scavenging capacity of this stream was coincident
with its higher amount of catechin, epicatechin, epicatechin gal-
late, epigallocatechin gallate and gallic acid. On the other hand,
condensed catechin, epicatechin and epicatechin gallate were
identied in the eluate from the resin saturated with DGPPL, sug-
gesting that the antioxidant potential of this fraction could be im-
proved by converting them into monomeric units. The presence of
procyanidins and their structural parameters (mDP and galloyla-
tion) were determined using cysteamine hydrochloride.
Table 5 shows the degree of polymerization and gallate con-
tents of the products desorbed from DGPPL and permeates from
Nanomax 50 and Inside Cram membranes. DGPPL include species
of higher degree of polymerization (mDP = 3.2) and slightly higher
proportion of galloylated units (12%). The degree of polymerization
was similar to the ones reported by Torres and Selga (2003) for
procyanidin extracts and fractions of grape pomace. Torres et al.
(2002) reported degrees of polymerization in the range 13.7 for
different isolates from Parellada grapes, a result similar to the data
reported in this work, whereas the galloylation percentages were
similar or higher than the ones determined in this work.
Data in Table 1c show similar phenolic contents, radical scav-
enging capacities and reducing powers for freeze-dried eluates
from DGPPL and membrane permeates adsorption/desorption pro-
cess. This process resulted in concentrates with phenolic contents
45 times higher than the isolates coming from direct membrane
concentration, and slightly higher than those obtained by ethyl
acetate extraction; whereas the radical scavenging capacity against
Table 5
Mean degree of polymerization (mDP) and percentage of galloylation and of desorbed
products.
Mean degree of polymerization (mDP) Galloylation (%)
DGPPL 3.2 12
Nanomax 50 1.7 11
Inside Cram 1.9 11
Desorption (g GAE desorbed/100 g GAE adsorbed) TEAC
a (mmol Trolox)
Total desorbed Major peak
61.6 56.6 108.3
65.0 56.3 57.0
57.6 46.3 50.2
ABTS radical was 25 times higher than that of products obtained by
membrane concentration, and 5 times higher than the ethyl ace-
tate soluble fraction. Products puried by adsorption/desorption
were 10 times more active than Trolox against the ABTS radical,
and presented higher activity than those reported by Peinado
et al. (2009) and Makris et al. (2008) for ethanolic extracts from
Pedro Ximnez grapes and from white grape pomace, respectively.
The radical scavenging capacity against DPPH radical of desorbed
products was comparable or higher than that of synthetic antioxi-
dants. Muselk et al. (2007) reported that the hydroxylation of cat-
echin to gallocatechin presented a signicant increase in
antioxidant effectiveness in the TEAC and FRAP assays. In this
work, the highest antioxidant activities were determined for des-
orbed products with comparatively high proportions of gallates.
The reducing power was equivalent to 2 mM ascorbic acid,
whereas the antioxidant activity in emulsion was considerably
lower than that of BHA (AAC100ppm = 90, AAC500ppm = 870). Muselk
et al. (2007) reported that in a lipid system the antioxidant activity
decreased with the polymerization degree, in contrast with the
behaviour of the antioxidant activity in aqueous phase. Kulisic-
Bilusic et al. (2009) found b-carotene bleaching inhibition higher
that 70% at red grape juice concentrations higher than 1%. Compar-
atively, the concentrates obtained by adsorption/desorption and by
ethyl acetate extraction gave 2632% inhibition. Similar AAC val-
ues were reported by Negro et al. (2003) for ethanolic extracts of
marc from Negro amaro at a concentration of 80 ppm. The FRAP
activities of pulps, skins and seeds of fruits reported by Guo et al.
(2003) refer to aqueous extracts, without quantication of pheno-
lics, and are lower than the ones determined in this work for ex-
tracts obtained by adsorption/desorption.
In conclusion, one gram of the concentrate obtained by freeze-
drying the best desorbed product showed a radical scavenging
activity comparable to almost 10 g Trolox and a FRAP value equiv-
alent to 0.5 g ascorbic acid. This means that the ingestion of 0.18 g
of the concentrate would be equivalent to the effect of the vitamin
C contained in 100 g of kiwi, 100 g guava, 600 g lemon or 250 g red
pepper.
Acknowledgements
The authors are grateful to the Spanish Ministry of Education
and Science (MEC) for the nancial support of this work (Research
Project reference ALG2006-05387, which had partial nancial sup-
port from the FEDER funds of the European Union). Beatriz Daz-
Reinoso thanks the Spanish MEC for her grant (reference BES-
2005-7525). Andrs Moure and Noelia Gonzlez thank the Xunta
de Galicia for their contracts (Isidro Parga Pondal and Lucas
Labrada Programs, respectively). The authors wish to thank M.
Jos Nez of University of Santiago de Compostela for the analysis
of procyanidins.
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 PUBLICACIN III

Optimization of antioxidants Extraction from Castanea sativa leaves.

Beatriz Daz-Reinoso, Diana Couto, Andrs Moure, Eduarda Fernandes,
Herminia Domnguez, Juan Carlos Paraj.
Chemical Engineering Journal 203 (2012) 101-109.
NDICE DE IMPACTO: 3,473
 Resultados

Resumen

Las hojas de C. sativa se han utilizado tradicionalmente como remedio popular para tratar la
tos, enfermedades reumticas o dolores musculares. En los ltimos aos varios estudios han
confirmado diversas propiedades de los extractos etanlicos y acuosos de hoja de castaa
como capacidad antioxidante (Calliste y col., 2001, 2005; Almeida y col., 2008; Barreira, 2010)
o actividad antimicrobiana (ivkovid y col., 2010; Hao y col., 2012), as como la posibilidad de
su utilizacin como ingredientes en la formulacin de cosmticos (Almeida y col., 2008b, 2014,
2015; Henry y col., 2005).

La extraccin y purificacin de compuestos activos a partir de fuentes naturales se est

convirtiendo en un campo de investigacin de inters creciente, encontrando aplicaciones en
la formulacin de ingredientes y aditivos para alimentos, productos farmacuticos y
cosmticos. El rendimiento en estos compuestos obtenidos a partir de diferentes materiales
vegetales est fuertemente influenciado por el procedimiento de extraccin. Las condiciones
de operacin y el tipo de disolvente empleado son variables crticas en la eficiencia del
proceso. Diversos estudios han evaluado la influencia de diferentes variables operacionales
(por ejemplo, temperatura, tiempo de extraccin o relacin slido-lquido) en el rendimiento
de extraccin de compuestos fenlicos a partir de residuos agroforestales como cscaras de
almendra, serrn de madera de pino (Pinelo y col., 2004) o erizos de castaa (Vzquez y col.,
2012). Para la extraccin de compuestos fenlicos antioxidantes a partir de hojas de castao se
han utilizado disolventes como agua (Barreira y col., 2008), metanol (Henry y col., 2005) o
etanol (ivkovi y col., 2009a,b; Almeida y col., 2008a).

El presente trabajo tuvo como objetivo analizar el efecto del disolvente y variables
operacionales en la extraccin convencional de compuestos fenlicos a partir de hoja de
castaa. Se utilizaron como disolventes agua, etanol y metanol. El intervalo seleccionado para
el tiempo de extraccin cubri las condiciones de inters prctico, mientras que las
temperaturas se seleccionaron manteniendo un compromiso entre el rendimiento de
extraccin y la limitacin por degradacin trmica de los compuestos de inters. Los valores
seleccionados para la relacin slido:lquido se mantuvieron en un intervalo en el cual la
transferencia de materia no es un factor limitante.

Las condiciones ptimas se seleccionaron con el fin de maximizar el contenido en compuestos

fenlicos as como su actividad frente al radical DFPH. En estas condiciones se analiz la

137
Resultados

actividad antioxidante frente a ERO (O2-, H2O2, HOCl, 1O2, ROO) y ERN (ONOO, NO) del
extracto obtenido.

El tiempo de extraccin y la temperatura presentaron una fuerte influencia en el rendimiento

de extraccin de compuestos fenlicos. Adems, el empleo de agua como disolvente condujo a
la obtencin de los extractos ms concentrados en compuestos fenlicos y con una capacidad
antirradicalaria comparable a la de antioxidantes sintticos. Los compuestos fenlicos
identificados en los extractos acuosos incluyeron cidos glico, protocatquico, 4-
hidroxibenzoico y vanllico, rutina, apigenina y quercetina.

El proceso propuesto es simple y flexible y el empleo de agua como disolvente ofrece ventajas
ecolgicas dado su bajo impacto medioambiental y por facilitar la utilizacin de los extractos
en la formulacin de nutracuticos.

138
 Chemical Engineering Journal 203 (2012) 101109

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Chemical Engineering Journal

journal homepage: www.elsevier.com/locate/cej

Optimization of antioxidants Extraction from Castanea sativa leaves

Beatriz Daz Reinoso a,b, Diana Couto c, Andrs Moure a,b,, Eduarda Fernandes c, Herminia Domnguez a,b,
Juan Carlos Paraj a,b
a
Departamento de Enxeera Quimica, Universidade de Vigo (Campus Ourense), Edicio Politcnico, As Lagoas, 32004 Ourense, Spain
b
CITI-Universidade de Vigo, Parque Tecnolxico de Galicia, Ra Galicia no. 2, 32900 Ourense, Spain
c
REQUIMTE, Departamento de Cincias Qumicas, Faculdade de Farmcia, Universidade do Porto, Rua de Jorge Viterbo Ferreira 228, 4050-313 Porto, Portugal

h i g h l i g h t s

" Response surface methodology was assessed to determine the optimum conditions of extraction.
" The highest phenolic release was performed with aqueous extraction.
" Antioxidant capacity of chestnut leaves extracts was screened using scavengers and chelating assays.
" Under optimum conditions the extracts show radical scavenging capacity similar to that of BHA.

a r t i c l e i n f o a b s t r a c t

Article history: The extraction of Castanea sativa leaves (CsLs) with selected solvents (96% ethanol, methanol and acidi-
Received 19 July 2011 ed water) was assessed by means of a set of experiments following a BoxWilson central composite cir-
Received in revised form 22 June 2012 cumscribed (CCC) design. CsL extraction was assessed on the basis of experimental results determined for
Accepted 26 June 2012
the yield in soluble compounds, the yield in phenolics and the antioxidant activity of extracts. The in vitro
Available online 4 July 2012
antioxidant activity was measured in terms of the scavenging abilities for a,a-diphenyl-b-picrylhydrazyl
(DPPH) radical. Selected extracts were also assayed for scavenging activity against reactive oxygen spe-
Keywords:
cies (ROSs) and reactive nitrogen species (RNSs). The highest extraction yields were obtained using meth-
Castanea sativa leaves
Solvent extraction
anol, whereas water allowed a selective extraction (with yields in phenolics up to 9 mg Gallic Acid
Phenolic compounds Equivalent/100 mg CsL) and provided the most concentrated (54 mg GAE/100 mg solid) and active
Antioxidant activity extracts. The major compounds identied in extracts were gallic acid, protocatechuic acid, 4-hydroxyben-
zoic acid, vanillic acid, rutin, quercetin and apigenin.
2012 Elsevier B.V. All rights reserved.

1. Introduction stances have been identied as phenolic compounds. The most

Castanea sativa Mill. is a species of the owering plant family
Fagaceae, mainly cultivated in temperate regions (Asia, Southern
Europe and North of Africa). The seasonal fruit is a nut, commonly
named sweet chestnut or marron, which is collected in autumn. It
is a traditional basic foodstuff and can be processed into different
elaborated and progressively diversied food products. Recently,
the nuts became important in human health owing to their appli-
cations as a component of gluten-free diets and as a source of
essential fatty acids.
C. sativa leaves (CsL) are used in folk medicine to treat cough,
diarrhea and rheumatic conditions, lower back pain, and stiff joints
or muscles. As in other medicinal plants, some of the active sub-
Corresponding author at: Departamento de Enxeera Quimica, Universidade de
Vigo (Campus Ourense), Edicio Politcnico, As Lagoas, 32004 Ourense, Spain. Tel.:
+34 988 368 892; fax: +34 988 387 001.
E-mail address: amoure@uvigo.es (A. Moure).
abundant of them in CsL are ellagic acid and gallic acid derivatives
[1]. These compounds present biological activities, including
ability for protecting against oxidative stress-related diseases and
antimicrobial activity. The capacity of aqueous, methanol, and
ethyl acetate extracts from CsL to scavenge a,a-diphenyl-b-pic-
rylhydrazyl (DPPH), superoxide radical O 2 , and hydroxyl radical
(HO) was already reported [25]. Water:acetone CsL extracts were
further washed with ethyl acetate to separate phenolic compounds
from tannins. This fraction showed antioxidant activity compara-
ble to the ones of reference pure antioxidants, and higher than
the ones determined for solvent puried fractions [3]. Etha-
nol:water extracts of CsL showed scavenging activities against
hydrogen peroxide (H2O2) and singlet oxygen (1O2) comparable
to that of ascorbic acid, and were more active against O
2 than Trol-
ox. In comparative terms, extracts were more active for scavenging
reactive nitrogen species (RNSs) than for reactive oxygen species
(ROSs) [6]. Water extracts of CsL also showed reducing power
and ability to cause the inhibition of b-carotene bleaching, lipid

1385-8947/$ - see front matter 2012 Elsevier B.V. All rights reserved.
http://dx.doi.org/10.1016/j.cej.2012.06.122
102 B. Daz Reinoso et al. / Chemical Engineering Journal 203 (2012) 101109
peroxidation and hemolysis [4,7]. The same properties were con-
rmed for extracts obtained with 50% ethanol [5], which also
showed ability to protect against DNA damage in rat pancreatic
b-cells [5].
CsL extracts have been reported to prevent changes related to
the uidity and integrity of the erythrocyte membranes [1]. The
ethyl acetate soluble fraction of the CsL aqueous extracts displayed
potent antibacterial action against Gram-positive and Gram-nega-
tive bacteria, which was ascribed to the presence of avonoids [8];
whereas ethanol extracts showed strong antibacterial activity
against Gram-positive bacteria [9].
The utilization of solvent extracts from CsL in cosmetic compo-
sitions has been claimed [10]. A CsL extract obtained with ethanol
water (containing rutin, ellagic acid, hyperoside, isoquercitrin and
chlorogenic acid) was considered safe and suitable for preventing
and treating oxidative stress-related diseases and photoageing
[11]. Flavonoid glycosides obtained from CsL have been considered
useful for the treatment and prevention of insulin-resistance dis-
eases [12].
The extraction and purication of biologically active compounds
from natural sources is becoming a growing research eld, nding
applications in the formulation of ingredients and additives for
food, pharmaceuticals and cosmetics. The yields in bioactive com-
pounds obtained from different plant materials are strongly inu-
enced by the extraction and purication procedures. The type of
solvent is an inuential variable: when CsL phenolics are the target
products, water [7], methanol [10], acetone, ethylacetate [3], etha-
nol-aqueous solutions [1,6,9,11] are suitable agents for extraction.
Recent literature has been reported on the extraction of antiox-
idant phenolic compounds from CsL, with emphasis on the type of
solvent, characterization of the extracts, and comparative evalua-
tion of different parts of the plant. Despite the increased extraction
yields and antioxidant potential of phenolics from skins [1,7],
leaves can be easily collected and possess a traditional background.
To our knowledge, the combined effects of the major operational
variables (temperature, contact time and liquidsolid ratio) on
the extraction of phenolics from CsL has not been reported before.
This study provides an experimental assessment of the effects
of selected operational variables on the extraction of phenolic com-
pounds with antioxidant activity from CsL. The composition of CsL
was measured, and the extraction of target fractions was assessed
using a set of experiments with a BoxWilson central composite
circumscribed (CCC) design. In experiments, the yields in soluble
solids and phenolics, as well as the antioxidant activities of ex-
tracts, were measured. The in vitro antioxidant activity was charac-
terized using the DPPH radical scavenging test. Selected extracts
were also assayed for scavenging activity against ROS (O 2 , H2O2,
peroxyl radical ROO, hypochlorous acid HOCl, and 1O2) and RNS
(nitric oxide NO and peroxynitrite ONOO).
2. Materials and methods
2.1. Materials
Chestnut CsL from the 2005 harvest were locally collected. Air-
dried to 9.7% average moisture, ground, sieved to pass 1 mm, and
stored in sealed plastic bags in a dry and dark. All the chemicals
and reagents were of analytical grade. Ethanol, hexane and meth-
anol were purchased from Panreac (Drogallega, S.L, Spain). Buty-
lhydroxy anisol (BHA) and butyl hydroxytoluene (BHT) were
purchased from Analema (Drogallega, S.L, Spain). Gallic acid, proto-
catechuic acid, 4-hydroxybenzoic acid, vanillic acid, quercetin and
apigenin were obtained from SigmaAldrich (St. Louis, USA) and
rutin from Extrasynthse (Lyon Nord, France). Dihydrorhodamine
123 (DHR), 4,5-diaminouorescein (DAF-2), 30% hydrogen perox-
ide, sodium hypochlorite solution containing 4% available chlorine,
diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), 3-(aminopropyl)-1-
hydroxy-3-isopropyl-2-oxo-1-triazene (NOC-5), b-nicotinamide
adenine dinucleotide (NADH), phenazine methosulfate (PMS),
nitroblue tetrazolium chloride (NBT) and lucigenin were obtained
from SigmaAldrich (St. Louis, USA). a,a0 -Azodiisobutyramidine
dihydrochloride (AAPH), histidine and Trolox were obtained from
Fluka Chemie GmbH (Steinheim, Germany). Fluorescein sodium
salt was obtained from Aldrich (Milwaukee, USA).
2.2. Solidliquid extraction
Ground CsL samples were in contact for the desired time with
the selected solvent (aqueous ethanol (96%) denoted as ES, metha-
nol denoted as MS, or acidied water denoted as AWS) at the se-
lected liquid to solid ratio and temperature in capped Erlenmeyer
asks kept in an orbital shaker at 120 rpm. Phase separation was
accomplished by ltration. The liquid phase was vacuum evapo-
rated and freeze-dried to obtain a crude extract. The extraction
yield was determined gravimetrically.
2.3. Experimental plan
The experimental plan followed a three-factor, central compos-
ite circumscribed (CCC) involving 20 experiments with six repli-
cates in the central point of the experimental domain. The
independent variables, their nomenclatures in dimensional and
dimensionless terms and their variation ranges were as follows:
contact time (t, X1, 3090 min); temperature (T, X2, 2550 C)
and liquid to solid ratio (L/S, X3, 1525 v/w). The particle size dis-
tribution (in the range 0.251 mm) was constant in all experi-
ments. Three solvents (96% ethanol, methanol, acidied water)
were employed in individual sets of experiments. The range se-
lected for the extraction time covered the conditions of practical
interest, whereas the temperature range was xed keeping in mind
a compromise between extraction yield, extraction rate and limita-
tion of thermal denaturation. The values assayed for the liquid to
solid ratio was in a wide interval where mass transfer is not lim-
ited. Table 2 lists the operational conditions assayed for individual
experiments.
The measured effects were the Soluble Extraction Yield (SEY, mg
soluble solids/100 mg dry CsL), the phenolic extraction yield (PEY,
mg GAE/100 mg dry CsL), and the DPPH radical scavenging capacity
(DPPH RS), which was selected to assess the antioxidant activity.
The experimental data determined for each of the three solvents
were adjusted according to the following second order equation:
X
k X
k X
k1 X
k
Y b0 bi X i bii X 2i bij X i X j 1
i1 i1 i1 j2
i<j
where X1, X2, . . ., Xk are the independent, dimensionless variables
affecting the responses (Y0 s); b0, bi (i = 1, 2, . . ., k), bii (i = 1, 2, . . ., k),
and bij (i = 1, 2, . . ., k; j = 1, 2, . . ., k) are the regression coefcients
for intercept, linear, quadratic, and interaction terms, respectively;
k is the number of variables. The Statsoft vs 5.0 software was used
in calculations.
2.4. Analytical methods
Ash content was determined by calcination at 550 C. Extrac-
tives (in hexane, 80% ethanol, and toluene:ethanol) were deter-
mined gravimetrically after Soxhlet extraction. Ground CsL
samples were subjected to moisture determination and to quanti-
tative acid hydrolysis with 72% sulfuric acid, following standard
methods [15]. The solid residue after hydrolysis was considered
 B. Daz Reinoso et al. / Chemical Engineering Journal 203 (2012) 101109
as Klason lignin. Monosaccharides and acetic acid were determined
by HPLC using a HewlettPackard chromatograph tted with a
refractive index detector (temp., 40 C). Other analysis conditions
were: column, ION-300 (Transgenomic Inc., USA); mobile phase,
3 mM H2SO4; ow, 0.4 mL/min. The yield in soluble compounds
was determined gravimetrically. The phenolic content was deter-
mined by the FolinCiocalteau method using gallic acid as a stan-
dard. Uronic acids were determined spectrophotometrically [16] as
galacturonic acid equivalents (GAEs).
Other analyses were carried out using an Agilent HPLC 1100
instrument equipped with a Waters Spherisorb ODS-2 column
and DAD detector, operating at a ow rate of 1 mL/min. Elution fol-
lowed the following nonlinear gradient: solvent A (acetonitrile/
5%(v/v) formic acid in water, 10:90); solvent B (acetonitrile/5%(v/
v) formic acid in water, 90:10); elution periods: 0 min, 100% A,
0% B; 40 min, 85% A, 15% B; 45 min, 0% A, 100% B; 55 min, 0% A,
100% B; 60 min, 100% A, 0% B; 65 min, 100% A, 0% B.
2.5. Antioxidant activity assays
In vitro antioxidant assays were performed using a microplate
reader (Synergy HT, BIO-TEK), for uorescence, absorbance in
UV/vis and luminescence measurements, equipped with a thermo-
stat. Control assays with commercial synthetic antioxidants were
run in parallel for comparative purposes.
2.5.1. DPPH (a,a-Diphenyl-b-picrylhydrazyl) radical scavenging assay
Two milliliters of a 3.6  105 M methanolic solution of DPPH
were added to 50 lL of a methanolic solution of the considered ex-
tract. The decrease in absorbance at 515 nm was recorded after
16 min. The Half Maximal Effective Concentration (EC50) was cal-
culated as the amount of methanolic extract causing a 50% inhibi-
tion of the DPPH radical.
2.5.2. Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC)
ABTS radical cation ABTS was produced according as de-
scribed previously [17]. Assays were run with solvent blanks and
extracts, and the percentage inhibition of absorbance was referred
to the concentration of extracts and Trolox.
2.5.3. Superoxide radical O
2 scavenging assay
The O
2 scavenging activity was determined by monitoring the
effects of the tested extracts on the O 2 -induced reduction of
nitroblue tetrazolium (NBT) at 560 nm [18]. O 2 was generated
by the b-nicotinamide adenine dinucleotide/phenazine methosul-
fate/oxygen (NADH/PMS/O2) system. The results were expressed
in terms of inhibition percentage of NBT reduction to diformazan.
Each result corresponds to four experiments, performed in
triplicate.
2.5.4. Hydrogen peroxide (H2O2) scavenging assay
The H2O2 scavenging activity measured the inhibition (in per-
centage) of the H2O2-induced oxidation of lucigenin [18]. Each
study corresponds to four experiments, performed in triplicate.
2.5.5. Hypochlorous acid (HOCl) scavenging assay
The HOCl scavenging activity measured the inhibition percent-
age of HOCl-induced oxidation of dihydrorhodamine 123 (DHR) to
rhodamine 123 [18]. HOCl was prepared by adjusting the pH of a
1% (m/v) solution of NaOCl to 6.2 with dropwise addition of
10%H2SO4. Each study corresponds to four experiments, performed
in triplicate.
2.5.6. Singlet oxygen (1O2) scavenging assay
The 1O2 scavenging activity was measured by monitoring the
inhibition (in percentage) of 1O2-induced oxidation of non-uores-
103
cent DHR [18]. 1O2 was generated by the thermal decomposition of
endoperoxide disodium 3,30 -(1,4-naphthalene) bispropionate
(NDPO2) [19]. Each study corresponds to four experiments, per-
formed in triplicate.
2.5.7. Peroxyl radical (ROO) scavenging assay
The ROO scavenging activity measured the effects of the tested
extracts on the uorescence decay resulting from ROO-induced
oxidation of uorescein, and the results were expressed in terms
of the Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) [18]. Each
study corresponds to four experiments, performed in triplicate.
2.5.8. Nitric oxide (NO) scavenging assay
The NO scavenging activity measured the inhibition percentage
of NO-induced oxidation of non-uorescent 4,5-diaminouoresce-
in (DAF-2) to the uorescent triazolouorescein (DAF-2T) [18].
Each study corresponds to four experiments, performed in
triplicate.
2.5.9. Peroxynitrite (ONOO) scavenging assay
The ONOO scavenging activity measured the effects of the
tested extracts on the inhibition percentage of the ONOO-induced
oxidation of non-uorescent DHR to uorescent rhodamine 123
[18]. ONOO was synthesized as described before [20]. Parallel as-
says were performed in the presence of 25 mM NaHCO3 in order to
simulate the physiological CO2 concentrations, where the reaction
between ONOO and bicarbonate is predominant, with a very fast
rate constant (k2 = 35.8  104 M1 s1) [21]. Each study corre-
sponds to four experiments, performed in triplicate.
3. Results and discussion
3.1. Composition
Table 1 lists compositional data of CsL. Lignin was the major
structural fraction, followed by hemicelluloses, which were mainly
constituted of xylose and uronic acids. In comparison with the data
reported for green leaves from South West England [22], the re-
sults determined for CsL showed similar cellulose content and a
signicantly higher lignin content. Extractives in 80% ethanol ac-
counted for 13.5% of the dry material, below the ranges reported
for 80% methanol (1720%) [10] and hot water (20.9%) [7].
Extractables in the ethanol solution (80% v/v) yield an extract
with a phenolic concentration intermediate between those re-
ported for hot water [3,7], methanol [3] and aqueous ethanol
[9,11] and 80% ethanol was a solvent more selective for phenolic
compounds than toluene:ethanol and hexane. The yield in soluble
solids, phenolic content and scavenging capacity for pro-oxidant
species obtained from less polar solvents than acidied water sol-
vent (AWS) was lower, corroborating previously reported ndings
[3]. Reduced yields and activities have been reported for extracts
obtained after sequential extractions with hexane, chloroform,
ethyl acetate, methanol, and water [8], although ethyl acetate
extracts eluted by medium-pressure liquid chromatography with
methanol were highly active [3]. The general trend of antioxidant
activity is closely dependent on the solvent polarity, the antioxi-
dant potential and the sequence found in this work was
BHA > 80% ethanol > toluene:ethanol (2:1) BHT  hexane.
3.2. Optimization of the extraction conditions
In order to achieve maximum yields of active extracts, the joint
optimization of the most inuential variables was addressed. The
liquid phases for extraction were selected on the basis of previous
data and in practical aspects (including availability, cost, toxicity,
104 B. Daz Reinoso et al. / Chemical Engineering Journal 203 (2012) 101109

Table 1 Table 3
Composition of Castanea sativa leaves (CsLs). Data expressed on dry basis. Experimental and calculated values of the solubles extraction yield (SEY).

