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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS


ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

Deteccin molecular de regiones oncognicas E6 y E7 de Virus del Papiloma


Humano mediante PCR en pacientes Papanicolaou negativo del Instituto
Regional de Enfermedades Neoplsicas de La Libertad.
Biologa VI A
(Mesa N 02)
AUTOR: Br. Josu Ricardo Arteaga Nuez.
ASESOR: Blgo. Ms. C. Manuel Pesantes Vera
Curso: Biologa Celular y Molecular.
Alumnos:
- CUADRA QUISPE ELGAR JAVIER
- CARRANZA RODRGUEZ NELLY
- CAMPOS LEN DIEGO JOSE
- CORNEJO ROQUE BRIAN
- MNDEZ MNDEZ YANINA
- CORTEZ FLORES ELVIS FERNANDO
- CHVEZ ALCNTARA CLAUDIA CRISTINA
- CARHUAJULCA JARA MARA GUADALUPE
- CAMPOS LOLOY FELIX
- DELGADO KAREN
- DAZ FERNNDEZ CLAUDIA

I. INTRODUCCIN
Segn la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), el cncer cervicouterino (CaCu)
es la segunda causa de mortalidad en mujeres a nivel mundial. 1 Durante los ltimos
40 aos en Canad, Estados Unidos y otros pases la incidencia de CaCu se
presenta con tasas significativamente bajas. Por otra parte, en la mayora de los
pases en desarrollo de Amrica Latina y el Caribe, las tasas anuales se mantienen
altas.2
El CaCu es el resultado de la progresin de leves anomalas epiteliales llamadas
displasia o neoplasia intraepiteliales cervical (NIC), frecuente en mujeres entre los
20 y 30 aos de edad, pasando por carcinoma in situ, entre los 25 y 35 aos, a
carcinoma invasivo en mujeres mayores de 40 aos. Las mujeres portadoras del
ADN del VPH, con 7 o ms embarazos, tienen un riesgo de padecer la enfermedad
4 veces ms que mujeres nulparas o con menor nmero de hijos. Los tumores
malignos del cuello uterino en estadios tempranos son identificables por
confirmacin histoanatomopatolgica. Aproximadamente la mitad del total de las
mujeres que desarrollan cncer del cuello uterino invasivo mueren despus de los 5
aos de ser diagnosticadas.3
La incidencia de infeccin con tipos virales oncognicos, parece ser ms alta que
aquella con tipos virales no oncognicos, dado que es originado por algunos
genotipos oncognicos del Virus del Papiloma Humano (VPH), motivo por el cual se
le ha considerado como una causa necesaria.4
En las ltimas dcadas, estudios epidemiolgicos y moleculares demuestran que el
VPH est implicado como principal agente en las primeras etapas de la
carcinognesis cervical.5 La mayora de hombres y mujeres adquieren la infeccin
durante su vida sexual activa. Las infecciones genitales por el VPH son transmitidos
principalmente por contacto sexual.6 La infeccin por VPH es inicialmente
asintomtica, y la transmisin puede ocurrir antes de que la expresin del virus se
manifieste.7 La severidad de traumas o erosiones epiteliales favorecen el
crecimiento viral.8
Los papilomavirus estn agrupados en familias diferentes: los Polyomaviridae y los
Papillomaviridae. En la familia Papillomaviridae se ha establecido la existencia de 18
gneros. Los papilomavirus humanos se encuentran ubicados en los gneros Alfa
papillomavirus, Beta papillomavirus, Gama papillomavirus, Mu papillomavirus y
Nu papillomavirus.9
En los Alfa papillomavirus se determin 15 especies, en las cuales la especie 7
comprende el VPH 18 de alto riesgo. En la especie 9 se encuentra el VPH 16,
tambin de alto riesgo, y tipos relacionados como VPH 31, 33, 52. La especie 10
contiene el VPH 6, VPH 11, siendo los tipos virales contenidos en esta especie
aislada en lesiones benignas.10
Los VPHs poseen un alto grado de tropismo por las clulas epiteliales. Producen
infecciones tanto en piel como de mucosas, los virus que infectan las mucosas, se
dividen en genotipos de alto y bajo riesgo. Los de bajo riesgo (LR VPH) son el
VPH 6 y 11, que producen verrugas benignas en el tracto genital. 11
Los VPH de alto riesgo (HR VPH) causan lesiones menos evidentes, y son
clasificados potencialmente cancergenos, ya que estn asociados con ms del 99%
de las enfermedades oncognicas. El nmero de HR VPHs varan entre genotipos
de VPH 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 56 y 58 los cuales conllevan constantemente
un alto riesgo.12
El VPH ha sido simplificado en el 85% del cncer del canal anal, 50% del cncer de
vulva, vagina y pene, 20% del cncer orofarngeo y 10% del cncer larngeo y
esofgico.13
Los estudios realizados en VPH revelan que el genoma est constituido por ADN
viral de 7200 8000 pb, con un tamao, de 45 55 mm de dimetro y una cpside
icosadrica compuesta por 72 capsmeros rodeando al genoma.14 El genoma se
divide en tres regiones: una regin temprana E (Early) la cual codifica para las
protenas virales (E6 y E7), necesarias para la replicacin del DNA viral, la
regulacin de la transcripcin y la transformacin e inmortalizacin celular, una
regin Tarda L (Late), que codifica para protenas estructurales de la cpside (L1 y
