Mtodos para mielina y trastornos asociados a ellos

Tcnicas para la demostracin de la mielina

La mielina es la capa aislante, que modifica la conduccin nerviosa a lo largo de los axones en el
sistema nervioso central y perifrico. Esta formado por oligodendrocitos en el sistema nervioso
central y clulas de Schwann en el sistema nervioso perifrico. Cada clula envuelve hasta 100
capas concntricas de plasma altamente especializado alrededor del axn.

Qumicamente la mielina consiste en protenas especificas lpidos y cerebrosidos. Existen sus

tcnicas para la demostracin de la mielina normal y tambin mtodos especficos para la
identificacin de productos de degeneracin de mielina como resultado de un proceso de
enfermedad (capitulo 11).

Los mtodos de inmunohistoqumica ahora estn disponibles para detectar las protenas
especificas presentes en las vainas de mielina.

histricamente los mtodos clsicos para la demostracin de la mielina involucraban un

mordiente de cromato tisular seguido de procesamiento de tejidos, tincin en hematoxilina, y
diferenciacin posterior en permanganato de potasio/acido oxlico/ sulfato de sodio. Este mtodo
asociado con los nombres de Weigert, Pal y Kultschitsky, proporciona una tincin brillante pero
lleva mucho tiempo

Varios mtodos estn disponibles para el tejido procesado con parafina fijado con formalina que,
debido a su facilidad de uso han reemplazado en gran medida las tcnicas mas antiguas. Algunas
de las tinciones de mielina se pueden combinar de forma til con una tincin de Nissl para
proporcionar tanto la localizacin de mielina como neuronal.

El mtodo Loyez (1910) usa un mordiente en 4 por ciento de alumbre de hierro seguido de tincin
en carbonato de litio/ hematoxilina y diferenciacin posterior. El mtodo de Weils (1928) usa
alumbre de hierro y hematoxilina simultneamente para lograr resultados similares. En ambas
tcnicas, las secciones estn teidas regresivamente y se usa la diferenciacin por etapas. Primero
4% de alumbre de hierro elimina tincin ligeramente unida en solucin con mordiente libre, y en
segundo lugar una solucin de Borax-ferricianuro (diferenciador de Weigert) actua como agente
oxidante y elimina el tinte de laca no especficamente unido, luxol fast blue es un tinte de
ftalocianina de cobre que se emplea de manera til en la tincin con mielina del tejido parafinico
procesado, y puede combinarse con tincin de Nissl, PAS y mtodos de hematoxilina.

la tincin de cianina en solitario es una tcnica simple y rpida para la demostracin de mielina,
tanto en el sistema nervioso central como, particularmente, en secciones de nervio perifrico.

la demostracin de fibras mielinizadas en el sistema nervioso perifrico requiere un control

microscpico cuidadoso, ya que las fibras individuales son importantes en la evaluacin
histolgica.
los mtodos histoqumicos de lpidos para la mielina normal, basados en su contenido de
esfingomielina, se discuten en el captulo 11. y los usos de las tcnicas de combinacin para
demostrar la mielina normal y degenerada en (p222)

La tincin inmunohistoqumica de mielina se observa como una asociacin con anticuerpos contra
la protena S100 es til para identificar tumores derivados de las clulas que forman mielina en los
nervios perifricos (clulas de Schwann). adems, la demostracin de la protena bsica de mielina
se puede aplicar a un cerebro menos maduro para asegurar que no se produzca una diferenciacin
excesiva de las estructuras finamente mielinizadas y escasamente dispersadas. en trminos
generales, en las secciones de parafina congeladas y fijadas con glutaraldehdo, la tincin de las
figuras de mielina es ms completa en comparacin con el material de parafina fijado con
formalina.

Mtodo de Weils para vainas de mielina:

En este mtodo, el mordiente y el colorante se mezlclan en la solucin de tincin.

Fijacion

Solucin salina o formol clcico.

Secciones

Parafina 10-15um. Congelado 20-30 um

Nitrocelulosa, 20-30 um.

Las secciones congeladas se llevan a travs de alcoholes hasta xilol y de vuelta al agua

Preparacin de la tincin

4% de alumbre de hierro acuoso

50ml de 1% hematoxilina

50 ml de hematoxilina al 1% a partir de hematoxilina alcohlica al 10% (5 ml) y agua destilada (45

ml)

mezclar juntos inmediatamente antes de usar

Metodo

1. Lavar las secciones en agua destilada

2. Colocar las secciones en la tincin durante 10-45 minutos a 50-60C
3. Lavar bien con agua del grifo
4. Diferenciar en 4% de alumbre de hierro, el tiempo suficiente para distinguir la materia gris
o las reas degeneradas
5. Lavar bien en varios cambios de agua destilada
6. Completar la diferenciacin en la solucin de ferricianuro de brax de Weigert
7. Lavar bien en varios cambios de agua destilada, seguido de agua del grifo
8. Deshidratar, aclarar y montar
Resultados

Mielina ---------- negro

Fondo ------------ amarillo

Notas

este es un buen mtodo para secciones congeladas. como con todas las tinciones de hematoxilina,
el alcohol cido puede usarse para diferenciar las secciones.