Structural components Content (g/100 g CsL) Exp. SEY (mg soluble solids/100 mg dry CsL)
Cellulose 19.4 ES MS AWS
Hemicelluloses 24.3
Exp Cal Exp Cal Exp Cal
Xylan 9.41
Arabinan 3.28 1 9.86 10.20 11.68 12.60 12.16 10.91
Acetyl groups 1.66 2 9.66 8.93 12.68 12.92 9.66 10.73
Uronic acids 9.39 3 9.14 7.86 10.52 10.38 12.24 11.80
Klason lignin 37.2 4 9.10 8.17 11.15 10.36 12.72 12.11
5 7.02 8.11 8.16 9.43 12.95 12.81
Non-structural components Content (g/100 g CsL)
6 9.46 10.90 12.55 13.17 18.17 17.87
Ash 4.34 7 8.32 9.21 10.89 11.13 11.01 9.20
Extractives 8 13.76 13.58 14.97 14.53 14.27 14.77
9 6.00 7.62 10.70 10.79 10.66 11.03
80% Ethanol 13.5
10 12.25 10.41 12.40 11.63 14.17 14.85
14.0 g GAE/100 g dry extract
11 9.28 8.73 11.00 9.88 9.13 10.93
EC50, DPPH = 1.49 mg extract/mL
12 11.02 11.34 12.56 13.01 16.21 15.45
Hexane 9.48 13 9.32 10.29 11.18 12.09 9.36 10.40
0.42 g GAE/100 g dry extract 14 11.20 10 14.39 12.81 12.27 12.27
EC50, DPPH = 16.42 mg extract/mL 15 12.36 11.57 9.78 9.81 12.21 11.88
Toluene:ethanol (1:2) 12.8 16 12.54 11.57 10.00 9.81 12.34 11.88
3.04 g GAE/100 g dry extract 17 12.01 11.57 9.75 9.81 11.41 11.88
EC50, DPPH = 2.73 mg extract/mL 18 12.13 11.57 10.50 9.81 10.39 11.88
19 10.22 11.57 9.41 9.81 12.44 11.88
GAEs: Gallic Acid Equivalents. 20 10.13 11.57 9.32 9.81 12.71 11.88

Table 2
Operational conditions assayed, expressed in terms of dimensional and dimensionless 3.2.1. Solubles extraction yield (SEY)
independent variables. The maximum extraction yield (18.2%) was reached using
Exp. Variables water as a solvent under the conditions of experiment 6 (opera-
tion for 90 min at 50 C using 25 mL AWS/g CsL). The yield was
t min (X1) T C (X2) L/S v/w (X3)
close to the value reported for extracts from leaves from C. sativa
1 30 (1) 25 (1) 25 (1)
grown in a near geographical area, obtained with boiling water
2 30 (1) 50 (1) 25 (1)
3 30 (1) 25 (1) 15 (1) for 30 min [7]. Ethanol (ES) and methanol (MS) provided lower
4 30 (1) 50 (1) 15 (1) yields than AWS, with maximum values in experiment 8 (per-
5 90 (1) 25 (1) 25 (1) formed for 90 min at 50 C, using 15 mL extracting agent/g CsL).
6 90 (1) 50 (1) 25 (1) The lowest yield (6.00 mg soluble solids/mg dry CsL) corre-
7 90 (1) 25 (1) 15 (1)
8 90 (1) 50 (1) 15 (1)
sponded to operation with ES for 9.6 min at 37.5 C using 20 mL
9 9.6 (1.68) 37.5 (0) 20 (0) ethanol/g CsL, and for 90 min at 25 C using 25 mL ethanol/g CsL.
10 110.4 (1.68) 37.5 (0) 20 (0) In experiments with ethanol, increasing the contact time while
11 60 (0) 16.5 (1.68) 20 (0) keeping temperature and liquid to solid ratio constant doubled
12 60 (0) 58.5 (1.68) 20 (0)
the extraction yield (see experiments 1520, performed in the
13 60 (0) 37.5 (0) 11.6 (1.68)
14 60 (0) 37.5 (0) 28.4 (1.68) central point of the experimental domain). Although a variety of
15 60 (0) 37.5 (0) 20 (0) compounds are soluble in all the liquid phases assayed in this
16 60 (0) 37.5 (0) 20 (0) study, both monomeric sugars (glucose, xylose, arabinose) and su-
17 60 (0) 37.5 (0) 20 (0) gar oligomers were preferentially solubilized by AWS (data not
18 60 (0) 37.5 (0) 20 (0)
19 60 (0) 37.5 (0) 20 (0)
shown).
20 60 (0) 37.5 (0) 20 (0) The experimental results in Table 3 were adjusted to Eq. (1) by
minimization of the deviation squares, enabling the calculation of
the results for given operation conditions. For comparative pur-
poses, the data calculated for the considered effects are included
and extracting capacity). Ethanol was chosen owing to its frequent in Tables 35 together with the experimental results. Only the
food applications [6,9]. Methanol is a reference solvent with high model coefcients signicant at a condence level > 95% (based
extracting ability [10] and leads to fractions of high radical scav- on a t-test) were considered for model predictions. The model coef-
enging capacity [3]. Acidied water is widely used to extract polar cients are listed in Table 6, as well as the results of the ANOVA.
compounds [23] and it is interesting because it could serve for the The equations employed to predict the extraction yield of solu-
development of alternative, solvent-free processes of limited ble compounds (SEY), expressed in terms of the dimensional inde-
environmental impact, and increases the extraction of tannins pendent variables, and including just the signicant terms, were as
[3]. CsL were extracted with each solvent under the experimental follows:
conditions shown in Table 2.
The statistical optimization procedure applied in the present SEYES 11:6  0:904 t 2 2
study enables the evaluation of the effects caused by both indi-
vidual independent variables and interactions among them. SEYMS 9:81 0:932  T 0:854  t  T  0:981  t  L=S
Related studies have been reported on the maximization of the
extraction of phenolic compounds from berries [24], evening 0:931  L=S2 3
primrose meal [25], black currants [13], grape pomace [26] or
wheat [14]. SEYAWS 11:9 1:14  t 1:34  T 1:31  t  T 1:12 t  L=S 4
 B. Daz Reinoso et al. / Chemical Engineering Journal 203 (2012) 101109 105

Table 4 values of time and temperature. Response surface for ES showed

Experimental and calculated values for the phenolic extraction yield (PEY). a different behavior at low T. The effect of solid to liquid ratio is
Exp. PEY (mg GAE/100 mg dry CsL) showed in Fig. 1A. Models predict different behavior for the sol-
ES MS AWS vents used. Ethanol seems not affected by the liquid to solid ratio.
Exp Cal Exp Cal Exp Cal
1 0.68 0.50 0.94 1.12 4.14 4.05 3.2.2. Phenolics extraction yield (PEY)
2 0.75 0.77 1.88 2.04 3.73 4.57
In the studied operational range, the maximum value of PEY
3 0.35 0.53 1.17 1.42 3.59 4.95
4 0.84 0.65 1.45 1.72 4.45 4.57 (9.16 mg GAE/100 mg CsL) achieved with AWS corresponded to
5 0.81 0.89 1.70 1.91 4.39 5.28 experiment 6 (performed for 90 min at 50 C using 25 mL acidied
6 2.24 1.95 2.02 2.25 9.16 8.81 water/g CsL), and was considerably higher than the value obtained
7 0.67 0.55 1.50 1.83 2.36 2.55 with ES (2.24 mg GAE/100 mg CsL in experiment 6, performed for
8 1.38 1.46 1.26 1.56 4.08 5.19
9 0.24 0.29 1.62 1.35 4.78 3.94
90 min at 50 C using 25 mL aqueous ethanol/g CsL), or with MS
10 1.20 1.30 2.27 1.87 6.10 5.49 (2.49 mg GAE/100 mg CsL obtained in experiment 12, performed
11 0.63 0.60 1.95 1.61 4.61 3.70 for 60 min at 58.5 C using 20 mL methanol/g CsL). In comparison
12 1.43 1.60 2.49 2.15 6.89 6.35 with results reported in related studies, the phenolic yields
13 0.68 0.66 1.91 1.47 5.08 3.91
achieved in ES extractions were lower than those reported for
14 0.88 1.05 2.03 1.80 6.49 6.21
15 0.98 0.94 1.19 1.36 3.50 3.91 ultrasound-assisted ethanol extraction of leaves from the Italian
16 1.02 0.94 1.23 1.36 3.23 3.91 marrone cultivar [9], and when the solvent was methanol the
17 0.81 0.94 1.67 1.36 4.44 3.91 yields achieved also were lower than those reported for solvent
18 0.95 0.94 1.67 1.36 4.00 3.91 extraction from a commercial powder plant [3].
19 1.00 0.94 1.14 1.36 3.75 3.91
20 0.91 0.94 1.13 1.36 4.31 3.91
The ratio between the yields in phenolics and soluble solids
(PEY/SEY), which measured the phenolic content in terms of mass
ratio respect the total weight of extract, was higher than 50% for
aqueous extracts, doubling the maximal values reached with alco-
hols. So, under optimal conditions, water was more selective than
Table 5 ethanol for phenolics extraction than the rest solvents employed in
Experimental and calculated values of variable EC50. the present work, as well as in literature studies with the same raw
Exp. EC50 (mg extract/mL)
material [6,11], including extracts obtained with boiling water [7]
and with a sequence of solvents [3]. As a general trend, the pheno-
ES MS AWS
lic yields obtained with water were between 24 or 310 times
Exp Cal Exp Cal Exp Cal higher than those obtained with methanol or ethanol, respectively
1 1.77 2.18 1.18 1.08 0.37 0.33 (Table 4).
2 1.75 1.96 0.87 0.98 0.49 0.47 Starting from the results listed in Table 6, it can be inferred that
3 2.91 2.90 1.16 0.88 0.52 0.44
the empirical equations derived from PEY with ES and AWS sol-
4 1.61 2.05 0.73 0.53 0.40 0.33
5 0.98 0.93 0.44 0.41 0.31 0.28 vents (considering only the coefcients signicant at the 95% con-
6 0.45 0.86 0.36 0.40 0.40 0.38 dence level) are as follows:
7 1.54 1.73 1.61 1.27 0.68 0.60
8 1.04 1.03 1.14 1.00 0.52 0.45
PEYES 0:938 0:300  t 0:296  T 0:116  L=S 0:197  t  T 5
9 3.71 3.29 0.70 0.86 0.31 0.39
10 1.52 1.38 0.54 0.70 0.39 0.45
11 1.74 1.61 0.48 0.82 0.34 0.42
12 1.27 0.84 0.51 0.51 0.36 0.41
PEYAWS 3:91 0:788  T 0:682  L=S 0:908  t  L=S 6
13 2.07 1.90 0.67 1.13 0.34 0.46 Both equations were signicant at the 95% condence level,
14 1.54 1.15 0.91 0.79 0.29 0.31
15 1.56 1.52 0.52 0.52 0.38 0.40
whereas no signicant dependence of PEY on the independent
16 1.66 1.52 0.59 0.52 0.41 0.40 variables was observed in extractions performed with methanol.
17 1.44 1.52 0.47 0.52 0.40 0.40 Besides the signicant terms shown in Eqs. (5) and (6), the con-
18 1.30 1.52 0.55 0.52 0.40 0.40 tribution of the interaction term time to temperature was signi-
19 1.54 1.52 0.58 0.52 0.40 0.40
cant at the 90% level in ethanol extractions. Fig. 1B shows the
20 1.56 1.52 0.45 0.52 0.41 0.40
response surfaces calculated for PEY as a function of the extraction
time and temperature (at the optimal L/S) and as a function of tem-
perature and L/S (at the optimal contact time) for ES and AWS
The three equations were signicant at the 95% condence le- extractions. The amount of solubilized phenolics increased with
vel. Considering the values of the model coefcients in Table 6, it temperature in both solvents, reaching maximal values (around
can be inferred that extraction time and temperature were the 6 mg GAE/100 mg dry CsL) operating with AWS at 58.5 C for
most inuential independent variables, no matter the extraction 9.54 min. The solubilized phenolics with AWS decreased with time
agent employed. The effects of the extraction time came mainly in such a way that prolonged contact times provided the lowest
from the interaction terms temperature L/S; whereas the qua- PEY values. This behavior is possibly due to a thermal decomposi-
dratic effects of time and liquid-to-solid ratio were inuential in tion of phenolic compounds in acidied water at high tempera-
the extractions with ES or MS. The response surfaces describing tures. A similar behavior during conventional solvent extraction
the dependence of SEY on the selected independent variables are was reported for compounds from wheat [14], black currants
shown in Fig. 1A for the three liquid phases considered. A related [13] or from berries [23].
behavior was observed for SEY in extractions performed with ES showed an inverse behavior, with maximal values of solubi-
AWS and MS, for which better yields were obtained at time and lized phenolics at temperatures higher than 50 C and 90 min. In
temperature values around 100 min and 55 C respectively. Com- this case, as expected, increased temperatures resulted in higher
paratively, models for AWS and ES predict maximal SEY values PEY, particularly, where the enhanced solubility and diffusivity of
(around 14% and 20%) for ES and AWS, respectively) for similar solutes play a major role.
 106 B. Daz Reinoso et al. / Chemical Engineering Journal 203 (2012) 101109

3.2.3. DPPH radical scavenging activity

0.046a

0.052a
0.062a
0.396 Extracts with high radical scavenging capacity (DPPH RS), mea-

0.586
0.018

0.011

0.079
0.003

0.009
0.008
0.004

1.57
AWS

sured as EC50, were obtained in AWS extractions performed under

the conditions of experiments 5 (in which the phases were in con-
tact for 90 min at 25 C using 25 mL of acidied water/g CsL), 9
(9.6 min, 37.5 C, 20 mL of acidied water/g CsL) and 14 (60 min,
37.5 C, 28.4 mL of acidied water/g CsL) with an half maximal
Effective Concentration of 0.31 and 0.29 mg aqueous extract/mL
0.156b

0.264b
0.517

0.662

0.261
0.048
0.092
0.101

0.094
0.052

0.023

0.064

2.18
(Table 5). These experiments resulted in extracts with the highest
MS

phenolic concentrations (0.338, 0.448 and 0.529 mg GAE/mg solu-

ble solids, respectively). AWS extraction under the conditions of
EC50 (mg extract/mL)

experiment 14 led to the extract with the highest concentration

of phenolics, which also showed the highest antioxidant activity.
The lowest EC50 of the extracts, indicative of optimal antioxi-
0.223b

0.288b
0.230b
0.566c

dant activity, was below the one determined for BHA

0.158
0.854

0.376
0.105

0.037
0.019
0.002
1.52

6.49
(EC50 = 0.25 mg/mL). The most active alcoholic extracts were pro-
ES

duced in experiment 6 (performed for 90 min at 50 C using

25 mL of alcohol/g CsL), with EC50 = 0.45 mg ethanolic extract/mL
and 0.36 mg methanolic extract/mL. It can be noted that the tem-
perature needed to obtain extracts with high antioxidant activity
was lower for water extractions (2537.5 C) than for alcohols
0.788b
0.682b

0.908b
0.754a
0.462

0.285
0.394

0.223
0.783

0.973
0.406

(50 C). The dependence of the radical scavenger capacity of ex-

AWS
3.91

4.00

tracts obtained with the three solvents studied on the operational

variables are given by the following equations:

DPPH RSES 1:52  0:566  t  0:230  T  0:223  L=S 0:288  t2

7
0.156
0.162

0.185

0.143

0.153
0.552
0.099

0.087

0.096

0.094

0.390
PEY (mg GAE/100 mg dry CsL)

1.36

1.37

DPPH RSMS 0:517  0:264  t  L=S 0:155  L=S2 8

MS

DPPH RSAWS 0:396  0:046  L=S  0:052  t  L=S 0:062  T  L=S

Regression coefcients and ANOVA of the adjusted models for the objective functions (SEY, PEY, radical scavenging, EC50).

9
The equations developed for methanol and ethanol extracts
0.116b

0.197b
0.296c
0.300c
0.938

0.177
0.052
0.057

0.095
0.037
0.909
0.030

were signicant at the 95% condence level, whereas the one de-
11.1

duced for water extracts was signicant at the 90% condence le-
ES

vel. The major contributions of the dependent variables (and

interactions among them) can be identied in Eqs. (7)(9).
Activities of commercial antioxidants, such as ascorbic acid
(EC50 = 0.12 mg/mL) and rutin (EC50 = 0.16 mg/mL) determined in
our laboratory, were slightly higher than the best extracts obtained
0.555

0.373
0.461
0.193

0.127
0.825

1.270
1.31b
1.12b
1.14c
1.34c

5.25
AWS
11.9

in this work. Higher DPPH radical scavenging capacities were re-

ported for an ethanolic extract produced by a series of ve extrac-
tion stages of 10 min (EC50 = 0.0126 mg/mL) [11], for crude
extracts and fractions obtained with a sequence of solvents
(EC50 = 0.0170.071 mg/mL) [3], and slightly higher for a boiling
water extract from chestnut leaves (IC50 = 0.17 mg/mL) [7].
0.854b
0.981b
0.495a
0.577a
0.932c

0.931c
0.249

0.215

0.816
0.084

1.005

The effects of the most inuential variables on the extract con-

9.81

4.92
MS
SEY (mg/100 mg dry CsL)

centration needed to scavenge 50% of DPPH (EC50) are shown in

Fig. 1c. Optimal conditions for antioxidant activity of the aqueous
extracts are dened by contact times in the range of 5090 min
and temperatures below 30 C, whereas alcoholic extracts manu-
factured at increased temperatures (up to 50 C) showed increased
0.904b
0.828a
0.775a

activity.
0.542

0.395

1.450
0.086

0.503

0.860

0.700
1.02a

2.53
11.6

The ABTS radical scavenging capacity of extracts produced un-

Coefcients signicant at p P 0.95.
Coefcients signicant at p P 0.99.
Coefcients signicant at p P 0.90.
ES

der selected conditions showed similar potency regardless the

extracting solvent. The most active extracts were obtained with
ES (EC50 = 0.34 mg/mL). This activity was near the ones determined
for AWS (0.38 mg/mL) and MS (0.37 mg/mL) extracts.
The phenolic content of extracts, measured by the ratio PEY/SEY
Model parameters

showed a close dependence on the DPPH radical scavenging capac-

Time  L/S (b13)
Time  T (b12)
Intercept (b0)

ity of the corresponding extracts (see Fig. 2). This nding suggests
T  L/S (b23)
Interaction
Time (b11)

that the total phenolic content of different extracts was a major

Time (b1)

Quadratic

L/S (b33)
L/S (b3)

T (b22)

Model

factor to explain their antioxidant activity, as it has been proposed

Linear

T (b2)

Error
Table 6

for polyphenols both in polar solvents [3] and in hot water extracts,
F

c
b
a

but not for avonoids [7].

 B. Daz Reinoso et al. / Chemical Engineering Journal 203 (2012) 101109 107

Fig. 1. Predicted dependence of (a) the solubles extraction yield (SEY), (b) phenolic extraction yield (PEY) and (c) antioxidant activity (EC50) of extracts on the contact time,
temperature and liquid solid ratio.

It can be noted that temperature caused different effects on the
PEY and on the antioxidant activity: PEY increased with tempera-
ture, whereas an intermediate temperature led to maximal antiox-
idant activity. It can be noted that increased temperatures enhance
extraction by improving both solubilities and diffusion coefcients.
However, intermediate temperatures can be more favorable for
extracting active phenolics, due to the limited degradation.
3.3. Antioxidant properties characterization
CsL aqueous extracts obtained under optimal conditions
described above were assayed for their ability to scavenge ROS
1 
(O  
2 , H2O2, ROO , HOCl, and O2) and RNS ( NO and ONOO , in the
presence and absence of HCO 3 ). Limited effects were observed in
experiments with H2O2 and HOCl, whereas the scavenging activi-
108 B. Daz Reinoso et al. / Chemical Engineering Journal 203 (2012) 101109

3.5 3.4. Composition of the CsL extracts

Water
3 Ethanol The literature reported on the phenolic compounds present in
Methanol
2.5 CsL lists a number of phenolic acids (p-hydroxyl, vanillyl, syringil,
gallic, ellagic, p-coumaric, chlorogenic and ferulic acids) [1,22] and
EC50 (g/L)

2 avonoids (rutin, hesperidin, quercetin, hyperoside, isoquercitrin,

apigenin, morin, naringin, narcissin, astragalin, galangin and
1.5
kaempferol) [6,8,10]. In the aqueous extracts produced according
1 to the optimized process of the present work, the major phenolic
compounds identied by HPLC were gallic acid, protocatechuic
0.5 acid, 4-hydroxybenzoic acid, vanillic acid, rutin, quercetin and
apigenin.
0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

PEY/SEY (g GAE / g solid) 4. Conclusions

Fig. 2. Relationship between phenolic content (calculated as the ratio PEY/SEY) and An experimental design was employed to develop mathemati-
DPPH radical scavenging capacity of extracts. cal equations suitable for assessing the yield in soluble compounds,
the yield in phenolics and the antioxidant activity of extracts pro-
duced from C. sativa leaves (CsL) with water, ethanol and metha-
100 O2.- HOCl 1
O2 .
NO nol. This feedstock is bio-renewable material of huge availability,
-
ONOO ONOO- with HCO3- employed in traditional medicine, and a potential source of radical
ROS and RNS scavenging activity (%)

scavengers. Both extraction time and temperature affected the

yields of soluble solids and phenolics strongly. Prolonged extrac-
75
tion periods (>90 min) at high temperatures (50 C) led to optimal
extraction of phenolics with water and ethanol; whereas limited
effects were associated to the contact time in extractions with
methanol at high temperatures. Acidied water was the best sol-
50
vent for phenolic extractions, which yield extracts of high purity.
Under selected conditions, extracts containing up to 54 wt% of phe-
nolic acids and avonoids were produced, with a radical scaveng-
ing capacity similar to that of BHA. The process proposed in this
25
work is simple, exible, and causes low environmental impact.

Acknowledgements
0
0 5 10 15 20 The authors greatly acknowledge MEC and FEDER for the nan-
Conc (g/mL) cial support of the Project AGL2006-05387. The authors wish to
thank Ms. Noelia Gonzlez (who held a Lucas Labrada contract
Fig. 3. ROS and RNS scavenging activity of extracts obtained under optimized from Xunta de Galicia). Beatriz Daz Reinoso thanks the Spanish
conditions.
MEC for her research grant (BES-2005-7525). Andrs Moure thanks
Xunta de Galicia for his research contract (Isidro Parga Pondal
Program). Diana Couto acknowledges the Fundao para a Cincia
Table 7
e Tecnologia nancial support for her PhD Grant (reference SFRH/
ROS and RNS scavenging effects (IC50, mean standard deviation) and ORAC ROO.
Standard deviation) of the aqueous extract obtained under optimized conditions.
BD/72856/2010).

IC50 (mg/mL)  103

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 PUBLICACIN IV

Membrane concentration of antioxidants from Castanea sativa

leaves aqueous extracts.
Beatriz Daz-Reinoso, Andrs Moure, Herminia Domnguez, Juan Carlos Paraj.
Chemical Engineering Journal 175 (2011) 95-102.
NDICE DE IMPACTO: 3,461
 Resultados

Resumen

El castao europeo (C. sativa) es un rbol perteneciente a la familia Fagaceae que crece en el
sur de Europa, especialmente en la regin del Mediterrneo y los Balcanes. Sus hojas han sido
estudiadas como una fuente interesante de compuestos activos (Calliste y col., 2005; Barreira
y col., 2010). Se han identificado compuestos fenlicos presentes en la hoja de castao como
cido elgico y derivados del cido glico (ivcovi y col., 2008). Estos compuestos presentan
actividades biolgicas incluyendo capacidad protectora frente a enfermedades relacionadas
con el estrs oxidativo o actividad antimicrobiana (ivkovic y col., 2010; Mujid y col. 2011).

La tecnologa de membranas ofrece ventajas como baja temperatura, ausencia de transicin

de fase o bajos consumos energticos en comparacin con otras tecnologas convencionales y
su uso ha sido ampliamente investigado para el fraccionamiento y/o concentracin de
compuestos fenlicos antioxidantes a partir de productos naturales y subproductos
procedentes de su procesado (Conde y col., 2013).

Como una continuacin del trabajo anterior, en el cual se evalu el efecto de las variables
operacionales en la extraccin de compuestos fenlicos a partir de hoja de castaa, en este
estudio se llev a cabo el escalado de dicha extraccin en las condiciones que permitieron
maximizar su capacidad antioxidante y una posterior evaluacin de la viabilidad de la
tecnologa de membranas con el objetivo de aumentar la pureza del extracto obtenido. Se
determin el contenido en compuestos fenlicos, su actividad antioxidante y la irritabilidad
tpica mediante el mtodo EpiSkin del retenido final obtenido.

Por otro lado, durante el proceso de filtrado con membranas el flujo de permeado disminuye
debido a los fenmenos de ensuciamiento y polarizacin de la concentracin, lo que se
traduce en la necesidad de intercalar etapas de lavado que aumentan los costes de
funcionamiento del proceso. Esta situacin constituye un parmetro importante en el diseo
de un proceso escalable. En el presente trabajo se evaluaron distintos modelos con el fin de
determinar los mecanismos involucrados en el descenso de flujo de permeado durante la
filtracin de los extractos acuosos de hoja de castaa.

El esquema operacional propuesto permiti la obtencin de un producto con una capacidad

antioxidante similar al Trolox y al BHA y potencialmente seguro para su uso tpico.