L2), y una regin de control LCR (Long Control Region), que contiene la secuencia
de ADN que permiten el control de la replicacin y de la expresin del genoma viral.
Se detect la expresin de ms de veinte ARN mensajeros (ARNm).15
As mismo, los productos de genes E6 y E7 interaccionan con las protenas p53 y la
Retinoblastoma (pRb); se denominan oncogenes virales o genes transformantes. 16
Los VPHs son altamente especficos de la especie a la que infectan, y presentan un
tropismo muy definido. En cuanto a los mecanismos de unin y entrada en la clula,
an son objeto de investigacin; la integrina 6 fue la primera protena candidata
como receptora para los VPHs, esta integrina se expresa fundamentalmente durante
la curacin de heridas.17 La unin estara mediada por los 15 ltimos aminocidos
del extremo carboxi terminal de la protena L1.18 Los VPHs entran en la clula por
endocitosis mediante una va dependiente de clatrina. La descapsidacin de la
partcula tiene lugar en el endosoma, liberndose el genoma y las protenas de la
cpside en las vesculas endocticas. La protena L2 podra potenciar la importancia
del genoma viral hacia el ncleo.19
Los genes E1 y E2 codifican para protenas que unen ADN y se expresan en clulas
basales y parabasales del epitelio. E2, es un factor de la transcripcin, que tiene la
capacidad de unirse a sitios de iniciacin de la replicacin, y junto a E1 reclutan las
protenas Hsp40 de la clula epidrmica para formar dos anillos alrededor del ADN
dando origen a la helicasa viral.
E1 constituye la enzima para reclutar a la ADN polimerasa del husped y a las
protenas de unin a ADN de cadena simple. A esto se suma la protena viral E2
para acoplarse al ciclo celular del husped. Por otra parte los genes de expresin
tarda, L1 y L2 son las protenas que forman la cpside viral.20
El mecanismo de accin de VPH de alto riesgo en el desarrollo de neoplasia
cervical, se explica principalmente por la accin de dos de sus oncoprotenas virales
codificadas por los genes E6 y E7. Estas tienen la capacidad de inmortalizar y
transformar queratinocitos, confiriendoles un alto grado de inestabilidad
cromosmica del genoma de la clula husped.21
Se considera que el proceso de integracin del genoma del VPH al genoma de la
clula husped es el evento fundamental en la progresin a cncer debido a la
sobreexpresin de las oncoprotenas E6 y E7 por la prdida de E2, protena
implicada en su regulacin.22
Los oncogenes E6 y E7 se expresan en forma constante en clulas cancerosas, el
bloqueo de la funcin de los genes E6 y E7 lleva a la re-versin del fenotipo maligno
de las clulas cancerosas, y estas oncoprotenas se unen e interactan
respectivamente con las protenas celulares p53 y pRb que son protenas
reguladoras del ciclo celular.23
El gen E6 es uno de los primeros genes que se expresan durante el ciclo viral y
codifica la oncoprotena E6, la cual est compuesta por 150 aminocidos con dos
dominios de dedos de zinc, caracterizados por la presencia de Cys X X Cys,
cuya integridad es esencial para su funcin y se encuentra distribuida tanto en el
citoplasma como el ncleo.5 Esta tiene la capacidad de unirse a un sin nmero de
blancos celulares que se muestran en la que le permite bloquear la apoptosis,
regular la transcripcin, abatir la diferenciacin celular y las interacciones clula
clula, e incrementar la inestabilidad cromosmica.24
La primera capacidad de las E6 de VPH de alto riesgo fue la capacidad para formar
complejos con p53. Una propiedad no compartida con oncoprotenas E6 de bajo
riesgo. A travs de esta interaccin las protenas E6 de alto riesgo pueden bloquear
la capacidad de p53.
La oncoprotena E6 de alto riesgo promueve la degradacin dependiente de
ubiquitina de p53, y su posterior degradacin.25 En efecto, la vida media de p53
decae en clulas una vez expresado el oncogn E6. La expresin de E7 de alto
riesgo y sus agentes de pRb pueden resultar en un incremento de los niveles de p53
dentro de las clulas que a su vez activa transcripcionalmente la expresin de genes
proappticos o genes como p21 que detiene el ciclo celular. E6 puede contrarrestar
el incremento inducido por la protena E7 en p53. E6 inhibe la apoptosis por vas
independientes de p53.26
La oncoprotena E7 es un polipptido de aproximadamente 100 aminocidos y
presenta tres dominios; CR1 donde se encuentra en el extremo amino terminal, CR2
el cual contiene un motivo LXCXE donde se une la protena pRb y CR3 por medio
del cual forma dmeros va a un motivo de dedos de zinc.27
Algunos estudios reportan que la protena E7 interactan con varias protenas
reguladoras del ciclo celular, especialmente en la transicin de la fase G1 a la fase
S del ciclo celular, entre estas protenas se encuentra la familia de protenas
supresoras de tumor de retinoblastoma (pRb).
E7 desregula el ciclo celular y conduce al incremento de la proliferacin celular,
inmortalizacin y finalmente transformacin.28