La tcnica de cianina solocromo para mielina en secciones de parafina

Fijacion

Solucin salina o formol clcico

Secciones

Parafina 6-10um. Secciones de criostato, 10um

Preparacin de la solucin

Cianina solocromo RS 0.2g

Agua destilada 96ml

10% Alumbre de hierro 4ml

Acido sulfrico concentrado 0.5ml

Mtodo

1. Llevar las secciones al agua

2. Teir durante 10-20 minutos a temperatura ambiente
3. Lave con agua corriente
4. Diferenciar en 5% de alumbre de hierro hasta que todos los nucleos esten sin teir. Lave
frecuentemente con agua destilada y examine.
5. Lave con agua del griffo
6. Contrarresta si se desea
7. Deshidratar, limpiar y montar

Resultados

Vainas de mielina --------- azul

Notas

a. La solucin de tincin se mantiene bien

b. Borax-ferricianuro se puede usar para la diferenciacin, pero su accin es lenta
c. Rojo neutro, Piero-Ponceau S o van Gieson se pueden usar para contrateir
Kluver & Barrera tincin Luxol fast blue para mielina con contratincion Nissl

Fijacion

Formalina

Secciones

Parafina, 10-15 um

Preparacion de soluciones

Luxol fast blue

Luxol fast blue 1g

Metanol absoluto 1000 ml

10% acido actico 5ml

Mezcle los reactivos y el filtro. Esto puede almacenarse hasta 18 meses antes de su uso.

Solucion Violeta de cresilo

Violeta de cresilo 0.5g

Agua destilada 100ml

Filtrar antes de usar

Diferenciador Violeta de cresilo

Alcohol 100 ml

Acido actico glacial 250 ul

Metodo

1. Tomar secciones en portaobjetos en alcohol al 95% (no agua)

2. Teir en solucin luxol fast blue, 2 horas a 60C o 37C durante la noche
3. Lave con alcohol al 70%
4. Lave con agua corriente
5. Diferenciar en solucin saturada de carbonato de litio hasta que se distingan la materia
gris y blanca. Esto puede controlarse mas fcilmente usando carbonato de litio al 0.05%
seguido de 95% de alcohol el su lugar
6. Lave con agua corriente
7. Compruebe la diferenciacin bajo el microscopio
8. Tinte en solucin de violeta de cresilo, 10-20 minutos
9. Lave con agua corriente
10. Diferenciador de violeta cresilo, 4-8 segundos.
11. Compruebe la diferenciacin bajo el microscopio
12. Deshidratar, aclarar en xilol y montar

Resultados

Mielina ------------ azul/verde

Celulas ------------- violeta/rosado

Metodos para teir la mielina degenerada

En el curso de las enfermedades desmielinizantes o despus de la muerte neuronal, el axn y la

mielina asociada mueren, y esto se puede detectar de varias maneras

1. Tecnica de Marchi para productos de degeneracin temprana (10-15 dias despus de la

lesin).
2. Tincin de lpidos neutros para productos de degeneracin tardia (5-6 semanas despus
de la lesin)
3. Perdida de tincin de mielina normal con una tcnica establecida (Weil, Kluver & barrera)

La perdida de mielina ocurrir con procesos tales como el infarto y la esclerosis multiple, y en
varias enfermedades degenerativas primarias del sistema nervioso central: por lo tanto, su
deteccin es importante en la practica neuropatologica. En el estado normal, la mielina es
hidroflica debido a su alto contenido de fosfolpidos polares, pero despus de la degeneracin se
vuelve hidrofbico con la formacin de esteres de colesterol. Tanto la mielina normal como la
mielina degenerada pueden teirse con tetroxido de osmio, sin embargo la osmiophilia de la
mielina normal se bloquea mediante un pretratamiento con un fuerte agente oxidante y este
fenmeno permite la deteccin de mielina degenerada mediante la tcnica Marchi. Despus de la
perdida de mielina los productos degenerados son fagocitados por lo macrofagos y en un periodo
de semanas a meses son eliminados del rea lo que da como resultado la falta de tincin normal
de la mielina con los mtodos de rutina.