151
 Chemical Engineering Journal 175 (2011) 95102

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Chemical Engineering Journal

journal homepage: www.elsevier.com/locate/cej

Membrane concentration of antioxidants from Castanea sativa leaves aqueous

extracts
Beatriz Daz-Reinoso a,b , Andrs Moure a,b, , Herminia Domnguez a,b , Juan Carlos Paraj a,b
a
Departamento de Enxenera Qumica, Universidade de Vigo (Campus Ourense), Edicio Politcnico, As Lagoas, 32004 Ourense, Spain
b
CITI-Universidade de Vigo, Parque Tecnolxico de Galicia, Ra Galicia n 2, 32900 Ourense, Spain

a r t i c l e i n f o a b s t r a c t

Article history: Aqueous extraction of Castanea sativa leaves (CsL) was scaled up and the extract was processed in a series
Received 31 May 2010 of two UF membranes (5 and 10 kDa) with the aim of concentrating the active phenolic compounds with
Received in revised form 8 September 2011 antioxidant activity. Due to the occurrence of adsorptive fouling of the phenolic compounds found in
Accepted 12 September 2011
one membranes conguration assayed (Conguration I), batch dilution of the retentate was required
for optimal performance. However, this strategy did not improve the selectivity of the process and the
Keywords:
active compounds were diluted. The best prediction of the permeate ux was provides by the cake
Castanea sativa leaves
layer formation model (CFM) to the 5 kDa membrane and by the standard pore blocking model (SBM)
Aqueous extraction
Ultraltration
to the 10 kDa membrane when the Conguration II was assayed. Secuencial ltration without dilution
Antioxidant activity of the 5 kDa permeate (Conguration I) provides a selective separation of active compounds on 10 kDa
membrane ltration process. The nal concentrated extracts presented radical scavenging capacities
comparable to Trolox and to BHA. The test with reconstituted human epidermis (Episkin ) conrmed
that the extracts were non irritant at 1%. Operation with reutilization of the permeate was feasible and
the extraction yield of active compounds was not signicantly affected. Due to the non selective retention
of phenolic and soluble protein, the separation of this latter by ethanol precipitation was proposed. The
ethanol precipitation of concentrates streams increased its purity and activity of the nal products by
about 15%.
2011 Elsevier B.V. All rights reserved.

1. Introduction however the maximal radical scavenging capacity was found at

Castanea sativa leaves (CsL) are a folk remedie to treat cough,
rheuma and muscular pain. Recent research has conrmed the
interesting properties of aqueous and ethanolic extracts including
the free radical scavenging capacity [13], antimicrobial activity
[4,5], and the potential and safety as ingredient in cosmetic com-
positions [6,7].
In a previous study an aqueous process for the extraction of
antioxidants from C. sativa leaves (CsL) was optimized to obtain
a mixture of active compounds (gallic acid, protocatechuic acid, 4-
hydroxybenzoic acid, vanillic acid, rutin, quercetin and apigenin),
which was as potent radical scavenger, comparable to synthetic
antioxidants [8]. The purity referred to phenolic compounds was in
the range 3450%. Further rening of the crude extracts obtained
could be desirable for some particular applications. Maximal yields
and purity were obtained for extractions carried out at 50 C,
Corresponding author at: Departamento de Enxenera Qumica, Universidade
de Vigo (Campus Ourense), Edicio Politcnico, As Lagoas, 32004 Ourense, Spain.
Tel.: +34 988368892; fax: +34 988387001.
E-mail address: amoure@uvigo.es (A. Moure).
25 C. The performance of an extraction at room temperature was
proposed and the possibility of improving the phenolic concentra-
tion in the nal extract was addressed with membranes.
Despite the advantages of water as a selective agent for the
extraction of antioxidants from CsL as well as a biorenewable non
toxic solvent for processing nutraceutical and food ingredients, the
high residual volumes compromise the environmental benets and
concentration costs. In order to dene a process suited for scaling up
and with reduced environmental impact both the consumption and
the disposal of aqueous streams should be limited. Membrane tech-
nology can be used to concentrate and/or selectively fractionate
bioactive compounds with antioxidant activity from aqueous and
alcoholic processing streams of products, by-products and wastes
from agro-food industry, particularly soluble protein and peptides
and phenolic compounds. Some successful applications include the
concentration [9] and fractionation [10,11] of grape phenolics; the
fractionation of phenolics from mushrooms [12], persimmon pulp
[13], almond skin extracts [14], mulberry root cortices [15], black
[16] and green tea [17], and Salvia miltiorrhiza [18].
An important parameter to dene a scalable design is the
membrane fouling. During a ltration process the membrane prop-
erties are affected by the feed characteristics and the operating

1385-8947/$ see front matter 2011 Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.cej.2011.09.059
96 B. Daz-Reinoso et al. / Chemical Engineering Journal 175 (2011) 95102
conditions. The fouling mechanisms include
membranesolutesolute interactions (UF fouling) and
membranesolute interactions (adsorptive fouling), inuenced
both by membrane properties (surface chemistry and surface pore
size) and feed characteristics (pH and salt content). Adsorptive
fouling was conrmed during the adsorption of polyphenolics
from green tea on the surface and inside polyethersulfone (PES)
membranes [19]. The adsorptive fouling of polyphenols onto
PES membranes was inuenced by the effect of pore size, polar
interactions (van der Waals, electron donoracceptor), multiple
hydrogen bonds towards the additive PVP in PES, benzene ring
interaction by  stacking and changes in water structure at the
membrane polymer surface [19,20]. Mixtures of polyphenols with
other components, such as polysaccharides, could form aggregates
having a strong contribution to adsorptive fouling of PES mem-
branes [20]. During UF of cork processing wastewaters, which are
a complex mixture of phenolic compounds, the more hydrophobic
component (ellagic acid) was almost totally retained forming an
adsorbed layer on cellulose acetate membranes independently of
the MWCO (6 and 98 kDa) and the hydrodynamic conditions [21].
The objective of this study was to scale up the aqueous extrac-
tion process from C. sativa leaves (CsL), to assess the performance
of a sequence of two ultraltration membranes for the concentra-
tion of phenolic compounds with antioxidant activity and to verify
that these properties of concentrated streams are not lost during
membrane processing.
2. Materials and methods
2.1. Materials
Chestnut (C. sativa) leaves (CsL) from 2005 harvest were locally
collected in Ribeira Sacra (Ourense, Spain). Air-dried and ground
CsL (nal moisture 9.68% and less than 1 mm) were stored in sealed
plastic bags in dry dark place before use. Butylhydroxyanisol (BHA)
and butylhydroxytoluene (BHT) (Analema) were used.
2.2. Aqueous extraction
Ground CsL (1 kg) was contacted with acidied water (25 L)
under conditions leading to maximal radical scavenging activity
(25 C during 90 min) in a home-made tank with stirring rate and
temperature control. Solid:liquid separation was accomplished by
vacuum ltration, and the liquid phase was processed in a series of
two ultraltration membranes.
2.3. Membrane equipment and operation
Membrane fractionation was performed in an UF lab pilot
home-made plant, consisting of a feed tank with 2.5 L, a peri-
staltic Masterex pump and a membrane module. Pressure was
monitored at the entrance and exit of the membrane module, a
needle valve located after the module was used for TMP regu-
lation. The pilot plant was equipped with 5 and 10 kDa Omega
membranes (Minisette, Pall Filtron) (0.12 mm 0.10 mm) having
an effective surface area of 0.07 m2 . The membrane material is
modied polyethersulfone and the maximum operation pressure
is 4 bar.
The aqueous phase generated after extraction was ultraltered
with the 5 kDa membrane, operating in concentration mode, at
20 C and at a xed transmembrane pressure of 2 bar, since at lower
values no permeation was observed and higher values could not be
feasible. Volume permeation uxes were measured up to a VRF
(Volume Reduction Factor) of about 26. The VRF can be expressed
as the ratio between the initial feed volume and the volume of
retentate.
Volume of feed V0
VRF = = (1)
Volume of retentate VR
Instantaneous samples of permeate and retentate were reg-
ularly taken and assayed for total solids, total phenolics, total
nitrogen, soluble protein, radical scavenging capacity (ABTS, DPPH),
and reducing power. Once reached a VRF of 2.3, the retentate was
processed in the 10 kDa membrane with simultaneous retentate
recycling and permeate removal (Conguration I, Fig. 1).
2.3.1. Batch redilution of retentate
To improve operation in the 10 kDa membrane water dilution
(1:2.125) of the retentate from the 5 kDa membrane (R1 ) was per-
formed (Conguration II, Fig. 1).
After operation, the fouled membranes were cleaned with a
caustic detergent solution (0.5% Ultrasil 11, Henkel Ecolab) at 50 C
for 60 min operating in full recirculation mode, and the system was
then operated with fresh water in order to check the ux recovery.
2.4. Analytical methods
The total phenolic content was determined by Folin-Ciocalteau
method using gallic acid as standard. Identication analyses were
carried out using an Agilent HPLC 1100 instrument equipped with
a Waters Spherisorb ODS-2 column and a DAD detector, operat-
ing with a ow rate of 1 mL/min. A nonlinear gradient of solvent
A (Acetonitrile/5% (v/v) formic acid in water, 10:90) and solvent B
(Acetonitrile/5% (v/v) formic acid in water, 90:10) was used: 0 min,
100% A, 0% B; 40 min, 85% A, 15% B; 45 min, 0% A, 100% B; 60 min,
100% A, 0% B. The protein concentration was determined by the
Bradford method with bovine serum albumin (Sigma Chem. Co.) as
the standard. The total nitrogen was analysed by elemental analysis
with a Thermo Finnigan EA 1112 analyzer.
2.5. Antioxidant activity
2.5.1. ,-Diphenyl--picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging
activity
Two milliliters of a 3.6 105 M methanolic solution of DPPH
(Fluka), were added to 50 L of a methanolic solution of the antiox-
idant. The decrease in absorbance at 515 nm was recorded after
16 min. EC50 was calculated as the amount of extracts (redissolved
in methanol) causing a 50% inhibition of the DPPH radical. Each
study was performed in triplicate.
2.5.2. TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity)
ABTS radical cation (ABTS+ ) [2,2 -azinobis (3-ethyl-
benzothiazoline-6-sulfonate)] was generated by reacting 7 mM
ABTS solution with potassium persulfate (nal concentration
2.45 mM) and maintaining the mixture in the dark for 1216 h
before use. ABTS+ solution was diluted with phosphate buffer
saline (PBS) (pH 7.4) to an absorbance of 0.70 at 734 nm and
equilibrated at 30 C. One mL of diluted ABTS+ solution was mixed
with 10 L of extract or Trolox standards in ethanol or phosphate
buffer saline (PBS). Absorbance readings were taken up to 6 min
and the percentage inhibition of absorbance was calculated as a
function of the concentration of extracts and Trolox. Each study
was performed in triplicate
Ferric reducing antioxidant power (FRAP) was determined with
a reactive solution prepared with 25 mL of 300 mmol/L acetate
buffer (pH 3.6), 2.5 mL of a 10 mmol/L 2,4,6-tripyridyl-s-triazine
(TPTZ) solution in 40 mmol/L HCl and 20 mmol/L ferric chloride in
distilled water. An aqueous solution of known Fe (II) concentration
was used for calibration. Samples (100 L) were mixed with 3 mL
 B. Daz-Reinoso et al. / Chemical Engineering Journal 175 (2011) 95102
a
CsL
aqueous 5 kDa
extract
Feed tank
Retentate R1
Configuration I
b
CsL
aqueous
5 kDa
ext ract
Feed tank
Retentate R1
Water
Configuration II
Fig. 1. Congurations evaluated for the concentration of the aqueous extracts from C. sativa leaves (CsL).
of the FRAP reagent and the absorbance was monitored at 593 nm.
Each study was performed in triplicate.
2.5.3. Reducing power
One mL of extract dissolved in methanol was mixed with
2.5 mL of 0.2 M phosphate buffer (pH 6.6) and 2.5 mL of 1.0%
potassium ferricyanide. The mixture was incubated at 50 C for
30 min before adding 2.5 mL of 10% trichloroacetic acid. The mix-
ture was centrifuged and 2.5 mL of the supernatant were combined
2.5 mL and with 0.5 mL of 0.1% ferric chloride before reading
the absorbance at 700 nm. The reducing power was expressed as
absorbance of the reaction mixture. Each study was performed in
triplicate.
2.6. In vitro skin irritation (Episkin) model
The in vitro reconstructed human tissues (Episkin ) model,
validated for regulatory purposes (http://ecvam.jrc.ec.europa.eu/
ft doc/EPISKIN-SIT-SOP%2006-08-08.pdf) [22], is based on deter-
mining cell viability, and cytokine release (interleukin-1 (IL-1))
as an additional endpoint. The reconstructed skin Episkin SNC
(Lyon, France) inserts (0.38 cm2 ) were transferred into 12 wells
plates containing 2 mL of maintenance medium and incubated at
37 C (5% CO2 , >95% humidity). After 24 h, the second column of
each plate was lled with maintenance medium preheated at 37 C.
Ten L of the product to be tested were dissolved at 1% in distilled
water and contacted during 15 min with the epidermis samples,
with a negative control (PBS) or with a positive control (5% SDS solu-
tion in distilled water). The epidermis samples were further washed
with sterile PBS and then incubated during 42 h in the maintenance
medium, which was then collected in Eppendorfs and frozen at
20 C for further determination of IL1-, with the Diaclone in vitro
test (maximum sensitivity of 31.2 pg/mL).
Cell viability was determined with MTT assay. Tissues were
transferred to wells containing 2 mL of a 0.3 mg/mL MTT ((3-[4,5-
dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) solution
and incubated for 3 h (37 C, 5% CO2 , 95% humidied atmosphere).
After incubation, the epidermis tissues were contacted with acidic
isopropanol (0.5 mL/tube) to extract the intracellular formazan.
The tubes were incubated for 4 h in dark with periodic vortexing,
97
Permeate P1
Permeate P2
10 kDa
Retentate R2
Permeate P1
R1 Permeate P2
diluted 10 kDa
Feed tank Retentate R2
centrifuged and a duplicate of 200 L were transferred to a 96-
well at bottom microtitre plate. Absorbance was read at 550 nm
with acidied isopropanol as blank and viability was calculated
considering 100% for the negative control.
2.6.1. Statistical analysis
Statistical signicance was determined by the Dunnets t test
and one-way analysis of variance (ANOVA) using the Excel soft-
ware. Statistical signicance was considered p < 0.05.
3. Results and discussion
The aqueous extracts from C. sativa leaves (CsL) were processed
through the 5 kDa membrane to remove the low molecular weight
compounds (nitrogen, mineral elements and soluble sugars). The
retentate (R1 ) was fractionated through higher molecular weight
membranes obtaining two streams with different compositions and
properties (Conguration I, Fig. 1). Deeslie and Cheryan [23] and
Moure et al. [24] used an increasing cut-off membrane sequence to
fractionate a soy protein efuent. The sequence shown in Cong-
uration I was adequate to fractionate CsL extracts (CsLE) since the
phenolic compounds presents in CsL include benzoic and cinnamic
acids, avonoids, and ellagic acid and gallic acid structures [4,5,7].
Chestnut leaves ethanolic extracts present a high content of ellag-
itannins, less amounts of gallotannins and even less of avonoids
[5]. High phenolic polymers and tannins are concentrated in water
fractions and the ratio of tannins/other phenolic compounds is
determinant in the radical scavenging capacity [2].
Fig. 2 shows the variation in the permeate ux with time for
PES at membranes. All the experiments (Conguration I and II)
were carried out at room temperature and TMP of 2 bar. The per-
meate ux decreased gradually in the 5 kDa membrane (Fig. 2a)
and with a more pronounced pattern in the 10 kDa (Fig. 2b). In
the 5 kDa membrane a VRF of 3 was reached. To overcome the
difculties associated to ultraltration in the 10 kDa membrane
(Fig. 2b) with a irregular permeate ux pattern possibly due to the
deposition of solutes on the membrane surface, batch dilution of
the retentate (R1 ) was proposed (Conguration II, Fig. 1). The time
dependence of J in this case is presented in Fig. 2c and d. Although
the operation could proceed for longer time than in the rst case
98 B. Daz-Reinoso et al. / Chemical Engineering Journal 175 (2011) 95102

Fig. 2. Time proles of the permeate ux of the aqueous extract from C. sativa leaves (CsL) determined with the 5 kDa (a, c) and 10 kDa (b, d) membranes. Lines represent
the calculated values according to the fouling models from data in Table 1.

(see Fig. 2b), the 80% of ux reduction in a relatively short operation
time revealed severe fouling problems; concentration-polarization
problems should appear at more prolonged times.
The variation in the permeate ux with time during the cross-
ow ltration has been widely studied, and various mechanisms to
explain the ux decrease have been proposed: total pore blocking
model (denoted by TBM) (Eq. (2)), standard pore blocking model
(denoted by SBM) (Eq. (3)), intermediate pore blocking model
(denoted by IBM) (Eq. (4)) and cake layer formation model (denoted
CFM) (Eq. (5)).
J = J0 eKt t (2)
 2
1 els, as reported in other membrane studies [29,30]. Experimental
J = J0 1 + Ks (AJ0 )0.5 t (3)
2 data from modied PES membranes of 5 and 10 kDa cut-off were
J = J0 (1 + Ki AJ0 t)1 (4)
1/2
J = J0 (1 + 2Kc (AJ0 )2 t) (5)
These fouling mechanism are widely used to predict the vari-
ation in permeate ux with the crossow ltration time [2528].
The permeate ux (J, L h1 m2 ) was tted to different models, cor-
relating the initial permeate ux (J0 ), the operation time (t, h) and
the membrane area (A, m2 ) with the respective K constants. In this
particular case, the transmembrane pressure was constant during
the ltration and these models can be lead to:
ln(J 1 ) = ln(J0 ) + Kt t (6)
J 0.5
= J00.5 + Ks t (7)
J 1 = J01 + Ki t (8)
J 2 = J02 + Kc t (9)
Plotting these functions (Eqs. (69)) the mass transport coef-
cients (K) were calculated from the slope of regression curves
permeate ux (J) versus time (t).
Table 1 summarizes the data tting to common fouling mod-
tted using the proposed models (Fig. 2). The best agreement with
experimental data was provided by the cake layer formation model
(CFM) to the 5 kDa membrane and by the standard pore blocking
model (SBM) to the 10 kDa membrane when the Conguration II
was assayed.
According to the permeate ux prole (Fig. 2ad), the best
prediction of ltration ux were achieved with the cake layer for-
mation model for the 5 kDa membrane (Fig. 2a and c) and with the
standard pore blocking model for the 10 kDa membrane (Fig. 2d)
but the data tting showed in Table 1 did no lead to any conclusive
 B. Daz-Reinoso et al. / Chemical Engineering Journal 175 (2011) 95102 99

Table 1
Fitting of permeate ux data to four fouling models.

Model Kt (h1 )Ks,i (L1 )Kc (h L2 ) R2 Fmodel

Conguration I
Total pore blocking (TBM) 0.154 0.965 611
Standard pore blocking (SBM) 0.217 0.968 667
5 kDa
Intermediate pore blocking (IBM) 0.303 0.967 654
Cake layer formation (CFM) 0.630 0.956 407
Total pore blocking (TBM) 1.95 0.954 149
Standard pore blocking (SBM) 1.41 0.940 112
10 kDa
Intermediate pore blocking (IBM) 1.08 0.924 86
Cake layer formation (CFM) 0.604 0.886 55

Conguration II
Total pore blocking (TBM) 0.209 0.954 463
Standard pore blocking (SBM) 0.301 0.969 697
5 kDa
Intermediate pore blocking (IBM) 0.435 0.978 983
Cake layer formation (CFM) 0.929 0.978 973
Total pore blocking (TBM) 3.57 0.987 1518
Standard pore blocking (SBM) 2.16 0.997 6894
10 kDa
Intermediate pore blocking (IBM) 1.47 0.982 1127
Cake layer formation (CFM) 0.689 0.894 171

Kt (h1 ) for total pore blocking; Ks (L1 ) for standard pore blocking.
Ki (L1 ) for intermediate pore blocking; Kc (h L2 ) for cake layer formation.

results. However, these results together with those of Fig. 2 could 3.1. Rejection of total phenolics and protein
suggest that intermediate pore blocking and cake layer formation
are those leading to better correlation with the experimental data The solute rejection (Rj ) of total phenolics and protein were cal-
since it gives the highest values for F and R2 for the 5 kDa membrane. culated for experiments performed at the TMP previously selected
Since both fouling models give a similar ux decay and both mod- to achieve VRF in the range 2.26.25.
els adjust experimental data it could be assumed that the fouling During the ultraltration, the retentate decreases from a volume
phenomenon is not very pronounced under the working conditions (VR ) to other volume (VR dVR ) owing to the production of a volume
tested. of permeate dVP , considering that concentrations in both phases are
When the ltration was performed according to Conguration II, CP and CR , a mass balance could be lead to:
the dialtration process carried out on the 10 kDa membrane could
CP dVR = d(VR CR ) (11)
suggest that the standard pore blocking model was the more appro-
priate. The main differences between both congurations are the CP
Rejection(Rj ) = 1 (12)
higher feed concentration in the Conguration I, which results in a CR
minor initial ux (Fig. 2b) but a less marked ux decrease according Cp can be expressed as a function of CR using Eq. (12) and sub-
to the constants values (Kt and Ks ) shown in Table 1. stituting in Eq. (11),
To determine which fouling mechanism could explain the ux
decrease, a new consideration was done according Hermia model Rj CR dVR = VR dCR (13)
principles [27,28]. The four models above mentioned are based
If it assumed that Rj is independent from the retentate concen-
on constant pressure ltration laws and thus the type of fouling
tration, the above equation could be expressed as:
depends on the value of parameter n in Eq. (10) C  V 
R 0
ln = Rj ln (14)
C0 VR
d2 t
 dt n
=k (10)
dV 2 dV

Usually Hermias models were developed through the ltration

curves of dt/dV versus V during crossow ltration, however a sim-
ilar analysis was adapted by Vicent Vela et al. [27] to crossow
ultraltration and the ltration curves of log(dJ/dt) versus log(J)
were used to understand the mechanisms of fouling. Typical curves
found in this work are shown in Fig. 3. For the experimental data
obtained from Conguration II, an estimation of parameter n in Eq.
(10) was possible, while for data from Conguration I the n parame-
ter estimation was not possible. The experimental data from 10 and
5 kDa membranes in Conguration II were tted and the n value
could be calculated as the slope of the linearized equation. Accord-
ing to Hermias model the 10 kDa permeate ux curve corresponds
to standard pore blocking model (SBM) and the calculated n value
was 1.6. The value of n calculated for the 5 KDa membrane was 1.3;
this value involves a fouling mechanism between standard pore
blocking (SBM) and intermediate pore blocking (IBM). Both meth-
ods provided similar values for the fouling mechanisms occurring Fig. 3. Filtration curve log(dJ/dt) versus log(J) for the 5 and 10 kDa membrane in
operating with Conguration II. the Congurations I and II.
100 B. Daz-Reinoso et al. / Chemical Engineering Journal 175 (2011) 95102

Fig. 4. Rejection for total phenolics (a) and soluble protein (b) in the Congurations I and II.

where C0 and V0 are the concentration and volume of the feed
stream. As the term V0 /VR is usually referred as the volume con-
centration ratio (denoted VRF).
When Eq. (14) is plotted the slope of the line is the average
rejection of the component j (Rj ).
Fig. 4 shows the linearization of total phenolics (a) and soluble
protein (b) for the 5 and 10 kDa membranes operating in the Cong-
urations I and II. The values obtained by regression, the regression
coefcients and the rejection value calculated using Eq. (12) from
nal concentrate and permeante streams are shown in Table 2.
Since both the 5 and 10 kDa membranes showed no preferential
rejection of protein over phenolic compounds, both components
were found in the nal retentate product. Signicantly higher val-
ues were obtained when the retentate from the 5 kDa membrane
was processed without dilution (Conguration I). This behavior was
also correlated with the calculated values of rejection from solute
concentrations in the nal permeate and concentrate streams. The
rejection coefcients found from 5 kDa membrane for phenolic
compound are higher that those found for phenolic compounds
from distilled grape pomace pressing liquors using nanoltration
membranes [31], (whereas the values found for the 10 kDa mem-
brane in both congurations were similar. At the same TMP (2 bar),
commercial UF spiral membranes showed similar rejection values
from phenolic compounds present in aqueous extracts of distilled
white grape pomace than those found from 5 kDa membrane [32].
While NF membranes which had lower retention values were simi-
lar to nd from 10 kDa UF membrane [32]. These different behaviors
on the rejection of the phenolic compound could be ascribed to
the different membrane material (PES, PTFE, regenerated cellulose,
PVDF), the type of membrane conguration (at, spiral, hollow
ber.) and their interaction with the membrane surface as it is tried
to show below.
3.2. Characterization of retentates
The chemical composition of the permeates and the retentates
produced in the 5 and 10 kDa membranes is summarized in Table 3.
As a general and expected trend, the soluble protein is concentrated
in the retentates, whereas the non proteic nitrogen is not selec-
tively retained in the membranes and is found both in permeates
and retentates. The retentate was concentrated to a product with
40% phenolics and with an ABTS radical scavenging capacity equiv-
alent to Trolox in weight basis. Despite solids were concentrated by
1.75.3 times and protein by twice, the total phenolics were only
concentrated by 1.2. The selective concentration of some avonoids
(rutin, quercetin, apigenin) in the retentate was observed, whereas
some simple phenolics (vanillic acid) were preferentially found in
permeates and others were not separated (gallic acid). To conrm
that the phenolic compounds could be adsorbed in the membrane
surface, the mass of solute adsorbed on the membrane surface and
pores, Mads , and the adsorption percentage, AP, dened in Eqs. (15)
and (16), respectively, were calculated and shown in Table 4. A
signicant amount of compounds became adsorbed
(C0 V0 ) [(CP VP ) + (CR VR )]
Mads = (15)
A
(C0 V0 ) [(CP VP ) + (CR VR )]
AP = 100 (16)
C0 V0
where V0 , VP and VR are the feed, permeate and retentate volumes.
Soluble small proteins and peptides from vegetal and animal
origin show antioxidant activity as radical scavengers, reducing
agents, protection against lipid oxidation in model systems and in
foods [33]. The selective removal of proteins could not be feasible
with these membranes and an ethanol precipitation step was incor-
porated. When absolute ethanol was added at 4 volume ratio, both

Table 2
Rejection for total phenolics and soluble protein in the 5 and 10 kDa membranes operating in the Congurations I and II.