La presente investigacin tuvo como objetivo principal, detectar las regiones


oncognicas E6 y E7 de Virus del Papiloma Humano mediante PCR en pacientes
Papanicolaou negativo del Instituto de Enfermedades Neoplsicas de la Libertad.
As mismo, como objetivos secundarios, determinar el grado de incidencia
caracterizando oncogenes de alto y bajo riesgo, as como tambin, evaluar el tipo de
infeccin que presenta cada paciente a causa de la presencia simultnea de ciertos
genotipos de VPH.

II. MATERIAL Y MTODOS


1. Poblacin de estudio
Se consideraron a las pacientes que acudieron a la patologa cervical en el Instituto
Regional de Enfermedades Neoplsicas IREN de La Libertad debido a que en el
2013, en Trujillo, segn investigaciones epidemiolgicas realizadas, se reportaron
un total de 1133 pacientes, de las cuales se estima que 921, aproximadamente, son
posibles diagnsticos falsos negativos, debido a que el error de diagnstico de este
tipo de anlisis de dar resultados falsos es el 20.5 %. El nmero de pacientes se
determin en relacin a la siguientes formulas estadsticas para variables
cualitativas teniendo en cuenta la presencia y ausencia de tal enfermedad.

2. Toma de Muestras
Para la investigacin se seleccionaron 20 muestras de mujeres, cuyos resultados
fueron Papanicolaou negativo, las cuales fueron tomadas por un gineclogo
encargado del IREN. Obtenida la muestra se coloc en un tubo cnico de 15 ml
conteniendo 10 ml del Medio Tampn Fosfato Salino, para luego ser etiquetadas y
conservadas con los cdigos de cada paciente.
3. Procesamiento de las Muestras
Para la extraccin y purificacin del ADN se utiliz el Kit de Roche; una vez obtenido
el ADN en microtubos de 500 l se procedi a amplificar las regiones que codifican
las protenas de la cpside L1 Y L2 para deteccin inespecfica de VPH, despus
una amplificacin selectiva para detectar regiones oncognicas E6 y E7 y tipificar a
los genotipos de HR VPH (VPH 16,18 ,31 ,33 y 52) y LR VPH (VPH 6/11); para
la amplificacin se utiliz primers especficos para genotipo. Se utilizaron microtubos
de 250 l correspondiente para cada genotipo, en estos se agreg 23.0 l del PRE
MIX de reaccin y 3.0 l del ADN haciendo un total de 26.0 l por reaccin,
simultneamente se prepar un control positivo y negativo para cada genotipo.
En cada microtubo contenido el amplicn se agreg 2.0 l de buffer de carga, se
mezcl y deposito 28.0 l de muestra en cada pozo; se analizaron 12 muestras por
cada corrido electrofortico, se corri simultneamente en el mismo gel un patrn de
corrido; adems, de un control negativo, positivo y 1.5 l de marcador de peso
molecular de 100 pb y 1 kb, luego se someti a una carga de 70 volt por 5 min y 92
volt por 55 min.
Luego se realiz una tincin para poder visualizarla en un trasluminador de luz
blanca obteniendo los perfiles electroforticos como resultado.