Las tinciones de lpidos neutros, como el aceite rojo O, pueden demostrar eficazmente la
degeneracin de mielina en secciones congeladas fijadas con formalina durante este periodo de
fagocitosis de lpidos de mielina, y esta es una forma efectiva de buscar la degeneracin del tracto
cuando la tincin con mielina negativa es equvoca y el uso de un mtodo Marchi no se establece
en el laboratorio.

El mtodo Marchi para degeneracin de la mielina

El descubrimiento de que es posible bloquear selectivamente la tincin de osmio de la mielina

normal mediante el tratamiento con dicromato de potasio es la base de la tcnica de Marchi. Hay
tres variantes del mtodo que usan diferentes agentes oxidantes, a saber, dicromato de potasio
en Marchi, dicromato de potasio en swank-davenport y yodato de sodio en tcnicas de busch, el
mtodo de Marchi puede ser propenso al artefacto. La llamada pseudo-granulacion. El mtodo de
Busch puede sobre oxidar y dar un resultado muy palido. Es el mtodo de Swank-Davenport el que
parece dar la demostracin mas confiable. Los efectos sobre el mtodo de Marchi del intervalo de
tiempo entre la aparicin de la lesin y la muerte y la duracin del tiempo de fijacin, han sido
investigados por Smith. Mostraron que el material almacenado en formalina desde hace 8 aos
todava puede dar una tincin positiva clara aunque depende de si el material positivo es
intracelular o extracelular. Despus de que la mielina se degenera, el material Marchi positivo es
en primer lugar extracelular y permanece asi durante aproximadamente 10 semanas. Despus de
ese tiempo, una cantidad creciente se fagocita y hay 3 intracelulares. Hay ciertas desventajas para
la tcnica de Marchi, principalmente la poca capacidad de penetracin del tetroxido de osmio (que
requiere el uso de un delgado bloque de tejido), la naturaleza toxica y el costo del tetroxido de
osmio, y la aparicin ocasional de artefactos en detalle e indico como podran distinguirse de la
verdadera degeneracin.

Las siguientes medidas pueden ayudar a reducir la incidencia de artefactos.

Prevencin de artefactos:

1. Los tejidos deben manipularse con un minimo de estiramiento o moretones

2. No se debe permitir que los tejidos se sequen
3. Los bloques grandes no deben ser mas gruesos que 3 mm. los bloques pequeos pueden
tener hasta 5 mm de grosor
4. No permita que los tejidos se superpongan en la solucin de Machis. los tejidos deben
estar planos
5. La impregnacin debe llevarse a cabo en la oscuridad
6. Se logra una mejor impregnacin si el tejido se voltea todos los das
7. Despus de la impregnacin, lavar los tejidos durante al menos 24 horas en agua
corriente.
8. Las secciones congeladas tienen menos artefactos que las secciones integradas. intente
cortar secciones congeladas y, si es necesario, incrustarlas ms tarde.

Mtodo de Marchi, modificacion swank-davenport

Fijacion

Formol salino

Secciones

Congeladas

Preparacin de la solucin de impregnacin

1% tetroxido de osmio 20ml

1% cloruro de potasio 60ml

Formaldehido 12ml

Acido actico glacial 1ml

El osmio es altamente txico y debe usarse en una campana extractora

Metodo

1. Cortar secciones delgadas de tejidos de 3-5mm de espesor

2. Inserte los tejidos durante 5-10 minutos en 1% de cloruro de potasio
3. Transfiera los tejidos a la solucin de impregnacin y djelos durante 7-12 dias a
temperatura ambiente, en la oscuridad.
4. lavar con agua del grifo durante 1 o 2 das
5. cortar secciones congeladas a 25-90 um. Montar en gelatina de glicerina-jalea o
deshidratar, aclarar y montar en estos blsamos de canada o
6. deshidratar e incrustar en cera de parafina o nitrocelulosa

Resultados

Mielina degenerada --------- negro

Dependiendo de la edad de la desmielinizacin, la cantidad de productos de reaccin puede variar

desde ser en forma de anillo, granulos irregulares gruesos, extracelulares o finos granulos
intracelulares dentro de los macrofagos.

Mielina normal ------- marron claro

Notas

Los tiempos de impregnacin no son crticos dentro de los limites dados. La dosificacin de los
productos qumicos es critica, la concenctracion de la mezcla no lo es. Poirer (1954) sugirio que la
solucin de impregnacin era demasiado fuerte y poda diluirse a un tercio de su resistencia
original. Las secciones pueden contrateirse en verde claro. Se usan tinciones de color rojo, los
colorantes rojos de sudan.

Figura 18.4

cordn cervical que muestra reas de degeneracin temprana de mielina. seccin de celoidina,
teida con el mtodo swank-davenport