Total phenolics Soluble protein

Rjexp Rjcalc R2 Rjexp Rjcalc R2

Conguration I
5 kDa 0.921 0.876 0.987 0.965 0.985 0.979
10 kDa 0.825 0.792 0.962 0.806 0.852 0.887

Conguration II
5 kDa 0.910 0.800 0.992 0.939 0.959 0.978
10 kDa 0.650 0.521 0.915 0.741 0.635 0.989
 B. Daz-Reinoso et al. / Chemical Engineering Journal 175 (2011) 95102 101

Table 3
Composition of the feed (aqueous extract of C. sativa leaves), permeate and retentate streams in the two congurations evaluated, operating at room temperature, TMP
2.0 0.05 bar. VRF = 2.3 (5 kDa); 3 (10 kDa Conguration I); 6.25 (10 kDa Conguration II).

Stream Total solids (g/L) Composition of freeze dried solid (%) Antioxidant properties
c d e
Nitrogen Protein Total phenolics Radical scavenging Reducing ability

ABTS DPPH EC50 FRAP Reducing power

(g Trolox/g FDP) (g FDP/L) (mmol AA/g FDP) (mol ferric sulfate/g FDP)

Feed 5.40 0.71 4.58 33.8 0.75 0.33 1.24 3.59

P1 (5 kDa) 1.20 1.08 1.16 16.1 0.25 1.00 0.73 2.10
R1 (5 kDa) 7.95 0.74 7.47 36.9 0.97 0.30 1.35 3.86

Conguration I
P2 1.20 0.82 3.07 14.4 0.23 0.19 0.57
R2 28.9 0.70 10.30 40.1 1.00 0.29 1.29 3.69
a
R2S 46.0 1.14 0.26 1.69
b
R2P 19.7

Conguration II
P2 2.15 0.74 8.90 35.5 0.85 0.34 1.16 3.33
R2 9.00 0.78 8.71 39.5 0.96 0.32 1.12 3.21
a
R2 S 45.7 1.03 0.42 1.74
b
R2 P 5.33 0.78 14.8

FDP: Freeze dried product; AA: Ascorbic acid.

a
R2S , R2 S = Supernatant resulting after ethanol addition to R2 or to R2 .
b
R2P , R2 P = Precipitate resulting after ethanol addition to R2 or to R2 .
c
Nitrogen was determined in an elemental analyzer.
d
Protein was determined as soluble protein by the Bradford method.
e
Total phenolics were determined as gallic acid equivalents (GAE).

Table 4
Values of the amount of solute adsorbed per unit area (Mads ) and adsorption percentage (AP).

Total phenolics Soluble protein

Mads (g/m2 ) AP (%) Mads (g/m2 ) AP (%)

Conguration I
5 kDa 6.35 10.0 0.77 6.33
10 kDa 7.03 21.2 1.20 20.9

Conguration II
5 kDa 12.4 17.7 1.12 9.62
10 kDa 6.40 14.4 0.54 5.15

the purity and activity of the nal products were increased by about at the concentrations tested indicated that CsLE could be safe for
15%. The ethanol-precipitated fraction from the retentate was not topical use.
active as antioxidant, since increased phenolic concentration, rad-
ical scavenging activity and reducing power were observed in the
4. Conclusions
supernatant.
The concentrated product of CsLE in the retentate showed
An environmentally friendly process consisting on the aqueous
an ABTS radical scavenging capacity equivalent to that of Trolox
extraction coupled to UF membranes proved to be suited for the
and a DPPH radical scavenging capacity slightly lower than BHA
concentration and selective recovery of antioxidants from C. sativa
(EC50 = 0.245 g/L). An ethanol:water extract from C. sativa leaf
leaves. A combination of two membranes of 5 and 10 kDa was pro-
extract presented good tolerance to in vivo skin irritation tests
posed to produce a retentate with 40% of active compounds in the
and potential for topical application in the prevention and treat-
rententate. The use of membranes increased the phenolic content
ment of oxidative stress-mediated diseases and photoageing [6].
by 18%, whereas the application of an additional precipitation with
The aqueous extracts produced and concentrated with membrane
ethanol resulted in an increase of 36%. Additional experiments of l-
technology were expected to be comparable in this respect. The safe
tration through membranes of different materials are ongoing with
topical use of the nal concentrated aqueous extract from C. sativa
the aim of improving the purity of the nal product. The retentate
leaves was tested on reconstituted human epidermis. The Episkin
product obtained the 10 kDa membrane, showed in vitro antioxi-
model mimic morphologically and biochemically living skin and is
dant properties comparable to those of Trolox and BHA and is safe
useful to classify skin irritants able to produce a decrease in cell
for topical use.
viability, evaluated by a MTT assay, and an increased release of
the pro-inammatory mediator interleukin IL-1, evaluated by an
ELISA assay after acute exposure. The epidermis viability, measured Acknowledgements
as optical density at 570 nm by the MTT assay and calculated as
percentage of cytotoxicity compared to the negative control (PBS), Authors gratefully acknowledge the nancial support of
was 83.74% 22.38, whereas in the positive control (SDS) it was AGL2006-05387, which had partial nancial support from the
26.28% 17.83. A product is considered an irritant when viabil- FEDER funds of the European Union. Beatriz Daz Reinoso thanks the
ity is reduced by 50%. The IL-1 content, expressed as pg/mL, was Spanish MEC for her grant (BES-2005-7525). Andrs Moure thanks
12.1 1.9 in PBS, 503.7 72.1 in SDS, and 16.2 5.7 for C. sativa the Xunta de Galicia for his research contract (Isidro Parga Pondal
leaves extracts in the R2 product. The absence of skin-irritant effects Program).
102 B. Daz-Reinoso et al. / Chemical Engineering Journal 175 (2011) 95102
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 PUBLICACIN V

Extraction of antioxidants from several berries pressing wastes

using conventional and supercritical solvents.
Liza E. Laroze, Beatriz Daz-Reinoso, Andrs Moure,
Mara Elvira Ziga, Herminia Domnguez.
European Food and Research Technology 231 (2010) 669-677.
NDICE DE IMPACTO: 1,585
 Resultados

Resumen

Los residuos slidos generados durante la produccin de zumo de frutas pueden resultar
interesantes como fuentes alternativas de compuestos bioactivos La utilizacin de residuos
implica un acercamiento sostenible a la utilizacin integral de las materias primas,
minimizando los problemas ambientales causados por su disposicin y aumentando el
beneficio global del proceso.

Los frutos del bosque son una fuente importante de compuestos fenlicos (cidos fenlicos,
flavonoides y taninos) y sus efectos beneficiosos sobre la salud debidos a su actividad
antioxidante han sido ampliamente estudiados (Scalzo y Mezzetti, 2010). El residuo slido
resultante del prensado de las frutas para la obtencin de zumos, compuesto principalmente
de la piel, la pulpa y las semillas, an contienen cantidades importantes de compuestos
fenlicos por lo que puede ser utilizado como materia prima para la obtencin de compuestos
antioxidantes naturales (Vattem y col., 2005; Zhou y col., 2009). La recuperacin de
compuestos fenlicos a partir de residuos de frutos del bosque se ha llevado a cabo utilizando
tanto tecnologas convencionales como alternativas. En los ltimos aos se est prestando
especial inters en la utilizacin de disolventes respetuosos con el medio ambiente que
permitan la extraccin de compuestos bioactivos a partir de materias primas de origen vegetal.
El dixido de carbono supercrtico es un disolvente no txico y barato adecuado para la
extraccin de compuestos apolares que, combinado con pequeas cantidades de un
modificador polar, permite la extraccin de compuestos fenlicos.

En el presente trabajo se llev a cabo la extraccin con dixido de carbono supercrtico de los
residuos de frambuesa y arndanos rojo y azul. Se evalu el efecto de la presin, temperatura
y presencia de modificador en los rendimientos de extraccin total y de compuestos fenlicos,
as como su actividad antioxidante frente a los radicales DFPH y ABTS. Estos resultados se
compararon con los obtenidos mediante extraccin convencional con metanol. Los
compuestos mayoritarios presentes en los extractos metanlicos se analizaron mediante CG-
MS.

163
Eur Food Res Technol (2010) 231:669677
DOI 10.1007/s00217-010-1320-9
ORIGINAL PAPER
Extraction of antioxidants from several berries pressing wastes
using conventional and supercritical solvents
Liza E. Laroze Beatriz Daz-Reinoso
Andres Moure Mara Elvira Zuniga
Herminia Domnguez
Received: 30 April 2010 / Revised: 16 June 2010 / Accepted: 23 June 2010 / Published online: 7 July 2010
 Springer-Verlag 2010
Abstract The solid waste generated in industrial berry
juice production was considered as a low cost raw material
for the extraction of natural antioxidants. Berries contain
phenolic compounds with high antioxidant potential,
including anthocyanins, proanthocyanidins, flavonols, cat-
echins, benzoic and cinnamic acids. The solid residues
generated from blueberry, cranberry and raspberry after
pressing were extracted by conventional solvent extraction
or by supercritical CO2 (SCCO2) extraction. The effect of
particle size and extraction time on the extraction yield,
phenolic yield and phenolic content of the extracts pro-
duced by conventional solvents was assessed. Supercritical
CO2 extraction was performed during 2 h operating in the
range 80300 bar at 60 C using 2.5 L CO2/h. Maximum
solubles yield of 5.20% were extracted from raspberry
wastes at 200 bar, 3.89% from cranberry wastes at 250 bar
and 1.4% from blueberry wastes at 200 bar. The highest
phenolic content of the extracts was observed for blueberry
pomace in the trap, with 9 grams of gallic acid equivalents
per 100 g of extract. The ABTS (2, 20 -azino-bis-[3-ethyl-
benzotiazol-6-sulfonic acid]) and DPPH (a,a-diphenyl-b-
picrylhydrazyl) radical scavenging capacity of the SCCO2
extracts was moderate in comparison with the activity of
conventional solvent extracts.
L. E. Laroze  M. E. Zuniga
Escuela de Ingeniera Bioqumica, Facultad de Ingeniera,
Pontificia Universidad Catolica de Valparaso, Av. Brasil 2157,
Valparaso, Chile
B. Daz-Reinoso  A. Moure (&)  H. Domnguez
Departamento de Enxenera Qumica, Universidade de Vigo,
As Lagoas, 32004 Ourense, Spain
e-mail: amoure@uvigo.es
Keywords Blueberry  Cranberry  Raspberry 
Pomace  Antioxidants  SCCO2 extraction
Introduction
The solid waste streams generated during fruit juice pro-
duction can be alternative and attractive sources of valu-
able bioactive compounds due to their low cost and
biorenewable nature. The utilization of wastes represents a
sustainable approach to the integral benefit of raw materials
minimizing the environmental problems caused by their
disposal.
Berries contain high levels of phytochemicals with
phenolic structure (phenolic acids, flavonoids, hydrolyz-
able and condensed tannins) that can act as antioxidants
and have health-promoting activities [9, 12, 22]. The solid
pressing wastes originated during separation of peels, seeds
and pulp from the fruit juice are an abundant source of
flavonoids, colors and pectins. Berries are rich sources of
anthocyanins, which impart the dark red or blue color to
the fruit, and are powerful antioxidants [17, 23].
The phenolic content and composition greatly differs
with the type of berry, and the extraction yield is greatly
affected by the solvent [11]. The recovery of compounds
from the solid residue after berry processing into juice or
wine has been reported using both conventional and
alternative technologies, such as ultrasound assisted alco-
holic extraction [24], supercritical fluid extraction [21].
The use of supercritical fluid extraction with carbon
dioxide (SCCO2) as a solvent [1, 10] has increasing
interest for the recovery of unaltered healthy compounds
suited for application in the food and pharmaceutical
industries. Carbon dioxide is an ideal solvent for the
extraction of natural products because it is non-toxic, non-
123
670
explosive, readily available and easy to remove from
extracted products. In addition, SCCO2 is an environ-
mentally friendly solvent-free extraction method with low
oxidative and thermal impact offering the possibility of
recovering intact natural compounds with minimal alter-
ation of the active ingredients and preservation of the
curative properties [15, 18]. A disadvantage of supercritical
carbon dioxide is that often polar compounds are difficult
to extract. This difficulty could be easily solved by using
small amounts of organic modifiers.
The present study was aimed at evaluating the effect of
extraction pressure, temperature and the presence of etha-
nol as co-solvent on the extraction and recovery of anti-
oxidant compounds remaining in the pressing pomace of
raspberry, blueberry and cranberry.
Materials and methods
Pressing pomace from fruit berries
Fruit pomaces of cranberry, blueberry and raspberry, sup-
plied by Bayas del Sur (Chile), were dehydrated and mil-
led. The ground material was passed through a sieve with
higher meshes of 1 mm and smaller meshes of 0.15 mm.
Two fractions were separated, S1 was the ground material
that remains on the higher mesh and S2 was the ground
material that remains on the smaller mesh. Afterward, both
fractions were vacuum-packed in plastic bags, transported
and kept at 4 C before use.
Conventional solvent extraction
The pressing pomaces from berries were ground in a coffee
grinder, and two different particle sizes were selected to
evaluate its effect on the yield extraction.
The samples were contacted with methanol at a solid to
liquid ratio of 1:20 in closed Erlenmeyer flasks kept in an
orbital shaker at 120 rpm, 40 C for 124 h. Solid/liquid
separation of the suspension was accomplished by vacuum
filtration, and the solvent was vacuum evaporated to obtain
a crude extract, which was dissolved in water and subse-
quently freeze-dried.
Extraction kinetics modelling
The data corresponding to the overall amount of total
solubles and polyphenolic compounds extracted from the
vegetal matrix at the different operation times were fitted to
the equation of Othmer and Jaatinen [16].
C = mt-b, being C the quantity of extracted solute on
solution, (g/L), t the extraction time, (min) and m and b the
fitting parameters. This equation was commonly employed
123
Eur Food Res Technol (2010) 231:669677
to model the kinetic extraction data in other vegetal
matrixes, providing important clues regarding facility of
extraction in such matters.
Supercritical CO2 extraction
The automated and computerized laboratory-pilot extrac-
tion plant (SFF model, Iberfluid, Spain) used in this work
was equipped with a 285-mL stainless steel extractor with a
20-mm porous plate and a 75-mL separator vessel (Fig. 1).
The extraction pressure was controlled by micrometering
valves, and the carbon dioxide used was Premier-X50S
from Carburos Metalicos S. A. (Ourense, Spain).
The extraction cell was filled with 10 g of the pressing
berries pomace. Extractions were carried out at 60 C, in
the pressure range of 80300 bar. Ethanol was used as
modifier and introduced in the inlet stream. Once the
selected conditions were achieved in the extractor,
dynamic extraction experiments were carried out. The
extracts were fractionated in a separator operating under
selected pressure and temperature conditions and in an
atmospheric trap operating under ambient conditions. The
operational conditions on the separator were 30 C, and the
pressure was fixed at 60% of the extraction pressure.
Analytical methods
Solvent and SCCO2 extracts were analyzed for total solids
(solid yield, SY), determined gravimetrically, total phen-
olics measured by Folin Ciocalteu [19], and antioxidant
activity. The amount of phenolic solubilized (denoted as
phenolic yield, PY) was defined in terms of the relative
7
PIC TI PIC
4
TI
TIC
TIC 6
2 5
TIC
3
1
1. CO 2 pump 5. Separator
2. Co-solvent pump 6. Separator
3. Preheater 7. Valve
4. Extraction vessel
Fig. 1 Supercritical CO2 extraction plant
Eur Food Res Technol (2010) 231:669677
amount of phenolics released to the solvent, expressed as g
gallic acid equivalents (GAE)/100 g raw material. The
phenolic content in extracts (PC) was measured by the
proportion of phenolics in the extracts and is expressed in
terms of weight percent.
Determination of the antioxidant activity
a,a-Diphenyl-b-picrylhydrazyl radical scavenging
Two mL of a 610-5 M methanolic solution of a,a-diphe-
nyl-b-picrylhydrazyl (DPPH) was added to 50 lL of a
methanolic solution of the antioxidant, and the decrease in
absorbance at 515 nm after 16 min was recorded in an
Agilent 8453E UVVisible spectrophotometer. The inhi-
bition percentage (IP) of the DPPH radical was calculated
as the percent of absorbance reduction after 16 min with
respect to the initial value, and finally the DPPH values
were calculated as the amount of free radical that was
stabilized by 1 g of phenolic compound determined by
Folin Ciocalteu method. EC50 was calculated as the con-
centration of phenolic compounds required to quench 50%
of the initial DPPH radical.
Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC)
This assay is based on the scavenging of ABTS radical
(2,20 -azinobis (3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonate)). ABTS
radical cation (ABTS?) was produced by reacting 7 mM
ABTS stock solution with 2.45 mM potassium persulfate
(final concentration) and allowing the mixture to stand in the
dark at room temperature for 1216 h before use. Next,
ABTS? solution was diluted with PBS (phosphate buffer
saline) (pH 7.4) to an absorbance of 0.70 at 734 nm and
equilibrated at 30 C. After addition of 1.0 mL of diluted
ABTS? solution to 10 lL of antioxidant compounds or
Trolox standards in ethanol or in PBS, the absorbance
reading was taken 6 min after initial mixing. Appropriate
solvent blanks were run in each assay. The percentage
inhibition of absorbance at 734 nm was calculated as a
function of the concentration of extracts and Trolox.
FRAP
Ferric reducing antioxidant power assay is based on the
ability of a compound to act as reductor, and the reducing
power offers information on the ability to reduce Fe3?. The
reactive solution was freshly prepared with 25 mL of
300 mmol/L acetate buffer (pH 3.6), 2.5 mL of a 10 mmol/
L 2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ) solution in 40 mmol/L
HCl and 20 mmol/L FeCl36 H2O in distilled water. An
aqueous solution of known Fe(II) concentration was used
for calibration. Samples (100 lL) were mixed with 3 mL
671
of the FRAP reagent, and the absorbance was monitored at
593 nm at 0 min after vortexing and after 4 min. Aqueous
solutions of ascorbic acid were used for calibration.
All tests and analyses were run in triplicate, and the
average values are presented.
GCMS analysis
GCMS analysis was carried out in splitless mode in a
Hewlett-Packard 5890-II gas chromatograph coupled to a
mass spectrometer HP-5970 using He as carrier gas. Sepa-
ration was performed using a 60 m 9 0.25 mm 9 0.25 lm
film thickness HP-Innowax capillary column. Temperature
was maintained at 45 C for 1 min, increased to 230 C at
3 C/min, and then held for 30 min. Mass spectrometer was
in EI mode (electron energy 70 eV; source temperature
250 C), and data acquisition was made in scanning mode
from 30 to 300 amu/s and 1.9 spectra/s. Compounds were
identified by comparison of the retention time and mass
spectra with library data of mass spectra and authentic
compounds. Qualitative analysis was performed by the
internal standard method (using 3-octanol and 3,4-dimeth-
ylphenol as standards) using model compounds for
calibration.
Conditioning of samples for GCMS
About 0.25 mL of 3-octanol (10 ppm) and 3,4-dimethyl-
phenol (100 ppm) was added as internal pattern into 25 mL
of a diluted hydrolysates solution. This mixture was
extracted with dichloromethane (DCM) under the follow-
ing conditions: first, extraction with 2.5 mL of DCM for
5 min at 600 rpm, and subsequently 5 min to pour off. The
aqueous phase was again extracted with 1.25 mL of DCM
two times with the same conditions. The total organic
phase was transferred to a graduate glass tube and con-
centrated with nitrogen stream up to a final volume of
0.5 mL.
Results and discussion
Conventional solvent extraction
The Fig. 2 shows the evolutions of extracted polyphenols
and total solids obtained by solvent extraction with meth-
anol from raspberry pomace and their mathematical fittings
are plotted for the two selected particle sizes. As can be
observed, further extraction up to 9 h can improve the
extraction of the solubles from the smaller fraction (S2),
while from the larger fraction (S1), after 30 h a slight
increase was observed. However, the amount of phenolic
compounds solubilized is still increasing after 9 h from
123
672 Eur Food Res Technol (2010) 231:669677

1.6 7 Table 1 Values resulting from fitting kinetic data of soluble solids
1.4
extraction to Othmer and Jaatinen equation
6
Soluble phenols (g/L)

Soluble solids (g/L)

1.2 Berry pomace m b R2 F
5
1 Cranberry S*1 1.729 0.210 0.998 1218.9
4
0.8 S2 0.402 0.174 0.978 89.7
3
0.6 Blueberry S1 0.619 0.255 0.993 279.9
2
0.4 S2 0.950 0.223 0.964 54.3
0.2 Soluble phenols (S1) soluble phenols (S2) 1 Raspberry S1 1.80 0.146 0.999 3226.5
0
Soluble solids (S1) Soluble solids (S2)
0 S2 1.04 0.223 0.997 1153.3
0 500 1000 1500 2000
* S1; Larger particle size, 1 mm
Time (min)
S2; Smaller particle size, 0.15 mm
Fig. 2 Extraction kinetics of soluble solids and soluble phenolic
compounds obtained with methanol from raspberry pomace using two
particle sizes (larger: S1; smaller: S2) Table 2 Values resulting from fitting kinetic data of soluble phenolic
(g/L) extracted to Othmer and Jaatinen equation

both fractions. These data confirm the difficulty for certain Berry pomace m b R2 F
compounds present in raspberry pomace to be released Cranberry S*1 0.148 0.219 0.999 1817.5
from the vegetable matrix. Experimental data fitted to the S2 0.333 0.095 0.999 2883.6
proposed empirical model both for soluble solids (Table 1) Blueberry S1 0.095 0.175 0.899 17.8
and polyphenolic compounds (Table 2). The predicted
S2 0.086 0.337 0.982 107.4
behavior was also plotted as continuous lines.
Raspberry S1 0.172 0.243 0.993 546.9
The effect of extraction time and particle size in overall
S2 0.168 0.283 0.969 126.9
pomaces on soluble solids yield and phenolic yield is
shown in Fig. 3. The extraction yield varied greatly among * S1; Larger particle size, 1 mm
the studied berry pomaces (Fig. 3a). As a general trend, an S2; Smaller particle size, 0.15 mm
increase on the extraction yield by decreasing the particle
size was observed. The lower particle size facilitates the during 18-h extraction, with EC50 0.30 g/L, whereas from
access of the extracting solvent to the solutes, reducing the cranberry pomace, the EC50 was 3.73 g/L (Fig. 4a). DPPH
mass transfer limitations. On the other hand, the existence values obtained from raspberries were similar to BHA
of lower particles is probably associated with a more value at 100 ppm concentration and approximately to
intense cell wall breakage. The utilization of prolonged extracts obtained by autohydrolysis from grape pomace
operation times would facilitate the extraction of higher and chestnust burs [6]. The worst DPPH value, the radical
molecular weight phenolics, which require more time to scavenging capacity obtained from cranberry, was higher
diffuse through the solid matrix. These data are concordant than the BHT (2.7 g/L) at 100 ppm (Fig. 4a).
with the kinetic fittings obtained for raspberry pomace, see Similarly, the ABTS radical scavenging capacity and the
Table 2 and Fig. 2. These compounds can be more active FRAP assays showed higher values for raspberry after 18-h
antioxidants than low molecular weight compounds. The extraction from 150-lm particles. The ABTS values from
highest yield of extractable phenolics was attained with blueberry pomace were similar to those reported by Conde
methanolic extraction during 18 h from raspberry pomace et al. [6] from corncobs and slightly lower than extracts
with 150-lm particle size, the phenolic content in the from chestnut burs and eucalypt woods [6]. These previous
extract reached 27.0 g GAE/100 g extract. The highest extracts showed similar ABTS radical scavenging capacity
phenolic yield with blueberry pomace was attained after than the extracts obtained from raspberries (Fig. 4b).
6 h of extraction from the lower size particle (17.2 g GAE/ The major compounds found in the extracts and
100 g extract). However, the highest phenolic content responsible for their radical scavenging activity have been
(13.8 g GAE/100 g extract) observed with cranberry described in literature and include phenolic acids as caf-
pomace was found for the higher size particle after 1 h of feic, ferulic, p-coumaric, p-hydroxybenzoic, chlorogenic
extraction, suggesting that simple phenolics would be the [7, 20], flavan-3-ol and flavonol as catechin, epicatechin,
predominant compounds in this material. quercetin, myricetin [13, 20] and also anthocyanidin and
The antioxidant activity, closely dependent on the resi- procyanidins as cyanidin, delphinidin, malvidin, petunidin
due type, was in general high (Fig. 4). The highest DPPH and peonidin [7, 13, 20]. The volatile compounds present in
radical scavenging capacity was observed for raspberry the dichloromethane fraction of the methanolic extracts
extracts produced from 150-lm pomace particle size from the berries pomaces are summarized in Table 3. Data

123
Eur Food Res Technol (2010) 231:669677 673

(g extract / 100 g pomace)

9.0 a 30
b

(g GAE / 100 g extract)

8.0
25

Phenolic yield
Solid yield 7.0

6.0 20

5.0 15
4.0 Blue (S1) Blue (S2)
Blue (S1) Blue (S2)
10 Cran (S1) Cran (S2)
3.0 Cran (S1) Cran (S2)
Rasp (S1) Rasp (S2) Rasp (S1) Rasp (S2)
2.0 5
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
Time (h) Time (h)

Fig. 3 Solid yield and phenolic content of the extracts obtained by conventional extraction with methanol from berries pomaces (larger: S1;
smaller: S2)
DPPH radical scavenging

(mM TROLOX / g extract)

4.5 a 4.0 b 2.5 c Blue (S1) Blue (S2)
Cran (S2)

(mM ascorbic acid /

Cran (S1)
4.0
3.5 2.0
Rasp (S1) Rasp (S2)
3.5
Blue (S1) Blue (S2)
3.0 3.0

g extract)
(EC50, g/L)

TEAC

FRAP
2.5
Cran (S1) Cran (S2) 1.5
Rasp (S1) Rasp (S2) 2.5
2.0 Blue (S1) Blue (S2) 1.0
1.5 2.0 Cran (S1) Cran (S2)
1.0 Rasp (S1) Rasp (S2)
0.5
1.5
0.5
0.0 1.0 0.0
0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10
Time (h) Time (h) Time (h)