RESULTADOS
Se analizaron 20 muestras cuyos resultados fueron negativos aplicando la tcnica
convencional de Papanicolaou, aparentemente estos pacientes con un rango de 38
a 62 aos de edad son sanos, las observaciones realizadas por el especialista en
ginecologa oncolgica report que en todos los casos evaluados presentan el
cuello uterino con aspecto anatmico normal solo un caso se report cuello uterino
congestivo (caso 2)
Como resultado se muestran los perfiles electroforticos que evidencian el amplicn
como un producto en la amplificacin de las regiones oncognicas. As mismo, para
la deteccin VPH inespecficos mediante la amplificacin de genes que codifican
protenas estructurales (L1 y L2).Se utiliz los primers genricos MY09 MY11 cuyo
amplicn es de 450-500pb encontrndose que en el 95% de muestras presentan
algn genotipo de VPH (Fig. 1) .Tambin se utiliz los primers GP5+-GP6+ cuyo
amplicn de 150pb confirm la presencia de VPH inespecfico en 4 muestras
seleccionadas (Fig. 2)
En las muestras evaluadas para la deteccin de regiones oncognicas E6 y E7 de
VPH de alto riesgo, se mostraron una alta frecuencia en cuanto a deteccin de
oncogenes de VPH 16 (paciente 01, 02 ,03, 04, 05, 06, 07, 08,09,10,11,12,13,14,15)
encontrndose en los perfiles electroforticos el 75% de pacientes.(Fig. 3 y 4) .En
cuanto a la deteccin de oncogenes de VPH 18 (paciente 06 y 08) se mostraron en
2 de los 20 casos (10%) lo que revela una frecuencia relativamente baja de tales
oncogenes (Fig. 4).As mismo, se encontraron oncogenes de VPH 33(paciente 4) en
1 de 20 casos (5%) (Fig. 5) .Se encontraron oncogenes de VPH 52 (paciente 04,
09,12) en 3 de los 20 casos (15%) (Fig. 6). Y para VPH 31no se detectaron
oncogenes en los casos evaluados.
La frecuencia de oncogenes E6 y E7 de VPH 6 Y 11 (paciente 17, 18,19 y 20) es
moderada y se consider la misma dado que los sitios de reconocimiento del
genomas son similares para ambos genotipos y en el perfil electrofortico de
detectaron en 4 de los 20 casos evaluados (20%) (Fig7).
Analizando todas las pacientes evaluadas se determin que el 70% presenta una
infeccin simple; 50% de pacientes presentan oncogenes E6 y E7 de VPH 16, y el
20% de VPH6/11.As mismo, el 25% presentaron infecciones mltiples: el 10% de
VPH 16 y 18, el 10% de VPH 16 y 52 y el 5% de VPH 16,33 y 52 (tabla1).

DISCUSION
CONCLUSIONES
REFERENCIAS BIBLIGRAFICAS

Figura 1. Deteccin de VPH mediante PCR con primers MY09-MY11, 1-20:


Muestras de estudio, C-: Control negativo, C+: Control positivo, M; Marcador de
peso molecular (100pb), CP: Patrn de corrido (150pb)

Figura 2. Deteccin de VPH mediante PCR con primers GP5 + - GP6+.01-06:


Muestras de estudio, C-: Control negativo, C+: Control positivo, M: Marcador de
peso molecular (100pb)
Figura 3. Deteccin de oncogenes E6 Y E7 de VPH 16 (119pb) mediante PCR.01-
14: Muestras de estudio, C-: Control negativo, C + control positivo, M: Marcador de
peso molecular (100pb)

Figura 4. Deteccin de oncogenes E6 Y E7 de VPH 16 (119pb) y VPH 18 (172pb)


mediante PCR.04-15: Muestras de estudio, 16 y 18: Genotipos de VPH, C-: Control
negativo, C+: Control positivo, M: Marcador de peso molecular (100pb).

Figura 5. Deteccin de oncogenes E6 y E7 de VPH 33(398 pb) mediante PCR.01-


12: Muestras de estudio, C-: Control negativo, M: Marcador de peso molecular
(100pb).
Figura 6. Deteccin de oncogenes E6 y E7 de VPH 52 (229 pb) mediante PCR. 04-
12: Muestras de estudio, C-: Control negativo, CP: Patrn de corrido (150pb), M:
Marcador de peso molecular (100pb).