Fig. 4 DPPH radical scavenging activity (a), TEAC assay (b) and FRAP assay (c) of the extract obtained by conventional extraction with
methanol from blueberry, cranberry and raspberry using two particle sizes (larger: S1; smaller: S2)

presented are based on the normalized areas with respect to higher than that reported by the same ones at 65 C and
that of 3-octanol. The major constituents of methanolic 200 bar.
extracts identified were capric acid, benzoic acid and their The highest phenolic content was obtained at low pres-
derivates, vanillin and vanillic acid. Others compounds sure, 75100 bar from cranberry and blueberry and at
identified that could contribute to the antioxidant properties 150 bar from raspberry. A different phenolic distribution in
of extracts were maltol, cinnamic acid and benzaldehyde, this last pomace was observed, the higher content in phenolic
but probably the observed effect is due to a synergistic compounds being collected in the separator, which could be
action of the different compounds present. explained by the moderately lower content of compounds of
high polarity in this fruit. A negative effect of pressure was
Supercritical CO2 extraction also observed by Mantell et al. [14], using CO2 with meth-
anol/water as co-solvent for the extraction of grape marc.
The partial extraction yields in the separator, trap and the Hasbay Adil et al. [8] and Mantell et al. [14] reported that
global yield obtained during 2 h operation at 60 C with higher percent of co-solvent (up to 20 wt% methanol or
2.5 L CO2/h are shown in Fig. 5. A continuous increase ethanol) and extraction at subcritical conditions was more
in the extraction yield with the operation pressure in the efficient for phenolic extraction from some pomaces.
range assayed was observed for cranberry pomace, As a general trend, the phenolic content of the extracts
reaching 3.89% at 250 bar. The maximal extraction yield increased with the increasing extraction pressure, and
(5.8%) from raspberry was observed at 150200 bar. optimal values were obtained at values of 200 bar and
Similar values have been reported by Carvalho et al. [3] higher. The extracts from cranberry recovered in the sep-
from rosemary at 40 C and 300 bar. Barjaktarovic et al. arator showed a maximum weight percent of 4 when the
[2] reported a maximum on the extraction yield about 4% extraction was performed between 200 and 300 bar,
at 100 bar and 40 C from juniper berries. These yields whereas for the extracts collected in the trap, the optimal
were lower than those reported by Castro-Vargaset al. [4] value was between 100 and 300 bar. The purity of blue-
(1216%) from guava seeds at 60 C and 100300 bar. berry extracts collected in the separator was progressively
The higher extraction yield (1.4%) for blueberry was reduced with increasing pressures in the studied range,
slightly lower than that of the other berries assayed, and it whereas in the trap, a continuous increase in the phenolic
was comparable to that reported by Cheah et al. [5] from purity was observed, reaching up to 9 g gallic acid
Magnolia officinalis at 65 C and 300 bar and slightly equivalents per 100 g extracts. Raspberry extracts obtained

123
674 Eur Food Res Technol (2010) 231:669677

Table 3 Composition of the methanol/water extract from raspberry, cranberry and blueberry pomace, analyzed by GCMS
N t (min) Compound Relative area to 3-octanol
Raspberry Cranberry Blueberry

1 10.58 Caproaldehyde 0.26 0.21 0.78

2 12.11 Ethylbenzene 0.05 0.01 0.01
3 12.63 p-Xylene 0.24
4 13.39 Hexanal dimethyl acetal 0.03 0.04 0.20
5 13.49 2-Heptanone 0.01
6 15.42 Furan, 2-pentyl 0.02 0.03
7 16.01 Pentyl alcohol 0.04 0.22
8 16.33 3-Octanone 0.06 0.07 0.07
9 17.78 n-Caprylaldehyde 0.01 0.04
10 17.89 Cyclohexanone 0.03
11 18.88 2 -Heptanol 0.01 0.03
12 18.97 Cis-2-Penten-1-ol 0.03
13 19.11 1-Methylcyclohexanol 0.03
14 19.28 Cis-Hepten-2-enal 0.03 0.08
15 19.96 2,7-Octanedione 0.01
16 20.30 1-Hexanol 0.81
17 20.85 2-Pentanone,4 hydroxy-4 methyl, 0.08
18 21.17 2-Cyclopenten-1-one, 2 methyl 0.02
19 24.41 Amyl vinyl carbinol 0.02 0.81
20 24.49 Cis 3-Methylcyclohexanol 0.02
21 24.94 Acetic acid 0.15 0.18 0.07
22 25.27 3-Furaldehyde 0.11 0.08 0.36
23 27.11 Malonic acid dimethyl ester 0.01
24 27.16 2,4-Heptadienal 0.04 0.13
25 27.68 Benzaldehyde 0.06 0.03 0.11
26 28.20 2-Cyclopenten-1-one, 2,3-dimethyl- 0.03
27 28.44 Propanoic acid 0.03
28 29.45 3,5-Octadien-2-one, (E,E)- 0.02 0.03
29 29.68 2-Furaldehyde-5-methyl 0.05
30 30.32 Isobutyric acid 0.08 0.02
31 34.29 Butanoic acid 0.01
32 31.55 Benzoic acid, methyl ester 0.25
33 31.90 Butyrolactone 0.05 0.06
34 32.96 n-Caproic acid vinyl ester 0.16
35 34.54 2,4-trans, trans-Nonadienal 0.03
36 33.49 Butanoic acid, 2-methyl 0.04
37 34.65 g-Caprolactone 0.02 0.03 0.01
38 35.80 Maleic anhydride dimethyl 0.01 0.05
39 36.05 Valeric acid 0.05 0.10
40 36.77 2-Hexen-4-olide 0.04
41 37.62 2(5H)-Furanone, 5-ethyl- 0.03
42 38.23 Methylsalicylate 0.00
43 38.82 e-cCaprolactone 0.02
44 39.34 Valerolactone 0.06
45 39.45 1-Phenylethanol 0.01
46 39.60 Acetic acid, 2-phenylethyl ester 0.02
47 40.71 Caproic acid 0.56 0.64 1.29

123
Eur Food Res Technol (2010) 231:669677 675

Table 3 continued
N t (min) Compound Relative area to 3-octanol
Raspberry Cranberry Blueberry

48 40.49 Propanoic acid, 2-methyl-, 3-hydroxy-2,4,4 trimethylpentyl ester 0.05

49 42.10 Benzyl alcohol 0.07 0.27 0.04
50 42.94 Phenylethyl alcohol 1.97
51 43.43 Hexanoic acid, 2-ethyl- 0.01 0.01
52 43.51 Dodecane,6-phenyl 0.00
53 43.59 Enanthic acid 0.04 0.04 0.12
54 43.89 Maltol 0.32 0.01
55 44.91 e-Octolactone 0.05
56 45.29 o-Cresol 0.10
57 45.39 Phenol 0.08
58 46.12 m-Cresol 0.01 0.05 0.11
59 46.95 Declactone 0.00
60 47.68 Nonanoic acid, 9-oxo, methyl ester 0.03
61 47.93 n-Caprylic acid 0.13 0.07 0.17
62 49.44 Nonanoic acid dimethyl ester 0.03
63 49.75 Ethanol, 2 phenoxy 0.03 0.04
64 50.52 Nonanoic acid 0.04 0.13 0.22
65 50.91 6-Amyl-a-pyrone 0.01 0.02 1.88
66 51.25 2-Octenoic acid 0.01 0.05
67 51.33 Octanoic acid, 8-hydroxy, methyl ester 0.01 0.06
68 52.16 Amylvalerolactone 0.17
69 53.03 Xylenol 9.41 8.93 9.84
70 53.98 Pterin-6-carboxylic acid 0.00
71 54.51 Decanoic acid 0.03 0.10
72 56.70 2(4H)Benzofuranone,5,6,7,7a-tetrahydro-4,4,7a-trimethyl-R- 0.06 0.17 0.11
73 56.73 Diethylpthalate 0.08
74 59.28 Benzoic acid 6.03
75 61.65 Phthalic acid, diisobutyl ester 0.09
76 62.43 Vainillin 0.34 0.30
77 63.52 Vainillic acid, methyl ester 0.08
78 63.70 4-Hydroxy-a-ionone 0.12
79 72.40 Nonanedioic acid, monomethyl ester 0.20
80 74.31 Cinnamic acid 0.06
81 75.29 Hexadecanoic acid 0.03
82 77.23 Gallaldehyde 3,5 dimethyl ether 0.14 0.54
83 78.68 Benzoic acid, 4 hydroxy-3,5 dimethoxy- 0.51

at pressures of 150 bar and higher and collected in the
separator contained 1% phenolics, and in the second sep-
arator, 1.5% regardless of the extraction temperature.
Table 4 summarizes the antioxidant activity of the dif-
ferent extracts on the free radical scavenging activities,
evaluated in a first approach as the ability to scavenge two
widely used free radicals: DPPH radical and ABTS radical.
The SCCO2 extracts from the berry pomaces showed a more
moderate potency against the DPPH radical than against the
ABTS radical. A DPPH radical scavenging capacity around
10% was obtained at 150 bar for the extracts collected in the
separator vessel and at 100, 200 bar in the trap. For these two
extracts obtained at room pressure, the higher DPPH scav-
enging activities were coincident with the higher phenolic
content. The extract obtained from raspberry at 300 bar and
recovered in the separator vessel was the most efficient DPPH
radical scavenger product (16% inhibition). Despite this
extract had a low SY and PY (Fig. 5b), the ratio between the
phenolic content and the extract solubilized indicated that the
compounds in this extract were the most active.

123
676 Eur Food Res Technol (2010) 231:669677

a 1.6 b 4.5 c 7.0

Separator Separator Trap Total yield
4.0

Raspberry pomace)
Blueberry pomace) 1.4 Trap 6.0

Cranberry pomace)

(g extract / 100 g
(g extract / 100 g

Total yield 3.5

(g extract / 100 g
1.2 5.0
3.0
1.0
2.5 4.0

SY

SY
SY

0.8 Separator
2.0 3.0
0.6 Trap
1.5
0.4
Total yield 2.0
1.0
0.2 0.5 1.0
0.0 0.0 0.0
75 125 175 225 275 325 75 125 175 225 275 325 75 125 175 225 275 325
Extraction pressure (bar) Extraction pressure (bar) Extraction pressure (bar)

70 100 200
Separator Separator Trap Separator
Trap 90 180 Trap

Cranberry pomace)

Raspberry pomace)
Blueberry pomace)

60
(mg GAE / 100 g

(mg GAE / 100 g

(mg GAE / 100 g

80 160
50 70 140
40 60 120

PY
PY

PY
50 100
30 40 80
20 30 60
20 40
10 10 20
0 0 0
75 125 175 225 275 325 75 125 175 225 275 325 75 125 175 225 275 325
Extraction pressure (bar) Extraction pressure (bar) Extraction pressure (bar)

Fig. 5 Solid yield (SY, global and in each separator) and phenolic yield (PY, expressed as gallic acid equivalents) obtained from blueberry (a),
cranberry (b) and raspberry (c) pomace using the smaller particle size

Table 4 Radical scavenging capacity of DPPH (expressed as lg antioxidant activity from the pomaces of blueberry, cran-
DPPH scavenged per g GAE) and ABTS (expressed as Trolox berry and raspberry pressing wastes. In the selected oper-
equivalents per g) of SCCO2 extracts from cranberry, blueberry and ation conditions, moderate extraction yields and purity
raspberry pomace values were attained. Maximum yields of 5.20% solubles
Pressure Cranberry Blueberry Raspberry were obtained from raspberry wastes operating at 200 bar,
Sep Trap Sep Trap Sep Trap
whereas from blueberry only 1.4% was obtained. However,
extraction was more selective from blueberry, since the
Phenolics extraction yields, PEY (mg GAE/100 g pomace) extracts collected in the second separator contained 9 g of
80 17.3 39.5 9.46 29.5 4.59 76.8 gallic acid equivalents per 100 g extracts. The extracts
100 10.6 42.6 9.73 22.8 19.0 42.4 were more active against the ABTS than against the DPPH
150 6.60 40.6 4.72 26.9 27.0 52.7 radical, the most potent being blueberry and raspberry,
200 11.1 67.3 2.80 12.1 6.70 59.5 respectively. Phenolic acids, flavonols, anthocyanins and
250 10.2 84.0 1.40 16.3 2.70 64.6 procyanidins were identified in the extracts and could be
300 8.39 35.0 18.0 9.81 15.3 46.8 responsible for the observed activity.
DPPH radical scavenging capacity (lg DPPH scavenged/g GAE)
80 70.2 53.9 75.0 41.3 81.5 23.8 Acknowledgments The authors are grateful to MCYT-FEDER
(Research Project AGL2003-03596), Xunta Galicia (Research Project
100 20.7 68.6 51.9 72.6 40.3 43.4 PGIDT, 04PXI38301PN) and CONICYT (Research Proyects
150 74.8 41.1 25.3 62.1 59.3 54.9 FONDECYT N 1070258 and FONDEF D07I1045) for the financial
200 27.6 47.4 43.3 69.3 40.0 55.8 support of this work. A. M. thanks the Isidro Parga Pondal Program of
Xunta Galicia, B. D. R thanks the Spanish MEC (Grant BES-2005-
250 109.9 50.4 81.5 71.4 63.7 25.7
7525) and L. L. is grateful to the MECE Program (Chile).
300 34.9 91.6 41.1 18.5 89.5 29.1
ABTS radical scavenging capacity (g Trolox/g GAE)
80 5.35 4.85 3.54 4.34 0.84 21.79
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100 4.19 2.52 7.12 1.08 13.1 5.92
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123
 PUBLICACIN VI

Procedimientos de recuperacin de compuestos antioxidantes presentes en

efluentes de destilera de vino.

Andrs Moure Varela, Herminia Domnguez Gonzlez, Juan Carlos Paraj Liares,
Mara Jess, Gonzlez Muoz, Beatriz Daz Reinoso, Enma Conde Pieiro, Mara Jess
Conde Pieiro, Noelia Gonzlez Lpez, Argimiro Levoso Touceda, Manuel Castro
Gonzlez, Emilio Vidal Canto, Jos Gonzlez Mndez.
Patente ES 2 345 748 A2 (2010).
 Resultados

Resumen

El inters por los antioxidantes naturales alternativos a los sintticos ha originado una intensa
bsqueda de fuentes abundantes y biorrenovables de estos compuestos, mereciendo especial
atencin aqullas de origen residual resultantes de la actividad agroindustrial y que en muchas
ocasiones aparecen en los efluentes lquidos del procesado industrial de vegetales, formando
parte de las corrientes residuales.

En las empresas vitivincolas que destilan el bagazo y las las producidas durante los trasiegos
segn avanza la elaboracin para producir aguardiente, adems de obtener el bagazo
destilado como residuo slido, se obtiene una corriente lquida de descarga denominada
vinaza compuesta por condensados y las agotadas. Este efluente, de carcter cido y con un
alto contenido en compuestos orgnicos ligeramente biodegradables, contiene cenizas,
azcares residuales, aminocidos, tartratos, cidos orgnicos (como actico, lctico y en
ocasiones mlico) y cantidades significativas de compuestos fenlicos que incluyen catequinas,
flavonoles y cidos benzoicos y cinmicos (Borja y col., 1993; Devesa-Rey y col., 2011; Martn
Santos y col., 2003).

Numerosos estudios se han centrado en la recuperacin de compuestos fenlicos partir de los

residuos slidos de la industria vitivincola especialmente bagazo y las, sin embargo aqullos
que abordan el aprovechamiento de los antioxidantes presentes en las corrientes residuales de
destileras son escasos.

En la presente patente se propone un proceso para la separacin, concentracin y purificacin

de los compuestos antioxidantes presentes en una corriente de vinaza. El proceso incluye el
empleo de distintas membranas de micro-, ultra- y nanofiltracin, as como el tratamiento con
resinas polimricas de adsorcin.

El procedimiento desarrollado permite la obtencin de extractos con elevado contenido en

antioxidantes adems de minimizar la generacin de residuos ofreciendo una alternativa a las
tecnologas convencionales de depuracin. Los productos obtenidos podrn emplearse para la
alimentacin humana y/o animal, as como para aplicaciones en la industria alimentaria o
cosmtica como antioxidantes naturales con actividad biolgica.

177
 11 Nmero de publicacin: 2 345 748


19 OFICINA ESPAOLA DE
PATENTES Y MARCAS
21 Nmero de solicitud: 200800076

51 Int. Cl.:

ESPAA C12F 3/10 (2006.01)

C02F 1/00 (2006.01)
A23L 1/30 (2006.01)
A61Q 19/08 (2006.01)

12 SOLICITUD DE PATENTE A2

22 Fecha de presentacin: 11.01.2008
71 Solicitante/s: Universidad de Vigo
Campus Universitario Lagoas Marcosende
36310 Vigo, Pontevedra, ES
Vitivincola del Ribeiro, S.C.G.

43 Fecha de publicacin de la solicitud: 30.09.2010
72 Inventor/es: Moure Varela, Andrs;
Domnguez Gonzlez, Herminia;
Parajo Liares, Juan Carlos;
Gonzlez Muoz, Mara Jess;
Daz Reinoso, Beatriz;
Conde Pieiro, Enma;
Conde Pieiro, Mara Jess;
Gonzlez Lpez, Noelia;
Levoso Touceda, Argimiro;
Castro Gonzlez, Manuel;
Vidal Canto, Emilio y
Gonzlez Mndez, Jos

43 Fecha de publicacin del folleto de la solicitud:
74 Agente: Ungra Lpez, Javier
30.09.2010

54 Ttulo: Procedimientos de recuperacin de compuestos antioxidantes presentes en efluentes de destilera de
vino.

57 Resumen:
Procedimientos de recuperacin de compuestos antioxi- sorcin y posterior desorcin con disoluciones de etanol.
dantes presentes en efluentes de destilera de vino. Las anteriores tecnologas pueden ser empleadas alter-
Se propone un proceso integrado de separacin, concen- nativa y/o conjuntamente. Los productos obtenidos pue-
tracin y purificacin de compuestos antioxidantes pre- den emplearse para la alimentacin humana y/o animal,
sentes en la suspensin residual (SR) que se obtiene en as como para aplicaciones en la industria alimentaria
las columnas de destilacin de una alcoholera (destilera) o cosmtica como antioxidantes naturales con actividad
de vino. SR comprende las agotadas y condensados del biolgica.
vapor empleado para el arrastre del etanol contenido en el
orujo y en las las que se alimentan a la columna de des-
tilacin (Fig. 1). Se minimiza la generacin de residuos y
se ofrece una alternativa a las tecnologas convenciona-
ES 2 345 748 A2

les de depuracin.
El procesamiento de SR se lleva a cabo mediante la se-
paracin de slidos en suspensin y levaduras, emplean-
do centrifugacin y/o microfiltracin, y posterior procesa-
miento de la fase lquida para la retencin selectiva y pu-
rificacin de compuestos fenlicos con poder antioxidan-
te. Las tecnologas consideradas incluyen extraccin con
disolventes, procesamiento con membranas de ultra- y
nanofiltracin, y tratamiento con resinas no-inicas para

Venta de fascculos: Oficina Espaola de Patentes y Marcas. P de la Castellana, 75 28071 Madrid

 PUBLICACIN VII

Valuable polyphenolic antioxidants from wine vinasses.

Beatriz Daz, Ana Gomes, Marisa Freitas, Eduarda Fernandes, Daniele R. Nogueira, Jos
Gonzlez, Andrs Moure, Argimiro Levoso, Mara Pilar Vinadell, Montserrat Mitjans,
Herminia Domnguez, Juan Carlos Paraj.
Food and Bioprocess Technology 5 (2012) 2708-2716.
NDICE DE IMPACTO: 4,115
 Resultados

Resumen

Uno de los residuos generados en la industria vitivincola con mayor impacto ambiental es el
lquido generado durante la destilacin del bagazo y las las para la produccin de aguardiente,
denominado vinaza. La depuracin convencional de este residuo se basa en un tratamiento
fsico para la separacin de los slidos y su posterior digestin anaerobia, aerobia o una
combinacin de ambas. Sin embargo este proceso puede verse afectado por la presencia de
compuestos fenlicos en la corriente de vinazas (Beltrn de Heredia y col., 2005), por lo que
una solucin alternativa interesante pasara por la extraccin y valorizacin de estos
compuestos fenlicos.

En la patente anterior se propuso un proceso eficiente y respetuoso con el medio ambiente

para la recuperacin, concentracin y purificacin de compuestos antioxidantes a partir de
vinazas de destilera. La naturaleza de la corriente utilizada, procedente del procesado de la
uva, y empleo de tecnologas limpias evitando el uso de disolventes txicos, pueden conferir al
extracto caractersticas y propiedades adecuadas para su empleo en la industria cosmtica y/o
alimentaria.

El objetivo del presente trabajo fue el estudio del producto obtenido mediante el
procedimiento de la patente en sistemas tanto qumicos como biolgicos. Se estudi la
actividad antioxidante del extracto frente a los radicales DFPH y ABTS as como frente a ERO
(O2-, H2O2, HOCl, 1O2, ROO) y ERN (ONOO, NO) y se realizaron evaluaciones preliminares de la
capacidad del extracto de proteger sistemas biolgicos en la oxidacin del -caroteno y en la
peroxidacin lipdica inducida en eritrocitos. Finalmente se analiz la irritabilidad cutnea
causada por el extracto mediante el mtodo EpiSkin.

Los resultados obtenidos confirmaron la potente capacidad antioxidante del extracto,

comparable a la observada en compuestos puros y antioxidantes sintticos, abriendo el
camino para su utilizacin como ingrediente funcional. Adems, la ausencia de efectos en el
test de irritabilidad EpiSkin favorece su posible aplicacin en la formulacin de cosmticos.

183
Food Bioprocess Technol
DOI 10.1007/s11947-011-0569-8
ORIGINAL PAPER
Valuable Polyphenolic Antioxidants from Wine Vinasses
Beatriz Daz & Ana Gomes & Marisa Freitas & Eduarda Fernandes &
Daniele R. Nogueira & Jos Gonzlez & Andrs Moure & Argimiro Levoso &
Mara Pilar Vinardell & Montserrat Mitjans & Herminia Domnguez &
Juan Carlos Paraj
Received: 21 January 2011 / Accepted: 21 March 2011
# Springer Science+Business Media, LLC 2011
Abstract The phenolic compounds from white wine
vinasses were concentrated following a patent pending
process. From 1 L of wine vinasses up to 42 g of a dry
product, containing 45% d.w. phenolics, could be obtained.
The antioxidant activity of wine vinasse product was
characterized for the reducing ability and for the scavenging
capacity on non-biological radicals (DPPH and ABTS+),
on the reactive oxygen species superoxide radical, peroxyl
radical, H2O2, singlet oxygen, hypochlorous acid and on
the reactive nitrogen species, nitric oxide, and peroxynitrite.
The ability of the product to protect biological systems was
preliminary evaluated through the protection against the -
carotene oxidation in emulsion and the lysis and lipid
peroxidation induced by APPH in erythrocytes. The
product showed activity comparable to that of standard
compounds (ascorbic acid, butylhydroxyanisol, butylhy-
B. Daz : A. Moure : H. Domnguez (*) : J. C. Paraj
Dep. Enxeera Qumica,
Universidade de Vigo (Campus Ourense) Edificio Politcnico,
As Lagoas s/n,
32004 Ourense, Spain
e-mail: herminia@uvigo.es
A. Gomes : M. Freitas : E. Fernandes
REQUIMTE, Departamento de Qumica, Faculdade de Farmcia,
Universidade do Porto,
Rua Anbal Cunha 164,
4099-030 Porto, Portugal
D. R. Nogueira : M. P. Vinardell : M. Mitjans
Dep. Fisiologia, Facultat de Farmcia, Universitat de Barcelona,
Av. Joan XXIII s/n,
08028 Barcelona, Spain
J. Gonzlez : A. Levoso
Cooperativa Vitivincola do Ribeiro, Valdepereira, Ridadavia,
Ourense, Spain
droxytoluene, lipoic acid, rutin, quercetin, Tiron, Trolox)
and could be proposed as a food antioxidant. The absence
of skin-irritant effects on reconstructed human tissues
(Episkin) showed that this product at 1% appear to be
safe for topical use in cosmetic applications.
Keywords Wine vinasses . Antioxidants . Radical
scavenging capacity . Lipid oxidation . Hemolysis . Dermal
irritation
Introduction
The interest in the exploitation of wine industry residues for
obtaining natural antioxidants, to be used as dietary
supplements or in the production of phytochemicals, is
nowadays well-established (Arvanitoyannis et al. 2006).
The published studies focus on the use of the solid wastes
with no reference to the possible recovery of antioxidants
from the liquid waste streams. The effluent from wine
distilleries (wine vinasses) generated by condensation of the
steam used for stripping the ethanol from the pomace has
an important environmental impact due to the acidic pH, as
well as high solids and organic matter content. The major
problem limiting the wastewater treatment of this stream is
the presence of significant amounts of phenolic compounds,
including benzoic acids, hydroxycinnamic acids, and
flavonoids, such as catechin, epicatechin, quercetin, kaemp-
ferol, and myricetin (Borja et al. 1993). Conventional
aerobic and anaerobic digestion could be affected by the
presence of these compounds and their oxidation has been
proposed (Beltrn et al. 1999; Bentez et al. 2000, 2003;
Beltrn de Heredia et al. 2005). However, another interesting
solution would be the extraction and commercial valorisation

of the phenolic compounds. The biological and antioxidant
properties, bioavailability, and potential toxicity of grape
phenolics have been recently revised (Xia et al. 2010). For
that purpose, an efficient and environmentally friendly
process has been optimized for the recovery, concentration,
and purification of the phenolics present in wine vinasses.
The process is included in a patent pending application
(Moure et al. 2008). The nature of the industrial stream,
generated as a by-product from a food process and the
characteristics of the proposed recovering technology,
avoiding the use of chemicals and toxic solvents, could
confer the extracts desirable properties and characteristics
suited for a wide variety of applications, including those in
relation to food and cosmetics.
In this work, the antioxidant activity of a concentrated and
purified product recovered from white wine vinasses was
studied in chemical and biological systems. The reducing
capacity, the radical scavenging activity against the stable free
radicals ,-diphenyl--picrylhydrazyl (DPPH) and [2,2- sugars were colorimetrically determined at 640 nm, by
azinobis (3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonate)] (ABTS+), as
well as the scavenging effects against the reactive oxygen
species (ROS) superoxide radical, hydrogen peroxide, singlet
oxygen, peroxyl radical, and the reactive nitrogen species
(RNS) nitric oxide and peroxinitrite was studied. The ability
of the extracts to protect biological systems was preliminary
evaluated through the protection against the -carotene
oxidation in emulsion and the lysis and lipid peroxidation
induced in erythrocytes. Finally, the potential skin irritation
was assayed by the validated reconstructed human epidermis
Episkin in vitro test.
Materials and Methods
Materials White wine vinasses (WV) resulting from spirit
distillation were supplied by Cooperativa Vitivincola do
Ribeiro (Ourense, Spain) and stored at 4 C before
processing. The composition of this effluent (pH 4.03)
could be summarized as: 10.83 g gallic acid equivalents/L,
18.56 g total sugars/L, 17.57 g reducing sugars/L, 13.09 g
glucose/L, 0.82 g ethanol/L, 1.74 g PO43/L, 0.96 g SO42/L,
and 0.05 g Cl/L. The wine vinasses were centrifuged at
4,500 rpm to remove suspended solids and processed
according to a new patented process (Moure et al. 2008).
Chemicals All the chemicals and reagents were of analytical
grade. Ascorbic acid, -carotene, chloroform, 4,5-
diaminofluorescein (DAF-2), diethylenetriaminepentaacetic
acid, dihydrorhodamine 123 (DHR), 3,5 dinitrosalicylic acid,
epicatechin, FolinCiocalteau reagent, gallic acid, 30%
hydrogen peroxide, sodium hypochlorite solution with 4%
available chlorine, linoleic acid, lucigenin, -nicotinamide
Food Bioprocess Technol
adenine dinucleotide, nitroblue tetrazolium chloride (NBT),
phenazine methosulfate, potassium ferricyanide, rutin, 2-
thiobarbituric acid, 3-(aminopropyl)-1-hydroxy-3-isopropyl-
2-oxo-1-triazene, trichloroacetic acid, tripyridyl-s-triazine and
tween 40 were obtained from Sigma-Aldrich (St. Louis,
USA). ,-Azodiisobutyramidine dihydrochloride (AAPH),
DPPH, ABTS, histidine, Tiron and Trolox were obtained from
Fluka Chemie GmbH (Steinheim, Germany). Fluorescein
sodium salt and quercetin were obtained from Aldrich
(Milwaukee, USA). Butylhydroxytoluene (BHT) and butyl-
hydroxyanisol (BHA) were from Roig Farma (Barcelona,
Spain). Episkin (batch 09-EKIN-038) supplied by SkinEthic
Laboratories (Lyon, France). Chloridric acid, ferric chloride,
ethanol, and methanol were obtained from Panreac
(Barcelona, Spain).
Analytical Methods Total sugars were colorimetrically
determined at 490 nm, using phenolsulfuric acid. Reducing
the 3,5 dinitrosalicylic acid method. Glucose and ethanol
were determined high-performance liquid chromatogra-
phy (HPLC) with an Aminex HPX-87 H 300/7.8 mm
column and IR detection using with 5 mM SO4H2 as
eluting solution.
Anions (SO42, PO43, Cl) were determined by ionic
chromatography in an automated Metrohm 861 system,
equipped with a MetrosepA Supp5 250/4.0 mm column,
operating with 0.7 mL/min of a 3.2 mM carbonate/
bicarbonate mobile phase.
Total phenolic content was determined by the Folin
Ciocalteu colorimetric method and expressed as gallic acid
equivalents. Selected phenolic compounds were analyzed in
an Agilent HPLC 1100 instrument equipped with a Waters
Spherisorb ODS-2 column (5 m, 2504.6 mm) and DAD
detector, operating at 30 C, with 20 L injection volume
and a flow rate of 1 mL/min. A non-linear gradient of
acetonitrile/5% (v/v) formic acid in water (10:90; solvent A)
and acetonitrile/5% (v/v) formic acid in water (90:10;
solvent B) was used as follows: 0 min 100% A, 40 min
85% A, 45 min 100% B, 55 min 100% A. Phenolic
compounds were identified by comparison of the retention
time and UV-visible spectral data with those of authentic
compounds.
Antioxidant Activity
Reducing Capacity
Ferric Reducing Antioxidant Power By using a reactive
solution prepared with 25 mL of 300 mM/L acetate buffer
(pH 3.6), 2.5 mL of a 10 mM/L 2,4,6-tripyridyl-s-triazine
Food Bioprocess Technol
solution in 40 mM/L HCl and 20 mM/L ferric chloride in
distilled water, ferric reducing antioxidant power (FRAP)
was determined. An aqueous solution of known Fe (II)
concentration was used for calibration. Samples (100 L)
were mixed with 3 mL of the FRAP reagent and the
absorbance was monitored at 593 nm.
Reducing Power One mL of the product to be tested
dissolved in methanol was mixed with 2.5 mL of 0.2 M
phosphate buffer (pH 6.6) and 2.5 mL of 1.0% potassium
ferricyanide. The mixture was incubated at 50 C for
30 min before adding 2.5 mL of 10% trichloroacetic acid.
The mixture was centrifuged, and 2.5 mL of the supernatant
were combined with 2.5 mL and with 0.5 mL of 0.1% ferric
chloride before reading the absorbance at 700 nm. The
reducing power was directly correlated with the final
absorbance of the reaction mixture.
Radical, ROS, and RNS Scavenging Capacity
Equipment A microplate reader (Synergy HT, BIO-TEK)
for fluorescence, UV/vis absorbance and luminescence
measurements, equipped with a thermostat, was used for
all the ROS and RNS scavenging assays. Each study
corresponds to four experiments performed in triplicate.
DPPH Radical Scavenging Activity Fifty microliter of a
methanolic solution of the antioxidant were added to 2 mL
of a 3.6105 M methanolic solution of DPPH. The
decrease in absorbance at 515 nm was recorded after
16 min. EC50 was calculated as the amount of product
causing a 50% inhibition of the DPPH radical.
Trolox Equivalent Antioxidant Capacity ABTS radical
cation (ABTS+) [2,2-azinobis (3-ethyl-benzothiazoline-6-
sulfonate)] was produced by mixing 7 mM ABTS stock
solution with 2.45 mM potassium persulfate (final concen-
tration) and allowing the mixture to stand in the dark at
room temperature for 1216 h before use. ABTS+ solution
was diluted with phosphate buffer saline (PBS; pH 7.4) to
an absorbance of 0.70 at 734 nm and equilibrated at 30 C.
After addition of 10 L of the tested product or Trolox
standards, in ethanol or PBS, to 1.0 mL of diluted ABTS+
solution, the absorbance was continuously read up to 6 min.
Solvent blanks were run in each assay, and the percentage
inhibition of absorbance was calculated as a function of the
concentration of the tested product and Trolox.
Superoxide Radical Scavenging Assay Superoxide radical
was generated by the -nicotinamide adenine dinucleotide/
phenazine methosulfate system and the superoxide radical
anion (O2) scavenging activity was determined by
monitoring the effect of the tested products on the O2-
induced reduction of NBT at 560 nm as previously
described (Gomes et al. 2007). The antioxidant Tiron
was used as positive control. The results were expressed as
the inhibition (in percentage) of the NBT reduction to
diformazan.
Hypochlorous Acid Scavenging Assay The hypochlorous
acid (HOCl) scavenging activity was measured by moni-
toring the effect of the tested products on HOCl-induced
oxidation of DHR to rhodamine 123, as previously
described (Gomes et al. 2007). HOCl was prepared by
adjusting the pH of a 1% (m/v) solution of NaOCl to 6.2
with dropwise addition of 10% H2SO4. Lipoic acid was
used as positive control. The results were expressed as the
percentage inhibition of HOCl-induced oxidation of DHR.
Singlet Oxygen Scavenging Assay The singlet oxygen (1O2)
scavenging activity was measured by monitoring the effect
of the tested products on the oxidation of non-fluorescent
DHR to fluorescent rhodamine 123 by this ROS, as
previously described (Gomes et al. 2007). Quercetin was
used as positive control. The results were expressed as the
percentage inhibition of 1O2-induced oxidation of DHR.
Peroxyl Radical Scavenging Assay The peroxyl radical
(ROO) scavenging activity was measured by monitoring
the effect of the tested products on the fluorescence decay
resulting from ROO-induced oxidation of fluorescein and
expressed as the oxygen radical absorbance capacity
(ORAC values), as previously described (Gomes et al.
2007). Trolox was used as the standard control.
Nitric Oxide Scavenging Assay The nitric oxide (NO)
scavenging activity was measured by monitoring the effect
of the tested products on the NO-induced oxidation of non-
fluorescent DAF-2 to the fluorescent triazolofluorescein, as
previously described (Gomes et al. 2007). Rutin was used
as positive control. The results were expressed as the
inhibition percentage of NO-induced oxidation.
Peroxynitrite Scavenging Assay The peroxynitrate
(ONOO) scavenging activity was measured by monitoring
the effect of the tested products on ONOO-induced
oxidation of non-fluorescent DHR to fluorescent rhodamine
123, as previously described (Gomes et al. 2007). Ascorbic
acid was used as positive control. In a parallel set of
experiments, the assays were performed in the presence of
25 mM NaHCO3 in order to simulate the physiological CO2
concentrations. This evaluation is important because, under
physiological conditions, the reaction between ONOO and

bicarbonate is predominant, with a very fast rate constant
(k2 =35.8104 M1 s1; Whiteman et al. 2002). The results
were expressed as the percentage inhibition of ONOO-
induced oxidation of DHR.
Other Oxidation Assays
-Carotene Bleaching Assay Following the spectrophoto-
metric method of Miller (1971), -carotene bleaching assay
was carried out. The antioxidant activity was measured by
the antioxidant activity coefficient (AAC), which gives an
estimate of the relative extent of oxidation in the presence of
wine vinasse product (WVP) with respect to the extent of the
oxidation in its absence. The AAC was calculated as a
function of the absorbance of control and sample at 470 nm:

method is based on determining cell viability, and cytokine
AWVP; 120 min  Acontrol; 120 min
AAC
 1; 000
Acontrol; 0 min  Acontrol; 120 min
Hemolysis Induced by APPH Blood samples were obtained
from rats, following the ethical guidelines of the University
of Barcelona, and were collected in tubes containing EDTA
as anticoagulant. Red blood cells (RBC) were separated
from plasma and buffy coat by centrifugation at 1,000g
for 10 min. Hemolysis of RBC mediated by AAPH was
measured using a modification of the method described
previously (Ugartondo et al. 2008). The antihemolytic
activity was studied by adding the product to the RBC
suspension in the presence of 100 mM AAPH at 37 C for
2.5 h. The IC50 (inhibitory concentration 50) of the
hemolysis induced by AAPH was determined.
Erythrocyte Lipid Peroxidation The level of malondialde-
hyde (MDA), a secondary product of lipid peroxidation, was
determined indirectly by measuring spectrophotometrically
thiobarbituric acid reactive (TBAR) substances formation
according to the method described previously (Ugartondo et
al. 2009). This method is based on the extraction of MDA
from erythrocyte suspension by trichloroacetic acid (TCA)
solution and the next reaction of this MDA with thiobarbi-
turic acid (TBA), giving a pink colored complex with
maximum absorption at 532 nm (TBAR substances). Lipid
peroxidation was induced by incubating erythrocytes with
hydrogen peroxide (H2O2) 20 mM alone or with different
compound concentrations for 90 min at 37 C. Following
incubation, RBC suspension was mixed with 1 mL of TCA
solution 20% w/v to remove potentially interfering substan-
ces (Srour et al. 2000). Samples were then centrifuged and
1 mL of supernatant was mixed with 1 mL of 1% of 2-TBA.
Finally, samples were heated at 90 C for 50 min, cooled
fast, centrifuged and the absorbance of the supernatant was
Food Bioprocess Technol
measured at 532 and 600 nm to eliminate possible
impurities. The degree of lipid peroxidation was expressed
as nanomole per milliliter of MDA inferred from the
standard curve from tetramethoxypropane. In addition, IC50
values were calculated as the antioxidant concentration
required for the inhibition of 50% TBAR formation.
In vitro Skin Irritation
The in vitro reconstructed human skin tissue (Episkin)
model is widely used and has been validated for regulatory
purposes as replacement to animal testing for skin corro-
sivity and skin irritation (http://ecvam.jrc.ec.europa.eu/
ft_doc/EPISKIN-SIT-SOP%2006-08-08.pdf) (Portes et al.
2002; Robinson et al. 2002; Tornier et al. 2010). The
release [interleukin-1 (IL-1)] as an additional endpoint.
Upon receipt from Episkin SNC (Lyon, France), the recon-
structed skin inserts (0.38 cm2) were transferred into 12 well-
plates containing 2 mL of maintenance medium and
incubated at 37 C under 5% CO2 and >95% humidity. After
24 h, the second column of each plate was filled with
maintenance medium preheated at 37 C. The product to be
tested (10 L) was dissolved (1%) in distilled water and
contacted with each epidermis sample during 15 min. A
negative control (PBS) and a positive control (5% SDS
solution in distilled water) were used. After exposure to the
products, the epidermis samples were washed with sterile
PBS and then incubated in the maintenance medium. After
42 h, the medium was collected in Eppendorf tubes and
frozen at 20 C for further determination of IL1-, with the
commercial Diaclone ELISA kit (UK, maximum sensitivity
of 31.2 pg/mL), following the protocol recommended by the
manufacturer. Cell viability was determined by the MTT
assay. Tissues were transferred to wells (2 mL/well)
containing 0.3 mg/mL of MTT solution and incubated for 3 h
(37 C, 5% CO2, 95% humidified atmosphere). After
incubation, the epidermis tissues were soaked with acidic
isopropanol (0.5 mL/tube) to extract the intracellular for-
mazan. These tubes were incubated for 4 h in the dark with
periodic vortexing. At the end of the incubation period, the
tubes were centrifuged and a duplicate of 200 L was
transferred to a 96-well flat bottom microtitre plate; absor-
bance was read at 550 nm with acidified isopropanol as
blank. Viability was calculated, considering 100% for the
negative control.
Statistical Analysis
Statistical significance was determined by the Dunnets t
test and one-way analysis of variance using the SPSS
Food Bioprocess Technol
software (SPSS Inc, Chicago, IL, USA). Statistical signifi-
cance was considered p<0.05.
Results and Discussion
The process optimized for the recovery and concentration
of the phenolic compounds present in wine vinasses is
relatively simple, inexpensive, scalable, and environmen-
tally friendly, since it avoids the use of toxic organic
solvents. The extract characterized in the present work has
been obtained following one of the processes included in a
patent pending application (Moure et al. 2008). The
sequence of proposed stages allows the reduction in the
total phenolic concentration, expressed as gallic acid
equivalents, from 10.8 g/L in the initial stream to 1.2 g/L
in the disposed liquid stream. From 1 L of white wine
vinasses, an average of 42 g dry WVP was obtained, with a
phenolic content of 44.7%, expressed in gallic acid
equivalents. Wine vinasses can be a promising source of
antioxidants in comparison with other solid residues, such
as pomace and seeds, which have been reviewed by Spigno
and De Faveri (2007). The utilization of the proposed
process to recover phenolic compounds from wine vinasses
could be advantageous over the solidliquid extraction
from solid wastes, since it avoids the need of adding water
or organic extracting solvents and the further removal
stages required for concentration purposes.
The WVP obtained presented a powder texture and fair
yellowishgray, brownishgray color. The phenolic com-
position is presented in Fig. 1 and the antioxidant properties
are summarized in Table 1. The RP-HPLC chromatogram
shows monomeric phenolic compounds, such as gallic acid,
catechin, epicatechin, and quercetin typically found in other
grape pomace extracts (Pinelo et al. 2005, 2007). At
retention times longer than 3040 min, the oligomeric and
polymeric polyphenols are eluted as a broad unresolved
Fig. 1 RP-HPLC profiles of the
monomeric phenols in the con-
centrated white wine vinasses
product. Peak identities:
280 nm: 1 gallic acid, 2
hydroxytyrosol, 3 catechin, 4
tyrosol, 5 4-
hydroxybenzaldehyde, 6 ()-
epicatechin; 329 nm: 7 caffeic
acid; 360 nm: 8 ellagic acid
elevation of the baseline, occurring when the acetonitrile
content is increased. In some grape products and by-
products, the most abundant compounds are catechin, gallic
acid, and epicatechin, but the tendency of certain com-
pounds to polymeryze during storage (Pinelo et al. 2005)
can lower the concentration of monomeric compounds and
increase the overall antiradical activity of the resulting
products. Degrees of polymerization in the range 1.43.7
were reported for extracts from white grape by-products
(Torres et al. 2002; Torres and Selga 2003), the relevance of
this property on the antiproliferative capacity has been
confirmed (Lizrraga et al. 2007).
Although the reducing capacity of a sample is not
directly related to its radical scavenging capacity, it is a
measure of the antioxidant properties. In addition to the
FolinCiocalteu assay for total phenolics, which measures
the reducing capacity, the ability to donate electrons by the
FRAP method and the iron(III) to iron(II) reduction activity
was assayed. The reducing capacity of the product was
equivalent to one half the same weight of Trolox.
In assays with stable free non biological radicals (DPPH
and ABTS+), widely used to characterize natural extracts
and compounds, the scavenging capacity of the product is
comparable or superior to those of synthetic commercial
antioxidants. The potency of one gram of WVP was
equivalent to that of 1.73 g of Trolox in the ABTS
scavenging assay. The product showed higher DPPH
radical scavenging capacity than BHT and a slightly lower
potency, but comparable to BHA, rutin, or ascorbic acid.
Food oxidation is one of the major causes of chemical
spoilage, resulting in rancidity and/or deterioration of the
nutritional quality, color, flavor, texture, and safety of food;
and it is assumed to be initiated by free radicals. The
prooxidant/antioxidant balance existing in a normal biolog-
ical system, can be altered under oxidative stress, generated
by diseases, diet, lifestyle, and environmental conditions,
leading to an overproduction of ROS/RNS or to a reduction
 Food Bioprocess Technol

Table 1 Physico-chemical and

antioxidant properties of the
freeze-dried concentrated
product from wine vinasses
(WVP) and the positive controls
assayed
Physical properties
Color Light yellow to gray pale
Mesh size 100% pass 80 Mesh
Odor/smell Characteristic, aromatic
Taste Characteristic, light bitter
Antioxidant properties
Reducing capacity
FRAP 0.4650.013 g ascorbic acid/g WVP
0.8340.016 g Fe sulfate/g WVP
Reducing power 0.5210.013 g ascorbic acid/g WVP
Radical scavenging capacity
ABTS (TEAC value) 1.730.09 g Trolox/g WVP
DPPH EC50, WVP =0.358 mg/mL
EC50, BHT =2.79 mg/mL
EC50, BHA =0.225 mg/mL
EC50, Rutin =0.160 mg/mL
EC50, Ascorbic acid =0.120 mg/mL
Reactive oxygen species (ROS) scavenging capacity
O2. IC50, WVP =10.82.6
IC50, Tiron =64.017.3
HOCl IC50, WVP =53.76.3
IC50, WVP, Lipoic acid =0.500.03
1
O2 IC50, WVP =11.81.1
IC50, WVP, Quercetin =0.660.03
ROO.(ORAC value) 0.3930.055 mg Trolox/g WVP
Reactive nitrogen species (RNS) scavenging capacity
NO IC50, WVP =2.040.08 g/mL
IC50, Rutin =2.410.49 g/mL
ONOO IC50, WVP =0.800.08 g/mL
IC50, Ascorbic acid =0.330.05 g/mL
ONOO with NaHCO3 IC50, WVP =1.250.07 g/mL
IC50, Ascorbic acid =0.650.14 g/mL
Antioxidant activity in emulsion
-carotene (antioxidant activity coefficient, AAC) AACWVP, at 1 g/L =513.734.16

AACBHT, at 5 g/L =980.472.17

AACBHA, at 1 g/L =886.939.98
Antihemolytic activity
APPH induced hemolysis IC50, WVP =123.217.60 g/mL
The total phenolic content was IC50, Epicatechin =119.8010.16 g/mL
0.447 g gallic acid equivalents Erythrocyte lipid peroxidation inhibition
per gram WVP MDA formation IC50, WVP =180.0211.28 g/mL
TEAC Trolox equivalent antiox- IC50, Epicatechin =156.099.48 g/mL
idant capacity

of antioxidant protection. This altered state has been
implicated in the pathogenesis of several cronic and
neurodegenerative diseases and aging. It is widely
assumed that the skin damage induced by UV irradiation
involves the generation of ROS and RNS. Several in
vitro assays were used to characterize the ability to
scavenge selected biologically relevant ROS, such as the
radicals superoxide and peroxyl, and the non-radicals,
singlet oxygen, and hypochlorous acid (Fig. 2) and the
RNS nitric oxide and peroxynitrite radicals (Fig. 3). All of
them were scavenged by the tested product in a concen-
tration dependent manner.
Food Bioprocess Technol

HOCl scavenging activity (%)

O2 scavenging activity (%)

O2.-scavenging activity (%)
100 100 100

80 80 80

60 60 60

40 40 40

20 20 20

0 0 0
0 10 20 30 40 0 40 80 120 160 0 20 40 60 80 100

1
Conc (g/mL) Conc (g/mL) Conc (g/mL)

Fig. 2 Scavenging activity of the white wine vinasses product against ROS (O2.; HOCl; and 1O2). Each point represents the values obtained
from four experiments performed in triplicate (mean SE)

O2 is produced as a result of the donation of one Nitric oxide, produced by the inducible enzymes in macro-
electron to oxygen in several metabolic processes or phages and neutrophils, is identified as a cytotoxic factor
following oxygen activation by irradiation. The O2 and responsible for immunity during the defense against
scavenging activity was measured by a non-enzymatic pathogens. In addition to pro-inflammatory effects, NO can
methodology in order to avoid the confounding effects generate more destructive reactive species, particularly
derived from the xanthine oxidase inhibition. The WVP ONOO by reacting with superoxide. ONOO is a
was more active than the positive control used, and more cytotoxic reactive species that can be generated by
than several 2-styrylchromones and flavonoids (Gomes et endothelial cells, neutrophils, and macrophages. The WVP
al. 2007). The scavenging activity of the WVP against ROS was as efficient NO radical scavenger as rutin, whereas the
was effective, but obtained at higher concentrations than ONOO capacity was lower than that of the selected
with the positive standards, HOCl being the ROS for which standard, ascorbic acid, both with and without NaHCO3.
a lower potency was observed. A similar relative potency The obtained results showed that the RNS scavenging
for ROS and RNS for a series of flavonoid derivatives activity (.NO, ONOO, and ONOO) in the presence of
(Gomes et al. 2007), and also for a plant extract (Almeida et NaHCO3 was comparable to that of the positive controls
al. 2009) was reported. 1O2, normally generated in the used. Interestingly, the ONOO scavenging was the highest,
presence of light and photosensitizers, is a potent oxidizing though decreased in the presence of NaHCO3 (as it also did
agent of a wide variety of biomolecules since it is an with the positive control ascorbic acid), indicating a lower
excited state of molecular oxygen with no unpaired (but still potent) activity against the prooxidant species that
electrons. At the highest tested concentration, an 80% result from the reaction of ONOO with CO2 such as the
inhibitory effect was observed, but the IC50 value revealed nitrogen dioxide radical (.NO2) and the carbonate radical
a significantly lower potency than the standard quercetin, anion (CO3.).
which was the most active among several tested flavonoids The protection against -carotene bleaching is useful to
(Gomes et al. 2007). The ORAC, determined as ROO evaluate the prevention of the oxidation of a lipidic
scavenging activity, was lower than that of other flavonoids substrate in emulsion, which is a system usually found in
reported by Gomes et al. (2007). food and cosmetic products. During the coupled oxidation

NO is produced by nitric oxide synthases and has a key of linoleic acid and -carotene in an emulsified aqueous
role in the regulation of several physiological functions and system in presence of oxygen at high temperature, the WVP
pathological processes, such as the inflammatory process. provided 52% and 58% of the protection offered by BHT
ONOO- scavenging activity (%)
ONOO- scavenging activity (%)
.NO scavenging activity (%)

100 100
100
(with NaHCO3-)

80 80 80

60 60 60

40 40 40

20 20 20

0 0 0
0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20
Conc (g/mL) Conc (g/mL) Conc (g/mL)

Fig. 3 Scavenging activity of the white wine vinasses product against NOS (NO; ONOO, in absence and in the presence of 25 mM NaHCO3).
Each point represents the values obtained from four experiments performed in triplicate (mean SE)

9 H2O2 through the erythrocyte membrane and further reaction
8 with hemoglobin, limiting damage and ROS generation.
7 The safe topical use of the WVP was evaluated on
MDA (nmol/mL)
6
5
4 were applied directly on the Episkin surface in comparison
3 to PBS as control and to SDS (5%), as an irritant reference
2 compound. After topical exposure for 15 min followed by
1
H 2O 2 H O2 2 H O2 2 H O
2 2 H O
2 2 H O
2 2
+ 100 g/mL + 200 g/mL + 400 g/mL + 600 g/mL + 1000 g/mL
Fig. 4 MDA levels in erythrocytes treated with 20 mM H2O2 and
with 20 mM H2O2 plus different concentrations of the white wine
vinasses product. Mean values SD of three independent experiments
and BHA, respectively. This behavior was probably due to
the fact that the vinasses were from distillates of white
grape pomace and white wines. The following sequence of
AAC for red and white wines in relation to some standards
was reported: red wines>BHT>quercetin>(+)-catechin>
white wines (Katalini et al. 2004). These authors found
that the average AAC values of red wines (2,630) were
higher than that for white wines (49), and that the ratio of
the AAC to total phenols was 998 for red wines and 151 for
white wines, suggesting that polyphenols of the red wines
were more efficient antioxidants.
Because of their susceptibility to peroxidation, RBC has
been used as a model to investigate oxidative damage of free
radicals to biomembrane components. The dose-response
curve was analyzed, and the IC50 value was obtained
(concentration inducing 50% inhibition of hemolysis in-
duced by AAPH). The extract showed an antihemolytic
activity comparable to epicatechin (Table 1). The protection
against membrane lipid peroxidative damage was also
evaluated by measuring the level of MDA, as a marker of
H2O2-induced injury of RBC. Rat RBC were treated with
20 mM H2O2 with or without the antioxidant product. The
erythrocyte treatment with H2O2 induced a higher rate of
MDA production (Fig. 4) due to the relevant oxidative
damage of the membrane cells. The results indicated that
lipid peroxidation could be effectively inhibited by the WVP
in a dose-dependent manner. This inhibitory effect was
statistically significant (p<0.05) for all the tested concen-
trations. At the lower concentration (100 g/mL), the
product protects lipid peroxidation by about 40% and raises
to about 80% protection at the higher concentration
(1,000 g/mL) tested. The WVP has a similar efficiency
and IC50 values in this two assays, this behavior was already
observed (Ugartondo et al. 2009), and ascribed to the
capacity of flavonoid compounds to prevent the passage of
Food Bioprocess Technol
reconstituted human epidermis (Episkin), which is a useful
test for the in vitro assessment of the irritation potential of
cosmetics (Faller et al. 2002). Solutions (1%) of the WVP
42 h of recovery, tissue viability and release of IL-1 were
determined. The results of tissue viability (92.3417.24%),
and the release of pro-inflammatory mediators (15.66.7 pg/
ml IL-1) in a similar extent to negative control (12.1
1.9 pg/ml IL-1) in a reconstituted human epidermis
confirmed the absence of irritating action of this product at
the tested concentration.
Conclusions
The phenolic product obtained from white wine vinasses,
following one of the claimed sequences of a patent pending
method to recover antioxidants from wine vinasses, showed
potent antioxidant activity measured by in vitro tests using
both chemical and biological assays. This product contains
44.7% phenolics, expressed in gallic acid equivalents, and
from 1 L white wine vinasses up to 42 g dry product can be
yielded. The possibility of recovering phenolic compounds
present in wine vinasses offers environmental advantages,
due to the availability and polluting capacity of this stream.
This process is simpler than the solidliquid extraction
from the solid pomace, which is the most widely reported
alternative. The growing demand for natural antioxidants
and the recognized biological properties of grape phenolics,
could favor the final application of this product as a
functional food ingredient. The radical scavenging capacity
of the white wine vinasses product against different species
was comparable to that observed for synthetic and natural
pure compounds. Considering the relevance of the ROS and
RNS on the skin aging process, the wine vinasses
concentrated product could also be proposed as ingredient
of topical antioxidant formulations for cosmetics, based on
the absence of irritating effects on the Episkin test.
Acknowledgments The authors are grateful to the Spanish Ministry
of Education and Science (MEC) for the financial support of this work
(Research Project reference ALG2006-05387, CTM2009-12664,
which had partial financial support from the FEDER funds of the
European Union). Beatriz Daz Reinoso thanks the Spanish MEC for
her grant (reference BES-2005-7525). Andrs Moure thanks the Xunta
de Galicia for his Isidro Parga Pondal contract. Daniele R. Nogueira
thanks AECID for her grant.
Food Bioprocess Technol
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 PUBLICACIN VIII

Supercritical CO2 extraction of chestnut burs antioxidants.