Figura 7. Deteccin de oncogenes E6 y E7 de PVH 6/11(334pb) mediante PCR. 16-


20: Muestras de estudio, M: Marcador de peso molecular (1 kb).

DISCUSIN
A nivel mundial el Cncer Cervicouterino se ha estudiado que en el 99% de los
casos tratados est implicado algn genotipo de VPH por lo que se considera
actualmente un factor necesario para el desarrollo del cncer invasivo. A este grupo
se le denomina VPH de alto riesgo y son los tipos: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 56,
58, etc. As mismo, se estima que en ms del 75% de casos estn asociados
frecuentemente a los genotipos 16, 18, 31, 33 y 52; y en menor grado los VPH de
bajo riesgo 6 y 11 son los ms frecuentes por causar verrugas genitales o cambios
leves en el cuello uterino.
La deteccin mediante PCR de VPH presenta una sensibilidad aproximada del 90%,
con un intervalo ms compacto (84.9 100%) y no vara con la edad; mientras que
en los anlisis citolgicos la especificidad se incrementa con la edad y resulta ms
baja,
El perfil electrofortico se visualiz en gel de poliacrilamida al 4% y la tincin con
nitrato de plata permiti, la identificacin especifica de los oncogenes E6 y E7 de
tipos de VPHs presentes en una muestra mediante la simple determinacin de la
longitud del amplicn.
En las pacientes evaluadas se encontraron una alta frecuencia de oncogenes de
VPH 16 (75%). En cuanto al VPH 18 se obtuvo una baja frecuencia oncognica del
10%. En todo el mundo la frecuencia de VPH 16 y 18 son relativamente diferentes
de acuerdo a las variaciones geogrficas.; por ejemplo se report que la frecuencia
de VPH 18 fue de 56%y de VPH 16 un 17% en una poblacin de mujeres
finlandesas.
La incidencia de VPH 31, 33 y 52 son bajas, menos del 10%; en esta investigacin
se obtuvo un 15 % de VPH 52, lo que explica que el VPH 52 es el genotipo con ms
prevalencia en el Per. As mismo se encontr el 15% de casos con oncogenes de
VPH 6/11. Se encontr infecciones mltiples en un 25% de pacientes evaluados.
Algunos estudios reportan que se estima que el 10 80% de pacientes que
desarrollan cncer, lo adquieren por una coinfeccin por ms de un genotipo de
VPH.
Existe una mayor ocurrencia de infecciones mltiples de VPH de alto riesgo, segn
Wentzensen los 7 genotipos que forman combinaciones mltiples son de VPH 16,
18, 31, 33, 45, 52 y 58; varia de 77,7% (infecciones simples) a 86,9% (infecciones
mltiples).
Son diversos los factores asociados a un mayor riesgo de adquirir una infeccin,
sino tambin la probabilidad de que esta sea producida por ms de un tipo, el
estado inmunolgico de la paciente, el comportamiento sexual, la edad de inicio de
las relaciones sexuales, nmero de parejas sexuales y el comportamiento sexual de
la pareja estn asociados a un mayor riesgo de infeccin mltiple.
El resultado obtenido en esta investigacin sugiere que el VPH es muy frecuente
aun en mujeres con Papanicolaou negativo. Por tanto, siempre y cuando existan
factores de riesgo, ser necesario recomendar una prueba altamente especfica
cmo es la PCR para la deteccin oncognica de VPHs inclusive antes que la clula
presente cambios citopticos.

CONCLUSIONES
El papilomavirus humano est compuesto por secuencias de nucletidos que, al ser
comparadas, presentan variabilidad entre los diferentes tipos. Esta variabilidad
puede ser detectada mediante el anlisis parcial de sus secuencias por diagnstico
con enzimas de restriccin, es decir, mediante PCR. Especficamente, los LCP
hacen uso de un esquema de tipificacin contra el cual comparan las fotografas del
gel de poliacrilamida y buscan el patrn concordante.
Se detect regiones oncognicas E6 y E7 de VPH mediante PCR en pacientes
evaluados Papanicolaou negativo del Instituto Regional de Enfermedades
Neoplsicas de La Libertad, encontrndose un elevado porcentaje de pacientes con
genotipos virales de VPH de alto riesgo.
Se pudo identificar que las regiones oncognicas E6 y E7 de VPH 16 es el ms
incidente y en menor grado el VPH 6/11, 52, 18 y 33.
Se identific infecciones simples predominantes de VPH 16 y 6/11. As mismo,
infecciones mltiples de VPHs (16, 33 y 52), (16 y 18) (16 y 52).

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