Beatriz Daz Reinoso, Andrs Moure, Herminia Domnguez.

 Resultados

Resumen

La castaa, que se recolecta en otoo, ha sido tradicionalmente un alimento bsico de la

regin y puede ser transformada en diferentes productos elaborados. Como resultado de su
recoleccin, quedan en las zonas de cultivo como residuos los erizos, que actualmente carecen
de uso comercial y aplicacin.

La revalorizacin de estos desechos permitira su posterior utilizacin por la industria

farmacutica, alimentaria o cosmtica. Se ha propuesto la extraccin directa con etanol, que
recupera un 10 % en peso del material, y presenta un contenido fenlico de 21 g EAG/100 g
extracto (Moure y col., 2014). Tambin se ha aplicado con xito el tratamiento de
autohidrlisis para lograr un fraccionamiento del material, logrando la solubilizacin de la
fraccin de hemicelulosas y de parte de la fraccin de lignina soluble en cido. La posterior
extraccin con acetato de etilo de los compuestos fenlicos presentes en la fase lquida
permiti obtener extractos con un 43 % de pureza en estos componentes (Conde y col.,
2011a). Tras la adsorcin en resinas polimricas y desorcin con etanol se obtuvieron extractos
con 56 % de contenido fenlico (Conde y col., 2011b).

En este estudio se plantea la extraccin selectiva de los compuestos fenlicos con dixido de
carbono supercrtico empleando etanol como modificador polar. Una vez seleccionada la
concentracin ptima, se evalu el efecto combinado de la presin y la temperatura, el efecto
del caudal de disolvente y del tiempo de extraccin, con el objetivo de maximizar los
rendimientos de extraccin y contenido fenlico de los extractos recogidos en un nico
separador operando en condiciones atmosfricas.

197
 ETHANOL-MODIFIED SUPERCRITICAL CO2 EXTRACTION OF CHESTNUT BURS ANTIOXIDANTS

Beatriz Daz Reinoso1, 2*, Andrs Moure1,2, Herminia Domnguez1,2

1
Departament of Chemical Engineering, University of Vigo (Campus Ourense), Edificio Politcnico, As
Lagoas, 32004 Ourense, Spain
2
CITI-Universidade de Vigo, Parque Tecnolxico de Galicia, Ra Galicia n 2, 32900 Ourense, Spain

ABSTRACT

Supercritical CO2 extraction of ground chestnut burs was studied at 10-35 MPa and 35-70 C

using ethanol at 10 % wt as cosolvent. Optimal extraction conditions were obtained at 20 MPa

and 55 C, with 20 g CO2/min, providing a yield of 1.16 % extractibles and the extracts showed

0,08 g TEAC equivalents/g. Extraction kinetics were studied by collecting fractions at regular

time intervals. Global yield was 2.5 % collected at 30-60 min showed higher antiradical

capacity but the matrix was not exhausted after 3 h of extraction.

Key words: Castanea sativa, supercritical CO2, phenolic, ABTS radical scaveging

*Corresponding author

1. INTRODUCTION

The consumer demand for natural antioxidants has motivated the increasing search for cheap

sources. Among them, agricultural and forest wastes are particularly interesting, based on

economic and environmental reasons.

Castanea sativa Miller, belongs to the beech family (Fagaceae) and is an important chestnut

variety produced in temperate areas. Chestnut fruits are used for different food purposes,

wood has furniture applications and the leaves have medicinal properties [1]. The antioxidant

potential of extracts from chestnut flowers, leaves, skins and fruits have been examined and

the most active were those with the highest polyphenols and flavonoids content [2]. Chestnut

1
burs and shells are underutilized residues [3]. Different technologies have been studied for the

extraction of chestnut burs, including conventional solvents [3] and subcritical water

processing and further liquid-liquid extraction [4,5]. The non isothermal autohydrolysis of

chestnut burs (CB) was optimized and 22 g solids/100 g CB could be solubilized at 200 C;

further ethyl acetate extraction yielded 5.5 g extract/100 g raw material [4]. The purity of the

extracts could be enhanced by adsorption onto polymeric resins and further desorption with

ethanol, reaching 60 % phenolic content and antioxidant properties comparable to BHA and

BHT [6]. Ethanolic extracts from spiny burs also protected from lipid peroxidation in liposomes,

the activity being higher in those extracts with higher phenolic and flavonoid content [7].

Conventional solvent extraction with ethanol or with toluene-methanol could be applied

before hydrothermal fractionation leading to fiber rich fractions with antioxidant properties

[5]. SFE process has several advantages compared to conventional methods. One of the main

characteristics of SFE is that changing operational conditions allows the selective recovery of

some compounds, and usually SC-CO2 has been proposed for the extraction of phenolics from

vegetal biomass [8], but has not been tried for chestnut burs yet.

From the point of view of their application is interesting to find the best extraction conditions.

For this purpose, the extraction yield, antioxidant capacity and also the determination of the

kinetic parameters should be studied. Several authors have determined the extraction

isotherms and the kinetics parameters defining a global extraction yield (X0) as the maximum

amount of solute that can be extracted from a specific solid matrix under given conditions of

temperature, pressure and solvent to feed ratio in a SFE process [9-11].

The overall extraction curve (OEC) is determined by plotting the global extraction yields as a

function time of process. Usually this curve is characterized by three regions: constant

extraction rate period (CER), falling extraction rate period (FER) and diffusion-controlled rate

period (DC). In the CER period, the extraction occurs mostly by convection at a constant rate.

2
During the FER period a change in the mass transfer phenomena from convection to diffusion

happens, and finally the DC mass transfer period is mainly governed by diffusion [12].

The aim of this work is to study the SC-CO2 extraction of antioxidant components from

chestnut burs, identifying the most influencing variables on the extraction yield and antiradical

properties. Kinetic studies are also included.

2. MATERIALS AND METHODS

2.1. Raw materials

Chestnut (Castanea sativa) burs (CB) were collected in Ribeira Sacra (Ourense, Spain). Samples

of selected materials were air-dried, milled to pass a 1 mm screen, homogenized to avoid

differences in composition, and stored in sealed plastic bags. Bags containing CB samples were

kept in the darkness at room temperature until use.

Conventional solvent extraction

The ground chestnut bur samples were contacted with 80 % ethanol and hexane in Soxhlet

during 12 h.

Supercritical fluid extraction

The ground CB (10 g) were packed with glass beads into a 1 L extraction vessel (Thar Designs

SFE-1000F-2-C10, Pittsburgh, USA). The CO2 was pumped by a P-200A piston pump (Thar

Design Inc., Pittsburgh, PA, USA) at a flow rate of 10-35 g CO2/min. The modifier was pumped

by a HPLC pump (Scientific Systems, Inc., USA, model Series III). Modifier was used in the range

2-20% in the extracting solvent stream to provide better extraction yields. The extract was

collected during selected extraction times in the first separator at ambient temperature.

Pressure was studied in the range 10-35 MPa and temperature in the range 35-70 C. The

separator was further washed with ethanol to recover the extract and this solution was

combined with the extract collected. Ethanol was removed in rotavapor and the extracts were

kept under N2, at -20 C in the dark until analysis.

3
2.3. Analytical methods

The extracts were analyzed for total solids, total phenolics and radical scavenging capacity.

The phenolic content was determined by the Folin-Ciocalteu method [13], and expressed as
gallic acid (Sigma) equivalents.

Antixidant properties

,-Diphenyl- -picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging. The DPPH assay was carried out
-5
according to von Gadow et al. [14]. Two milliliters of a 3.610 M methanolic solution of DPPH

(Fluka), were added to 50 L of a methanolic solution of the antioxidant. The decrease in

absorbance at 515 nm was recorded after 16 minutes. The Inhibition Percentage (IP) was

calculated as the percentage of total DPPH radical which reacts with the antioxidant.

Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC) was measured as by Re et al. [15]. The ABTS

radical cation (ABTS+) [2,2-azinobis (3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonate)] was produced by

reacting 7 mM ABTS stock solution with 2.45 mM potassium persulfate, the mixture was kept

in the dark at room temperature for 16 h before use. ABTS+ solution was diluted with

phosphate buffer saline (PBS) (pH 7.4) to an absorbance of 0.70 at 734 nm and equilibrated at

30 C. After addition of 1.0 mL of diluted ABTS+ solution to 10 L of extract or Trolox standards

in ethanol or PBS, the absorbance reading was taken up to 6 min. Solvent blanks were used

and the percentage inhibition of absorbance was calculated as a function of the concentration

of extracts and Trolox.

Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP). The method originally developed by Benzie and

Strain [16] to measure the ferric reducing ability of plasma was modified as per Conde et al.

[17] to enable the handling of samples dissolved in ethanol. A reactive solution prepared with

25 mL of 300 mmol/L acetate buffer (pH 3.6), 2.5 mL of a 10 mmol/L 2,4,6-tripyridyl-s-triazine

(TPTZ) solution in 40 mmol/L HCl and 20 mmol/L ferric chloride in distilled water. An aqueous

solution of known Fe (II) concentration was used for calibration. Samples (100 L) were mixed

4
with 3 mL of the FRAP reagent and the absorbance was monitored at 593 nm. Aqueous

solutions of ascorbic acid were used for calibration.

3. RESULTS AND DISCUSSION

Effect of ethanol concentration

The effect of the amount of ethanol as modifier on the yield of antioxidant compounds and

their activity was evaluated. This influence was studied at 40 C, 20 MPa, using a CO2 flow rate

of 2-20 g/min and an extraction time of 30 min. Based on toxicological aspects, especially for

food applications, only ethanol was considered to as a polar modifier in the supercritical

carbon dioxide extractions. Figure 1a shows the solid extraction yield in the ethanol-modified

supercritical CO2. For practical purposes and to avoid the use of high ethanol proportions,

values higher than 20 % were not evaluated. The extraction yield increased from 0.3 to 1.4 g

extract /100 g CB with the ethanol concentration from 0 up to 20 %. Extraction yields obtained

with ethanol concentration higher than 10 % did not show significant increases. This

behaviour, even a slight drop in the extraction yield, was also obtained for other samples and

matrices using ethanol modified-CO2 [19-21]. This could be attributed to some solute-modifier

interactions that can weaken the solute-supercritical CO2 interactions.

Figure 1b shows the antiradical properties of the extracts produced. The antioxidant activity of

the compounds extracted by ethanol-modified SC-CO2 increased from 0.025 to 0.085 g

Trolox/g extract, with ethanol concentrations varying from 2 to 20 %. The lower increase in the

extraction yield at ethanol concentration upper to 10 % was not in agreement with the

antiradical properties, which showed a continuous increase with the ethanol concentration.

On the basis of these results, 10 % ethanol concentration was selected for further studies.

The major components identified in ethanolic extracts from chestnut burs were ellagic acid

and ellagitannin structures (25 %), also coumaric and gallic acid derivatives (10 %) and

flavonoid structures (9 %) were present. Positive correlation of ellagitannins with the

5
antioxidative activity were found [22]. Gallic acid esters of glucose, ellagic acid and small

amounts of a quercetin glucoside were also identifed in ethanolic and methanolic chestnut bur

extracts [3]. The extraction of ellagic and gallic acids and its glycosylated derivatives was

favoured by the addition of ethanol as cosolvent for the extraction from E. globulus bark [23]

and by methanol from J. curcas [24].

Yields close to 1.4 % were attained and the antiradical capacity was lower than 0.1 g Trolox per

gram of extract. This value is only slighlty lower than the ethanol extraction yield from

chestnut burs (1.8 %), which produced extracts with 0.5 % phenolics (as GAE) and 0.13 %

flavonoid content (as CE) [7]. Aqueous solutions of 50 % methanol at 75 C in 75 min yielded

19 % with 36 % GAE and with 50 % ethanol at the same temperature and in 30 min yielded 18

% extracts with 26 % GAE [3]. Ethanol extraction yielded 12 % and the extract contained 21 %

phenolics, with an EC50,DPPH = 0.38 g/L [5]. A more aggressive solubilization treatment

(autohydrolysis), allowed a yield of 3 % (GAE), a phenolic content of 60 % and one gram of

extract was as active ABTS radical scavenger as 0.85 g Trolox, EC50, DPPH was 0.14 g/L, lower than

for BHA (0.24 g/L) and the reducing power was 0.2 mM ascorbic acid equivalent [4]. These

extracts contained gallic acid as the major components.

The solubility of gallic acid methyl ester or methyl gallate in supercritical carbon dioxide,

modelled in the range 10 to 50 MPa and 313 to 333 K, showed maximum values at 333 K and

45-50 MPa [25]. Increasing pressure (30 MPa) and increasing concentrations of ethanol (15 %)

as cosolvent allowed increased extraction yields of low molecular weight phenols, and at the

higher values some were obtained in the extracts [26]. Gallic acid and coumaric acid were

extracted from grape pomace using 10 % modified ethanol operating at 313 K and at 20 and 35

MPa, respectively [27]. Gallic acid was among the major components in Vitis labrusca seed

extracts produced with supercritical carbon dioxide modified with 7 % ethanol at 45 C and 16

MPa [28]. Extraction with supercritical carbon dioxide modified with 15 % ethanol, provided

6
promising antioxidant properties of Eucalyptus camaldulensis leaf extracts [29], gallic acid and

ellagic acid being responsible for the antioxidant properties of the extracts.

The behaviour of the global yield isotherms obtained at 35, 45, 55 and 70 C under different

pressures (10-35 MPa) is shown in Figure 2. The highest global yields were obtained at 300 bar

due to the high solvent density. The solubility of solutes in supercritical fluids is influenced by

temperature and pressure, and is generally a function of the density of the solvent. However,

the effect of temperature on solubility can be complex due to the opposing factors of solute

vapor pressure and solvent density. Solute vapor pressure increases with increasing

temperature resulting in increased solubility while solvent density decreases resulting in

decreased solubility [30]. At 100 bar, increasing the temperature from 35 to 45 C increased

the global yield from 0.90 % to 1.10 %, while at 300 bar, the same temperature decreased the

global yield from 1.15 % to 0.95 %. These results indicate that the solute vapor pressure effect

is more pronounced at lower pressure and the solvent density effect is more effective at

higher pressure. This behaviour is known as crossover phenomenom [30] or retrograde [10]

and has been observed in studies about different bioactive compounds from vegetal biomass

[10, 11, 30, 31]. The different yields obtained varying pressure and temperature probably

occurred due to the solubility of different kind of solutes in the fluid phase as a function of

process variables. As noted, the crossover phenomenon was observed between the isotherms

at 35 and 45 C at approximately between 25 and 35 MPa; while between 55 and 70 C

retrograde behaviour occurs at 300 bar. When considering the ethanol-modified SC-CO2

extractions performed at 35 and 55 C the retrograde point is close to 175 bar.

As a general trend, the yield increases with pressure at 45, 55 and 70 C. The lowest values

were close to 0 g extract/ 100 g CB obtained at 10 MPa and 55 and 70 C. The higher values

were obtained operating at 30 MPa and 55 and 70 C.

7
Maximum yields could be found at 30 MPa and maximum antiradical activity of the extracts

was observed at 20 MPa (Figure 2b). In addition, crossover phenomenon in antiradical activity

at 20-30 MPa was observed. This behaviour for methyl gallate and for other low molecular

weight phenolics was found between 10 and 20 MPa [25, 32].

Effect of solvent flow rate

To determine the effect of CO2 flow rate on the extraction yield and on the antioxidant activity

of extracts produced, the SFE process was carried out using different CO2 flow rate (10, 15, 20,

25, 30 and 35 g CO2/min), while other extracting parameters were fitted as following:

extraction temperature of 45 C, extraction time of 30 min and a pressure of 20 MPa, with 10%

ethanol as modifier.

The effects of CO2 flow rate on the extraction yield and on the antioxidant activity are shown in

Figure 3a. As can be seen in this figure, the increase in CO2 flow rate improved the extraction

yield significantly. When the flow rate varied from 10 to 25 g CO2/min the yield increased from

0.60 to 1.13 g extract/100 g CB. Further increase in the CO2 flow rate did not improve

significantly the extraction yields, and even at 35 g CO2/min the extraction yield decreased.

Figure 3.b shows the effect of the CO2 flow rate on the antioxidant activity of extracts. The

increase on the flow rater showed a beneficial effect on the TEAC values, although these were

moderate values.

The TEAC values of the extracts obtained by ethanol-modified SC-CO2 varying the flow rate

between 20 and 35 g CO2/min increased from 0.058 to 0.084 g Trolox/g extract, although the

shape of antioxidant curve and the deviation errors in each value suggest a similar antioxidant

behavior of extracts produced, with antioxidant values around 0.07 g Trolox/g extract. Based

on these results, the flow rate of 20 g CO2/min was used for the kinetic study.

8
Extraction kinetics

The compromise conditions that provided good extraction yield and antioxidant activity (20

MPa, 55 C) were selected for determining the overall extraction curve (OEC) (Figure 4). The

total extract recovered in the OEC after 180 min of processing was 2.5 g extract/100 g CB. The

total yield obtained by Soxhlet extraction was 11.8 % using ethanol and 1.25 % with hexane.

The OEC showed two of the three characteristics periods of a SFE process: CER and FER. The

third period (DC) was not reached during the process time used. An initial lag period of

approximately 15 min (tLAG = 14.7 min) for the SFE process was also found until the system

reached the pseudosteady state [12]. The yield at the end of the CER period (64.5 min) was 70

% of the total yield. The lack of the DC period line indicates that the raw material bed was not

exhausted after 180 min of extraction.

The ABTS radical scavenging of the individual fractions is shown in Figure 5. The most active

fractions were those collected between 30 and 60 min, showing an activity of 10 % that of

Trolox.

CONCLUSIONS

Supercritical carbon dioxide with 10 % ethanol as modifier was suited for the extraction of

compounds with antioxidant properties from chestnut burs. The optimal temperature was 55

C and for higher yields and antiradical action, 20 MPa could be selected. The optimal solvent

flow rate was 20 g/min and the fractions collected at 30-60 min showed higher antiradical

capacity. The remaining solid could be suited for further hydrothermal processing as in

previous works.

ACKNOWLEDGMENTS

Beatriz Beatriz Diaz-Reinoso thanks the Spanish MEC for her grant (reference BES-2005-7525)

and Miguel Estvez thanks the Xunta de Galicia (INBIOMED project, with partial funding from

the FEDER Program of the European Union).

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[32] R. Murga, M.T. Sanz, S. Beltrn, J.L. Cabezas, Solubility of syringic and vanillic acids

in supercritical carbon dioxide, Journal of Chemical and Engineering Data 49 (2004) 779-782.

13
FIGURES

Figure 1: Effect of ethanol concentration on (a) extraction yield and (b) TEAC.

a)
Extraction yield (g extract/100 g CB) 1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0 5 10 15 20 25

Ethanol (%)

b)
0.12

0.10
TEAC (g trolox/g extract)

0.08

0.06

0.04

0.02

0.00
0 5 10 15 20 25

Ethanol (%)

14
 Figure 2: Effects of pressure and temperature on (a) extraction yield and (b) TEAC.
35C, 45C, 55C, 70C.
a)

1.80

Extraction yield (g extract/100g CB) 1.60

1.40
1.20
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
0 10 20 30 40
P (MPa)

b)
0.12
TEAC (g Trolox/g extract)

0.10

0.08

0.06

0.04

0.02

0.00
0 10 20 30 40

P (MPa)

15
 Figure 3: Effect of solvent mass flow on (a) extraction yield and (b) TEAC.

a)
1.6

Extraction yield (g extract/100 g CB)

1.4

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0
0 10 20 30 40

Solvent mass flow (g/min)

b)
0.12
TEAC (gTrolox/g extract)

0.10

0.08

0.06

0.04

0.02

0.00
0 10 20 30 40

Solvent mass flow (g/min)

16
 Figure 4: Extraction kinetics of total soluble at 55 C and 20 MPa
with 10 % ethanol as modifier.

Extraction yield (g extract/100 g CB)

3.0

2.5 FER

2.0

1.5
CER
1.0

0.5

0.0
tLAG tCER
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Time (min)

Figure 5: (a) Extraction yield, (b) TEAC values, (c) FRAP and (d) DPPH scavenging activity of
fractions collected during 3h SFE at 55 C and 20 MPa with 10 % ethanol as modifier.
a)
0.70
Extraction yield (g extract/100 g CB)

0.60

0.50

0.40

0.30

0.20

0.10

0.00
F0 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8

b)

0.14
TEAC (g Trolox/g extract)

0.12

0.10

0.08

0.06

0.04

0.02

0.00
F0 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8

17
c)
1.00

FRAP (mM Ascorbic Acid)

0.80

0.60

0.40

0.20

0.00
F0 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8

b)
20.00
18.00
16.00
14.00
12.00
IP (%)

10.00
8.00
6.00
4.00
2.00
0.00
F0 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8

18
5. DISCUSIN GENERAL
 Discusin general

5. DISCUSIN GENERAL

5.1. RESIDUOS DE ALCOHOLERA: BAGAZO DESTILADO Y VINAZAS

Bagazo destilado

El bagazo destilado se prens para recuperar todo el lquido retenido en l. Se obtuvo as una
corriente lquida con un contenido en compuestos fenlicos de 4,4 g EAG/L y una actividad
frente al radical ABTS de 51,9 mM equivalentes de Trolox. El slido resultante se someti a una
etapa de lavado con agua caliente. La corriente acuosa obtenida present un contenido en
compuestos fenlicos de 0,23 g EAG/L y valor de TEAC de 3,42 mM.

Con el fin de aumentar la concentracin en compuestos fenlicos y la actividad antioxidante de

las corrientes obtenidas, se evalu el empleo de distintas membranas de NF y UF. Los extractos
acuosos obtenidos a partir del bagazo prensado se procesaron empleando cinco membranas
diferentes (InsideCram, Nanomax 50, Nanomax 95, DL2540 y GE2540) cuyas caractersticas
se encuentran recogidas en la Tabla 3.2.

El primer paso fue la determinacin de las condiciones ptimas de operacin para cada una de
las membranas empleadas. Para ello se trabaj de manera cerrada recirculando al tanque de
alimentacin tanto la corriente de retenido como la de permeado. Se analiz el efecto de la
PTM en los flujos de permeado y en la selectividad de cada una de las membranas.

Solo se observ una relacin lineal entre ambas variables en el caso de las membranas
Nanomax 95 y GE2540, mientras que el resto de las membranas slo mantuvieron la linealidad
a las presiones ms bajas utilizadas. La mayor cada de flujo de permeado se observ en la
membrana InsideCram y en menor medida en la membrana Nanomax 95, mientras que el
resto mostraron flujos prcticamente estables a las PTM probadas. Por otro lado los flujos de
permeado obtenidos no presentaron proporcionalidad respecto al tamao de corte de las
membranas. Los mayores flujos de permeado se obtuvieron con las membranas Nanomax 95
(250 Da) e InsideCram (1 kDa), mientras que la membrana de GE2540 (1 kDa) alcanz el flujo
de permeado ms bajo. Esto sugiere que el material de la membrana podra jugar un papel
importante en el proceso de filtracin.

La selectividad de la membrana vendr dado por el coeficiente de rechazo. Para la membrana

InsideCram el rechazo tanto en slidos en suspensin como en compuestos fenlicos
aument con la presin, mientras que estos valores permanecieron prcticamente constantes

219
Discusin general

en el caso de las membranas Nanomax y decrecieron para las membranas DL250 y GE250. La
capacidad antioxidante expresada como valores TEAC present un comportamiento similar.

Con estos resultados se seleccionaron las PTM ptimas para llevar a cabo los ensayos en
circuito abierto retirando de manera continua la corriente de permeado, con el fin de estudiar
la concentracin de los extractos acuosos.

Para todas las membranas el flujo de permeado descendi gradualmente como consecuencia
del aumento de la concentracin de solutos en el retenido. Este descenso fue especialmente
pronunciado al principio del proceso en el caso de la membrana InsideCram. Sin embargo con
esta membrana se alcanz el mayor grado de concentracin permitiendo disminuir el volumen
inicial de muestra en ms de 6 veces.

En general, ninguna de las membranas utilizadas mostr diferencias de rechazo entre

compuestos fenlicos y azcares. La similitud de pesos moleculares de las especies presentes
en la alimentacin dificulta el proceso de fraccionamiento, por lo que la operacin de filtracin
se orient hacia la concentracin de la corriente de alimentacin.

Tras el proceso de concentracin el contenido en compuestos fenlicos se increment entre 3

y 6 veces respecto a la corriente inicial (0,615-1,090 g EAG/L). Estos valores son entre 2 y 3
veces superiores a los encontrados para los extractos acuosos de bagazos de uva tinta (Pinelo y
col, 2005a) y comparables a los obtenidos a partir de bagazo destilado de uva tinta utilizando
etanol acidificado como disolvente (Brazinha y col., 2014). La actividad antioxidante frente al
radical DFPH se mantuvo en valores similares a los de la alimentacin y fue ligeramente
superior a la presentada por los antioxidantes sintticos BHA y BHT. Los valores de actividad
frente al radical ABTS aumentaron 3-6 veces, obtenindose valores (12,1-22,5 mM Trolox)
comparables a los obtenidos a partir de bagazo prensado mediante extraccin asistida por
ultrasonidos (Gonzlez-Params y col., 2004).

Con el objetivo de obtener un extracto con menor cantidad de impurezas se llevaron a cabo
extracciones con acetato de etilo de los concentrados obtenidos. Los mejores rendimientos de
extraccin se obtuvieron con las membranas Nanomax 50 e InsideCram. Esta ltima condujo
adems a un extracto con un contenido en compuestos fenlicos de 51,7 g EAG/100 g
extracto. Se han obtenido valores comparables mediante extraccin convencional con
distintos disolventes a partir de semillas de uva (Jayaprakasha y col, 2003; Baydar y col., 2004).

220
 Discusin general

Finalmente se evalu la eficacia de las etapas de limpieza necesarias para restaurar la

permeabilidad inicial de las distintas membranas. Slo la membrana InsideCram no present
ensuciamiento irreversible, aunque fueron necesarios 4 lavados para recuperar la
permeabilidad inicial. El resto de las membranas presentaron ensuciamiento irreversible,
perdiendo entre un 2-7 % de la permeabilidad inicial.

En base a estos resultados se llev a cabo la concentracin de la corriente lquida de prensado

del bagazo destilado. Se emplearon las membranas InsideCram, Nanomax 50 y Nanomax 95
en las condiciones de presin transmembrana optimizadas para los extractos acuosos.

El coeficiente de rechazo de compuestos fenlicos fue del 96,6 % en el caso de la membrana

Nanomax 95, mientras que para la membrana Nanomax 50, del mismo material pero con un
tamao de corte menor, el valor encontrado fue de 51,5 %. A su vez el efecto del material
qued reflejado en el valor de 71,7 % encontrado para la membrana cermica InsideCram,
con un tamao de corte similar a la membrana Nanomax 50.

En cuanto a la actividad antioxidante de los productos obtenidos con cada una de las
membranas se encontraron valores ligeramente inferiores a los de los antioxidantes sintticos.
En general los valores de actividad como captadores de radicales DFPH (CE50 = 1,51-1,64 g/L)
fueron intermedios entre los encontrados para el BHA y el BHT, mientras que los valores
obtenidos para el radical ABTS fueron menores que para el Trolox (0,385-0,410 g Trolox/g
extracto), aunque ligeramente superiores a los valores encontrados por Rockenbach y col.
(2011b) para los extractos metanlicos de bagazo de uva tinta.

Como medio para mejorar estos resultados, los concentrados se extrajeron con acetato de
etilo, con lo que se consigui incrementar el contenido en compuestos fenlicos de 4 a 6 veces
respecto al concentrado inicial. Se han alcanzado purezas comparables mediante la extraccin
de bagazo de uva tinta liofilizada con distintas mezclas de etanol, metanol y agua (Thimothe y
col., 2007, Hogan y col., 2010). El mejor resultado correspondi al concentrado de la
membrana Nanomax 50 (42,5 g EAG/100 g extracto) con una actividad antioxidante frente al
radical DFPH (CE50 = 0,293 g/L) similar a la de antioxidantes comerciales y una capacidad
antioxidante frente al radical ABTS equivalente a 2 g de Trolox por gramo de extracto. Estos
resultados son similares a los obtenidos mediante autohidrlisis de bagazo de uva seguido de
extraccin con acetato de etilo de los compuestos fenlicos presentes en la fase lquida (Conde
y col., 2011a). El poder reductor para los extractos de acetato de etilo para esta membrana es
comparable al obtenido para el bagazo de uva blanco (Makris y col., 2007), mientras que el

221
Discusin general

coeficiente actividad antioxidante para el ensayo del -caroteno fue menor que el obtenido en
extractos acuosos de bagazo prensado (Lapornik y col., 2005) o para zumo de uva (Kulisic-
Bilusicy col., 2009).

Por otro lado, las corrientes de permeado procedentes del proceso de filtracin con cada una
de las membranas todava presentan compuestos fenlicos de bajo peso molecular, por lo que
se emple un resina polimrica Sepabeads SP700 para su aprovechamiento. Mediante este
procedimiento se obtuvieron fracciones con un contenido en compuestos fenlicos (37,4-53,6
g EAG/g extracto) 4-5 veces mayor que en los concentrados obtenidos mediante tecnologa de
membranas y ligeramente superiores a los extractos de acetato de etilo. Conde y col. (2011b)
consiguieron aumentar la pureza de los extractos de bagazo de uva tinta en ms de un 50 %
mediante autohidrlisis y extraccin con acetato de etilo tras la adsorcin en resinas
polimricas y posterior desorcin con etanol. Los valores de actividad antioxidante obtenidos
frente al radical ABTS (9,9-10,5 mM Trolox) fueron veinte veces mejores que los de los
productos obtenidos nicamente por membranas, 5 veces superiores a los extractos de
acetato de etilo y mayores que los obtenidos para extractos etanlicos de uva Pedro Ximnez
(Peinado y col., 2009), mientras que los valores de FRAP obtenidos fueron el doble que los
encontrados por Rockenbach y col. (2011b) para piel de uva tinta.

Tanto los extractos de acetato de etilo como los permeados desorbidos presentaron un poder
reductor equivalente a 2 mM de cido ascrbico y una actividad antioxidante en emulsin
considerablemente menor que los antioxidantes sintticos BHA y BHT, pero similar a la
obtenida para extractos etanlicos de uva Negroamaro a 80 ppm (Negro y col., 2003).

Vinazas

Las vinazas de vino blanco procedentes de destilera se utilizaron como fuente renovable y de
bajo coste de compuestos fenlicos con actividad antioxidante. Estas vinazas se procesaron
mediante el esquema propuesto en la patente para la separacin y purificacin de los
compuestos antioxidantes presentes. Este esquema incluye una serie de etapas como
centrifugacin o tecnologa de membranas, permitiendo evitar tanto el uso tanto de altas
temperaturas como disolventes orgnicos. El proceso optimizado para la recuperacin y
concentracin de compuestos fenlicos presentes en las vinazas de vino blanco es
relativamente simple, econmico, escalable y respetuoso con el medio ambiente.

El producto final obtenido, de color claro y con un olor aromtico caracterstico, present un
contenido en compuestos fenlicos de 45 g EAG/100 g. El anlisis mediante HPLC mostr que

222
 Discusin general

los principales componentes incluyen flavonoides, flavonoles y cidos hidroxibenzoicos e

hidroxicinmicos, compuestos previamente identificados en efluentes de alcoholera (Borja y
col., 1993).

Se llevaron a cabo distintos ensayos in vitro para la determinacin de la capacidad antioxidante

del producto final obtenido. La capacidad de captacin del radical ABTS fue comparable a casi
2 g de Trolox mientras que la capacidad antioxidante frente al radical DFPH fue mayor que la
presentada por el BHT, comparable a las de la rutina o el cido ascrbico, y ligeramente
inferior al antioxidante sinttico BHA. El poder reductor fue equivalente a 0,5 g de cido
ascrbico. El extracto fue efectivo frente a ERO, pero en general para obtener estos resultados
de actividad se requirieron concentraciones mayores que las de los estndares positivos
utilizados como control. Por otro lado la actividad del extracto frente al radical NO fue
comparable a la presentada por la rutina, mientras que el radical ONOO- mostr una capacidad
antioxidante menor que la del cido ascrbico. Se han encontrado actividades frente a ERO y
ERN similares en extractos de hoja de eucalipto (Almeida y col., 2009) y de frutas tropicales
(Chist y col., 2012; Ribeiro y col., 2014). Finalmente, la capacidad de proteger la oxidacin de
una emulsin de cido linoleico fue casi del 60 % de la actividad presentada por los
antioxidantes sintticos BHA y BHT, mientras que la capacidad inhibidora de la hemolisis de
eritrocitos en presencia de AAPH fue comparable a la epicatequina.

Se evalu la irritabilidad cutnea derivada de la aplicacin tpica del extracto mediante el

ensayo in vitro EpiSkin. Los resultados obtenidos mostraron que el producto final obtenido no
es irritante cuando se aplica al 1 %.

5.2. RESIDUOS FORESTALES: HOJAS Y ERIZOS DE CASTAO

Hoja de castao

La primera parte del trabajo con estos residuos se centr en la evaluacin de la influencia de
las principales variables implicadas en el proceso de extraccin con disolventes. Para ello se
llev a cabo un diseo de experimentos con el fin de seleccionar las condiciones de operacin
que conducen a la obtencin de extractos con mayor contenido en compuestos fenlicos y
mayor actividad antioxidante. Como disolventes se emplearon agua, etanol y metanol.

Se observ que el tiempo de extraccin y la temperatura fueron las variables con mayor efecto
en el rendimiento global. Los mejores rendimientos de extraccin se obtuvieron utilizando
agua como disolvente alcanzndose un valor de 18,17 % en las condiciones: 90 min, 50 C y

223
Discusin general

25 mL disolvente/g castaa. Barreira y col. (2008) obtuvieron un rendimiento de extraccin

similar utilizando agua hirviendo durante 30 min y una relacin lquido: slido de 10 mL/g. El
empleo de etanol y metanol como disolvente condujo a menores rendimientos de extraccin
(7,02-13,76 % y 8,16-14,53 %, respectivamente).

El rendimiento en compuestos fenlicos aument con la temperatura tanto para el agua como
para el etanol. Los mejores rendimientos de extraccin se obtuvieron con el agua (9,16 g
EAG/100 g) en las condiciones de 90 min, 50 C, 25 mL/g. Los resultados obtenidos con etanol
y metanol fueron entre 2-4 y 3-10 veces menores que los observados para el agua,
respectivamente. Adems, la fraccin msica correspondiente a los compuestos fenlicos fue
de hasta 54 g EAG/g extracto para los extractos acuosos y dos veces superior a las obtenidas
en los extractos alcohlicos, por lo que en las condiciones ms favorables, el agua result ser el
mejor disolvente para la extraccin de compuestos fenlicos. Barreira y col. (2010) obtuvieron
purezas similares utilizando agua a temperatura ambiente durante una hora de extraccin,
mientras que la utilizacin de otros disolventes (Callliste y col., 2005; Almeida y col., 2008b) o
agua hirviendo (Barreira y col., 2008), condujo a extracciones menos selectivas.

En cuanto a la actividad antioxidante medida como captacin del radical DFPH los extractos
acuosos fueron los ms activos obtenindose una CE50 de 0,29 mg/mL. Barreira y col. (2008)
obtuvieron una actividad antioxidante solo ligeramente superior (CE50 = 0,17 mg/mL), mientras
que la utilizacin de agua a temperatura ambiente condujo a resultados comparables (Barreira
y col., 2010). Los mejores resultados obtenidos con etanol y metanol fueron de 0,45 mg/mL y
0,36 mg/mL, respectivamente. Almeida y col. (2008b) obtuvieron actividades antioxidantes
mayores (CE50 = 14-23 g/mL) utilizando distintas mezclas de etanol y agua en extracciones
consecutivas de 20 minutos cada una. En general la temperatura necesaria para obtener
extractos con mayor capacidad antioxidante fue menor en el caso del agua (25-37,5 C) que
para los alcoholes (50 C). El efecto de la temperatura en este caso no fue el mismo que en el
rendimiento de extraccin de compuestos fenlicos, ya que temperaturas intermedias
favorecieron la extraccin de compuestos activos.

En general, se observ que las condiciones ptimas para obtener un extracto antioxidante a
partir de hoja de castaa fueron temperaturas menores de 30 C y un intervalo de tiempo
entre 50 y 90 min utilizando agua como disolvente.

El anlisis mediante HPLC de los extractos acuosos obtenidos operando en las condiciones
seleccionadas permiti identificar los compuestos fenlicos presentes, que incluyeron: cido

224
 Discusin general

glico, cido protocatquico, cido 4-hidroxibenzoico, cido vanllico, rutina, quercetina y

apigenina.

Finalmente, se evalu la actividad antioxidante como captadores de ERO y ERN del extracto
acuoso obtenido. Se observaron actividades limitadas frente al perxido de hidrgeno y al
cido hiplocloroso mientras que se obtuvieron mejores resultados frente al radical superxido,
al oxgeno singlete y especialmente frente a ERN, mostrando una tendencia similar a la
encontrada en la bibliografa (Almeida y col., 2008a).

El siguiente paso del presente trabajo consisti en el desarrollo de un proceso de fcil

implementacin y escalado que permita la obtencin de extractos antioxidantes con mayor
pureza en compuestos fenlicos, sin limitar su capacidad antioxidante. Para ello se escogieron
las condiciones del experimento que condujeron a un extracto con mayor actividad
antioxidante (90 min, 25 C, 25mL/g) para llevar a cabo el escalado a 25 L de la extraccin
acuosa. En estas condiciones se obtuvo un rendimiento de extraccin del 13,5 %, con un
contenido en compuestos fenlicos de 33,8 %. Esta corriente se proces mediante una
secuencia de dos membranas Omega de 5 kDa y 10 kDa, respectivamente. Las caractersticas
de ambas membranas se encuentran recogidas en la Tabla 3.2.

En los experimentos a flujo abierto se observ que la cada de flujo de permeado fue gradual
en la membrana de 5 kDa. Sin embargo esta cada fue muy pronunciada en la membrana de
10 kDa con un patrn de flujo muy irregular, posiblemente debido a la deposicin de solutos
sobre la superficie de la membrana. El porcentaje de compuestos fenlicos adsorbidos sobre la
superficie de esta membrana fue del 21,2 % y del 20,9 % en el caso de protena soluble. Para
limitar este efecto se plante la dilucin del retenido procedente de la membrana de 5 kDa
antes de su paso a la membrana de 10 kDa. Esta configuracin permiti prolongar el proceso
de filtracin, sin embargo se observ una cada del 80 % del flujo al principio de la operacin,
poniendo de manifiesto serios problemas de ensuciamiento en esta membrana. Con el fin de
predecir la cada de flujo y explicar los mecanismos de ensuciamiento que tiene lugar en el
proceso, se evalu el ajuste de los datos experimentales distintos modelos tericos (Hermia,
1982; Vela y col., 2009). Para todos los experimentos, la cada de flujo en la membrana de
5 kDa fue consistente con los modelos de bloqueo de poro estndar y bloqueo de poro
intermedio. En el caso de la membrana de 10 kDa operando con dilucin de la corriente de
entrada el modelo de bloqueo de poro estndar fue el que mejor se ajust a los datos
experimentales. Sin embargo, operando sin dilucin de la alimentacin ninguno de los
modelos se ajust a la cada de flujo observada.

225
Discusin general

Los rechazos obtenidos indicaron que ninguna de las membranas empleadas present una
retencin preferente frente a protenas o compuestos fenlicos. La protena soluble se
concentr en el retenido mientras que el nitrgeno no proteico se recuper tanto en la
corriente de retenido como en la de permeado. En cuanto a los compuestos fenlicos, se
observ la concentracin selectiva de algunos flavonoides (rutina, quercetina y apigenina)
mientras que compuestos fenlicos ms simples (cido vanillico) se identificaron
preferentemente en la corriente de permeado. Otros compuestos como el cido glico se
recuperaron en ambas corrientes. Al final del proceso la concentracin en compuestos
fenlicos aument un 18 %, mientras que las protenas doblaron su concentracin.

Dado que la tecnologa de membranas no result efectiva para la eliminacin de las protenas,
se incluy una etapa de precipitacin con etanol. Se obtuvo un compuesto final con una
pureza en compuestos fenlicos del 46 %. La actividad antioxidante frente al radical ABTS
obtenida fue ligeramente superior a la del Trolox (1,14 g Trolox/g extracto) mientras que la
actividad frente al radical DFPH (CE50 = 0,26 g/L) fue ligeramente inferior que la del BHA
(0,245 g/L).

Se ha encontrado en la bibliografa que los extractos de hoja de castaa obtenidos con

etanol:agua no presentaron efectos irritantes en piel (Almeida y col., 2008b), por lo que
finalmente se evalu la irritabilidad del extracto acuoso obtenido tras su concentracin por
membranas. La ausencia de efectos irritantes de la piel en tejidos humanos reconstruidos
(EpiSkin) mostr que el producto es seguro al 1 % para su uso tpico en aplicaciones
cosmticas.

Erizos de castao

En la extraccin supercrtica de erizos de castao se evalu, en primer lugar, el efecto de la

presencia de etanol como modificador en el rendimiento de extraccin as como en la
actividad antioxidante frente al radical ABTS de los extractos obtenidos. Para ello se llevaron a
cabo extracciones a 200 bar y 40 C utilizando concentraciones de etanol entre 2 y 20 %. El
empleo de modificador supuso un aumento en el rendimiento de extraccin de hasta 5 veces.
Utilizando una concentracin del 10 % de etanol se alcanz un valor de 1,27 g/100 g de erizo
de castao. Por otro lado el empleo de concentraciones entre 5 y 20 % de etanol dio lugar a
extractos con una capacidad antioxidante frente al radical ABTS en el intervalo 0,035-0,086 g
Trolox/g extracto, mejorando la capacidad antioxidante obtenida con CO2 puro entre 1,2 y 3
veces. La utilizacin de etanol como modificador ha tenido efecto positivo en la extraccin

226
 Discusin general

supercrtica a partir de otros residuos de origen forestal, as el empleo de concentraciones de

etanol del 5 % supuso un aumento de 1,5 veces respecto a la extraccin si modificador de hoja
de anacardo (Leito y col., 2013), mientras que concentraciones de 15 % mejoraron en ms de
6 veces la extraccin de compuestos fenlicos a partir de corteza de eucalipto (Santos y col.,
2012).

En base a los resultados obtenidos, se analiz el efecto de la presin y la temperatura en el

rendimiento de extraccin y TEAC utilizando etanol en una concentracin del 10 %. El aumento
en la presin de extraccin ejerci un efecto positivo tanto en el rendimiento de extraccin
como en la capacidad antioxidante de los extractos como resultado del aumento de la
densidad del CO2 (y en consecuencia, de su capacidad solvatante). Por otro lado operando a
100 bar el aumento de la temperatura supuso una disminucin en los rendimientos de
extraccin, debido a la disminucin de la densidad del disolvente, mientras que a partir de
200 bar, el efecto de la presin de vapor de soluto se vuelve predominante y se observa un
aumento del rendimiento de extraccin con la temperatura a pasar de la disminucin de la
densidad del disolvente.

Las condiciones de extraccin ptimas se fijaron en 200 bar y 55 C. Se obtuvo as un

rendimiento de extraccin de 1,18 g extracto/100 g de hoja de castao y una actividad
antioxidante equivalente a 0,076 g Trolox/g extracto. Se han obtenido rendimientos de
extraccin similares a partir de erizo de castao en la extraccin con etanol al 50 % mediante
ultrasonidos (ivkovi y col., 2010) o mediante Soxhlet utilizando acetona como disolvente
(Vzquez y col., 2009).

En estas condiciones se utilizaron caudales de CO2 entre 10-35 g/min y se estudi su efecto
sobre el rendimiento de extraccin. A 10 g/min se obtuvo un rendimiento de extraccin de
0,59 g extracto/100 g de erizo de castao, mientras que a 20 g/min este valor aument hasta
1,16 g extracto/100 g de erizo de castao y se mantuvo prcticamente constante en el
intervalo de caudales de 20-35 g/min. La actividad antioxidante frente al radical ABTS se
increment desde 0,058 g Trolox/g extracto hasta 0,084 g Trolox/g extracto con el aumento
del flujo de caudal, sin embargo la forma de la curva antioxidante obtenida y los errores de
desviacin en cada valor sugieren un comportamiento constante de los extractos obtenidos
alrededor de 0,07 g Trolox/ g extracto. En base a estos resultados se seleccion como ptimo
el caudal de 20 g/min.

227
Discusin general

Con el fin de evaluar la influencia del tiempo en la extraccin supercrtica del erizo de castao,
se midi la cintica de extraccin durante 3 h en las condiciones ptimas (200 bar, 55 C,
20 g/min de CO2, 10 % etanol). La forma de la curva de extraccin obtenida indica la existencia
de dos etapas controladas por diferentes mecanismos de transferencia de materia. Durante
aproximadamente la primera hora del proceso, la extraccin est gobernada por el transporte
convectivo, alcanzndose al final de esta etapa un 70 % de la extraccin total. Una vez
agotados los solutos de la superficie de la muestra, comienzan a ser extrados los compuestos
del interior de la matriz slida y la difusin pasa a ser el mecanismo predominante. El
rendimiento global obtenido tras 3 h de extraccin fue de 2,5 g extracto/100 g de erizo de
castao. Las fracciones recogidas entre los 30 y 60 min fueron las ms activas con una
capacidad antioxidante frente al radical ABTS entre 0,1-0,12 g Trolox/g extracto.

5.3. RESIDUOS DE INDUSTRIA ALIMENTARIA: BAGAZOS DE FRUTOS DEL

BOSQUE

En general los mayores rendimientos de extraccin supercrtica (1,4-5,8 %) se obtuvieron en el

intervalo de presiones mayores (200-300 bar). Se han obtenido valores comparables en la
extraccin supercrtica de bagazo de arndano trabajando a 200 bar y utilizando etanol como
modificador (Paes y col., 2014), mientras que la extraccin supercrtica asistida por
ultrasonidos de bagazo de mora en condiciones de presin similares condujo a rendimientos
ligeramente superiores (Pasquel-Retegui y col., 2014). Mediante extraccin convencional
utilizando metanol como disolvente se alcanzaron rendimientos de extraccin entre 4 y 9 %.

El intervalo de presiones ms bajo, 8-15 MPa, favoreci el rendimiento en compuestos

fenlicos, salvo en el caso del bagazo de arndano rojo donde se obtuvo un rendimiento
mximo en el segundo separador de 84 mg EAG/100 g bagazo a 30 MPa. Por otro lado, la
pureza de los extractos obtenidos aument con la presin, obtenindose los valores ms altos
a presiones a partir de 150 MPa. Los valores obtenidos variaron entre 1,5-9 g EAG/100 g
extracto, siendo la extraccin ms selectiva en el caso del arndano azul. Paes y col. (2014)
obtuvieron purezas similares para el bagazo de arndano azul trabajando a 200 bar y un 10 %
de etanol como modificador. Se han alcanzado purezas de hasta 5 g EAG/100 g en la extraccin
supercrtica asistida por ultrasonidos a 200 bar y 60 C con modificador a partir de bagazo de
fresa (Pasquel-Retegui y col., 2014).

228
 Discusin general

En el caso de la extraccin convencional la pureza de los extractos obtenidos vari entre 13,8-
27 g EAG/100 g extracto, obtenindose el mximo valor en el caso de la frambuesa tras 18 h
de extraccin.

La actividad antioxidante de los extractos obtenidos tanto por extraccin convencional como
supercrtica de los distintos bagazos se estudi mediante diferentes mtodos in vitro. En el
caso de los extractos metanlicos los mejores resultados se obtuvieron para la frambuesa que
present una actividad frente al radical DFPH (CE50 = 0,30 g/L) comparable al BHA. Los
extractos supercrticos mostraron mayor actividad antioxidante frente al radical ABTS que
frente al radical DFPH, pero en ambos casos mucho menores que las presentadas por los
extractos en metanol.

La composicin de los extractos metanlicos se analiz mediante GC-MS. Los compuestos

fenlicos identificados incluyeron cido cprico, cido benzoico, vainillina y cido vainllico.
Otros compuestos identificados que pueden contribuir a las propiedades antioxidantes de los
extractos fueron maltol, cido cinmico y benzaldehdo.

229
6. CONCLUSIONES
 Conclusiones

6. CONCLUSIONES

El empleo de dixido de carbono supercrtico result til para la extraccin de

compuestos antioxidantes a partir de bagazos de frutos del bosque y erizo de castaa.

En el caso de los bagazos de fruto rojo los mejores rendimientos de extraccin se

alcanzaron en el intervalo de presiones entre 200 y 300 bar. La extraccin ms
selectiva se obtuvo en el caso del arndano azul alcanzndose una pureza en el
segundo separador de 9 g EAG/100 g extracto.

Las condiciones ptimas de extraccin supercrtica de erizo de castaa fueron de 200

bar, 55 C y un 10 % de etanol como modificador utilizando un flujo de disolvente de
de 20 g/min. El rendimiento global tras 3 h de extraccin fue de 2,5 % siendo las
fracciones con mayor capacidad antirradicalaria las recogidas entre los 30 y 60 min.

Los procesos de filtracin con membranas desarrollados en la presente Tesis han

resultado prcticos, de fcil implementacin y eficaces para la concentracin de
corrientes y obtencin de productos con actividad antioxidante. El contenido en
compuestos fenlicos se increment de 2 a 6 veces respecto a las corrientes iniciales.
La actividad antioxidante in vitro de los productos finales obtenidos fue mayor que la
presentada por las corrientes iniciales. La incorporacin de una etapa de extraccin
con acetato de etilo o de precipitacin con etanol permiti aumentar la pureza de los
extractos obtenidos. La utilizacin de resinas polimricas de adsorcin-desorcin fue
til para recuperar los compuestos fenlicos presentes en las corrientes de permeado.

Los productos finales obtenidos presentaron actividades antioxidantes comparables a

las de compuestos puros y antioxidantes sintticos. Los productos obtenidos a partir
de hoja de castao y vinazas de vino blanco no presentaron irritabilidad cutnea a
concentraciones de 1 %, por lo que podra ser posible su uso en la formulacin de
cosmticos.

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